專利名稱：蘭花細菌性褐斑病菌檢測用引物和探針及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及蘭花細菌性褐斑病菌 檢測用引物及探針。
背景技術：
蘭花細菌性褐斑病(」c^fovorax ave"fle subsp. ca"/e，g)是蘭花
上一種重要的細菌病害，被列為我國進境植物檢疫性有害生物。該 病菌主要侵染蝴蝶蘭，卡特萊蘭，文心蘭，石斛蘭，杓蘭等多種蘭 科植物，該病可通過植株遠距離傳播，該病目前主要分布于菲律賓、 意大利、葡萄牙、澳大利亞以及我國臺灣等國家和地區。近年來我 國蘭花生產發展很快，引進蘭花品種和數量大幅度增加，該病傳入 的風險日益增大。
本研究選擇已報道的蘭花褐斑病菌ITS序列設計一條熒光標記 探針和一對引物，建立了蘭花褐斑病菌的熒光PCR檢測方法，反應 結東即可根據擴增曲線判定是否有蘭花褐斑病菌。
發明內容
本發明目的在于提供用于蘭花細菌性褐斑病菌實時熒光PCR檢 測的引物及探針序列。
本發明通過分析已報道蘭花細菌性褐斑病菌ITS序列的基礎上， 分別設計引物和熒光探針。所述的引物對由正向和反向引物組成， 其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO.l和SEQIDN0.2所示；所 述探針的核苷酸序列如序列表中的SEQIDN0.3所示，該探針的一 端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料，該探針可用 的報告熒光染料選自FAM、 HEX、 TET、 JOE、 VIC、 FITC、 CY3和CY5中一種，可用的淬滅熒光染料選自TAMRA、ROX、DABCYL、 BHQ1和BHQ2。
根據TaqMan技術，在常規PCR的基礎上添加了 一條標記了兩 個熒光染料基團的核苷酸探針，例如將報告熒光染料標記在探針的 5'端，淬滅熒光染料標記在探針的3'端，兩者構成能量轉移結構，即 報告熒光染料所發射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當二者距離變 遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中， 探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于％《酶具有5'端到3'端的 外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作 用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現對蘭花細菌性褐斑病菌 的檢測。
具體地，本發明提供了 一種蘭花細菌性褐斑病菌檢測用引物， 該引物的正向引物序列SEQIDNO.l (FP)和反向引物序列SEQID N0.2 (RP)的核苷酸序列為
SEQ ID NO. 1: 5 '-GTCGGTTCGATCCCGTCAT-3' SEQ ID NO.2: 5'陽GGCAACGCTGATTCGACTCTAT陽3' 本發明還提供了 一種與上述引物配合使用的探針，其核苷酸序 列為SEQ ID NO.3: 5'- ACGATATGCCCTGCGGTAG -3' (LP),該 探針一端標記有報告熒光染料，另 一端標記有淬滅熒光染料。
優選上述探針的5'端標記有FAM熒光染料，3'標記有TAMRA 熒光染料。
本發明還提供了一種檢測蘭花細菌性褐斑病菌的方法，該方法 以樣品總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQIDNO.l的引物FP 和核苷酸序列為SEQIDNO.2的引物RP以及核苷酸序列為SEQID NO.3的探針LP進行實時熒光PCR檢測，每個循環結東釆集數據， 反應結東后根據擴增曲線判定蘭花細菌性褐斑病菌的存在。
優選地，上述方法中的實時熒光PCR反應過程中的退火溫度為60°C。
本發明還提供了一種用于檢測蘭花細菌性褐斑病菌的試劑盒， 該試劑盒含有上述引物SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2。
優選的，上述試劑盒還包括核苷酸序列為SEQIDNO.3的探針。
具體地，本發明的檢測蘭花細菌性褐斑病菌的方法是以樣品總 DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，反應條件是在反應體系中 加入超純水水，2xMasterMix,引物FP,引物RP，探針LP,總DNA。 其中Master Mix購自Applied Biosystems公司。
更具體地，本發明的檢測蘭花細菌性褐斑病菌的方法是以樣品 總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，反應條件是在50pL反應 體系中加入21.5|aL超純水水，25pL 2xMaster Mix, 1 引物FP ( 20 }imol/L )， 1 引物RP ( 20 jimol/L )， 1 探針LP ( 10 pmol/L ), 1.6 ng總DNA。
其中，上述方法的反應條件是第一個循環為95。C 10min;隨 后40個循環，94°C 15s, 60°C lmin。
當然，可以根據本發明給出的引物或者其擴增產物序列設計其 他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。
進一步，還可以將本發明引物、探針以及相關試劑組裝成試劑 盒，以方便使用。
根據蘭花細菌性褐斑病菌ITS序列設計的本發明的引物及探針 是經過長期篩選得到的，該探針特異性好，用于熒光PCR檢測靈敏 性高。而且應用該引物和探針的檢測方法準確性高、靈敏度高，其 能夠快速簡單地判斷樣品是否有蘭花細菌性褐斑病菌，為進出口安 全提供了保證。
圖l是樣品檢測，實時熒光PCR技術檢測蘭花細菌性褐斑病菌的結 果，其中l是陽性對照，2是蘭花褐斑病樣品，3是健康蘭花。圖2是實時熒光PCR靈敏度測試，其中1-8表示DNA的濃度 分別為9xl(T2fig/|LiL, 9xl(rVg/VL, 9xlO國Vg/pL, 9xl(rVg/pL,
9xio-Vg4iL, 9xi(rVg/)iL, 9xi(rVg"L, 9xi(rVg/inL。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明 的范圍。 實施例l
引物及探針的設計和合成
根據蘭花細菌性褐斑病菌ITS序列，釆用探針設計軟件Express 2.0設計引物及探針，經過大量篩選得到如下序列的引物序列和探針 引物的正向序列(FP)為SEQIDNO.l,引物的反向序列(RP) 為SEQIDN0.2,具體序列的組成如下
SEQ ID NO. 1: 5 '誦GTCGGTTCGATCCCGTCAT-3' SEQ ID N0.2: 5'-GGCAACGCTGATTCGACTCTAT-3' 探針的核苷酸序列為LP: 5'-ACGATATGCCCTGCGGTAG-3' 根據上述核苷酸序列信息合成正向引物FP、反向引物RP和探 針LP,在探針的5'端用FAM熒光染料標記，3'端用TAMRA標 記。將上述引物FP和引物RP分別配制成濃度為20 (imol/L的溶液， 將標記的探針配制成10fxmol/L的溶液，備用。
總DNA的提取
1) 分別釆集適量的健康和表現病狀的石斛蘭幼嫩葉片，按照如 下步驟制備總DNA樣品溶液。
用液氮將上述嫩葉片研成粉末，取0.4 g裝入1.5 ml的離心管中 (該離心管在-20 -C預冷)；
2) 預熱1.5xCTAB到95°C,取1 ml加入到裝有葉片粉末的離 心管中，混勻(防止凍融)；3) 立即置于65。C水浴30min,每5min上下顛倒l次，12000g離心5 min。
4) 吸取上清液約60(^1,加入等體積(600jiL)氯仿/異戊醇(24:1)混合液，上下顛倒數次，至下層液相呈深綠色為止，12000g離心5分鐘。
5) 取450pL上清液于一新1.5ml離心管，加入lml的95°/。乙醇和45pL的IOMNH4AC,混勾，室溫放置10min。
6) 然后12000g離心10min,去上清，用75%的乙醇浸洗沉淀，自然干燥約30min。
7) 加入50pL的1/10TE (含^(ig的RNase ),置于4。C過夜，待DNA溶解后，得健康和病癥總DNA模板液，檢測DNA濃度及質量，備用。
實時PCR擴增
1、 建立實時熒光PCR反應體系
取上述總DNA模板液分別配制成含1.6ngDNA的健康和病癥的模板液，另外配制9xlO g/VLDNA的蘭花褐斑病陽性對照，分別進行如下實時熒光PCR反應
在3個50iiL反應體系中都加入21.5 ^L超純水，25 (iL2xMasterMix (購自Applied Biosystems公司)，1 pL引物FP( 20 (imol/L )， 1 jaL引物RP ( 20 pmol/L )， 1 |iL探針LP ( 10 (imol/L),然后分別加入1.6ng的健康總DNA、病癥總DNA和陽性對照總DNA
2、 實時熒光PCR反應
將樣品分別管放入ABI公司ABI7700型號熒光PCR儀后，設置如下條件進行反應第一個循環為95匸10min;隨后40個循環，94°C 15s, 60°C lmin。每個循環結束后釆集數據。熒光強度變化曲線如圖l所示。試驗結果
通過實時熒光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，健康對照沒有變化,表現癥狀的石斛蘭葉片總DNA的熒光強度與陽性對照的熒光強度都產生了變化，可以看出釆用上述方法對葉片中蘭花褐斑病的檢測很準確和靈敏。實施例2
用超純水分別稀釋細菌DNA,進行相對靈敏度檢測，在50pL反應體系中，DNA分別為9xlO g4iL， 9xlO g/jiL， 9xlO-4|ug/|iL，9xlO g4iL， 9xlO g小L， 9xl(rVg/pL， 9xl(rVg/iiL， 9xlO-Vg/|LiL。按照如上方法，使用本發明的引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2和探針SEQIDN0.3測試本發明方法的檢測靈敏度，結果如圖2所示，本發明方法的最低檢測限是9x 1 (TVg爾L,本發明方法用于檢測蘭花褐斑病菌非常靈敏，效果非常好。序歹IJ 表
<110>中國檢驗檢疫科學研究院
<120>蘭花細菌性褐斑病菌檢測用引物和探針及其檢測方法
<130〉
<160〉 3
<170> Patentln version 3.3
<210><211〉<212〉<213><400〉
1
19
DNA
人工序列1
gtcggttcga tcccgtcat 19
<210> 2<211> 22<212> DNA<213〉人工序列<400> 2
ggcaacgctg attcgactct at 22
<210〉 3<211> 19<212〉 DNA<213>人工序列<400> 3
acgatatgcc ctgcggtag 19
權利要求
1、一種蘭花細菌性褐斑病菌檢測用引物，該引物的正向引物序列SEQ ID NO.1和反向引物序列SEQ ID NO.2如下SEQ ID NO.15′-GTCGGTTCGATCCCGTCAT-3′SEQ ID NO.25′-GGCAACGCTGATTCGACTCTAT-3′。
2、 與權利要求l所述的引物配合使用的探針，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.3: 5'- ACGATATGCCCTGCGGTAG -3'，該探針 一端標記 有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料。
3、 根據權利要求2所述的探針，其5'端標記有FAM熒光染料， 3'標記有TAMRA熒光染料。
4、 一種檢測蘭花細菌性褐斑病菌的方法，該方法以樣品總DNA 為模板,利用核苷酸序列為SEQIDNO.l的引物FP和核苷酸序列為 SEQ ID NO.2的引物RP以及核苷酸序列為SEQ ID NO.3的探針LP 進行實時熒光PCR檢測，每個循環結束釆集數據，反應結東后根據 擴增曲線判定蘭花細菌性褐斑病菌的存在。
5、 根據權利要求4所述的方法，其中實時熒光PCR反應過程 中的退火溫度為60°C。
6、 根據權利要求4所述的方法，以樣品總DNA為模板，進行 實時熒光PCR反應，反應條件是在反應體系中加入超純水水， 2xMasterMix,引物FP,引物RP,探針LP，總DNA。其中Master Mix購自Applied Biosystems公司。
7、 根據權利要求6所述的方法，其中反應條件是在50/xL反應 體系中加入21.5/xL超純水水，25/xL 2xMaster Mix, 1 /iL引物FP ( 20 /miol/L ), 1 /xL引物RP ( 20 /xmol/L )， 1 探針LP ( 10 /xmol/L), 1.6 ng總DNA。
8、 根據權利要求4-7所述的方法，其中熒光PCR反應的反應條 件是第一個循環為95°C 10min;隨后40個循環，94°C 15s， 60°Clmin。
9、 一種用于檢測蘭花細菌性褐斑病菌的試劑盒，該試劑盒包含 引物SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2。
10、 根據權利要求8所述的試劑盒，該試劑盒還包括核苷酸序 列為SEQIDN0.3的探針。
全文摘要
本發明提供了一種蘭花細菌性褐斑病菌檢測用引物和探針及其檢測方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。本發明還進一步提供了檢測蘭花細菌性褐斑病菌的方法。該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進行實時熒光PCR擴增，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。本發明探針特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度高，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101457259SQ200910076399
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月15日 優先權日2009年1月15日
發明者丁翠珍, 朱水芳, 葛建軍, 趙文軍, 青 陳, 陳洪俊, 陳紅運 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院;廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心