溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法

專利名稱：溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法。
背景技術：
葡萄球菌(Staphylococcus)是革蘭氏陽性球菌的一種，廣泛分布于自然界，如空氣、水、土壤、飼料和一些物品上，也存在于人和動物的體表、鼻咽部及腸道，絕大多數不致病，少數可引起人和動物致病，其中金黃色葡萄球菌致病力最強，常引起皮膚、組織及器官的化膿性炎癥，是燒傷創面感染、急性肝功能衰竭和血源性腎炎等疾病的主要病源菌。金黃色葡萄球菌還和G-膿毒病菌同時發生，協同作用，嚴重威脅患者的生命。金黃色葡萄球菌產生的腸毒素還可污染食物而導致食物中毒。醫院的醫師和護士中鼻腔帶菌達到80～100％，而且常為耐藥菌株，是醫院感染的重要因素。
1940年，青霉素G的發現和使用有效的控制了金黃色葡萄球菌的感染，90％的金葡菌對青霉素敏感。1944年，英國發現了耐青霉素的金葡菌。隨著β-類酰胺類抗生素在臨床的廣泛使用，耐藥菌比例不斷增加。耐藥菌通過產生β-類酰胺酶分解抗生素表現出耐藥性。1960年，甲氧西林研制成功，因其對青霉素酶穩定而在臨床上對耐青霉素金葡菌表現出良好的治療效果。但隨著新型抗生素的使用，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)比例不斷增加，目前金黃色葡萄球菌占所有革蘭氏陽性球菌感染的第一位。金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌占75％。
萬古霉素是治療MRSA的首選藥物，然而1997年日本就分離出第一株對萬古霉素中度耐藥的金黃色葡萄球菌，萬古霉素對其最小抑菌濃度為8mg/L。2002年，美國首次報道了萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌，萬古霉素對其最小抑菌濃度為32mg/L。萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的出現使細菌感染再次成為非常棘手的臨床問題，2003年美國CDC制定了“VRSA/VISA檢測和控制指南”，2005年NCCLS藥敏試驗執行標準中增加了萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌檢測方法，要求各實驗室開展對萬古霉素耐藥菌的監測。
面對金葡菌對傳統抗菌藥物耐藥狀況日益嚴重的情況，開發新型抗菌制劑顯得尤為迫切。溶葡萄球菌酶作為葡萄球菌細胞壁裂解酶引起了人們的重視。1964年，Schindler和Schuhardt首次從一株編號為NRRL B-2628的模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)培養物中發現并分離了溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)。該酶為246個氨基酸組成的單鏈分子，分子量27kDa，鋅為必須的輔助因子。氨基酸組成中缺少半胱氨酸，堿性氨基酸的比例較高，等電點在10.4～11.4之間。溶葡萄球菌酶能特異性地水解細菌細胞壁肽聚糖交聯結構甘氨酸五肽橋聯中第二位和第三位甘氨酸形成的肽鍵，因此具有破壁溶菌作用。由于甘氨酸五肽橋聯結構僅大量存在于葡萄球菌細胞壁，其中又以金葡菌細胞壁分布最廣，因此溶葡萄球菌酶主要對葡萄球菌尤其是金葡菌具有溶菌殺菌作用。
早期獲得溶葡萄球菌酶的主要手段是從模仿葡萄球菌培養物中分離提取((Schindler C.A.et al(1965)″Purification and properties of lysostaphina lyticagent for the Staphylococcus aureus.″Biochem.Biophys.Acta.97242-250；IversonO.J.et al(1973)″Studies on lysostaphin，separation and characterization of threeenzymes.″Eur.J.Biochem.38293-300；Valisena S.，F.E.et al(1982)″Purificationand Characterization of three separate bacteriolytic enzymes excreted by S.aureus，S.simulans and S.saprophyticus.″J.Bact.151636-647；Sugai M.，T.et al(1990)″Rapid purification of lysostaphin for analysis of cell-wall proteins.″J.Microb.Meth.12133-138；Marova I.et al(1993)″Modified simplified method for isolation oflysostaphin from the culture filtrate of Staphylococus staphylolyticus.″FoliaMicrobiol.38245-252)，產物純度不高而且不均一，容易被熱源和過敏原污染。基因工程和蛋白質分離純化技術的發展為大量制備高純度的溶葡萄球菌酶開辟了新的途徑。1987年，Heath，L.S.等表達了溶葡萄球菌酶基因(″Cloning of thelysostaphin gene of S.simulans biovar staphylolyticus.″Abstr.Ann.Meet.Am.Soc.Microb.H58p 149；″Plasmid encoded lysostaphin endopeptidase gene of S.simulansbiovar staphylolyticus.″FEMS Microb.Lett.44129-133)，Recsei P.A.等克隆了完整基因(″Cloning，sequence，and expression of the lysostaphin gene fromStaphylococcus simulans.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841127-1131，1987)，Heinrich P.，R.等(″The molecular organization of the lysostaphin gene and itssequences repeated in tandem.″Mol.Gen.Genet.209563-569，1987)和美國專利U.S.Pat.No.4,931,390報道和公開了完整的基因序列。目前溶葡萄球菌酶已經實現了在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌等多種工程菌中的重組表達。重組產品的產量和純度均有很大的提高，其理化性質、酶活性等和天然酶沒有本質區別，為臨床應用奠定了基礎。
Dajes等動物試驗研究表明重組溶葡萄球菌酶的局部有效治療劑量眼部0.28％，Kokai-kun等鼻腔使用劑量0.5％，Patron等對動物全身給藥的劑量為5mg/kg，每日3次，因此有效的溶葡萄球菌酶治療劑量是很高的，因此構建高效表達菌株，開發大規模的工業化制備技術對此酶的臨床應用十分重要。
1990年印度生物技術國際有限公司申請了國際專利WO01/29201“Expression of recombinant mature lysostaphin”，該方法直接表達溶葡萄球菌酶成熟肽基因，表達產物在細胞內以可溶形式表達，表達量為20.2％，蛋白回收率8.9mg/L。中國專利CN190290A公開了一種大腸桿菌高效外分泌表達溶葡萄球菌酶的方法，該方法用3升培養液經過分離純化得到溶葡萄球菌酶83mg，回收率27.7mg/L。以上專利的方法生產溶葡萄球菌酶都存在表達量低，收率低的問題。
另外，溶葡萄球菌酶作為異源蛋白質，在機體內的主要不良反應是產生免疫反應，引起過敏反應。動物藥代動力學研究表明該酶進入體內1小時95％的酶已經降解。聚乙二醇(PEG)修飾技術的應用使聚乙二醇(PEG)的許多優良特性轉移到修飾蛋白中去。當聚乙二醇(PEG)偶聯到蛋白質分子表面時，可減少蛋白質藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使蛋白質藥物不易被免疫系統的細胞識別。PEG類修飾劑的藥物動力學性質也發生很大改變，半衰期延長。2003年Walsh等報道了溶葡萄球菌酶的PEG修飾，采用了分支PEG，PEG化溶葡萄球菌酶半衰期延長到24小時。該方法的主要問題是分支PEG成本很高，不適合產業化的要求。
現有技術表達溶葡萄球菌酶產量無法滿足大規模制備的要求，PEG修飾的成本很高，因此有必要開發適合大量制備溶葡萄球菌酶的方法及低成本的修飾技術。

發明內容
本發明的目的在于提供一種表達量高，收率高，適合大規模制備的溶葡萄球菌酶的制備方法。
本發明的另外一個目的在于提供一種低成本的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶。
本發明還有一個目的是提供上述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法。
為了實現上述的第一個目的，本發明采用的溶葡萄球菌酶的制備方法，包括以下的步驟(1)、溶葡萄球菌酶基因的獲得；(2)、表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌將溶葡萄球菌酶基因片段插入到表達載體質粒的酶切位點，然后直接轉化大腸桿菌宿主菌，其中所述的表達載體質粒是pET系列載體質粒；(3)、陽性克隆的篩選、培養、誘導表達篩選出陽性克隆在培養基上進行培養，經誘導使目標蛋白表達；(4)、表達產物的分離、純化首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經離心得到破菌液上清，然后對破菌液上清用層析技術純化。
上述的溶葡萄球菌酶cDNA序列是已知的，編碼一個全長246個氨基酸的蛋白質。溶葡萄球菌酶的編碼序列可以來源于基因文庫，或根據文獻報道的溶葡萄球菌酶cDNA序列全基因合成，還可以設計引物，通過PCR擴增獲得。
作為優選，上述的溶葡萄球菌酶基因序列如SEQ ID NO.1所述。這里是根據大腸桿菌高效表達的需要優化設計溶葡萄球菌酶基因序列。
作為優選，上述的pET系列載體質粒是pET-11b、pET-22b、pET-15b、pET-19b、pET-30a-c和pET-32a-c中的一種或多種。
作為優選，上的步驟(2)酶切位點是Nde I/BamH I或Nco I/BamH I位點。
作為優選，上的步驟(3)中陽性克隆篩選是用氨芐青霉素做抗性篩選。
作為優選，上述的步驟(3)中培養的溫度控制在28℃～40℃。再優選的培養的溫度控制在30℃～35℃。
作為優選，上述的步驟(3)中誘導表達使用濃度為0.1～1.5mmol/L的IPTG作為誘導劑。再優選的誘導表達使用濃度為0.4～1.0mmol/L。
作為優選，上述的步驟(3)中誘導的溫度控制在20℃～40℃。再優選的培養的溫度控制在25℃～30℃。
作為優選，上述的步驟(4)中層析技術是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法。
為了實現上述的第二個目的，本發明的聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶由溶葡萄球菌酶與聚乙二醇采用單點或多點修飾構成。
作為優選，上述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇。作為再優選，上述的單甲氧基聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。作為最優選，上述的單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇醛。
作為優選，上述的聚乙二醇的分子量為5kDa～100kDa。再優選的分子量為5kDa～40kDa。最優選的分子量為20kDa～40kDa。
為了實現上述的第三個目的，本發明的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，包括了上述實現第一個目的的溶葡萄球菌酶的制備步驟和純化后的溶葡萄球菌酶聚乙二醇修飾步驟。
上述的聚乙二醇修飾反應的條件為配制修飾反應緩沖液，離子強度為5～500mmol/L，pH值為4～8；時間8～24小時，反應溫度4～25℃。
作為優選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發生共價結合反應的重量比例為0.5～20。再優選的重量比例為2～10。
作為優選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發生共價結合反應的緩沖液的pH值為3～8。再優選的pH值為5～7。
作為優選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發生共價結合反應的溫度為4℃～37℃。再優選的溫度為4℃～25℃。
作為優選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發生共價結合反應的時間為4～48小時。再優選的時間為16～24小時。
本發明的溶葡萄球菌酶的制備方法，其表達方案簡單，表達量高，達到30％以上，純化工藝簡單，收率高，表達產物可溶，不需要復性，直接用層析方法進行純化，純化收率大大提高，純化收率達到1～3g/L，適合大規模制備。
本發明聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶由溶葡萄球菌酶與聚乙二醇采用單點或多點修飾構成，聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶免疫原性降低，半衰期延長，適合臨床應用于葡萄球菌感染的治療，且修飾的成本低。


圖1目標蛋白的表達分析M蛋白分子量，從上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd；1～3誘導菌體全蛋白；4未誘導菌體。
圖2陽離子交換層析圖譜。
圖3疏水層析圖譜。
圖4純化產物的電泳分析1～3純化中間體；4純化Lysostaphin；M蛋白分子量，從上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd。
圖5純化產物的RP-HPLC分析結果。
圖6聚乙二醇修飾的Lysostaphin電泳分析1～3未修飾的Lysostaphin；4聚乙二醇化Lysostaphin；
M蛋白分子量，從上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd。
具體實施例方式
實施例1溶葡萄球菌酶基因的合成、克隆和表達表達載體采用pET-22b(Invitrogen)，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
根據Genebank公布的Staphylococcus simulans的Lysostaphin基因序列(AX828346)及專利WO03074689的溶葡萄球菌酶基因序列，根據大腸桿菌高效表達的需要優化設計溶葡萄球菌酶基因序列，見SEQ ID NO.1，基因編碼產物的氨基酸序列見SEQ ID NO.2。合成20段互補的寡核苷酸，并在5’端和3’端分別引如酶切位點Nde I、BamH I，按分子克隆的常規方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾混合，94℃變性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4連接酶，16℃連接過夜。取連接產物用下述引物進行擴增引物15‘--TATACATATGGCTGCAACACATGAACA引物23‘-TCTGGATCCTCAGTTACTTTATAGTTCCCCAAA擴增條件95℃、30s；55℃、30s；70℃、60s，循環次數30次。最后70℃保溫延伸10min。用Nde I和BamH I消化所述的溶葡萄球菌酶的PCR產物。
pET-22b質粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與合成的溶葡萄球菌酶基因片段連接，20μL反應體系基因片段與載體大片段的比例為10∶1，加T4 DNA連接酶300單位，15℃連接過夜，取10μL連接產物直接轉化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)感受態細胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養過夜，獲得工程菌經進一步篩選。氨芐青霉素做抗性篩選，得到陽性克隆。提取質粒，用限制性內切酶進行鑒定。陽性轉化子用通用引物進行序列分析，結果克隆序列與設計序列完全一致。
接種陽性克隆進行培養，經1mmol/L的IPTG誘導，結果見圖1。
實施例2、不同培養條件對表達的影響采用培養基(0.5％Yeast Extract，1.0％Peptone，0.5％NaCl，0.05mg/L Amp，pH7.4)研究了不同溫度條件誘導對產物表達狀態的影響。接種量5％(種子液體積占培養基體積的比例)，誘導前培養溫度37℃，采用IPTG誘導，劑量1mmol/L。培養后4個溫度進行誘導，結果見下表。

總結加誘導劑后25℃培養4小時，表達量可以達到30％，而且目標蛋白主要表達在破菌上清中，如果延長表達時間，如表達8小時，則目標蛋白超過80％在破菌后的沉淀中，因此優選的條件是37℃培養后，25℃誘導表達4小時，目標蛋白主要在破菌后上清中，有利于分離純化。
實施例3表達產物的分離、純化用菌體破碎緩沖液(40mM Tris-Cl，02M NaCl，0.5mM EDTA，pH8.0)按照20ml/g的比例懸浮濕菌體。超聲波法破碎菌體(220V，20khz，900W，冰水浴條件下超聲破碎)。
將破菌液用高速離心進行離心(10000g，30min，4℃)，去掉沉淀，收集上清。收集到的破菌上清液用離子交換層析法分離純化，其過程為用pH值為8.5的20mmol/L Tris.CL緩沖液稀釋，使其電導率小于5mS/cm。用同樣的緩沖液平衡層析柱(50mm×10cm)，層析凝膠可選用CM-Sepharose Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow、Mono-S(Amersham Pharmacia)。上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用緩沖液(0.01～0.5mol/L NaCL，20mM Tris-Cl，pH8.0)進行梯度洗脫，當NaCL濃度達到30％時出現目標蛋白，收集目標蛋白峰，層析圖譜見圖2。洗脫出來的蛋白樣品純度在85-90％。將離子交換目標蛋白峰補加(NH4)2SO4使終濃度為0.6～0.8mol/L，疏水層析柱(XK26/20)用緩沖體系A(20mM Tris-Cl，pH8.5，0.6M(NH4)2SO4)平衡，疏水凝膠可選用Phenyl-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose High Perforance及Butyl-Sepharose Fast Flow，流速10ml/min，上樣后用緩沖液B(20mM Tris-Cl；pH8.5)通過降低鹽濃度梯度洗拖，收集目標蛋白峰，疏水層析圖譜見圖3。目標蛋白電泳純度95％，分析結果見圖4。
得到的疏水層析峰經Sephadex G-25脫鹽，平衡液為20mmol/L PB，pH7.4。樣品脫鹽后即為精細純化的溶葡萄球菌酶。
實施例4純化產物的酶活性分析酶活性分析采用比濁法，參照Piotr Szweda等的方法(Cloning，Expression，and Purification of the Staphylococcus simulans Lysostaphin Using theIntein-Chitin-Binding Domain(CBD)System(Protein)，受試菌為金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus。活化的金黃色葡萄球菌在LB培養基中37℃培養至OD620nm為0.25，加入適量純化溶葡萄球菌酶(10μL，約1μg)，37℃保溫10min后測定OD620nm的吸收值。酶活性單位定義為pH7.5條件下37℃保溫10min，將6ml金黃色葡萄球菌懸液OD620nm為0.25降至0.125所需的酶量為1個的單位。本發明的溶葡萄球菌酶比活性達到412U/mg。
實施例5純化產物的純度分析純化溶葡萄球菌酶的純度采用RP-HPLC方法進一步進行分析，分析柱為Alltech公司Vydac 214TP5415，150mm×4.6mm，5μm，流動相A0.1％TFA，ACN-H2O(5∶95)；流動相B0.1％TFA，ACN-H2O(95∶5)，流速0.8ml/min，檢測波長214nm，分析方法見下表

樣品純度達到99％，分析結果見圖5。
實施例6溶葡萄球菌酶的聚乙二醇修飾將純化的溶葡萄球菌酶(LSS)溶于pH8.0、100mM的磷酸鹽緩沖液中，按溶葡萄球菌酶單甲氧基聚乙二醇醛＝1∶5(w/w)的比例加入溶解后，加入NaCNBH3使其終濃度為8mM，冰箱2～8℃反應16～24小時。修飾反應結束后采用分子篩柱(Sephacryl-200)去除未修飾的LSS以及游離的聚乙二醇。以pH8.0、20mM PB為洗脫液，流速5ml/min，收集第一個蛋白峰為修飾蛋白峰，電泳分析結果見圖6。
序列表<110>杭州北斗生物技術有限公司<120>一種溶葡萄球菌酶及其衍生物的制備方法<160>2<210>1<211>757<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(741)<220>
<221>misc_feature<223>Lysostaphin編碼序列<400>1ATGGCTGCAA CACATGAACA TTCAGCACAA TGGTTGAATA ATTACAAAAA50AGGATATGGT TACGGTCCTT ATCCATTAGG TATAAATGGC GGTATGCACT 100ACGGAGTTGA TTTTTTTATG AATATTGGAA CACCAGTAAA AGCTATTTCA 150AGCGGAAAAA TAGTTGAAGC TGGTTGGAGT AATTACGGAG GAGGTAATCA 200AATAGGTCTT ATTGAAAATG ATGGAGTGCA TAGACAATGG TATATGCATC 250TAAGTAAATA TAATGTTAAA GTAGGAGATT ATGTCAAAGC TGGTCAAATA 300ATCGGTTGGT CTGGAAGCAC TGGTTATTCT ACAGCACCAC ATTTACACTT 350CCAAAGAATG GTTAATTCAT TTTCAAATTC AACTGCCCAA GATCCAATGC 400CTTTCTTAAA GAGCGCAGGA TATGGAAAAG CAGGTGGTAC AGTAACTCCA 450ACGCCGAATA CAGGTTGGAA AACAAACAAA TATGGCACAC TATATAAATC 500AGAGTCAGCT AGCTTCACAC CTAATACAGA TATAATAACA AGAACGACTG 550GTCCATTTAG AAGCATGCCG CAGTCAGGAG TCTTAAAAGC AGGTCAAACA 600ATTCATTATG ATGAAGTGAT GAAACAAGAC GGTCATGTTT GGGTAGGTTA 650TACAGGTAAC AGTGGCCAAC GTATTTACTT GCCTGTAAGA ACATGGAATA 700AATCTACTAA TACTTTAGGT GTTCTTTGGG GAACTATAAA GTAACTGAGG 750ATCCAGA 757
<210>2<211>247<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia Coli)<400>2Met Ala Ala The His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys Gly Tyr Gly1 5 10 15 20Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met25 30 35 40Asn Ile Gly The Pro Val Lys Ala Ile Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser45 50 55 60Asn Tyr Gly Gly Gly Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp65 70 75 80Tyr Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gln Ile85 90 95 100Ile Gly Trp Ser Gly Ser The Gly Tyr Ser The Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met105 110 115 120Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser The Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly125 130 135 140Tyr Gly Lys Ala Gly Gly The Val The Pro The Pro Asn The Gly Trp Lys The Asn Lys145 150 155 160Tyr Gly The Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe The Pro Asn The Asp Ile Ile The165 170 175 180Arg The The Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln The185 190 195 200Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr The Gly Asn205 210 215 220Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg The Trp Asn Lys Ser The Asn The Leu Gly225 230 235 240Val Leu Trp Gly The Ile Lys24權利要求
1.溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于包括以下的步驟(1)、溶葡萄球菌酶基因的設計與合成；(2)、表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌將溶葡萄球菌酶基因片段插入到表達載體質粒的酶切位點，然后直接轉化大腸桿菌宿主菌，其中所述的表達載體質粒是pET系列載體質粒；(3)、陽性克隆的篩選、培養、誘導表達篩選出陽性克隆在培養基上進行培養，經誘導使目標蛋白表達；(4)、表達產物的分離、純化將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經離心得到破菌液上清，然后對破菌液上清用層析技術純化。
2.根據權利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于溶葡萄球菌酶基因的獲得是通過全基因合成或通過設計引物，再PCR獲得。
3.根據權利要求2所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于溶葡萄球菌酶基因序列如SEQ ID NO.1所述。
4.根據權利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于pET系列載體質粒是pET-11b、pET-22b、pET-15b、pET-19b、pET-30a-c和pET-32a-c中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中培養的溫度控制在28℃～40℃。
6.根據權利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中誘導溫度控制在20℃-37℃。
7.根據權利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于步驟(4)中層析技術是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法。
8.聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶，其特征在于由溶葡萄球菌酶與聚乙二醇采用單點或多點修飾構成。
9.根據權利要求8所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶，其特征在于所述的聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯和單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。
10.根據權利要求8或9所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶，其特征在于聚乙二醇的分子量為5kDa～100kDa。
11.根據權利要求8所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于包括如權利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備步驟和純化后的溶葡萄球菌酶聚乙二醇修飾步驟。
12.根據權利要求11所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發生共價結合反應的重量比例為0.5～20。
13.根據權利要求11或12所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發生共價結合反應的緩沖液的pH值為4～8，反應的溫度為2℃～37℃，反應的時間為4～48小時。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法。溶葡萄球菌酶的制備方法主要包括設計并合成優化的溶葡萄球菌酶基因，構建表達載體后轉化大腸桿菌工程菌，篩選高表達菌株，發酵培養工程菌，表達產物分離純化。其中所述的表達載體質粒是pET系列載體質粒。本發明的方法，表達方案簡單，表達量高，純化工藝簡單，收率高，表達產物可溶，不需要復性，直接用層析方法進行純化，純化收率大大提高，適合大規模制備。本發明公開的溶葡萄球菌酶衍生物由PEG修飾后免疫原性降低，半衰期延長，適合臨床應用于葡萄球菌感染的治療。
文檔編號C12N15/56GK101092618SQ20071006872
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月22日 優先權日2007年5月22日
發明者劉國安, 劉沐榮, 康經武 申請人:杭州北斗生物技術有限公司