L-色氨酸基因工程菌及其生產l-色氨酸的方法

專利名稱：：L-色氨酸基因工程菌及其生產l-色氨酸的方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程
技術領域：
，具體涉及一種L-色氨酸基因工程菌及其生產L-色氨酸的方法。
背景技術：
：目前，L-色氨酸的生產方法主要有四種蛋白水解提取法、化學合成法、酶促轉化法和直接發酵法。前2種方法分別存在著材料來源有限、需多步合成工藝和光學拆分及得率低、周期長等缺點，酶促轉化法具有終產物積累量高、反應周期短、分離提純容易等優點，它是生產L-色氨酸較為有效的方法。目前日本與我國企業多采用酶法生產。我國中科院微生物研究所余志華等采用重組DNA技術，成功地構建了能夠高效表達用于酶法生產的色氨酸合成酶基因工程菌E并進行了規模化生產，但由于酶法底物之一L-絲氨酸價格昂貴，另一底物吲哚難溶于水，且對色氨酸合成酶抑制強烈，影響轉化率提高，因此目前L-色氨酸的市場價格仍居高不下。對L-色氨酸發酵工藝的研究始于60年代初期。雖然對這種方法的研究進行得比較早，但在相當長的一段時間內達不到工業化生產的要求，主要原因是從葡萄糖到L-色氨酸的生物合成途徑比較漫長，其代謝流也比較弱，而且L-色氨酸的合成需要多種前體物(如PRPP等)，另一方面，L-色氨酸生物合成途徑中的調控機制也比較復雜。用傳統方法誘變黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌等出發菌株，解除菌體自身反饋調節，切斷支路代謝，增加前體物的合成等，對芳香族氨基酸生物合成正常代謝機制進行調節，取得了一定成果，如1982年日本杉本慎一等利用黃色短桿菌酪氨酸、蛋氨酸雙重缺陷型兼對-氟苯丙氨酸抗性株，誘導5-氟色氨酸抗性株積累8.0g/LL-色氨酸，進一步賦予重氮絲氨酸抗性，積累10.3g/LL-色氨酸。1987年他們又從該株誘變出磺酸胍抗性突變株，在相同的培養條件下積累L-色氨酸18.8g/L。1987年日本倉橋等發現高濃度的L-色氨酸抑制枯草桿菌色氨酸生產菌生長，依次賦予該菌具有對以下各結構類似物5-氟色氨酸、吲哚霉素、重氮絲氨酸，6-重氮-5-氧基-L-正亮氨酸、肉桂酸的抗性，誘變得到了AJ-11982菌株，能從200g/L葡萄糖生產21.5g/L色氨酸。已知的L-色氨酸生產方法是基于一個突變的&pE基因的表達，該基因編碼有色氨酸不敏感的鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶，以及基于在合適的可自動復制的載體上的trp操縱子的其他基因的表達。由于這些基因的相對高拷貝數，^p感因的表達也多，對應的色氨酸代謝中的每一種酶的量也增加了，即可實現色氨酸的過量生產。1979年Tribe和Pittard首次利用DNA重組技術將引入￡中，色氨酸的產量達到lg/L。1982年Aibaetal將帶有下調的和^pD基因引入^沐和toaA缺陷的￡中，在含有葡萄糖和鄰氨基苯甲酸的培養基中培養，L-色氨酸的產量在27h時后為6.2g/1，同時他們還分離到一株抗6-氟色氨酸的突變株，以此菌株為出發菌株，同時引入增強表達得trp操縱子，通過發酵優化91h時產量達到50g/l。1993年Chanetal將三個拷貝的色氨酸操縱子基因整合到AcoW的基因組中，獲得了穩定生產L-色氨酸的生產菌株，9.2g/l葡萄糖轉化率13%，在沒有選擇壓力的情況下也能穩定表達，因此將基因整合到基因組中獲得穩定表達也是非常有用的策略。通過增強失調的trp操縱子在宿主菌中的表達來提高L-色氨酸的產量的在Berry(1996)和Camakarisetal(1997)也有所描述。隨著重組DNA技術在微生物育種中的應用，在L-色氨酸生產菌株的篩選和產酸水平的提高方面出現了突破。例如從大腸桿菌EMS4-C25中分離得到抗反饋調節的色氨酸操縱子，并將其克隆到質粒pUC19和pHSG576中分別得到重組質粒pTC701和pTC576。將pTC576轉化到大腸桿菌中，該菌經過17h的分批發酵積累色氨酸16g/L。Ikeda等將帶有DAHP合成酶(DS)和色氨酸合成酶(F)的質粒引入產色氨酸的谷氨酸棒桿菌KY10-894中，使色氨酸的產量提高了54%，分批發酵100h左右達到了66g/L。基因工程育種在各種L-色氨酸生產菌中的成功實踐說明其發展勢頭，也必將成為未來工業微生物育種的發展趨勢。基因工程構建L-色氨酸生產菌的專利報道有日本協和發酵公司申請的專利EP-A-0401735描述了以含有重組質粒的棒狀桿菌或短桿菌來生產L-色氨酸的方法。在這些質粒中含有合成DAHP合酶，鄰氨基苯甲酸合酶，吲哚-3-甘油-P合酶，色氨酸合酶和磷酸甘油脫氫酶的遺傳信息。使用了抗反饋鄰氨基苯甲酸合酶的等位基因。Stauffer化學公司申請的專利EPO149539中揭示了通過在細胞中防止絲氨酸降解來提高色氨酸產量的方法。使用了破壞絲氨酸降解酶(絲氨酸脫氨酶，Serinedeaminase，sda)的大腸桿菌K12突變體來生產氨基酸。德國電化學公司申請的中國專利CN93117586.0，通過有一個去調控的(deregulated)色氨酸代謝和至少一個抗反饋serA等位基因而去調控的絲氨酸代謝的突變體，在相同培養條件下產量提高2.6倍，分批發酵48h最高達到24.1g/L。另外以重組大腸桿菌為宿主菌生產L-色氨酸的授權專利還有CN1085950A，EP0293207，US4371614，US4588687等。各專利保護其新構建的位點，也描述了它們的不同發酵產酸能力，但均未達到文獻Ikeda等報道66g/L的最高水平。
發明內容本發明目的在于克服現有技術中存在的上述問題，提供一種能夠通過基因工程的方法對大腸桿菌的L-色氨酸合成途徑進行改造，得到一株能夠生產L-色氨酸的L-色氨酸生產菌的技術方案。本發明中的L-色氨酸基因工程菌，其分類命名為Ecoh'CGMCC0000，己于2007年5月14日保藏在中國典型培養物保藏中心(其簡稱為CCTCC)，保藏編號CCTCCM207065。所述的L-色氨酸基因工程菌的生產方法，包括以下步驟1)07^7突變菌株的構建，通過膠回收PCR產物，借助電擊轉化(電轉化條件2.5kV，200Q，25yF)將PCR產物轉入大腸桿菌rJL^感受態細胞中，于37。C培養23小時，將菌液涂布在含有阿普拉霉素(50"g/ml)的平板上，能夠長出的轉化子就是敲除Oy^基因的菌株。2)以(△serA)和Jcl2337(CGSCtt6373)作為供體和受體，利用Pl噬菌體轉導方法獲得雙敲除菌株C7C(AserAAtnaA)。3)重組質粒pSUFEBPT的構建，主要包括重組質粒pSU-F的克隆、重組質粒pSU-FE的克隆、重組質粒pSU-FEB的構建、重組質粒pSU-FEBP的構建、重組質粒pSU-FEBPT的構建、重組質粒pSU-FS的構建、重組質粒pSU-FStrpO的構建。4)將獲得的具有多種敲除基因的大腸桿菌宿主菌M"O突變體制成感受態細胞，然后用化學轉化方法或電擊轉化方法將實施例3獲得的多種組合重組表達質粒轉入感受態細胞(具體方法參考分子克隆in)，獲得多株L-色氨酸基因工程菌，初篩得到Aco乃'CGMCC0000。所述的L-色氨酸基因工程菌發酵生產L-色氨酸的方法，包括以下步驟1)挑取一株基因工程菌Acoh'CGMCC0000的單菌落接種于含4mlLB培養基的試管中，37。C過夜，然后按1%的接種量轉接至含200mlLB培養基的1L搖瓶中，37"C培養68小時，隨后按58X的接種量轉接于5L發酵罐(發酵罐的培養基裝量為3L)中進行發酵。2)發酵采用低糖補料的方法，溫度33。C，用濃氨水自動調pH至7.0,控制溶氧在1030%。3)起始設置通氣量為0.06L/L/min，溶氧濃度通過轉速來調整(250700rpm);當轉速達到700rpm時，將通氣量設置為1.0L/L/min;當轉速再次達到最大值時，開始補加葡萄糖(60%)，使罐中的葡萄糖濃度維持在2%左右。4)發酵過程中每隔3小時取樣，測定發酵液中的葡萄糖含量，以控制發酵液中的葡萄糖濃度；同時以HPLC測定其中的L-色氨酸含量，HPLC的測定條件如下HPLC(Agilenttechnologies,1100)，柱子ZORBAXSB-C18(4.6X250mm)，流動相組成1.29%乙酸0.115%三乙胺=39:61，流速是lml/min，檢測波長240nm。5)將得到的發酵液進行過濾，分別收集上清液及濾渣。6)自上清液中蒸餾獲得酒精，自濾渣中提取L-色氨酸。上述的L-色氨酸基因工程菌及其生產L-色氨酸的方法，實用性強、具有終產物積累量高、反應周期短、分離提純容易，其不僅是目前國內第一次提出利用基因工程的方法改造大腸桿菌的L-色氨酸代謝途徑生產L-色氨酸，也是目前國內首次運用發酵法生產L-色氨酸。圖l:為重組質粒pSU-F的示意圖，帶有自身啟動子抗反饋抑制的突變基因aroF克隆入pSU2718獲得。圖2:為重組質粒pSU-FS的示意圖，在圖1的基礎上將帶有自身啟動子的serA基因克隆入pSU2718。圖3:為重組質粒pSUFEBPT的示意圖，其中aroE，aroB，tktA在Ptrc啟動子下串聯表達，PPsA帶有自身啟動子。圖4:為重組質粒pSUFStrpO的示意圖，其中trp0為帶有Ptrc啟動子的色氨酸操縱子，包括trpE，trpD，trpC,trpB，t卬A。圖5:為基因工程菌E.coliCGMCC0000(AtnaAAserA)/pSUFStrpO發酵曲線圖。具體實施例方式以下通過實施例和試驗例對本發明作進一步詳細說明。根據大腸桿菌中L-色氨酸的代謝途徑，本發明首先構建了tnaA和serA雙基因敲除的菌株W3110(AtnaAAserA)，同時構建了含有L-色氨酸代謝途徑中關鍵基因aroF、trpEDCBA、serA等基因的重組表達質粒，以實現L-色氨酸的過表達，然后將重組表達質粒轉入雙基因敲除的菌株W3110(AtnaAAserA)中，獲得L-色氨酸的生產菌株，進一步通過敲除tyrA，pheA，tyrR，trpR等基因構建不同中斷組合優化L-色氨酸代謝流，同時進一步通過過表達aroE，aroB，tktA,ppsA等基因的不同組合來增強L-色氨酸的代謝流，最終尋找最佳的高產菌株而得到E.coliCGMCC0000。實施例1:/^"突變菌株的構建，以^W的敲除為例加以說明參考Gust.B.等的文獻(PCR-targetingsysteminStr印tomycescoelicolor，Gust.B.，KieserT.etal，2002)，利用PCR-Targeting方法進行大腸桿菌基因組中0^4基因的敲除，具體如下以質粒pIJ773GeneticStockCenter)為模板，利用引物tyrA—up和tyrA-down,PCR擴增質粒pIJ773中的aac(Apra)基因，引物序列如下tyrA-U:5，-GGCAGCTGACGGCTCGCGTGGCTTAAGMGTTTATTATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'tyrAD:5'-GGTGCCGGATGATGTGAATCATCCGGCACTGGATTATTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，55°C，45sec，72°C，90sec，30循環。膠回收PCR產物，借助電擊轉化(電轉化條件2.5kV，200Q，25uF)將PCR產物轉入大腸桿菌/^7^感受態細胞中，于37"C培養23小時，將菌液涂布在含有阿普拉霉素(50iig/ml)的平板上，能夠長出的轉化子就是敲除t少7^基因的菌株。將獲得的陽性轉化子以引物tyrA_F—V5，-TATCCGTMCCGATGCCTGC-3，tyrA—R_V5，-GGGAMTCACCCGTTCMTG-3，進行PCR鑒定，PCR條件同上。其它突變體如"7^,p力d的獲得方法同上，可得突變菌株W77。(AserA)和勝7。(ApheA)。實施例2:雙敲或多敲除菌株的獲得分別以(△serA)和Jcl2337(CGSC#6373)作為供體和受體，利用Pl噬菌體轉導方法獲得雙敲除菌株r/C(AserAAtnaA)。Pl噬菌體轉導方法具體如下經過夜培養的(△serA)供體菌液接種至LB液體培養基中，37。C培養12小時至0.D.值約為0.4;取20ul供體菌液，100nlPl噬菌體原液，30u10.5M的CaCl2以及3ml半固體LB培養基(含0.7%瓊脂糖)，在半固體培養基溫度約為5(TC時混合，倒在LB培養基上，待培養基凝固后于37'C培養46小時。待噬菌體充分增殖后，在平皿里面加入4.5mlLB液體培養基，4"C放過夜，將平皿表面的液體移至5mlEP管，加入幾滴氯仿，劇烈來回搖動；離心后，小心地將上清液移至另一試管，加入幾滴氯仿，水相即為lysate。將lysate用生理鹽水(0.85%NaCl)稀釋一倍后置于平皿中，用紫外照射5min。經過夜培養的受體菌株接種于LB液體培養基上，37"C培養23小時；取100UlJcl2337受體菌液，加入450nl50mM的CaCl2和10u1lysate，放置37。C溫育30min，離心除去上清，加入100u1LB和100y11M的檸檬酸鈉，將菌液涂布在含有阿普拉霉素(50ug/ml)和四環素(10"g/ml)的平板上，能夠長出的轉化子就是sez^和to^己經被雙敲除的菌株。其它不同突變株的組合方法同上，可以獲得多突變菌株。實施例3:重組質粒pSUFEBPT的構建1、重組質粒pSU-F的克隆以Acoh'DH5a(Amersham公司)的基因組為模板，利用引物P148L(+)、P148L(-)、aroFSacI(+)和aroFSacI(-)進行重疊PCR，擴增Acoh.DH5a的aroF基因，引物序列如下P148L(+)-5，-ttagatctgaatagcccgcaatacctgggc-3，5P148L(-):5，-gctattcagatctaacgcttccgtcgccagtgg-3，；aroFSacI(+)-5，-aacgagctcaccggaaagtcctcgggcataag-3，-aroFSacI(_):5，-aacgagctccgacttcatcaatttgatcgcgtaa—3，；首先用引物對aroFSacI(+)和P148L(+)擴增出一片段，擴增條件為94°C，2rain，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環;再用引物對aroFSacI(-)和P148L(-)擴增出另一個片段,擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，lmin，72°C，lmin，30循環；膠回收上述兩個PCR片段，再用引物對aroFSacI(+)和aroFSacI(-)擴增出aro,全長基因擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，1.5min，72°C，lmin，30循環。PCR結果中已經將Acoh'DH5a中的az"堪因148位脯氨酸突變成亮氨酸，克隆得到突變的aro/^因，然后將PCR片斷用SacI酶切后克隆至pSU2718質粒(Martinez,E.，B.Bartolome,andRdelaCruz.1988.pACYC184-derivedcloningvectorscontainingthemultiplecloningsiteandlacZareportergeneofpUC8/9andpUC18/19plasmids.Gene68:159-162)，得到重組質粒pSU-F。2、重組質粒pSU-FE的克隆以￡coh'DH5a的基因組為模板，利用引物aroE(Nco)和aroE(Bam)，PCR擴增￡co力'DH5a的基因，引物序列如下axoE(Nco):5，-catgccatggaaacctatgctgtttttg-3，；aroE(Bam)-5，-cgggatcctcacgcggacaattcctcctg-3，？擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環。擴增得到的基因用NcoI和BamHI酶切后，克隆至質粒pTrc99a(Pharmacia公司)，得到重組質粒pTrc-aroE;以質粒pTrc-aroE為模板，利用引物aroE(BglII)和aroE(Bam)，PCR擴增質粒pTrc-aroE中的arof基因，引物序列如下axoE(BglII)-5，-gaagatctcgacatcataacggttctggc-3，；aroE(Bam)-5，-cgggatcctcacgcggacaattcctcctg-3，；擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環。擴增得到的基因再以BglII和BamHI酶切克隆至載體質粒pSU-F，得到重組質粒pSU-FE。3、重組質粒pSU-FEB的構建以f.coh'DH5a的基因組為模板，利用引物aroB(Nco)和aroB(SacI)，PCR擴增￡"7/DH5a的<37"5基因，引物序列如下aroB(Nco)-5，-catgccatggatggagaggattgtcg-3，；aroB(SalI)-5，-gcgtcgacttacgctgattgacaatc-3，；擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，lmin，30循環。擴增得到的aro萬基因以NcoI和SalI酶切后克隆至質粒pET28(b)(Novagen公司)，得到重組質粒pET-aroB，再使用XbalI和SalI酶切重組質粒pET-aroB，將切下的aro萬基因克隆至pSU-FE，得到重組質粒pSU-FEB。4、重組質粒pSU-FEBP的構建以Ecoh'DH5a的基因組為模板，利用引物ppsa-3和ppsa-4，PCR擴增Acoh'DH5ci的/7p&4基因，引物序列如下ppsa-3s5，-cgg33ttc3肪cgcac3g3agcgt3gaacg-3，5ppsa-4:5'-cgggatcccataaccccggcgactaaacgc-3'擴增條《牛為94。C，2min，94°C，45sec,57°C，45sec,72°C，2.5min，30循環。將重組質粒pSU-FEB用HindIII酶切后補平，然后將擴增得到的pps力基因的平端連接至pSU-FEB，得到重組質粒pSU-FEBP。5、重組質粒pSU-FEBPT的構建以大腸桿菌K12的基因組為模板，利用引物tktA(Nde)和tktA(BamHI)，PCR擴增大腸桿菌K12的A"基因，引物序列如下tktAF(Nde):5，-ggaattccatatgtcctcacgtaaagagcttg-3，；tktAR(BamHI):5，-cgggatccttacagcagttcttttgctttcg-3，；擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，56°C，45sec，72°C，2min，30循環。擴增得到的AM基因以NdeI和BamHI酶切后克隆至pET-24(a)(Novagen公司)中，得到質粒pET-tktA。以質粒pET-tktA為模板，使用引物tktA(I)和tktA(II)，PCR擴增重組質粒pET-tktA中的AM基因連同pET24(a)中的RBS位點，引物序列如下tktA(I)-5，-catgcatgctctcagtggtggtggtggtg-3，；tktA(II):5，-catgcatgcttacagcagttcttttgctttcg-3，，擴增條件為94°C，2min，94°C，45sec，60。C，45sec，72°C，2min，30循環。擴增產物以SphI酶切后克隆至質粒pSU-FEBP，得到重組質粒pSUFEBPT，其結構如圖6所示，其中pnaroF表示帶有自身啟動子的aro,基因，ptrcaroE表示帶有trc啟動子的arof基因，p叩psa表示帶有自身啟動子的//7^基因。6、重組質粒pSU-FS的構建以W3110基因組為模板，PCR擴增sez^(含天然啟動子)，兩端加HindIII位點，PCR片段(1.64k)克隆到pSUF重組質粒的HindIII為點，酶切鑒定，因無序列如下serA+Pnative-F:5'-GACATGTGTCAAGCTTTTACCAGG-3'serA+Pnative-R:5，-GCTTCGGTGMAGCTTTACCG-3，擴增條件為:94°C，2min，94°C，45sec，60。C，45sec，72°C，2min，30循環。7、重組質粒pSU-FStrpO的構建以CGSCtf7692W3110trpEFBR719的基因組為模板，PCR擴增6.58k的片斷，兩端加EcoRI，BamHI酶切位點，TA克隆到pMD18-T，得重組質粒pMDtrpoperon，測序，驗證后，EcoRI,BamHI雙酶切，回收6.58k片段；pTrc99a(Amp"用EcoRI，BamHI雙酶切回收4.17k片段，與trpoperon連接，轉化DH5a，挑陽性克隆，用EcoRI，BamHI雙酶切驗證重組質粒pTrctrp0(10.75k);以pTrctrp0為模版PCR擴增帶Ptrc的trpoperon(約7k)，引物兩端分別加Xmal和Smal酶切位點，TA克隆，測序，酶切回收目的片段(7k),克隆入pSUFS的重組質粒pSUFSt卬O(12.3k)。引物序列如下Trp-Op-F:5，-GAGMTTCCMTGCAMCACAMMC-3，Trp-Op-R:5'-TGGATCCAGAAAGTTAAAATGCCG-3'Trc-0p-F:5，-aacccgggcggttctggcaaatattc_3，Trc-Op-R:5，一caggccccgggtgaaaatcttctc-3，實施例4:L-色氨酸重組表達菌株的獲得將實施例1和2獲得的多種敲除基因的大腸桿菌宿主菌07"突變體制成感受態細胞，然后用化學轉化方法或電擊轉化方法將實施例3獲得的多種組合重組表達質粒轉入感受態細胞(具體方法參考分子克隆m)，獲得多株L-色氨酸發酵生產基因工程菌，初篩得到Acoh'CGMCCOOOO。實施例5:L-色氨酸基因工程菌發酵生產L-色氨酸挑取一株基因工程菌Kco力'CGMCCOOOO的單菌落接種于含4mlLB培養基的試管中，37'C過夜，然后按l^的接種量轉接至含200mlLB培養基的lL搖瓶中，37i:培養68小時，隨后按58X的接種量轉接于5L發酵罐(發酵罐的培養基裝量為3L)中進行發酵。發酵采用低糖補料的方法，溫度33t，用濃氨水自動調pH至7.0，控制溶氧在1030%。采用三階段發酵起始設置通氣量為0.06L/L/min，溶氧濃度通過轉速來調整(250700rpm);當轉速達到700rpm時，進入第二階段，將通氣量設置為1.0L/L/min;當轉速再次達到最大值時，進入第三階段，開始補加葡萄糖(60%)，使罐中的葡萄糖濃度維持在2%左右。發酵過程中每隔3小時取樣，參考周雅璇等的方法(周雅璇等，酶法測定酒中葡萄糖含量，中國衛生檢驗雜志，2005，15(2)，194-221)測定發酵液中的葡萄糖含量，以控制發酵液中的葡萄糖濃度；同時以HPLC測定其中的L-色氨酸含量，HPLC的測定條件如下HPLC(Agilenttechnologies,1100)，柱子ZORBAXSB-C18(4.6X250mm)，流動相組成1.29%乙酸0.115%三乙胺=39:61，流速是lml/min，檢測波長240nm。10g/L5g/L10g/L7發酵培養基:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>LB培養基-蛋白胨(OXOID):酵母提取物(OXOID):氯化鈉PH:種子罐培養基MgS040.3檸檬酸鈉1(NH4)2S041.5FeS040.075MnS040.0016Na2S040.05ZnS040.003CoCl20.0004CuS040.002發酵結果如圖5所示。發明所構建的L-色氨酸基因工程菌A"h'CGMCCOOOO在5L發酵罐發酵24h，積累L-色氨酸達到llg/L。綜上所述，本發明所構建的L-色氨酸基因工程菌ACGMCC0000能夠實現發酵過程中發酵液中L-色氨酸的有效積累，從而為L-色氨酸生產的產業化奠定了基礎。權利要求1.L-色氨酸基因工程菌，其分類命名為E.coliCGMCC0000，保藏編號CCTCCM207065。2.L-色氨酸基因工程菌的生產方法，包括以下步驟1)^^^突變菌株的構建，通過膠回收PCR產物，借助電擊轉化(電轉化條件2.5kV,200Q，25uF)將PCR產物轉入大腸桿菌ML^感受態細胞中，于37。C培養23小時，將菌液涂布在含有阿普拉霉素(50ug/ml)的平板上，能夠長出的轉化子就是敲除tj^力基因的菌株。2)以(△serA)和Jcl2337(CGSC#6373)作為供體和受體，利用Pl噬菌體轉導方法獲得雙敲除菌株C/C(AserAAtnaA)。3)重組質粒pSUFEBPT的構建，主要包括重組質粒pSU-F的克隆、重組質粒pSU-FE的克隆、重組質粒pSU-FEB的構建、重組質粒pSU-FEBP的構建、重組質粒pSU-FEBPT的構建、重組質粒pSU-FS的構建、重組質粒pSU-FStrp0的構建。4)將獲得的具有多種敲除基因的大腸桿菌宿主菌MWO突變體制成感受態細胞，然后用化學轉化方法或電擊轉化方法將實施例3獲得的多種組合重組表達質粒轉入感受態細胞(具體方法參考分子克隆III)，獲得多株L-色氨酸基因工程菌，初篩得到Aco力'CGMCC0000。3.L-色氨酸基因工程菌發酵生產L-色氨酸的方法，包括以下步驟1)挑取一株基因工程菌Aco7iCGMCC0000的單菌落接種于含4mlLB培養基的試管中，37'C過夜，然后按1%的接種量轉接至含200mlLB培養基的1L搖瓶中，37"培養68小時，隨后按58M的接種量轉接于5L發酵罐(發酵罐的培養基裝量為3L)中進行發酵。2)發酵采用低糖補料的方法，溫度33。C，用濃氨水自動調pH至7.0，控制溶氧在1030%。3)起始設置通氣量為0.06L/L/min，溶氧濃度通過轉速來調整(250700rpm);當轉速達到700rpm時，將通氣量設置為1.0L/L/min;當轉速再次達2到最大值時，開始補加葡萄糖(60%)，使罐中的葡萄糖濃度維持在2%左右。4)發酵過程中每隔3小時取樣，測定發酵液中的葡萄糖含量，以控制發酵液中的葡萄糖濃度；同時以HPLC測定其中的L-色氨酸含量，HPLC的測定條件如下:HPLC(Agilenttechnologies,1100)，柱子Z0RBAXSB-C18(4.6X250腿)，流動相組成1.29%乙酸0.115%三乙胺=39:61，流速是lml/min，檢測波長240nm。5)將得到的發酵液進行過濾，分別收集上清液及濾渣。6)自上清液中蒸餾獲得酒精，自濾渣中提取L-色氨酸。全文摘要公開了一種L-色氨酸基因工程菌，保藏編號CCTCCM207065以及用該基因工程菌生產L-色氨酸的方法，包括以下步驟1.將L-色氨酸基因工程菌接種于含4mlLB培養基的試管中，37℃過夜，然后按1％的接種量轉接至含200mlLB培養基的1L搖瓶中，37℃培養6～8小時，隨后按5～8％的接種量轉接于5L發酵罐中進行發酵；2.采用低糖補料的方法處理；3.分三步進行發酵；4.發酵過程中通過取樣，控制發酵液中的葡萄糖含量；5.對得到的發酵液進行過濾、提取L-色氨酸。上述的L-色氨酸基因工程菌及其生產L-色氨酸的方法，實用性強、具有終產物積累量高、反應周期短、分離提純容易。文檔編號C12R1/19GK101307301SQ20071006857公開日2008年11月19日申請日期2007年5月17日優先權日2007年5月17日發明者潔于,儲消和,宏肖,范文超申請人:浙江升華拜克生物股份有限公司;中國科學院上海生命科學研究院湖州工業生物技術中心