專利名稱：一種熱變性卵清蛋白人工酶及制備方法
一種熱變性卵清蛋白AI酶及制備，法
技術領域：
本發明涉及人工酶的模擬領域，是在無催化活性的蛋白質中人工誘 導出活性部位，使常用的卵清蛋白獲得了一定的酶催化的能力。
背景技術：
酶是能夠專一性地催化特定底物或反應的蛋白質。在天然酶的蛋白 質結構中必然存在著一個或幾個能夠識別和催化底物分子的凹槽，被稱為活性部 位。活性部位與底物在空間微和靜電±5補，形成了被稱為"誘導契合"的柔性 匹配。換而言之， 一種酶之所以能夠從許多化合物中識別出它所催化的底物，是因 為該酶的活性部位與相應的底物是匹配的。
人工誘導活性部位首先是在高分子化合物中， 一種稱為模板聚合的技術是將底 物包埋在聚合物中，然后洗除底物。這樣，殘留在聚合物中與底物形狀匹配的空穴 就被視為一種人工的"活性部位"，它們己經在該底物的催化上顯示出了一定的活
性(Alexander C. et al. J. Mol. Recognit. 2006， 19: 106~180;-Batra D. & Shea K. J.
Curr.Opin.Chem.Biol.2003，7:434"442)。而后， 一種用蛋白質代替聚合物的生物印 記技術被提出，它是利用蛋白質沉淀時會包裹雜質的原理將底物包裹其中。當被包 裹的底物從蛋白質中洗掉后，蛋白質便殘留下了 "活性部位"(Hansen D. E.
Biomaterials. 2007, 28: 4178~4191;-Turner N. W. et al. Biotechnol. Prog. 2006, 22:
1474-1489)。但是，這種蛋白質沉淀^iS7jC溶解，從而失去了誘導出的"活性部位"， 催化活性也隨即消失。然而，酶通常是在水介質進行催化的。為解決這一問題，研: 究者將沉淀的蛋白質進行交聯(PeiCiker F. & Fischer L. Biooig. Med. Chem. 1999, 7: 2231-2237)，但化學反應往往會破壞原蛋白質和活性部位的結構，使催化能力明顯 下降。
卵清蛋白質體系中有多種磷糖蛋白質，主要包括卵清蛋白、伴清蛋白、卵粘蛋 白、卵類粘蛋白、溶菌酶等。它們皆不是某種指定底物的水解酶(溶菌酶育^7K解細 菌細胞壁，只占蛋清蛋白總量的3 4%)。然而，卵清蛋白質體系在60。C以上會熱 變性，凝結成不溶不熔物。凝結物不溶于水和有機溶劑，以其作為人工酶的母糊每 可使催化劑在水介質中艦。
發明內容本發明目的是用廉價易得的卵清蛋白制備出能夠在水介質下催化的
人工模擬酶。
本發明樹共的熱變傲鳥卵清蛋白人工酶，尉旨 ——由熱變性的雞卵清蛋白質所構成的；
——人工酶內部含有與底物分子在形^ti:相i以的空穴；
——底物是能夠發生水解反應的底物是能夠發生水解反應的Boz-精氨酉樹硝 基苯胺或能夠發生乙酰化反應的對硝基苯胺。
本發明所掛共的卵清蛋白AX模擬酶的制備方法是
將戶腿擇的Boz-精氨酉樹硝基苯胺艦硝基苯胺作為模板溶于卵清蛋白中，超 聲分散，加熱變性，使卵清蛋白凝結成^7jC介質中懸浮的微粒。
微粒中包裹著大量底物分子。通過洗滌去除蛋白質中的這些底物，就會在蛋白 質M^^粒中殘留下相應的空穴。這些空穴與底物分子在開娥和靜電上互補匹配。
如上戶腿的人工模擬酶在水介質中不溶解失活，能催化Boz-精氨酉樹硝基苯胺 的水解反應。
本發明所提供的雞卵清蛋白人工模擬酶的具體制備過程包括
將2 2.5 g Boz-精氨鵬硝基苯胺艦硝基苯胺溶于10 mL的Tris-HCl緩沖 液中，加入45 5g雞卵清蛋白，在冰浴中超聲2min;
然后，加熱至10(TC，回流20min，過濾；
凍干濾餅，研磨，加入戊二醛溶液，過夜；
過濾，用磷酸鈉緩沖液洗滌3次，真空千燥得到熱變啦鳥卵清蛋白人工酶。 ——活性測試
以水循環器使反應溫度維持在37t0.1。C;在熱變性雞卵清蛋白人工酶催化下，
1.8 mg Boz-精氨St^硝基苯胺在100 mL Tris-HCl緩沖、艦行水解反應，用紫外-可 見分光光度^^^監測在410nm吸收峰的上升；或者以0.7mg對硝基苯^^ 100 mL乙酸酐進行乙酰化反應；對生成物的濃度隨時間的變ttJS行回歸分析，計算催 化反應的初速率。
本發明的優點和積^^果本發明采用較為廉價和易得的蛋白質制備具有一定
活性的人工酶，在一定禾，上模擬昂貴的酶蛋白的催化功能。同時，作為一種蛋白 質模型，說明人工誘導的"活性部位"可在一定程度上具有酶活性部位的功能特征。
具體實施方式
實施例l
1、 BOZ-精氨TO硝基苯胺,在雞卵清蛋白中的皿與洗脫
將2 2.5 g Boz-精氨ife^硝基苯胺模板溶于10 mL的Tris-HCl緩沖液中，加 入45 5g雞卵清蛋白，在冰浴中超聲2min;然后，加熱至IO(TC，回流20min; 過濾，凍干濾餅，研磨，加入戊二醛溶液，過夜；過濾，用磷酸鈉緩沖液洗滌3 次，真空千燥得到熱變性卵清蛋白人工酶。
2、 活性測試
以水循環器使反應鵬維持在37±0.1°C;在熱變慰鳥卵清蛋白人工謝崔化下， 1.8 mg Boz-精氨,硝基苯胺在100 mL Tris-HCl緩沖液進行水解反應，用紫外-可 見分光光度似鼦宗監測在410 nm吸收峰的上升，對生成物的濃度隨時間的變4t3t 行回歸分析，計算催化反應的初速率。測試結果表明，熱變ftX鳥卵清蛋白人工,崔 化下Boz-精氨酉樹硝基苯胺水解的初速率是一般熱變慰鳥卵清蛋白的12倍。
實施例2
1、對硝基苯胺模板在雞卵清蛋白中的包封與洗脫
將2 2.5 g對硝基苯胺模板溶于10 mL的Tris-HCl緩沖液中，加入4.5 5 g 雞卵清蛋白，在冰浴中超聲2min;然后，加熱至10(TC，保溫20min;過濾，凍
干濾餅，研磨，加入戊二醛溶液，過夜；過濾，用磷M緩沖液洗滌3次，真空 千燥得到熱變性卵清蛋白AX酶。
2、活性測試
以水循環器使反應，維持在37:M).1。C;在熱變性X鳥卵清蛋白人工酶催化下， 0.7 mg對硝基苯S敏100 mL乙酸酐進行乙酰化反應，用紫外-可見分光光度似艮 蹤監測在410 nm吸收峰的下降，對生成物的濃度隨時間的變化進行回歸分析，計 算催化反應的初速率。測試結果表明，熱變慰鳥卵清蛋白AX謝崔化下對硝基苯胺 乙酰化的初速率是一般熱變啦鳥卵清蛋白的7.6倍。
權利要求
1、一種熱變性雞卵清蛋白人工酶，其特征在于——人工酶是由熱變性的雞卵清蛋白質所構成的；——人工酶內部含有與底物分子在形狀上相似的空穴；——底物是能夠發生水解反應的Boz-精氨酰對硝基苯胺或能夠發生乙酰化反應的對硝基苯胺。
2、 一種權利要求i戶;M的熱變傲鳥卵清蛋白Ai酶的制備方法，其特征是該方飽括將2 2.5 g Boz-精氨艦硝基苯胺艦硝基苯胺溶于10 mL的Tris-HCl緩沖 液中，加入45 5g雞卵清蛋白，在冰浴中超聲2min;然后，加熱至10(TC，回流20min，過濾；凍干濾餅，研磨，加入戊二醛溶液，過夜；過濾，用磷M緩沖液洗滌3次，真空千燥得到熱變啦鳥卵清蛋白人工酶。
全文摘要
一種熱變性卵清蛋白人工酶及制備方法。本發明是以廉價易得的卵清蛋白為母體材料，在溶入底物模板后，通過熱變性形成了包裹著大量模擬分子的體型蛋白質，洗滌脫除模板后，蛋白質結構內部便殘留下與這些模板分子在形狀上互補的空穴。蛋白質具有酶催化所需要的催化基團，而這些空穴可模擬酶的活性部位對底物反應進行催化。
文檔編號C12N9/14GK101186905SQ20071015105
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月14日 優先權日2007年12月14日 公開號200710151051.發明者張嘉琪, 謝秀榮, 茜 趙, 鄭嗣華, 魏新躍, 黃衛洪, 黃積濤 申請人:天津理工大學