西尼羅病毒的引物和探針及一步法實時rt-pcr檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：：西尼羅病毒的引物和探針及一步法實時rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明專利屬于生物
技術領域：
，涉及科研、臨床和病毒流行病學監測等工作中使用RT-PCR方法對西尼羅病毒RNA的檢測和定量分析。具體是針對西尼羅病毒的弓1物和探針及一步法實時RT-PCR抬二測試劑盒。
背景技術：
：西尼羅病毒與人類疾病西尼羅病毒(WestNileVirus,麗V)病是一種烈4認畜共患疾病，1937年在烏干達北部尼羅河地區首K現而得名。近年來西尼羅病毒感染在歐洲、中東、西亞和俄羅斯等地區和國家頻頻發生，成為近年來影響美國最大的傳染病。西尼羅病毒是經庫蚊等嗜鳥蚊傳播，以鳥類為主要動物宿主的黃病毒。人、馬和其他哺乳動物在被西尼羅病毒感染的蚊蟲叮咬后而發病，輕者出ltt熱、頭痛等流感樣癥狀(西尼羅熱)，重者可表現為中樞神經系統癥狀(西尼羅腦ii),甚至死亡。西尼羅病毒的檢測西尼羅病毒的檢測方法主要有以下幾種病毒分離與鑒定、血清中和^C^險(Serumneutralizationtest,SNT)、SH統疫吸附4全觀'J(Enzyme-linkedimmunosorbentassays,ELISA)、PCR檢測等。病毒分離是病毒I"生腦炎M^出、最重要的診斷手段。對于新發疾病病例，病毒分離是最有價值的工作，但西尼羅病4^離需在生物安全4級(P4)^^牛下進行。血清中和^r瞼(Serumneutralizationtest,SNT)和酶聯免疫吸附檢測(Enzyme—1inkedimmunosorbentassays,ELISA)均為免疫學才全觀'J方法，每丈感'f生高，但特異性4支差，并存在一定的交XMl。制備單克隆抗體可以增加特異性，但成本較高。PCR抬r測具有快速、準確的特點，也被廣泛用于對西尼羅病毒的檢測。目前已經建立的PCR檢測方法有l)SonjaLinke等Z//7h,《i577ei^r"《yV/ecWg《"s/,""e"/o"oT胎WW/eK/r〃5"http:///e柳5"/脂d26/res/-/7/"e尸化/.^M7人jWr側e/."。7H"i7針對5，非編碼區(UTR)的實時PCR(Taqman熒光i笨針)-險測方法，檢測靈壽幻復能達106-10—^lasmidcopies/assay,該方法適合西尼羅病毒的診斷和^^亍病學研究。2)Jim6nez—ClaveroMA等//歷e^7ez—67szero#ijgzi'erov^Wc7'0《e/1爿/7won^e//cresH/,771—/0<35^/尸orcfefe"/(9/of///7e塔e7//加5gei7Wr〃51^./「"，"/sg/2.T/ji^"《7《C4分-M用TaqManMGB探針對西尼羅病毒進行了實時RT-PCR檢測，壽l感性可達10—2~10—3pf'u/tube。實時PCR(Real-timePCR)4支術實時PCR技術是近年來J^yte來的一種新型的PCR技術，它是在傳統PCR反應體系的勤出上添加了熒光染料或具有熒光標記的探針，將熒光信號強弱與PCR擴增情況結合在4，通過監測PCR反應管內焚光信號的變化來實時觀測PCR反應進行的情況。實時PCR技術，解決了傳統PCR難以對擴增起始模板的量進行測定的難題，避免了傳統檢測技術樣本消耗量大，實驗操作繁瑣，檢測靈敏度低等缺點，并具有快速、避免交叉污染等特點，可以在基因檢測、基因表達、SNP分析等領域廣泛應用。而TaqMan探針的采用，更增加了檢測的特異性和結果的可靠性，是一種方便、快捷、經濟的檢測方法，尤其適用于科研、臨J^^病毒;jU于病學監測等工作。但是，由于實時PCR技術具有很好的敏感性和特異性，因此容易出現假陽性和假陰性結果，所以實際應用時需要設置參照(Control)。通常的做法是檢測目的基因的同時檢測樣本物種基因組中表達穩定的看家基因，如GAPDH、(3-actin、16或18SrRNA等。這樣就存在幾個問題1、由于不同物種的看家基因序列存在差異，所以檢測不同物種目的基因時，需要對每一種物種設計看家基因的引物和探針，缺乏通用性，且增加實驗操作的繁瑣性和成本；2、對目的基因和看家基因分兩管并^f全測時，增加了試劑和人力的成本，也增加了交叉污染機會。如果在同一管檢測則會因為兩套51物和探針之間的相互作用而降低PCR反應效率，并增加了弓1物和探針的設計難度。本發明設計一組引物及探針及相應的試劑盒，其中包括一對可以同時檢測西尼羅病毒和參照基因的引物和兩條針對西尼羅病毒和參照基因的TaqMan探針，使PCR反應體系中的引物和探針數量由通常藥6條減少到4條，從而可以實現西尼羅病毒和參照基因在同一管進行高效率的擴增，減少了實驗試劑成本和操作步驟，并減少了PCR實驗通常需要避免的污染機會，很好的避免了上述問題。
發明內容本發明的目的提僻十對西尼羅病毒的？1物和探針及一步法實時RT-PCR檢測試劑盒。采用所述試劑盒，運用一步法實時RT-PCR并結合TaqMan探針技術，適用于檢測多種不同制備方法得到的、不同物種的RNA樣本(如總RNA、mRNA、病毒粒等)，對西尼羅病毒RNA進行特異性檢測和定量分析。本發明提供的用于檢測西尼羅病毒RNA的一步法實時RT-PCR檢測試劑盒。其原理為由醒LV來源的反轉錄酶應LVRTase將西尼羅病毒RNA反轉錄為cDNA，然后使用熱啟動TaqDNA聚合酶擴增cDNA。4^p反應在同一反應體系中一步完成，反應過程無需開蓋操作。熱啟動TaqDNA聚合酶有效iE免了非特異擴增，同時結合TaqMan探針法，對西尼羅病毒進行筒單快速的高靈敏度、高特異性實時檢測。本發明中含有西尼羅病毒檢測用的F嵐標記探針，同時還含有西尼羅內參RNA和內參RNA檢測用HEX標記探針，可以進行兩色熒光只縫道同時實時檢測，反應過程無須開蓋，反應結束無須電泳，檢測快速，并極大減少了PCR產物污染所產生的假陽性結果。西尼羅內參RNA的加入與檢測可以排除因樣品純度等問題造成的假陰性結果。使用西尼羅標準品RNA制作標準曲線，可以對西尼羅病毒進行定量分析。為實現上述目的而采用的技術方案之一是提供一組針對西尼羅病毒的引物和4笨針，包括以下序列(1)西尼羅病毒的上游引物，其序列為SEQIDN01;(2)西尼羅病毒的下游引物，其序列為SEQIDN02;(3)西尼羅病毒的TaQMan探針，其序列為SEQIDN03;(4)內參RNA的TaqMan探針，其序列為SEQIDN04;或者包含上述序列SEQIDN01~SEQIDN04的向5，端或/和3'端延長的序列；或者與上述序列SEQIDN01-SEQID,同源性大于85%的序列；或者上述序列SEQIDN01SEQIDN04的磁基互補序列。本發明的技術方案^i是提供一種含有上述弓1物和探針序列的西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其組成包括OneSt印RT-PCRMasterMix、標準品RNA、內參RNA、Primer&ProbeMix、逆轉錄酶和水；其中所述的Prime&ProbeMix包括序列為SEQIDN01~SEQIDN04的混合物。試劑盒中所述OneSt印RT-PCRMasterMix為含RT-PCR緩沖液、Mgcl2,dNTPs、DNA聚合酶和無RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶為熱啟動TaqDNA聚合酶。所述標準品RNA序列為SEQIDN05。所述內參RNA序列為SEQIDN06。所述水為無RNA酶水。試劑盒中各組分試劑應保存于-20°C;盡量減少反復凍融。本發明應用實時RT-PCR技術對樣本中的西尼羅病毒RNA進行檢測，解決了傳統檢測技術樣本消耗量大，實驗操作繁瑣，檢測靈ltl低等缺點；TaQMan探針的采用，更增加了檢測的特異性和結果的可靠性，是一種方便、快捷、經濟的檢測方法，尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學監測等工作。本發明設計一組引物及探針及相應的試劑盒，其中包括一對可以同時檢測西尼羅病毒和參照基因的引物和兩條針對西尼羅病毒和參照基因的TaqMan探針，使PCR反應體系中的引物和探針數量由通常的6條減少到4條，從而可以實現西尼羅病毒和參照基因在同一管進行高效率的擴增，減少了實驗試劑成本和才剁乍步驟，并減少了PCR實聰通常需要避免的污染機會。圖1是本發明采用的TaqMan探針圖例。圖2是RiboGreen方法的RNA定量標準曲線。圖3是西尼羅病毒RNAOneSt印RT-PCR擴增曲線。圖4是西尼羅病毒RNAOneSt鄰RT-PCR標準曲線。圖5是內參RNAOneSt印RT-PCR擴增曲線。具體實施方式下面結合M實例，進一步闡ii^發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。此外，應理解，在閱讀了4^發明講述的內容以后，本領域的技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣屬于本申請所附權利要求書所限定的范圍。下列實例中未注明M務f牛的實驗方法，通常按照常規務f牛，如分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的^^牛。所用無才/M匕學試劑和有才/u容劑均符合分子生物學實驗的要求。引物和探針由上海生工公司合成，pBS-T載體購自北京TIANGEN公司，腦LV逆轉錄酶購自美國Stratagene公司、TaqDNA聚合酶購自美國ABI公司，DNaseI、RNaseH和T7RNA多|^購自大連寶生物公司，T3RNA多聚酶購自美國Promega/>司，RiboGreen和RNA定量試劑盒購自美國Invitrogen公司。熒光PCR儀MX3000P為美國Stratagene公司產品，熒光PCR儀Rotorgene3000為澳大利亞CorbettResearch公司產品。1.引物和探針的設計才艮據GeneBank公布的西尼羅病毒序列(AccessionNumber:AY490240)設計引物和探針。使用01igo6.O軟件在西尼羅病毒基因序列第967nt-2469nt(E基因)中設計和優選引物與探針，并進行質量分析。所設計的引物和探針經Blast檢索能檢測出所有現有已知的西尼羅病毒抹，不與Hendra病毒4朱產生陽性結果。(1)西尼羅病毒的上游引物，其序列為SEQIDN01:5'-CAACGGCTGCGGACTATTT-3'(2)西尼羅病毒的下游引物，其序列為SEQIDN02:5'-CTTTCAAGATGGTTCTTCCT-3'(3)西尼羅病毒的TaqMan探針，其序列為SEQIDNO35'-FAM-CAAAGGAAGCATTGACACATGCGCC-DABCYL-3，(4)內參RNA的TaqMan探針，其序列為SEQIDN04:5,-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQ1-3，探針設計原理如圖l，其中FAM、HEX為熒i^艮告基團，DABCYL、BHQ1為熒光淬M團。2.西尼羅病毒標準品RNA及內參RNA的制備和標定應用PCR方法從出發質粒(含西尼羅病毒E基因)擴增一li/f列，其中含有前述《1物和探針結合序列；將PCR產物純化后連接pBS-T載體，測序正確后線性化載體，佳Jf]T7或T3RNA聚合酶進行體外轉錄，所得到產物用DNaseI和RNaseH消化后使用RNA純化試劑盒純化，加入適量無RNA酶水，即為標準品RNA，放-80°C冰箱備用。使用RiboGreen方法和RNA定量試劑盒(Invitrogen)制作標準曲線，將得到的標準品RNA定量，并換算成拷貝數/ul。內參RNA的制備和標定同西尼羅病毒標準品RNA。用RiboGreen方法和RNA定量試劑盒制作的標準曲線如圖2。標準品RNA序列為SEQIDN05:5,-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGM)UCCUGGCAGAAGUCCGCAGUUAUUGCUAUCUGGCUACCGUCAGCGAUCUC虹ACCAAAGCUGCGUGCCCGACUAUGGGAGAAGCUCACAAUGACAAACGUGCUGACCCAGCUUUUGUGUGCAAACAAGGAGUAGUGGACAGAGGUUGGGGCAACGGCUGUGGACUA而UGGCAAAGGAAGCAUUGACACAUGCGCCAAAUUUGCCUGUUCCACCAAGGCAACAGGAAGAACCAUUCUGAAAGAGAACAUCAAGUACGAAGUGGCUAUCU腦UCCAUGGACCAACCACUGUGGAGUCGCAUGGAAACUACUCCACACAGAUUGGGGCGACUCAGGCAGGGAGAUUUAGCAUCACUCCUGCGGCGCCUUCAUACACACUAAAACUUGGAGAG訓GGAGAGGUGACGGUGGACUGUGAACCACGAUCAGGGAUUGACACCAAUGCAUACUACGUGAUGAC腦CGGAACAAAGAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCC腦AGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCC-3'內參RNA序列為SEQIDN06:5，-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUAGACAACGGCUGCGGACUAUUUAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUAGGAAGAACCAUCUUGAAAGUCUAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUG冊UCC-3，3.OneSt印RT-PCR^將裝有2xOneSt印RT-PCRMasterMix、5xprimers&probesMix、RNA樣品或標準品RNA、內參RNA、固LV和無RNA酶水的離心管從-20。C冰箱中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，^i4短暫離心，用移液器按下表中的說明在冰盒上配制OneStepRT-PCR反應體系(參見表l)。表lOneSt印RT-PCR反應體系的配制OneSt印RT-PCR^J^成分20ulM體系50ul幻iz體系體積(ul)終濃度體積(ul)終濃度2xOneSt印RT-PCRMasterMix101x251x5xPrimers&ProbesMix41x101xRNA樣品或標準品RNA或無RNA酶7JC2—5—隨LV50U/ul0.20.5U/ul0.50.5U/ul內參RNA(102copies/id)1—2.5—無RNA酶水2.8—7—反應^^牛42°C30minutes,1個循環;95°C15minutes,1個循環；95°C12seconds,55。C20秒、，72。C20秒、，40個循環。4.敏感性和特異性連續IO倍稀釋西尼羅標準品RNA進行敏感性分析。在20ulRT-PCR反應體系中按3中的^I^^牛進行OneSt印RT-PCR反應，由軟件自動產生西尼羅病毒OneSt印RT-PCR擴增曲線、標準曲線，見圖3、4。標準曲線的線性范圍為3.6xl0'3.6xl()2c叩ies/ul。內參RNA擴增曲線見圖5。陰'^十照(用無RNA酶水代替RNA樣品)無F掘熒光信號擴增，有HEX焚光信號擴增，見圖3、5。5.操作中防止假陰性和假陽性現象的措施。(1)無論是進行陰性對照、陽'^t照實驗，還是實際樣品檢測時，反應體系中都務必添加內參RNA,防止出現假陰性。(2)同時進行陰'l^t照實驗，防止出現假陽性。(3)同時進行陽'1^于照實驗，防止出現假陰性。6.結果判定①陰性對照實驗在配制實時RT-PCR反應液時，用無RNA酶水替代檢測樣品。對各種實驗結果的判定情況說明M2。表2陰'h^t照實驗結果判定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>②陽性對照實驗制作標準曲線時，用西尼羅標準品RNA的各濃度梯度稀釋液替^^r測樣,對各種實驗結果的判定情況說明M3。表3陽4i^照實驗結果判定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>對各種實驗結果的判定情況說明見表4。表4實驗樣品的檢測結果判定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7.注意事項A、RNA實驗操作注意事項本試劑盒是利用RT-PCR反應對病毒或內參RNA樣品進行擴增。RNA的純度和完整性會影響實驗結果，而制備RNA的關4紋要抑制細胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實驗中必須采取以下措施戴一次性干凈手套；使用RNA操作專用實驗臺；在操作過程中避泉講話等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA酶污染。盡量^J^一次性塑料器皿，若用玻璃器亞，應在卩M前按下列方法進行處理用0.1%DEPC(焦碳S吏二乙酯)水溶液在3rC下浸泡12小時；然后在120。C下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。RNA實驗用的器具建議專門使用，不要用于其它實-險。用于RNA實驗的試劑，須使用干熱滅菌(18(TC,60min.)或使用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝(也可以4賴RNA實驗用的一次性塑料容器)，使用的無菌水須用0.1%的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA實驗用的試劑和無菌水都應專用，避免混用后交叉污染。^i]簡單的RNA純化方法即可獲得滿足于RT-PCR反應的RNA(只需少量的RNA便可進行RT-PCR反應)。但為了保證實驗的成功率，建議使用GTC法(異硫氰酸胍法)制備高純度RNA。為了防止RNA分解，RNA樣品應盡量避免反復凍融，并盡可能保存于-80。C環境。B、生物樣本實驗操作注意事項生物樣M潛在危險，樣品的采集、處理、保存、運輸、檢測實驗均應遵循國家相應的管理規定和生物安全條例。必須做好相關的保護4普施，以確保實驗人員安全。本試劑盒所4細的西尼羅PositiveControlRNA是通itA工合成DNA后，再經體外轉錄得到的。使用安全，無感染性。C、PCR實—險注意事項本試劑盒檢測靈敏度高，為了防止污染，實驗^區操作①第一區反應液配制區。②第二區樣品制備區。③第三區樣品添加區及反應檢測區。三個區間必須進行物理性隔離，避免人為因素造成污染。PCR實驗用熒i^示"i^笨針應避光^^"。當同時需要i^f亍^次RealTimeOneSt印RT-PCR反_應時，應先配制各種試劑的混合液(其中包括MasterMix、無RNA酶水、Buffer、各種酶等)，然后再分裝到每個反應管中。這樣，可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重復分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或實驗樣品之間產生的誤差。反應液的配制、分裝應一定使用新的(無污染的)槍頭、Microtube等，盡量避免污染。8.試劑盒^吏用實例試劑準備(1)西尼羅病毒的一步法實時RT-PCR檢測試劑盒；(2)待檢測RNA樣品操作步驟(1)根據檢測樣^lt量(N)計算所需^管數(R)，以每個樣本做3個重復為例，總反應管數為設需要的管數為R=(N+6+l)x3+l，其中用來做定量標準曲線的標準品RNA6管，陰'^^j"照l管。為避免分液過程中損失，一管備用。(2)選才奪20ul或50ul反應體系，根據表1所建議體積乘以總反應管凄仏，在1.5mlEP管中冰上配制除標準品RNA或樣品RNA外的其它組分，混勻后分裝18ul或45ul反應';^/^液至PCR管，分別加入標準品RNA或樣品RNA或無RNA酶水，蓋好蓋子，放入實時PCR儀。(3)運行PCR儀，根據表l建議的^^f牛進行PCR反應。實時熒光PCR儀設置為同時采集F細和HEX熒光信號。(4)反應結束后利用PCR儀隨機附帶分析軟件分析結果。(5)參照表2~表4對反應結果進行判定。本發明中涉及的核*列SEQIDN01,西尼羅病毒的上游引物5'-AAACATCAGCAGGAAGGC-3，SEQIDN02,西尼羅病毒的下游引物5,-CCACTCTGTTCTATAGGTTCTT-3，SEQIDN03,西尼羅病毒的TaqMan探針5，-FAM-AAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCAT-DABCYL-3'SEQIDN04,內參RNA的TaqMan探針5，-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQl-3，SEQIDN05，標準品RNA:5，-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGC而GAUUCCUGGCAGAAGUCCGCAGUUAUUGCUAUCUGGCUACCGUCAGCGAUCUCUCCACCAAAGCUGCGUGCCCGACUAUGGGAGAAGCUCACAAUGACAAACGUGCUGACCCAGCUUUUGUGUGCAAACAAGGAGUAGUGGACAGAGGUUGGGGCAACGGCUGUGGACUAUUUGGCAAAGGAAGCAUUGACACAUGCGCCAAAUUUGCCUGUUCCACCAAGGCAACAGGAAGAACCAUUCUGAAAGAGAACAUCAAGUACGAAGUGGCUAUCUUUGUCCAUGGACCAACCACUGUGGAGUCGCAUGGAAACUACUCCACACAGAUUGGGGCGACUCAGGCAGGGAGAUUUAGCAUCACUCCUGCGGCGCC而CAUACACACUAAAACUUGGAGAGUAUGGAGAGGUGACGGUGGACUGUGAACCACGAUCAGGGAUUGACACCAAUGCAUACUACGUGAUGACUGUCGGAACAAAGAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCC-3，SEQIDN06,內參RNA:5，-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGA而AGACCGGCUGCGGACUAUUUAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUAGGAAGAACCAUCUUGAAAGUCUAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAA而UCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUG蘭CC-3，權利要求1.一組針對西尼羅病毒的引物和探針，包括以下序列(1)西尼羅病毒的上游引物，其序列為SEQIDNO1；(2)西尼羅病毒的下游引物，其序列為SEQIDNO2；(3)西尼羅病毒的TaqMan探針，其序列為SEQIDNO3；(4)內參RNA的TaqMan探針，其序列為SEQIDNO4；或者包含上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4同源性大于85％的序列；或者上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的堿基互補序列。2.—種西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其組成包括OneStepRT-PCRMasterMix、標準品RNA、內參RNA、Primer&ProbeMix、逆轉錄酶和水；其中所述的Primer&ProbeMix包括序列為SEQIDN01~SEQIDN04的混合物。3.根據權利要求2所述的一種西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述OneStepRT-PCRMasterMix為含RT-PCR緩沖液、Mgcl;，dNTPs、DNA聚合酶和無RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶為熱啟動TaqDNA聚合酶。4.根據權利要求2所述的一種西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述標準品RNA序列為SEQIDN05。5.根據權利要求2所述的一種西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特^iE^于，所述內參RNA序列為SEQIDN06。6.根據權利要求2所述的一種西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所迷水為無RM酶水。7.根據權利要求2所述的一種西尼羅病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中各組分的量為:2xOneSt印RT-PCRMasterMix1.25ml/管、標準品RNA凍干管(濃度梯度)共6管、內參RNA凍干管1管、5xprimer&Pr。beMixl.Oml/管、逆轉錄酶薩LV80ul/管和無RNA酶水1Qml/瓶。全文摘要本發明涉一組引物及探針及相應的試劑盒，其中包括一對可以同時檢測西尼羅病毒和參照基因的引物和兩條針對西尼羅病毒和參照基因的TaqMan探針，使PCR反應體系中的引物和探針數量由通常的6條減少到4條，從而可以實現西尼羅病毒和參照基因在同一管進行高效率的擴增，能夠實現對不同物種目的基因的檢測，通用性強，減少了引物和探針的數量及實驗試劑成本和操作步驟，并減少了PCR實驗通常需要避免的污染機會。本發明試劑盒適用于科研或臨床中西尼羅病毒的檢測，尤其適用病毒性疾病預防控制工作中對西尼羅病毒的監測。文檔編號C12Q1/68GK101245394SQ20071009278公開日2008年8月20日申請日期2007年9月29日優先權日2007年9月29日發明者曾志磊,鵬謝,曉陳申請人:謝鵬;曾志磊