與分析物測定相關的方法、混合物、試劑盒和組合物的制作方法

專利名稱：與分析物測定相關的方法、混合物、試劑盒和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及與通過質譜法進行分析物測定相關的方法、混合物、試劑盒和組合物。
導言 本發明涉及通過質量分析測定分析物。分析物可以是感興趣的任何分子。分析物的非限定性實例包括但不限于蛋白質、肽、核酸、碳水化合物、脂質、類固醇和質量小于1500道爾頓的小分子。可利用獨特的標記試劑對分析物進行測定，所述標記試劑使得可對復雜混合物中的分析物進行相對定量和/或絕對定量。可成組使用標記試劑用于分析復雜的樣品混合物，其中標記試劑可以是同分異構的(isomeric)和/或同量異位的(isobaric)。
參照圖1a，標記試劑包含報告物部分、平衡物(或連接物)部分和反應活性基團，其中所述反應活性基團被組合物中已反應分析物形式的分析物所取代。此通式的標記試劑和標記的分析物的實例已經公開于例如公開的共同未決和共有的美國專利申請US 2004-0219685 A1、US2005-0114042 A1、US 2005-0147982 A1、US 2005-0147985 A1、US2005-0147987 A1、US 2005-0148771 A1、US 2005-0148773 A1和US2005-0148774 A1中。如在所引用的公開的美國專利申請中所討論的，同分異構和/或同量異位的標記試劑組可以用于標記例如兩個或更多個不同樣品的分析物，其中組中的不同標記試劑均具有相同的總質量，但每個報告物部分可被特別編碼，使得該組的每個報告物部分都具有獨特的質量。因為該組中的所有試劑都具有相同的總質量但可包含具有獨特質量的報告物部分，所以平衡物(或連接物)部分通常也會(但并非必須)包含一種或多種重原子同位素，以此“平衡”每個獨特報告物的質量，從而該組中每種標記試劑的報告物/連接物組合都具有相同的總質量。
在圖1b中圖示了新標記試劑(或標記的分析物)的實例(如本文中所詳述的)。盡管是以未取代形式(除了R1和R2)進行闡述的，但應當理解所述標記試劑可以是取代的或未取代的。在圖示中，某些鍵顯示為斷裂的，從而從標記試劑或標記的分析物上至少釋放獨特的報告物部分、以及通常但不必要的平衡物部分。對于標記的分析物而言，然后可將在質譜儀中觀察到的每種特別的報告物離子(有時候稱為信號離子(signature ion))用于定量樣品和/或樣品混合物中分析物的量。
圖2a和2b圖示了如圖1b所示的基礎結構的9種不同編碼形式(例如R1和R2可彼此獨立地為氫或甲基)，其可用于促進至少9重實驗(9-plex experiment)，其中星號(＊)用于表明在適當時此處12C原子被13C原子替代，或者14N原子被15N原子替代。圖2c中顯示了不同報告物/信號離子的建議結構。然而，如果例如在報告物部分和/或平衡部分中，氘也用于替代一個或多個氫原子和/或用18O替代16O，則可預料有多于9種不同的化合物，從而可進行多于9重的實驗。參照如下圖6a和6b，對于此通式的標記試劑/標記的分析物的進一步替代的這種可能性進行了更詳細的討論。
與在圖2a和2b中所示的那些相似的同量異位化合物的可替代組(其中R1和R2可用于形成6元環)圖示于圖3a和3b中。這些標記試劑可形成9種不同的報告物/信號離子的同樣的組，其建議結構顯示于圖2c中。能夠容易地制備具有分析物分析所需性質的替代結構表明本發明實施方式具有通用性。
通常，標記試劑、標記的分析物和所述標記試劑和/或標記的分析物的一些中間體可由式I化合物，包括其鹽形式和/或其水合物形式所代表
其中Z可以是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、能與分析物的官能團反應而形成標記的分析物的反應活性基團、反應活性基團的離去基團，其中所述離去基團在所述標記試劑與分析物的親核性官能團或與共價鍵合的分析物反應時離去，其中對原子或基團V+、X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面進行更詳細地描述。
因此，在一些實施方案中，分析物可以通過所述分析物與式I’化合物(包括其鹽形式和/或其水合物形式)所代表的標記試劑的反應而標記
其中Z’代表能與分析物的官能團反應而形成標記的分析物的反應活性基團或所述反應活性基團的離去基團，其中所述原子或基團X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L將在下面進行更詳細地描述。所述標記試劑可以成組使用，其中所述組包含同分異構和/或同量異位的化合物，由此標記的分析物同樣可以是同分異構和/或同量異位的。
此外，在一些實施方案中，如此標記的分析物可由式I”所代表，包括其鹽形式和/或其水合物形式
其中，Z”代表與所述標記試劑共價鍵合(可能通過所述反應活性基團的其它原子或基團)的分析物，其中所述原子或基團X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面進行更詳細地描述。
此外，在一些實施方案中，所述標記試劑的中間體可由式I”’所代表，包括其鹽形式和/或其水合物形式
其中Z”’代表-OH、-SH、-O-V+或-S-V+，其中所述V+、X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面進行更詳細地描述。所述中間體可用于例如產生本文中所公開的標記試劑，包括原位產生所述標記試劑，其中所述原位產生的標記試劑可用于標記分析物。
在圖示的化合物中，基團Y-J-表示報告物部分。因此，可將同分異構和/或同量異位的標記試劑組進行編碼，使得所述組的每種不同標記試劑具有相同的總質量但其中所述組的每種不同標記試劑的基團Y-J-被特別編碼，例如通過利用一個或多個同位素富集部位進行，從而當基團Y-J-的基團J與所述標記的分析物(或其片段)的其余部分之間的鍵在質譜儀中斷裂時，可形成具有獨特質量的報告物離子(參見圖1c)。與報告物部分(即信號離子或報告物離子)相關的離子的峰強度可與被分析樣品中標記的分析物的量(常表示為濃度和/或量)相關聯。因此，同分異構的和/或同量異位的標記試劑組可用于標記兩種或更多種不同樣品的分析物，其中所述標記試劑可因不同的樣品而不同并且其中所述標記試劑可包含能與產生所述標記的分析物的樣品關聯的具有獨特質量的報告物部分。因此，即使是通過對混合多種不同樣品的標記產物而獲得的標記的分析物的復雜混合物進行分析，也可將例如每個報告物部分的存在和/或量的信息與兩種或更多種不同樣品中的所述分析物相關聯起來。
如本文中所述，可制備成組的九種或更多的同分異構和/或同量異位的標記試劑，從而允許9重(9-plex)或更多的實驗(一種示例性分析的圖示可見于圖19a和19b中)。例如，有可能對各自進行不同標記后混合的9種(或更多種)不同樣品中的分析物進行同時鑒定和/或定量。這樣的分析可通過從9種不同樣品(每種樣品被圖2a/2b或3a/3b所示組中的不同的標記試劑所標記)的混合物中確定獨特的報告物離子(其可具有如圖2c所示的結構)而實現。因此，本發明的實施方案特別適于復雜樣品化合物的多重分析(multiplex)。例如，本發明的一些實施方案可用于蛋白質組分析和/或基因組分析，以及用于與基因組分析和蛋白質組分析有關的相關性研究。本發明的一些實施方案也可用于小分子分析，比如脂質、類固醇或氨基酸分析。可使用同分異構的和/或同量異位的試劑的實驗性分析包括但不限于時間過程研究、生物標記物分析、多重蛋白質組分析、多維蛋白質鑒定技術實驗(mudpit experiment)、親和性Pull-down實驗(affinity pull-down)、翻譯后修飾(PTM)測定(參見例如公開的美國專利申請No.US 2005-0208550 A1)以及多重控制實驗(multiple control experiments)。



本領域技術人員將理解以下所描述的附圖僅用于舉例說明的目的。所述附圖并非意在以任何方式限制本發明教導的范圍。
圖1a是標記試劑或標記的分析物的組成部分及其斷裂性質的舉例說明。
圖1b是示例性的基于N-甲基哌嗪的標記試劑或標記的分析物的一般組成部分及其斷裂性質的舉例說明。
圖1c是被鑒定通式的標記的分析物的一般組成部分及其斷裂性質的舉例說明。
圖1d是一些示例性的同量異位的標記試劑的通式的說明。
圖2a是不同同量異位化合物的舉例說明，其中所述化合物與圖2b所示化合物一起能形成9-重組(a 9-plex set)。
圖2b是不同同量異位化合物的舉例說明，其中所述化合物與圖2a所示化合物一起能形成9-重組。
圖2c是用于報告物離子(即信號離子)的各種可能結構的舉例說明，所述報告物離子可由圖2a、2b、3a和3b中所示的同量異位化合物產生。
圖3a是不同同量異位化合物的舉例說明，其中所述化合物與圖3b所示化合物一起能形成9-重組，其中所述平衡物包含環結構。
圖3b是不同同量異位化合物的舉例說明，其中所述化合物與圖3a所示化合物一起能形成9-重組，其中平衡物包含環結構。
圖4a是示例性的同量異位化合物的說明。
圖4b是示例性的同分異構的同量異位化合物的說明。
圖5是將示例性的載體結合的標記的分析物從載體上斷開的過程的舉例說明。
圖6a是標記試劑或標記的分析物的舉例說明，其中所述報告物包含多個同位素富集部位。
圖6b是標記試劑或標記的分析物的舉例說明，其中所述平衡物(連接物)包含多個同位素富集部位。
圖7a是示例性標記試劑的示例性合成的步驟1-3的說明。
圖7b是示例性標記試劑的示例性合成的步驟4-5的說明。
圖7c是示例性標記試劑的示例性合成的步驟6-7的說明。
圖8是合成多種活性酯的方案的舉例說明。
圖9a是舉例說明同位素編碼的原料的表，通過實踐本文中所公開的本發明，所述原料能用于制備多種同量異位化合物。
圖9b是舉例說明同位素編碼的原料的表，通過實踐本文中所公開的本發明，所述原料能用于制備多種同量異位化合物。
圖9c是舉例說明同位素編碼的原料的表，通過實踐本文中所公開的本發明，所述原料能用于制備多種同量異位化合物。
圖10a是舉例說明同位素編碼的原料的表，通過實踐本文中所公開的本發明，所述原料能用于制備多種同量異位化合物。
圖10b是舉例說明同位素編碼的原料的表，通過實踐本文中所公開的本發明，所述原料能用于制備多種同量異位化合物。
圖10c是舉例說明同位素編碼的原料的表，通過實踐本文中所公開的本發明，所述原料能用于制備多種同量異位化合物。
圖11a是對編碼的肌氨酸衍生物的一種可能合成途徑的舉例說明，所述編碼的肌氨酸衍生物可用于制備編碼的N-甲基-哌嗪衍生物。
圖11b是對編碼的肌氨酸衍生物的一種可能合成途徑的舉例說明，所述編碼的肌氨酸衍生物可用于制備編碼的N-甲基-哌嗪衍生物。
圖12a是對包含兩個同位素編碼部位的編碼的N-甲基乙二胺的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖12b是對包含四個同位素編碼部位的編碼的N-甲基乙二胺的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖12c是對包含四個同位素編碼部位的編碼的N-甲基乙二胺的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖12d是對包含四個同位素編碼部位的編碼的哌嗪的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖12e是對包含兩個同位素編碼部位的編碼的哌嗪的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖13是對使用同量異位的標記試劑組(即標記物1和標記物2)處理測試樣品和對照樣品的一種可能工作流程的舉例說明。
圖14a是對使用同量異位的標記試劑組(即標記物1和標記物2)處理測試樣品和對照樣品的一種可能工作流程的舉例說明。
圖14b是對捕獲支持物的組成部分的舉例說明。
圖14c是對示例性的捕獲支持物的舉例說明。
圖15是對使用同量異位的標記試劑組(即標記物1和標記物2)處理測試樣品和對照樣品的一種可能工作流程的舉例說明。
圖16是對使用同量異位的標記試劑組(即標記物1、標記物2、標記物3和標記物4)處理兩種蛋白質樣品的一種可能工作流程的舉例說明。
圖17是對使用同量異位的標記試劑組(即標記物1、標記物2、標記物3和標記物4)處理兩種蛋白質樣品的一種可能工作流程的舉例說明。
圖18是對使用同量異位的標記試劑組(即標記物1、標記物2、標記物3、標記物4、標記物5和標記物6)處理兩種蛋白質樣品的一種可能工作流程的舉例說明。
圖19a是對所選質量的肽的MS分析的標記物和產物(尤其是m/z)的舉例說明，其中所述所選質量的肽源自采用同量異位的標記試劑組進行不同標記的9種不同樣品。
圖19b是對9種不同標記的肽(具有特定的m/z值)的MS/MS分析結果的舉例說明，其中所述肽選自如圖19a中所示的MS分析。
圖20是對一些示例性標記試劑的可能途徑的舉例說明。
圖21是對一些示例性標記試劑的可能途徑的舉例說明。
圖22a是使用本文中所述的未編碼形式的示例性標記試劑標記的肽([Glu1]-人血纖維蛋白肽B)的MS數據的譜圖。
圖22b是在圖22a中所示的標記的肽的所選峰的MS/MS數據譜圖，其中將所述肽進行CID斷裂和片段的再分析。
圖23a是使用本文中所述的未編碼形式的示例性標記試劑標記的肽([Glu1]-人血纖維蛋白肽B)的MS數據譜圖。
圖23b是在圖23a中所示的標記的肽的所選峰的MS/MS數據譜圖，其中將所述肽進行CID斷裂和片段的再分析。
圖24a是使用本文中所述的未編碼形式的示例性標記試劑標記的肽([Glu1]-人血纖維蛋白肽B)的MS數據譜圖。
圖24b是在圖24a中所示的標記的肽的所選峰的MS/MS數據譜圖，其中將所述肽進行CID斷裂和片段的再分析。
圖25a是對不同同量異位試劑的舉例說明，其中所述試劑與圖25b所示化合物一起能形成8-重組(8-plex set)。
圖25b是對不同同量異位試劑的舉例說明，其中所述試劑與圖25a所示化合物一起能形成8-重組。
圖26a是對不同同量異位試劑的舉例說明，其中所述試劑與圖26b所示化合物一起能形成8-重組。
圖26b是對不同同量異位試劑的舉例說明，其中所述試劑與圖26a所示化合物一起能形成8-重組。
圖27a是對示例性標記試劑的示例性合成的步驟1-3的說明。
圖27b是對示例性標記試劑的示例性合成的步驟4-5的說明。
圖27c是對示例性標記試劑的示例性合成的步驟6-7的說明。
圖28a是對包含兩個同位素編碼部位的編碼的N-甲基乙二胺的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖28b是對包含六個同位素編碼部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成的舉例說明。
圖29a是對包含四個同位素編碼部位的編碼的N-甲基乙二胺的一種可能合成途徑的舉例說明。
圖29b是對包含八個同位素編碼部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成的舉例說明。
在本申請中所引用的全部文獻和類似材料，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和互聯網頁，不論這些文獻和類似材料的格式如何，為任何的和所有的目的，均明確地通過引用而整體并入本文中。
定義 出于解釋本發明的目的，將使用以下定義，如果需要，任何時候以單數使用的術語也包括其復數形式，并且反之亦然。出于解釋本說明書及其所附權利要求書的目的，當以下提出的任何定義與其它任何文件(包括通過引用并入本文中的任何文件)中的詞語的用法相抵觸時，將總是以下面提出的定義為準，除非清楚地表明了相反的意思(例如在術語最初使用的文件中)。除非另有說明或者“和/或”的使用明顯不合適的情況下，本文中“或”的使用總是意指“和/或”。除非另有說明或者“一個或多個”的使用明顯不合適的情況下，本文中“一個”的使用總是意指“一個或多個”。“包含”、“包括”、“含有”的使用可以互換，而且并非意在限制。另外，在對一個或多個實施方案的描述中使用了術語“包含”(“包括”)的情況下，本領域技術人員將理解，在一些具體情況下，所述一個或多個實施方案也可由短語“基本上由...組成”和/或“由...組成”進行描述。
a.)本文中使用的“分析物”意指可測定的感興趣的分子。分析物的非限定性實例包括但不限于蛋白質、肽、核酸(DNA或RNA)、碳水化合物、脂質、類固醇和分子量小于1500道爾頓(Da)的其它小分子。分析物的來源、或包含所述分析物的樣品并不限制其可來自任何來源。分析物可以是天然的或合成的。分析物或包含分析物的樣品的來源的非限定性實例包括細胞或組織、或其培養物(或傳代培養物)。分析物來源的其它非限定性實例包括但不限于粗的或加工的細胞溶解產物、體液、組織提取物、細胞提取物或來自分離過程(比如色譜分離、一維電泳分離、二維電泳分離或毛細管電泳分離)的級分(或部分)。體液包括但不限于血液、尿、糞便、腦液、羊水、淋巴液或腺體分泌的流體。處理的細胞溶解物意指除了溶解細胞所需要的處理以外，還處理所述細胞溶解物以進行對所收集材料的其它處理。例如，所述樣品可以是包含一種或多種分析物的細胞溶解物，所述分析物是通過利用一種或多種蛋白水解酶處理細胞溶解物以消化前體肽和/或蛋白而形成的肽. b.)酯”意指酯和/或硫酯，除非其所使用的上下文中清楚地表明并非如此(例如當參考另外指出的具體結構時)。
c.)本文中所使用的“斷裂”意指共價鍵的斷裂。
d.)本文中所使用的“片段”/“斷裂”(“fragment”)意指斷裂的產物(名詞)或引起斷裂的操作(動詞)。
e.)本文中所用的“水合物形式”意指化合物或混合物的任何水合狀態或化合物的多于一種的水合狀態。例如，本文中所述標記試劑可以是半水合物、一水合物、二水合物等。此外，本文中所述標記試劑的樣品可同時包含一水合物、二水合物和半水合物的形式。
f.)本文中所用的鹵素基團指-F、-Cl、-Br或-I。
g.)本文中對化合物所使用的“同位素富集的”意指已經富集了一種或多種重原子同位素(例如穩定的同位素，比如氘、13C、15N、18O、37Cl或81Br)的化合物(例如標記試劑)。在一些實施方案中，也可以使用不穩定的同位素(例如14C或3H)。“富集的”意指重原子同位素的量超過了天然同位素的豐度。在不同的實施方案中，同位素富集的化合物可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個同位素富集的部位。
因為同位素富集并不是100％的有效，所以在化合物的樣品中可存在處于較少的富集狀態且具有較低質量的雜質。同樣，由于過于富集(例如不期望的富集)以及由于天然同位素的豐度，可在化合物的樣品中存在較大質量的雜質。在一些實施方案中，所引入的每種重原子同位素可以至少80％的同位素純度存在于同位素富集部位。在一些實施方案中，所引入的每種重原子同位素可以至少93％的同位素純度存在于同位素富集部位。在一些實施方案中，所引入的每種重原子同位素可以至少96％的同位素純度存在于同位素富集部位。在一些實施方案中，所引入的每種重原子同位素可以至少98％的同位素純度存在于同位素富集部位。
h.)本文中所使用的“同位素富集部位”意指化合物中的部位，在所述部位用重的原子同位素替代該原子的輕的同位素(例如13C替代12C，18O替代16O，15N替代14N，或者氘替代氫)。
i.)本文中對于化合物所使用的“輕”意指未用重原子同位素進行富集的化合物。本文中對于原子所使用的“輕”意指所述原子最低質量的同位素。本文中對于化合物所使用的“重”意指用至少一種重原子進行同位素富集的化合物。本文中對于原子所使用的“重”意指所述原子的重質量同位素。
j.)本文中所使用的“標記試劑”意指適于標記用于測定的分析物的結構部分。術語標記物(“label”)與術語標簽(“tag”)和標記(“mark”)以及其它等價的術語和短語是同義的。例如，標記的分析物(labeledanalyte)還可以稱為標記的分析物(tagged analyte)或標記的分析物(marked analyte)。因此，術語“標記物”(“label”)、“標簽”(“tag”)、質量標簽(“mass tag”)、標記(“mark”)以及這些術語的派生詞是等價的和可互換的，并且指適于標記或者已經標記用于測定的分析物的結構部分。有時候標記試劑可稱為標簽試劑(“tagging reagent”)或質量標簽試劑(“mass-tagging reagent”)。
k.)本文中所使用的“天然同位素豐度”意指，基于自然界中天然占優勢的一種或多種同位素，在化合物中發現的一種或多種重同位素的水平(或分布)。例如，得自活植物材料的天然化合物通常包含相對于12C的約1.08％的13C。
l.)本文中所使用的同量異位物(isobar)是具有相同的標稱總質量的在結構上不能區分的化合物(除了重原子同位素的同位素含量和/或分布以外)。為免除疑惑，根據本文中的定義，圖4a的化合物1-4是同量異位的。相比較而言，本文中所使用的異構體是具有相同的標稱總質量的在結構上能區分的化合物。示例性的異構的同量異位物在圖4b中說明。
m.)本文中所使用的“載體”、“固相載體”(“solid support”、“solidcarrier”)或樹脂意指任何固相材料。固相載體包括術語比如“載體”(“support”)、“合成載體”、“固相”、“表面”、“膜”和/或“載體”(“support”)。固相載體可由有機聚合物組成，比如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺、以及其共聚物和接枝物。固相載體還可以是無機物，比如玻璃、二氧化硅、可控孔度玻璃(CPG)、或反相二氧化硅。固相載體的外形可以為珠、球、微粒、顆粒、凝膠、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本平面的、或非平面的。固相載體可以是多孔的或非多孔的，并且可具有膨脹或非膨脹的性質。固相載體可以設計成池、凹陷或其它容器、管、特征或位置的形式。多個固相載體可以設置為處于陣列的不同位置，對試劑的自動遞送是可尋址的，或通過檢測方法和/或設備尋址。
n.)本文中所使用的“樣品或其部分”或“樣品部分”可用于指樣品的一部分。樣品的部分可以通過簡單取出樣品的一部分而得到，或者其可通過進行使樣品被分級為兩個或多個部分的分離過程而得到。除非說明書的內容中另外指出，這些術語是等價的并可互換，意指樣品產生的任何類型的部分。
o.)本文中所使用的“信號離子”和“報告物離子”是可以互換的，并且都是指通過使標記試劑或標記的分析物斷裂而由報告物部分產生的具有獨特質量的報告物離子。信號離子或報告物離子鑒定所述用于標記分析物的獨特的標記試劑，其在MS/MS分析中的峰強度可與存在于分析樣品中的標記的分析物的量相關。本文中所使用的信號離子或報告物離子有時候僅稱為報告物。本文中所使用的報告物部分有時候也僅稱為報告物。應當理解，報告物部分指與標記試劑、標記的分析物或其片段相結合的基團，報告物離子指通過斷裂連接所述報告物部分和所述標記試劑、標記的分析物或其片段的鍵而形成的片段。因此，在本文中使用“報告物”時將表明其本義。還應當理解，短語“獨特的報告物部分”與“具有獨特質量的報告物部分”是等價的并可互換，“獨特的報告物離子”與“具有獨特質量的報告物離子”是等價的并可互換。
p.)本文中所使用的術語“鹽形式”包括化合物的鹽或化合物的鹽混合物。此外，化合物的兩性離子形式也包含在術語“鹽形式”中。具有胺或其它堿性基團的化合物的鹽例如可以通過使之與合適的有機酸或無機酸(比如鹽酸、氫溴酸、乙酸、高氯酸等)反應而得到。具有季銨基團的化合物也可含有反離子比如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根離子、高氯酸根離子等。具有羧酸或其它酸性官能團的化合物的鹽可通過使所述化合物與合適的堿(例如氫氧化物堿)反應而制得。因此，酸官能團的鹽可具有反離子，比如鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子等。
q.)本文中所使用的“合成化合物”意指通過操縱過程包括操縱天然發生途徑而產生的化合物。因此，可利用合成化學技術制備合成化合物。然而，本文中所使用的“合成化合物”還意指包括例如通過酶方法而產生的化合物，所述酶方法包括例如給有機體(比如細菌或酵母)提供同位素富集的化合物，所述有機體改變這些化合物從而產生本文中所述的同位素富集的標記試劑或所述標記試劑的中間體。
r.)本文中所使用的“合成富集的”指操縱合成或天然過程從而產生本文中所述的同位素富集的標記試劑、或所述標記制劑的中間體。
s.)已公認，原子或分子的質量可以是近似的，常常是最接近的整個原子質量單位或最接近的以十或以百計的原子質量單位。本文中所使用的“總質量”指在以下范圍內的絕對質量和近似質量，所述范圍中不同原子類型的同位素的使用在質量上如此接近以至于它們在平衡所述報告物和/或連接物部分的質量(從而所述報告物/連接物組合的總質量在同分異構和/或同量異位的標記試劑的組或試劑盒中相同)的目的上在功能上是等價的，而無論所使用的不同同位素類型在質量上非常小的差異能否檢測得到。
例如，氧的常見同位素具有16.0(實際質量15.9949)和18.0(實際質量17.9992)的總質量，碳的常見同位素具有12.0(實際質量12.00000)和13.0(實際質量13.00336)的總質量，氮的常見同位素具有14.0(實際質量14.0031)和15.0(實際質量15.0001)的總質量。雖然這些值是估計的，但本領域技術人員將會理解，如果在組中的一個標記物內的同位素富集部位使用18O同位素，那么額外的2個質量單位(超出總質量16.0的氧同位素)可以例如通過引入其它的標記物而在所述包含16O組的不同標記物中補償兩個碳13C原子替代兩個12C原子，兩個15N原子替代14N，甚至一個13C原子和一個15N原子替代12C和14N以補償給18O。通過此方法，所述組內的兩個不同標記物可具有相同的總質量，因為在使用兩個13C原子(替代兩個12C原子)、兩個15N原子(替代兩個14N原子)、一個13C和一個15N(替代12C和14N)或一個18O原子(替代一個16O原子)從而使得所述組或試劑盒的所有標記物在質量上增加兩個道爾頓時，它們之間的質量差別實際上非常小，不會實質上妨礙所述分析。
這一點可以參考圖4a得到說明。在圖4a中，化合物3(圖4a；分子式C513CH1115N2O)的報告物/連接物組合具有兩個15N原子和一個13C原子，總理論質量為130.085。相比而言，同量異位物1(圖4a；分子式C513CH11N218O)具有一個18O原子和一個13C原子，總理論質量為130.095。盡管所述報告物/連接物部分存在微小的絕對質量差異(質量130.095與質量130.085)，化合物1和3可以是同量異位物，它們除了重原子同位素的含量以外，在結構上不可區分。然而，出于本發明的目的，化合物1和3的報告物/連接物部分的總質量都是130.1，因為無論質譜儀是否靈敏到足以測量同量異位物1和3所產生的報告物離子的絕對質量間的微小差異，都不會對分析造成妨礙。
同樣，參考圖4b，舉例說明了兩種同分異構的同量異位物，其中化合物5和6的報告物/連接物部分的質量分別是144.111和144.100。出于本發明的目的，這些化合物的報告物/連接物部分的總質量都是144.1，因為無論質譜儀是否靈敏到足以測量同量異位物5和6所產生的報告物離子的絕對質量間的小差異，都不會對分析造成妨礙。
從圖4a和4b清楚可見，相同重原子同位素在結構內的分布對于產生同分異構和/或同量異位的標記試劑的組而言并不是唯一的考慮因素。可以將重原子同位素類型混合以實現所期望總質量的同分異構體和/或同量異位物。這樣，重原子同位素的選擇(組合)及其分布都是在制備可用于本發明實施方案的同分異構和/或同量異位的標記試劑時可以考慮的因素。
t.)本文中所使用的術語“烷基”指直鏈或支鏈的C2-C8烴或環狀C3-C8烴(即環烷基，比如環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環己基亞甲基)，其可以是完全飽和的。當在本文中使用時，術語“烷基”指可被取代或未取代的基團。術語“烷基”還意指其中烷基鏈上的一個或多個亞甲基可以被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些實施方案中，烷基可以是直鏈或支鏈的C2-C6烴或環狀C3-C6烴，其可以是完全飽和的。
u.)本文中所使用的術語“亞烷基”指包含連接到至少兩個結構部分的至少兩個點的直鏈或支鏈的烷基鏈或環烷基基團(例如{CH2}-(亞甲基)、-{CH2CH2}-(亞乙基)、

等，其中括號{}表示連接的點)。當在本文中使用時，術語“亞烷基”指可被取代或未取代的基團。術語“亞烷基”還意指其中亞烷基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可以被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些實施方案中，亞烷基可以是C1-C10烴。在一些實施方案中，亞烷基可以是C2-C6烴。
v.)本文中所使用的術語“烯基”指包含一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈C2-C8烴或環狀C3-C8烴。當在本文中使用時，術語“烯基”指可以被取代或未取代的基團。術語“烯基”還意指其中烯基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可以被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些實施方案中，烯基可以是具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的C2-C6烴或環狀的C3-C6烴。
w.)本文中所使用的術語“亞烯基”指包含連接到至少兩個部分上的兩個點的烯基。當在本文中使用時，術語“亞烯基”指可以被取代或未取代的基團。術語“亞烯基”還意指其中亞烯基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。
x.)本文中所使用的術語“炔基”指包含一個或多個叁鍵的直鏈或支鏈C2-C8烴或環狀C3-C8烴。當在本文中使用時，術語“炔基”指可以被取代或未取代的的基團。術語“炔基”還意指其中炔基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些實施方案中，炔基可以是具有一個或多個叁鍵的直鏈或支鏈的C2-C6烴或環狀的C3-C6烴。
y.)本文中所使用的術語“亞炔基”指包含連接到至少兩個部分上的兩個點的炔基。當在本文中使用時，術語“亞炔基”指可以被取代或未取代的的基團。術語“亞炔基”還意指其中亞炔基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。
z.)本文中所使用的術語“脂肪族”指如上述定義的任何直鏈、支鏈或環狀的烷基、烯基和炔基部分。當在本文中使用時，術語“脂肪族”指可被取代或未取代的基團。
aa.)本文中所使用的術語“芳基”(單獨或作為另一結構(例如芳基烷基等)的一部分時)指碳環芳香性基團，比如苯基。芳基還包括稠合的多環芳香環系，其中碳環芳香環與其它碳環芳香環稠合(例如1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等)，或者其中碳環芳香環與一個或多個碳環非芳香環稠合(例如四氫萘、茚滿等)。本文中所使用的術語“芳基”指可被取代或未取代的基團。
ab.)本文中所使用的術語“雜芳基”指包含1、2、3或4個彼此獨立地選自氮、硫和氧的雜原子的芳香雜環。本文中所使用的術語“雜芳基”指可被取代或未取代的基團。雜芳基可以與一個或兩個環稠合，比如環烷基、芳基或雜芳環。雜芳基與分子的連接點可以是雜芳基、環烷基、雜環烷基或芳基環，并且所述雜芳基可以通過碳原子或雜原子連接。雜芳基的實例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、異噁唑基、異噻唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、吲嗪基、咪唑并吡啶基、吡唑基、三唑基、噁唑基、四唑基、苯并咪唑基、苯并異噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、吲哚基、四氫吲哚基、氮雜吲哚基(azaindolyl)、咪唑并吡啶基、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并[2，3]嘧啶基、吡唑并[3，4]嘧啶基或苯并(b)噻吩基，其中每個基團都可任選地被取代。
ac.)本文中所使用的術語“亞芳基”指包含至少連接到兩個結構部分上的至少兩個點的芳基或雜芳基(例如亞苯基等)。亞芳基與碳環非芳香環稠合的連接點可以在芳香環、非芳香環中的任一個上。本文中所使用的術語“亞芳基”指可被取代或未取代的基團。
ad.)本文中所使用的術語“芳基烷基”指通過亞烷基連接物與其它結構部分連接的芳基或雜芳基。本文中所使用的術語“芳基烷基”指可被取代或未取代的基團。術語“芳基烷基”意指其中芳基烷基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。
ae.)本文中所使用的術語“亞芳基烷基”指具有與至少兩個結構部分相連的至少兩個點的芳基烷基。連接的第二點可以在芳環或亞烷基中的任一個上。本文中所使用的術語“亞芳基烷基”指可被取代或未取代的基團。術語“亞芳基烷基”還意指其中亞芳基烷基的烷基鏈上的一個或多個亞甲基(如果有的話)可被雜原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。當亞芳基烷基被取代時，取代基可以在所述亞芳基烷基的芳香環或亞烷基部分中的任一個或兩個上。
af.)本文中所使用的術語“任選取代的”和“取代或未取代的”是等價和可互換的。任何烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或亞芳基烷基的合適取代基包括在本發明實施方案中所使用的反應條件下穩定的任何取代基。合適取代基的非限定性實例可包括烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環己基等)、鹵代烷基(例如三氟甲基、2，2，2-三氟乙基等)、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、芳基(例如苯基)、芳基烷基(例如芐基)、硝基、氰基、季銨化的氮原子或鹵素基團(例如氟、氯、溴和/或碘)。
此外，烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或亞芳基烷基的任何部分也可以被＝O或＝S取代。
ah.)本文中所使用的術語“活性酯”指可在堿性條件下易于與胺、醇和某些硫醇反應而分別得到酰胺、酯和硫酯的化合物。另外請參考Leo A Paquette，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis.Vol.2，John Wiley and Sons，New York，1995，其作為證據表明活性酯是有機化學領域中沿用已久的術語。
ai.)本文中所使用的術語“雜環”指在所述一個或多個環中包含至少兩種不同元素的原子的任何環狀分子結構。另外請參考OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Oxford UniversityPress，Oxford，1997，其作為證據表明雜環是有機化學領域中沿用已久的術語。
aj.)本文中所使用的術語“離去基團”指在取代反應或置換反應中離去的任何帶電荷或不帶電荷的原子或基團，其被認為是反應基質的殘余物或主要部分。另外請參考Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Oxford University Press，Oxford，1997，其作為證據表明離去基團是有機化學領域中沿用已久的術語。
ak.)本文中所使用的術語“保護基團”指與分子中的官能團反應并與之結合以防止所述官能團受到該分子隨后參與的反應的影響的化學基團，其隨后可被脫除從而再生未保護的官能團。另外請參考OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Oxford UniversityPress，Oxford，1997，其作為證據表明保護基團是有機化學領域中沿用已久的術語。
具體實施方案 應當理解，在此“概要”部分中的以下討論可涉及本發明的各種實施方案的一些或全部。
1.概要 標記試劑 如前所述，標記試劑通常包含報告物部分、平衡物部分(或連接物部分)和反應活性基團(圖1a)。本文中公開的一些新型標記試劑可由通式I’所代表，包括其鹽形式和/或其水合物形式
報告物 平衡物 其中Z’代表反應活性基團或所述反應活性基團的離去基團，其中所述原子或基團X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面進行更詳細地描述。對于式I’所代表的化合物而言，標出了所述分子的報告物部分和平衡物部分。其它同量異位的標記試劑的式子可見于圖1d中。
反應活性基團 在方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案中使用的標記試劑的反應活性基團(有時用縮寫“RG”表示)可以是親電性的或親核性的基團，其能與樣品的一種或多種反應活性分析物的一種或多種官能團反應。應當理解，在一些情況下，可認為反應活性基團包含與連接物(平衡物)相結合的原子或基團。例如，如果反應活性基團是活性酯或酰基鹵基團，那么出于平衡同分異構和/或同量異位的標記試劑組中的報告物部分的質量的目的，所述活性酯的羰基或酰基鹵在一些情況下也可被認為是與連接物結合的，其中羰基碳存在于標記試劑和標記的分析物中。因此，在一些實施方案中，反應活性基團可理解為僅代表反應活性基團的離去基團。
還應當理解，當反應活性基團由下述一些具體結構部分代表時，分析物可通過一個或多個其它的原子或基團與連接物(平衡物)連接，所述其它的原子或基團可以被認為或不被認為是所述連接物(平衡物)的一部分。
反應活性基團可以預先存在或者其可在原位制備。反應活性基團的原位制備可以在缺乏反應活性分析物的情況下進行或者其可在存在反應活性分析物的情況下進行。例如，羧酸基團可以用水溶性的碳二亞胺(例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；EDC)進行原位修飾從而制得親電性基團，所述親電性基團能與分析物的親核物比如烷基或芳基胺反應。在一些實施方案中，利用EDC對標記試劑的羧酸基團的活化可以在含胺(親核物)分析物的存在下進行。在一些實施方案中，所述含胺(親核物)分析物也可以在與EDC的初始反應進行之后加入。在另一些實施方案中，可通過原位除去保護基團而原位產生反應活性基團。因此，由本發明實施方案的方法、混合物、試劑盒和/或組合物可以預料到通過親核物和/或親電物的反應而影響分析物衍生化的任何存在的或新產生的試劑。
在標記試劑的反應活性基團是親電物的情況下，所述親電物能與一種或多種分析物的合適的親核基團反應。在標記試劑的反應活性基團是親核物的情況下，所述親核物能與一種或多種分析物的合適的親電基團反應。許多合適的親核基團和親電基團對是化學和生物化學領域中已知并常用的。包括可與分析物(例如蛋白質、肽、核酸、碳水化合物、脂質、類固醇或質量小于1500道爾頓的其它小分子)結合的以實現其衍生化的合適的親核或親電基團的試劑的非限定性實例描述于PierceLife Science & Analytical Research Products Catalog & Handbook(aPerstorp Biotec Company)，Rockford，IL 61105，USA中。其它合適的試劑是本領域中眾所周知的，并且它們可由多個其它供貨商如Sigma-Aldrich處商購得到。
標記試劑的反應活性基團可以是胺反應活性基團。例如，胺反應活性基團可以是活性酯。活性酯在肽合成中是眾所周知的，并且其指在通常用于肽合成的條件下可易于與氨基酸的N-α胺反應的某些酯(參見Leo A Paquette，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，Vol.2.John Wiley and Sons，New York，1995)。所述胺活性酯基團可以是N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮酯(Dhbt)、羥基吡咯烷酮酯(NHP)、2，4-二鹵代苯基酯(參見圖8和以下標題“標記試劑制備方法的舉例說明”下的內容)、2，2，2-三氟乙基酯或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯。例如，活性酯的離去基團(在本文的一些實施方案中通常稱為Z’，比如在此情形下，變量RG僅與反應活性基團的離去基團部分是同義的)可以由以下各式所代表
其中X’是-O-或-S-，并且每個X”彼此獨立地是-F、-Cl、-Br或-I(關于代表性化合物的活性酯的合成的更詳細描述請參見美國公開專利申請No.US 2005-0148771 A1)。上述描述的都是活性酯的醇或硫醇離去基團，其中所述醇或硫醇離去基團可通過氨基酸的N-α-胺與所述活性酯基團的羰基碳反應而被置換。本領域普通技術人員應當清楚，可利用公知的方法及本文中的公開內容制備本文中所描述的任何合適的標記/標簽試劑的活性酯(例如N-羥基琥珀酰亞胺基酯)(另外請參照例如GregT.Hermanson(1996).＂The Chemistry of Reactive Groups＂in＂Bioconjugate Techniques＂Chapter 2 pages 137-165，Academic Press，(New York)；還請參照Innovation And Perspectives In Solid PhaseSynthesis，EditorRoger Epton，SPCC(UK)Ltd，Birmingham，1990)。
在一些實施方案中，標記試劑的反應活性基團可以是混合酸酐，因為已知混合酸酐與胺基團有效地反應從而產生酰胺鍵。混合酸酐是公知的并且可利用有機化學和/或肽化學領域內常用的方法進行制備。
在一些實施方案中，標記試劑的反應活性基團可以是酰鹵基團，比如酰氟基團(參見Carpino等J.Am.Chem.Soc.，1129651(1990))或酰氯基團。
在一些實施方案中，標記試劑的反應活性基團可以是硫醇反應活性基團。例如，所述硫醇反應活性基團可以是馬來酰亞胺、烷基鹵化物、α-鹵代酰基的芳基鹵化物、α-鹵代硫酮或α-鹵代亞胺。鹵化物或鹵代意指氟、氯、溴或碘的原子。所述硫醇反應活性基團是眾所周知的并可利用肽化學領域中常用的方法進行制備。
在一些實施方案中，標記試劑的反應活性基團可以是羥基反應活性基團。例如，所述羥基反應活性基團可以是三苯甲基鹵化物或甲硅烷基鹵化物活性部分。所述三苯甲基鹵化物活性部分可以是取代的(例如X”’-甲氧基三苯甲基、X”’-二甲氧基三苯甲基、X”’-三甲氧基三苯甲基等)或未取代的，其中X是連接反應活性基團和連接物(即平衡物)的鍵。所述甲硅烷基活性部分可以是烷基取代的甲硅烷基鹵化物，比如X”’-二甲基甲硅烷基、X”’-二三乙基甲硅烷基(X”’-ditriethylsilyl)、X”’-二丙基甲硅烷基、X”’-二異丙基甲硅烷基等)，其中X”’是連接反應活性基團和連接物(即平衡物)的鍵。所述反應活性基團是眾所周知的并可利用核酸化學領域中常用的方法進行制備。
在一些實施方案中，標記試劑的反應活性基團可以是親核物，比如氨基、羥基或硫醇基。在一些實施方案中，所述親核反應活性基團可以是氨基烷基、羥基烷基或硫代烷基。所述反應活性基團是眾所周知的并可利用有機化學領域中常用的方法進行制備。
報告物部分 本發明實施方案中使用的標記試劑的報告物部分(有時候使用縮寫“RP”表示)可以是具有可測定的獨特質量(或質荷比)的基團。因此，每組的報告物部分可具有獨特的總質量。不同的報告物部分可包含一個或多個重原子同位素以達到其獨特的總質量。例如，存在著碳(12C、13C和14C)、氮(14N和15N)、氧(16O和18O)或氫(氫、氘和氚)的同位素，并且可用于制備不同組的報告物部分。這些并非是限制性的，因為其它的輕原子和重原子同位素也可以用于報告物部分中。適于制備包含輕和重原子同位素的報告物部分的基礎起始原料可從各商業來源購得，比如Cambridge Isotope Laboratories、Andover、MA(參見www.isotope.com的名單或“基礎起始原料”)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支機構)。Cambridge Isotope Laboratories和Isotec也會按照客戶合成協議制備所需要的化合物。同上。
報告物部分可包含固定的電荷或者能被離子化。因為報告物部分可包含固定的電荷或者能被離子化，所以標記試劑可能以鹽(或鹽的混合物)或兩性離子的形式被分離或者用于標記反應活性分析物。報告物部分(或報告物離子)的離子化使其可在質譜儀中進行測定。因此，報告物部分在標記的分析物中的存在可作為片段離子(有時稱為信號離子(或報告物離子))而測定。當離子化后，報告物離子可包含一個或多個凈正電荷或凈負電荷。因此，報告物離子可包含一個或多個酸性基團和/或堿性基團，因為這些基團可在質譜儀中容易地離子化。例如，報告物部分可包含一個或多個氮原子(正電荷)或一個或多個可離子化的酸性集團，比如羧酸基團、磺酸基團或磷酸基團(負電荷)。包含至少一種堿性氮的報告物部分的非限定性實例包括取代或未取代的含有嗎啉、哌啶或哌嗪的化合物。
獨特的報告物部分可與感興趣的樣品相結合，從而標記具有所述獨特報告物部分的樣品的一種或多種分析物。這樣，有關獨特報告物部分(通常作為報告物離子而被檢測到)的信息可與有關樣品的一種或全部分析物的信息相關聯。然而，當測定報告物離子時，所述獨特的報告物部分不必與分析物物理性連接，而是在標記的分析物的離子被斷裂從而產生子片段離子(daughter fragment ion)和報告物離子后，報告物離子的獨特的總質量例如可在串聯的質量分析儀的第二次質量分析中進行測定。測定的報告物離子可用于鑒定測定的分析物所來源的樣品。此外，所述獨特的報告物離子相對于其它報告物離子或相對于與校正標準相關的報告物離子(例如用具體報告物標記的分析物)的量可用于測定樣品中分析物的相對量和/或絕對量(常以濃度和/或量來表示)。因此，比如具體樣品中的一種或多種分析物的量的信息可與用于標記每種具體樣品的報告物部分相關聯。在對一種或多種分析物的鑒定也被測定的情況下，所述信息可與涉及不同報告物離子的信息相關聯，從而有利于對一個或多個樣品中每種標記的分析物的鑒定和量的測定。
報告物部分可包含與取代或未取代的N-烷基化的乙酸部分的亞甲基碳共價鍵合的氮原子，其中所述取代或未取代的亞甲基基團而非羧酸基團是報告物的一部分。羧酸基團可用于將報告物與連接物連接起來。氮原子可被一個、兩個或三個基團烷基化。例如，含有氮原子的部分可以是取代的仲胺，比如二甲胺、二乙胺或二丙胺。
報告物部分可以是包含環氮原子的5、6或7元雜環，所述環氮原子被取代或未取代的乙酸部分N-烷基化，分析物通過N-烷基乙酸部分的羰基碳連接到乙酸部分上，其中所述取代或未取代的亞甲基基團而非羧酸基團是報告物的一部分。雜環可以是芳香的或非芳香的。因此，報告物部分可以由式Y-J-表示，其中基團Y代表5、6或7元雜環，基團J代表乙酸部分的取代或未取代的亞甲基。雜環可以是取代的或未取代的。例如，雜環部分的取代基可包括烷基、烷氧基和/或芳基。取代基可包括保護或未保護的基團，比如適于將分析物連接到載體上的胺、羥基或硫醇基團。雜環可包含其它的雜原子比如一個或多個硅、氮、氧和/或硫原子。
可以選擇報告物部分以便其在對分析物進行分析的通常條件下基本上不發生亞斷裂(sub-fragment)。為清楚起見，這是個可選的而非必需的特征。可以選擇報告物，使得在向質譜儀中標記的分析物施加離解能使其斷裂的條件下報告物基本上不發生亞斷裂。“基本上不發生亞斷裂”意指在對感興趣的分析物進行成功分析時，在上述背景噪音下難以或不可能檢測到報告物的片段。
在一些實施方案中，可以有意進行選擇，使報告物離子的總質量不同于尋求測定的分析物的質量或分析物的任何預計片段的質量。例如，在蛋白質或肽是分析物的情況下，可選擇報告物離子的總質量，使之不同于任何天然存在的氨基酸或肽，或預計的其片段離子。這可有助于分析物的測定，因為基于分析物，具有同樣一致質量的任何可能樣品成分的缺乏可增加任何分析結果的可信度。肽的質量范圍的實例可見于表1中，其中很少背景可預測到。
表1選擇與肽分析相關的標記物片段離子m/z的可能的“安靜區域” 報告物部分可以是非聚合的。可以選擇報告物部分以產生m/z小于250原子質量單位(amu)的信號離子。可以選擇報告物部分以產生m/z小于200amu的信號離子。可以選擇報告物部分以產生m/z小于150amu的信號離子。這些小分子可容易地在第二級質譜分析中測定，其不含有其它的在一級質譜分析中具有同樣一致質量的樣品成分。在本文中，可對在一級質譜分析中測定的所選離子進行二級質譜分析，通常在串聯質譜儀(或者，例如通過單級儀器中的源后衰變)中進行。因為具有特定質荷比的離子可特定地從一級質譜分析中選擇出來用于可能的斷裂和進一步的質量分析，所以來自一級質譜分析的未選擇的離子不被帶到二級質譜分析中并因此不會污染二級質譜分析的譜圖。此外，質譜儀的靈敏度和檢測器的線性(出于定量目的)在此低質量范圍內可相當穩健。而且，現階段的質譜儀技術可允許在此質量范圍內小于1道爾頓的基線質量分辨率。
平衡物(或連接物)部分 可用于本發明實施方案的標記試劑的平衡物(或連接物)部分(有時使用縮寫“LK”表示)將報告物部分與分析物或報告物部分與反應活性基團連接起來，取決于與分析物的反應是否已發生。可選擇連接物以產生中性物(即在質譜儀中經歷中性丟失)，其中連接連接物和報告物部分的鍵(RL鍵)以及連接連接物與分析物的鍵(LA鍵)在質譜儀中斷裂。可將連接物設計成當施加解離能級(包括亞斷裂)時發生亞斷裂，從而僅產生連接物的中性片段。可設計連接物以產生一種或多種可檢測的片段。
連接物部分可包含一種或多種重原子同位素，從而其質量補償給(用于混合物的每種標記的分析物的或用于標記試劑組和/或試劑盒的標記試劑的)報告物部分間的總質量差異。而且，報告物/連接物組合(即報告物/連接物部分)的集合總質量(即作為一個整體的總質量)對于混合物中每種標記的分析物而言或對于標記試劑組和/或試劑盒的標記試劑而言可以是相同的。更具體地，連接物部分可補償不同樣品中標記的分析物的報告物部分間的總質量差異，其中報告物部分的獨特的總質量與標記的分析物所來源的樣品相關聯，并且報告物/連接物組合的集合總質量對于樣品混合物中的每種標記的分析物而言都是相同的，而不管分析物所來源的樣品如何。這樣，當進行標記然后混合以產生樣品混合物時，在兩個或更多個不同樣品中的相同分析物的總質量可具有同樣的總質量。
例如，標記的分析物或用于標記分析物的標記試劑組和/或試劑盒的標記試劑可以是同分異構的和/或同量異位的。因此，如果在質譜儀中從樣品混合物的初始質量分析中選擇具有特定質荷比的離子(取自樣品混合物)(即選擇的離子)，則來自構成樣品混合物的不同樣品的同樣分析物可代表與其在樣品混合物中的各自濃度和/或量成比例的所選擇的離子。因此，連接物不僅連接報告物和分析物，它還能用于補償獨特報告物部分的差異質量從而調和不同樣品中標記的分析物的報告物/連接物部分的總質量(參照圖2a/2b和3a/3b)。
因為連接物可用作報告物部分的質量平衡物，所以連接物中原子的數目越大，則標記試劑組和/或試劑盒的不同同分異構的/同量異位的標記試劑的可能數目也越大。換言之，通常連接物包含的原子數目越大，則存在的可能的報告物/連接物組合就越多，因為同位素可在連接物的大多數位置取代從而產生連接物部分的異構體和/或同量異位物，其中所述連接物部分用于補償報告物部分的差異質量并因此產生獨特的同分異構和/或同量異位的標記試劑組。這些不同的標記試劑組尤其適合同一和/或不同樣品中分析物的多重分析。
在標記試劑組和/或試劑盒中的標記試劑的總數目可以是兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個或更多。在組和/或試劑盒中的標記試劑的多樣性僅受到報告物和連接物部分的原子數目、取代輕原子同位素的可用的重原子同位素以及不同合成構型(其中同位素可通過合成而置入)的限制。然而，如前文所表明，多種同位素富集的基礎起始原料可容易地從制造商如CambridgeIsotope Laboratories和Isotec處得到。這些同位素富集的基礎起始原料可在制備同分異構和同量異位的標記試劑組的合成過程中使用，或者用于生產在制備同分異構的和同量異位的標記試劑組的合成過程中使用的同位素富集的基礎起始原料。此方面在以下標題“標記試劑制備方法的舉例說明”下進行了更詳細的論述。
制備適用于標記試劑組的同量異位標記試劑的一些實施例在下面進行更詳細地論述。例如，連接物部分可由式1#代表
其中由X1、X2、K、L、R1和R2所代表的原子或基團在以下進行了更詳細的描述。
報告物/連接物組合(即報告物/連接物部分) 標記試劑可包含彼此直接連接的報告物部分和連接物部分。如上所述，報告物/連接物部分對于標記試劑組和/或試劑盒中的每個成員而言在總質量上可以是相同的。此外，連接報告物部分和連接物部分的鍵經設計以便當施加解離能級時斷裂所選離子的至少一部分，從而從連接物部分和/或連接物/分析物部分釋放報告物離子。因此，可在MS/MS分析中直接檢測報告物離子的總質量(在質譜儀中作為質比(即m/z)而被檢測到)及其強度。
報告物/連接物部分可包含在標記試劑組或試劑盒中的各種標記試劑的相同或不同重原子同位素的各種組合。在科學文獻中，這有時被稱為“編碼”(“coding”)、“同位素編碼”(“isotope coding”)或簡稱為“編碼”(“encoding”)。例如，Abersold等已公開了同位素編碼的親和力標簽(ICAT；參見WO00/11208)。在一方面，Abersold等的試劑與本發明的標記試劑的不同之處在于Abersold沒有教導兩種或更多種相同質量的標記試劑，比如同分異構和/或同量異位的標記試劑。相反，Abersold等教導了其標記試劑的“輕”和“重”的形式。
在一些實施方案中，報告物和/或連接物部分可包含可用于將標記試劑或標記的分析物固定到載體上的原子或基團。固定可以是直接或間接的。例如，在一些實施方案中，如果與報告物和/或連接物結合的原子或基團(例如報告物和/或連接物的烷基胺取代基)與載體的反應活性基團(例如可斷開的連接物)直接相互作用以實現固定，則可發生直接固定。相比而言，如果例如將報告物和/或連接物的取代基(例如報告物和/或連接物的烷基胺取代基)修飾(例如被生物素化)并且修飾基團與載體(例如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素)的反應活性基團相互作用以實現固定，則發生間接固定。因此，本發明涉及其中分析物可與載體結合的標記試劑反應的實施方案，其中每種載體包含獨特的標記試劑，從而不同的樣品與不同的載體反應，并且本發明涉及其中每種不同的樣品與不同的標記試劑反應并且反應產物此后被固定到相同或不同的載體上的實施方案。在每一種情況下，樣品混合物通常都通過利用質譜儀將標記的分析物從用于分析的載體上斷開而得到(參見圖5)。
質譜儀/質譜法(MS) 可使用具有選擇并斷裂分子離子的能力的串聯質譜儀和其它質譜儀實踐本發明的方法。串聯質譜儀(以及在較次要地位上的單級質譜儀)具有根據分子離子的質荷比(m/z)選擇并斷裂分子離子以及然后記錄所得到的片段(子片段)離子譜的能力。更具體地，通過對所選離子施加解離能級(即碰撞誘導解離(CID))可產生子片段離子譜。例如，可從一級質譜分析中選擇對應于具有特定m/z比的標記的肽，在二級質譜分析中對其進行斷裂和再分析。能夠進行這樣的串聯質量分析的代表性儀器包括但不限于磁性四區(magnetic four-sector)質譜儀、串聯飛行時間質譜儀、三重四極桿質譜儀、離子阱質譜儀和混合四極桿飛行時間(Q-TOF)質譜儀。
這些類型的質譜儀可與各種類型的電離源組合，所述電離源包括但不限于電噴霧離子化(ESI)和基質輔助激光解吸電離(MALDI)。電離源可用于產生第一級質譜分析的帶電物種，其中分析物不具有固定的電荷。其它的質譜法儀器和斷裂方法包括MALDI-MS儀器中的源后衰變和使用MALDI-TOF(飛行時間)-TOF MS的高能量CID。關于串聯質譜儀的新近綜述請參見R.Aebersold和D.Goodlett，MassSpectrometry in Proteomics.Chem.Rev.101269-295(2001)。
通過解離能級(Dissociative Energy Level)的斷裂 眾所周知，鍵的斷裂可作為發生在質譜儀中的過程的結果。而且，可通過給離子施加解離能級而在質譜儀中引起鍵斷裂。例如，解離能級可在質譜儀中通過碰撞誘導解離(CID，有時也稱為碰撞活化的解離或CAD)而產生。質譜領域內的普通技術人員將會理解，用于施加引起斷裂的解離能級的其它示例性技術包括但不限于光解離、電子捕獲解離(ECD)、電子轉移解離(ETD，參見美國公開專利申請No.2005-199804A1和Syka等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA.，101(26)9528-9533(2004))、以及表面誘導解離(SID)。出于解釋本說明書的目的，解離能級還可認為包括任何類型的導致在質譜儀中斷裂的氣相化學反應。
通過碰撞誘導解離的斷裂過程包括通過與惰性氣體碰撞而使所選離子的動能狀態增加到鍵斷裂發生的點。例如，動能可通過與惰性氣體(比如氮氣、氦氣或氬氣)的碰撞而轉移到碰撞池內。可轉移給離子的動能的量與允許進入碰撞池的氣體分子的數目成比例。當存在更多的氣體分子時，更大量的動能可轉移給所選的離子，當存在較少氣體分子時，可轉移較少的動能。
因此，很清楚質譜儀中的解離能級是可以控制的。還公認某些鍵較其它鍵更不穩定。分析物或報告物/連接物部分中的鍵的不穩定性取決于分析物或報告物/連接物部分的性質。因此，可調節解離能級以便分析物和/或標記物(例如報告物/連接物組合)以可測定的方式斷裂。本領域技術人員會理解如何對質譜儀的部件進行這樣的常規調節而實現合適的解離能級，從而將至少一部分的標記的分析物的離子斷裂成離子化的報告物部分和子片段離子。
例如，可將解離能施加給從一級質譜分析中選擇/分離的離子。在串聯質譜儀中，可將解離能級施加給提取的離子，然后將其轉移至二級質譜分析儀。選擇的離子可具有所選的質荷比。質荷比可在由質譜儀的性質所決定的質荷比的范圍內。當使用碰撞誘導解離時，通過使離子通過碰撞池，可將離子從一級質譜分析儀轉移至二級質譜分析儀，在所述碰撞池內可施加解離能級從而產生片段離子。例如，被送至二級質譜分析儀用于分析的離子的實例包括殘留的(未斷裂的)所選離子的一些或一部分、以及報告物離子(信號離子)和標記的分析物的子片段離子。
通過計算機輔助數據庫分析的分析物測定 在一些實施方案中，可基于子離子(daughter-ion)斷裂模式測定分析物，所述子離子斷裂模式通過計算機輔助的與已知或“理論的”分析物光譜的比較而分析。例如，在低能量CID下斷裂的肽離子的子片段離子譜可以認為是許多離散的斷裂事件的總和。共同的命名區分了子片段離子，根據斷裂的酰胺鍵和在鍵斷裂后仍帶電荷的肽片段(Reopstorff等，Biomed.Mass Spectrom.，11601(1988))。在易斷裂的酰胺鍵的N末端一側保留的電荷導致形成b型離子。如果斷裂的酰胺鍵的C末端一側保留電荷，則片段離子稱為y型離子。除了b型和y型離子以外，CID質譜可包含其它的診斷片段離子(子片段離子)。這些包括通過從谷氨酸、賴氨酸和精氨酸中性丟失氨(-17amu)或者從含有羥基的氨基酸(如絲氨酸和蘇氨酸)丟失水(-18amu)而產生的離子。已經觀察到在低能量CID條件下某些氨基酸較其它氨基酸更容易斷裂。對于含有脯氨酸或天冬氨酸殘基的肽而言，這尤其顯而易見，對于天冬氨酰基-脯氨酸鍵來說甚至更是如此(Mak，M.等，Rapid Commun.MassSpectrom.，12837-842(1998))。因此，相比于所有其它氨基酸二聚體組合間的肽鍵，Z”’-pro二聚體或Z”’-asp二聚體的肽鍵(其中Z”’是任意中性氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸)傾向于更不穩定。
因此，對于肽和蛋白質樣品來說，低能量CID譜包含交疊b系列和y系列離子、來自同一肽的內部片段離子、以及亞銨離子(immonium)和其它中性丟失離子的冗余的序列特異性信息。盡管對這樣的CID譜進行解析以從頭組裝母體肽的氨基酸序列是具有挑戰性并耗費時間的，但仍可進行。關于計算機輔助的從頭測序方法的新近進展描述于Huang，Y.，Ross，P，Smirnov，I，Martin，S.和Pappin，D.2003，Proceedings of6th International Symposium on MS in Health and Life Sciences，Aug24-28，2003，San Francisco CA中。在鑒定肽序列方面的最有意義的進展是計算機算法的進展，所述算法使肽CID譜與已存在于蛋白質和DNA序列數據庫中的肽序列相關聯。這些方法通過程序如SEQUEST(Eng，J.等J.Am.Soc.Mass Spectrom.，5976-989(1994))和MASCOT(Perkins，D.等Electrophoresis，203551-3567(1999))而舉例說明。
簡而言之，實驗的肽CID譜(MS/MS譜)與由計算機從得自蛋白質或基因組序列數據庫的肽序列產生的“理論性”子片段離子譜相匹配或相關。此匹配或關聯性基于在MS/MS模式中子片段離子的預測質量與所檢測到的質量之間的相似性。根據此實驗性與“理論性”斷裂模式相符合的程度給可能的匹配性或相關性評分。對于給定的肽氨基酸序列的數據庫檢索的約束條件是如此有鑒別力，以至于單個的肽CID譜即可足以鑒定整個基因組或表達序列標簽(EST)的數據庫中的任何給定蛋白質。其它綜述請參見Yates，J.R.Trends，Genetics，165-8(2000)和Yates，J.R.，Electrophoresis 19893-900(1998)。
因此，對MS/MS譜的子片段離子分析不僅可用于測定標記分析物的分析物，還可用于測定所述被測定的分析物所來源的分析物。例如，在MS/MS分析中肽的鑒定可用于測定蛋白質，所述肽作為酶消化的蛋白質產物從所述蛋白質斷裂而來。可以預見，此分析可用于其它的分析物，比如核酸、脂質和/或類固醇。
RL鍵和LA鍵 報告物部分的原子與連接物部分的原子之間的鍵是RL鍵。連接物部分的原子與分析物的原子之間的鍵是LA鍵。在一些實施方案中，當被施加解離能級時，在至少一部分所選離子中的RL鍵和LA鍵均可斷裂。因此，在一些實施方案中，可在質譜儀中調節解離能級，以便在標記分析物的至少一部分所選離子中的RL鍵和LA鍵均斷裂。
RL鍵的斷裂從分析物釋放出報告物部分，以便可獨立于分析物測定報告物離子。LA鍵的斷裂從分析物釋放出報告物/連接物部分，或者從分析物釋放出連接物，這取決于是否RL鍵已經斷裂。在一些實施方式中，RL鍵可比LA鍵更不穩定。在一些實施方案中，LA鍵可比RL鍵更不穩定。在一些實施方案中，RL鍵和LA鍵可具有同樣的相對不穩定性。簡而言之，在本發明的各種實施方案中，設計使RL鍵斷裂，從而釋放報告物離子，但LA鍵可能斷裂或不斷裂。
在一些實施方案中，當感興趣的分析物是蛋白質或肽時，可調節RL鍵和LA鍵的酰胺(肽)鍵的相對不穩定性。相比于典型的酰胺(肽)鍵，RL鍵、LA鍵或RL鍵和LA鍵均可以更不穩定、同樣穩定或較穩定。例如，在解離能的條件下，與Z”’-pro二聚體或Z”’-asp二聚體相比，RL鍵和/或LA鍵可以較不易于斷裂，其中Z”’是任意天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些實施方案中，RL鍵和LA鍵可在典型酰胺鍵的大約相同的解離能級下斷裂。在一些實施方案中，與典型的酰胺鍵相比，RL鍵和LA鍵可在更高解離能級下斷裂。
在一些實施方案中，可存在RL鍵和LA鍵，以便RL鍵的斷裂導致LA鍵的斷裂，并且反之亦然。在此方法中，RL鍵和LA鍵基本上同時斷裂，以便沒有重要量的分析物或其子片段離子包含部分標記物。“重要量的分析物”意指少于25％、優選少于10％的部分標記的分析物可在質譜儀中(例如在MS/MS分析中)測定到。
在一些實施方案中，因為在質譜儀中(例如在MS/MS分析中)分析物的標記片段和未標記片段之間可存在清楚的界限，所以此特征可簡化來自子片段離子譜的計算機輔助分析的分析物的鑒定，因為不需將標記物殘留物的補償施加給用于分析物的子片段離子的分析的質量計算。此外，因為分析物的片段離子在某些實施方案中是全標記或未標記的(但不是部分標記的)，所以很少存在或不存在由跨越斷裂鍵的同位素分布所引起的質量分散，從而會存在這樣的情況由于應用解離能級而引起標記的分析物的斷裂，導致同位素存在于部分標記的分析物的單個易斷鍵的每一側。
分析物的標記 如前所述，可以通過使分析物的官能團與標記試劑的反應活性基團反應而標記分析物。分析物的官能團可以是親電基團或親核基團中的一種，標記試劑的官能團可以是親電基團或親核基團中的另一種。親電物和親核物可以反應以形成分析物與標記試劑間的共價連接。
標記反應可在溶液中發生。在一些實施方案中，分析物或標記試劑中的一種可以是載體結合的。標記反應有時可以在含水條件下進行。可以為標記生物分子(如蛋白質、肽和/或核酸)而選擇含水條件。標記反應有時可在有機溶劑或有機溶劑的混合物中進行。可以選擇小分子的分析物的有機溶劑。可在廣泛范圍內使用水和一種或多種有機溶劑的混合物。例如，可制備并使用水和約5％到與約95％的一種或多種有機溶劑(v/v)的溶液以標記分析物。在一些實施方案中，可制備并使用水和約50％到與約95％的一種或多種有機溶劑(v/v)的溶液以標記分析物。在一些實施方案中，可制備并使用水和約65％到與約80％的一種或多種有機溶劑(v/v)的溶液以標記分析物。有機溶劑的非限定性的實例包括N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、N-甲基吡咯烷(NMP)和醇類比如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。本領域技術人員根據標記試劑的性質和分析物的性質，利用不超過本領域可獲知的知識和本文中公開的內容以及常規的實驗，將能夠確定促進分析物標記的合適的溶劑條件。
當進行標記反應時，可調節pH。pH可在4-10的范圍內。pH也可在此范圍以外。通常，可通過加入非親核性有機堿而調節非水反應的堿性。合適的堿的非限定性實例包括N-甲基嗎啉、三乙胺和N，N-二異丙基乙胺。或者，可利用生物緩沖劑(比如N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸](HEPES)或4-嗎啉乙磺酸(MES))或無機緩沖劑(比如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉)調節含水溶劑的pH。因為至少反應基團之一可以是親電性的，所以選擇不含任何親核性基團的緩沖劑可能是理想的。在應用常規實驗的條件下，本領域技術人員能夠確定用于調節標記反應的pH的其它緩沖劑，從而促進使用標記試劑對分析物的標記。因此，本領域技術人員將能夠根據標記試劑的性質和分析物的性質，利用不超過本文中公開的內容以及常規的實驗來確定合適的溶劑和pH條件，從而促進分析物標記。
樣品處理 在本發明的某些實施方案中，可在標記一種或多種分析物之前和之后處理樣品。處理可促進對所述一種或多種分析物的標記。所述處理可促進對樣品組分的分析。處理可簡化對樣品的操作。處理可促進前述的兩項或更多項。
例如，可用酶或化學物處理樣品。酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質和肽)、核酸酶(以降解核酸)或一些其它的酶。可選擇酶以具有恰好可預料的降解方式。還可以將兩種或更多種蛋白酶和/或兩種或更多種核酸酶一起使用，或與其它的酶使用，從而降解樣品組分。
例如，蛋白水解酶胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，其斷裂絲氨酸或精氨酸與非特定氨基酸之間的肽鍵從而產生包含胺末端(N末端)和絲氨酸或精氨酸羰基末端氨基酸(C末端)的肽。在此方法中，來自蛋白質斷裂的肽是可預測的，其在來自胰蛋白酶消化物的樣品中的存在和/或量可以成為其所來源的蛋白質的存在和/或量的指示。此外，肽的游離胺末端可以是促進肽的標記的良好親核物。其它示例性的蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶(例如羧肽酶A、B、C等)。
例如，當用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化時，蛋白質(例如蛋白g)可能產生三種肽(例如肽B、C和D)。因此，已經用蛋白水解酶(比如胰蛋白酶)水解過并且當分析時確認含有肽B、C和D的樣品可被認為最初包含蛋白g。肽B、C和D的量也將與消化的樣品中蛋白g的量相關聯。在此方法中，關于樣品(或其部分)中肽B、C和D中的一種或多種的鑒定和/或定量的任何測定都可用來鑒定和/或定量最初樣品(或其部分)中的蛋白質。
因為某些酶的活性是可預測的，所以由已知序列的蛋白質降解而產生的肽的序列也是可預測的。根據此信息，可產生“理論上的”肽信息。因此，在來自實際樣品的質譜分析的子片段離子(如上所述)的計算機輔助分析中，對“理論上的”肽片段的測定可用于測定一種或多種未知樣品中的一種或多種肽或蛋白質(例如參見以上標題為“通過計算機輔助數據庫分析的分析物測定”的部分)。
在一些實施方案中，樣品處理可包括對待標記的一種或多種分析物的前體的處理。例如，如果待標記的一種或多種分析物是源于消化的蛋白質的肽，并且對此實例來說選擇標記試劑以使其與肽或肽分析物的胺基團(例如賴氨酸的N-α-胺基團和N-ε-胺基團)反應，可以促進標記反應的方式處理樣品的蛋白質(分析物前體分子)。在此實例中，可用還原劑(例如三[2-羧乙基]膦(TCEP))將蛋白質還原，然后通過與封閉劑(例如甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS))的反應進行封閉。在此方法中，蛋白質的硫醇基團被封閉并因此不干擾分析物的胺與標記試劑之間的標記反應。
本領域技術人員將會理解，利用易得的試劑和借助常規實驗可調整的方案，可進行對某些其它前體分子的處理。可根據待標記分析物和標記試劑的性質對試劑和條件進行精確選擇。
在一些實施方案中，樣品處理可包括將分析物或分析物前體固定到固體載體上，而不論是否用標記試劑標記。固定可包括共價固定和吸附以及其它的非共價固定方法(例如靜電固定)。在一些實施方案中，固定可有助于降低產品的復雜性。在一些實施方案中，固定可有助于分析物標記。在一些實施方案中，固定可有助于分析物前體標記。在一些實施方案中，固定可有助于對具有某些性質(例如，它們具有或缺乏半胱氨酸部分)的樣品組分的一部分進行選擇性標記。在一些實施方案中，固定可有助于純化。固定可有助于前述各項中的兩項或多項。
包括分離樣品混合物的分離 在一些實施方案中，對標記分析物的樣品或樣品混合物的處理可能涉及分離。可對標記或未標記的分析物、標記或未標記的分析物前體、或其部分進行一種或多種分離。可對得自固相捕獲物或分離過程的其它產品的一種或多種部分進行一種或多種分離。可對前述各項中的兩項或多項進行分離。
例如，可制備來自不同樣品的包含不同標記分析物的樣品混合物。“不同標記”意為彼此區別的每個標記物包含可鑒別的獨特性質(例如每個標記物包含獨特的報告物部分，所述獨特的報告物部分在MS/MS分析中產生獨特的“信號離子”)。為分析樣品混合物，可分離所述樣品混合物的組分并對所述樣品混合物的僅一部分進行質量分析。在此方法中，分析物的復雜性可被充分降低，因為可對分離的分析物單獨進行質量分析，因而增加了分析方法的靈敏度。當然可對樣品混合物的一個或多個其它的部分進行重復分析一次或多次，從而可對所述樣品混合物的所有部分進行分析。
分離條件(在所述條件下不同標記的相同分析物在與其在樣品混合物中的豐度成比例的濃度或量下共洗脫)可用來測定每種樣品(所述樣品包括樣品混合物)中的每種標記分析物的量，前提是每種樣品被加到所述樣品混合物中的量是已知的。因此，在一些實施方案中，樣品混合物的分離可簡化分析，并同時保持質量分析(例如MS/MS分析)中測定的信號與樣品混合物中不同標記的分析物的量之間的相關性。
可通過色譜法進行分離。例如，可使用液相色譜/質譜(LC/MS)實現樣品分離和質量分析。而且，可使用任何合適的色譜分離方法分離感興趣的分析物。例如，色譜分離可以是正相色譜法、反相色譜法、離子交換色譜法(即陰離子交換色譜法或陽離子交換色譜法)、體積排阻色譜法或親和色譜法。
分離可以在電泳下進行。可使用的電泳分離技術的非限定性實例包括但不限于一維電泳分離、二維電泳分離和/或毛細管電泳分離。
可使用同量異位的標記試劑或試劑組來標記樣品的分析物。當進行分離步驟時，同量異位的標記試劑尤其有用，因為標記試劑組的同量異位標記物在結構上不能區分(并且在分析物斷裂除去報告物之前不可通過總質量進行區分)。因此，以不同的同量異位的標記物標記的相同組成的所有分析物都能以嚴格相同的方式進行色譜分離(即共洗脫)。因為它們在結構上不可區分，分離過程的洗脫物可包含一定量的同量異位的標記分析物，所述標記分析物與樣品混合物中的標記分析物的量成比例。而且，根據制備樣品混合物的知識(為制備樣品混合物而加入的樣品和其它可選成分(例如校正標準物)的份數)，可能使樣品混合物中標記分析物的量與標記分析物所來源的樣品中的標記分析物的量相關。
標記試劑也可以是同分異構的。盡管異構體有時可通過色譜分離，但存在條件依賴的情形，其中可進行分離過程以共洗脫所有被不同標記的同樣分析物，其中存在于洗脫物中的全部標記分析物的量與其在樣品混合物中的濃度和/或量成比例。
分析物的相對定量和絕對定量 在一些實施方案中，對樣品混合物中不同標記的相同分析物進行相對定量是可能的。例如，通過與質量分析(例如在對一級質譜分析中所檢測到的標記分析物進行選擇并用于二級質譜分析)中測定的報告物離子(即信號離子)的相對量(例如報告的峰的面積和/或高度)進行比較，對不同標記的相同分析物進行相對定量是可能的。換言之，在每種報告物離子可與所用的特定樣品的信息相關聯以產生樣品混合物的情況下，在質譜分析中報告物離子相對于所檢測到的其它報告物離子的相對量，即是樣品混合物中分析物的相對量。在形成樣品混合物的組成成分已知的情況下，可基于所檢測到的用于具有選定的質荷比的標記分析物的報告物離子的相對量，將用于制備樣品混合物的每種樣品中的分析物的相對量反算出來。對于在一級質譜分析中所檢測到的所有不同標記分析物來說均可重復此過程。在此方法中，可測定用于制備樣品混合物的每種不同樣品中的每種反應活性分析物的相對量(常以濃度和/或量表示)。
在另一些實施方案中，可確定分析物的絕對定量。對于這些實施方案而言，可向樣品混合物中加入已知量的一種或多種不同標記的分析物(一種或多種校正標準物)。校正標準物可以是用同分異構和/或同量異位的標記物或標記物組(用于標記樣品混合物的分析物)標記的預期分析物，前提條件是所述校正標準物的報告物部分與用于形成樣品混合物的任何樣品相比是獨特的。利用與樣品混合物中不同標記的分析物的一種或多種報告物離子的相對量的相關性，一旦確定報告物離子相對所述一種或多種校正標準物的相對量，則可參考加入到樣品混合物中的校正標準物的量而計算樣品混合物中所有不同標記的分析物的絕對量(常以濃度和/或量表示)。在此方法中，還可基于制備樣品混合物的方法的知識而確定每種不同標記的分析物(對其而言，在其來源的樣品中存在校正標準物)的絕對量。
盡管有前述內容，但在需要時，還可針對報告物部分中任何天然或人工產生的同位素豐度做出報告物離子(信號離子)強度的修正。有多種方法修正報告物部分信號離子中雜質的同位素豐度。這樣的修正方法的實例可見于公開的共同未決和共有的名稱為“Method andApparatus For De-Convoluting A Convoluted Spectrum”的美國專利No.7,105,806。基本上，可利用數學公式和計算，通過對標記試劑的交疊同位素簇的褶合譜的退卷積計算而確定與單個標記試劑的同位素簇相關的加質量峰(up-mass peak)和減質量峰(down mass peak)。不管值是如何確定的，在準確定量每種報告物離子(即信號離子)的強度方面越謹慎，來源樣品中分析物的相對定量和絕對定量就越準確。
蛋白質組分析 本發明的實施方案可用于復雜分析，因為可利用質量分析技術，以快速和重復的方式將樣品多重化(multiplexed)、分析和再分析。例如，可進行樣品混合物分析，以確定一種或多種樣品中的一種或多種分析物的量。可針對樣品混合物所包含的樣品測定一種或多種分析物的量(常以濃度和/或量表示)。因為可快速進行樣品處理和質量分析，所以這些方法可重復多次，以便可以測定樣品混合物的多種不同標記分析物在分析物來源樣品中的相對量和/或絕對量。
可使用這樣的快速多重分析(multiplex analysis)的一種應用是在蛋白質組分析領域。蛋白質組學可看作是在生物過程的結構、功能和調控方面描述基因組序列中編碼信息的一種實驗性方法。這可以通過對細胞或組織所表達的總蛋白質成分的系統性分析而實現。與本發明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案組合使用的質譜是用于此綜合蛋白質分析的一種可能工具。
例如，利用9種同量異位標記試劑組，可獲得實驗中的9個時間點以測定例如基于生長細胞對特定刺激物的應答的蛋白質表達的上調或下調。還可進行較少的時間點但引入一種或多種對照物。還可使同樣的多重實驗加倍或成三倍進行。在所有情形下，都可在單個多重實驗中測定任選地相對于一種或多種任選的對照物和/或樣品重復的蛋白質表達的上調或下調。此外，因為樣品混合物的處理是平行進行的，所以結果是直接可比的，從而不需在方案或實驗條件方面做出對微小變化的補償。因此，這些同量異位的標記試劑可用的實驗分析包括但不限于時間過程的實驗、生物標記物分析、多重蛋白質組分析、多維蛋白質鑒定技術實驗(mudpit experiments)、親和性pull-downs實驗(affinitypull-downs)、翻譯后修飾測定(PTM)和多重控制實驗(multiple controlexperiment)。
II.組合物 在一些實施方案中，本發明涉及由式I代表的包括其鹽形式和/或水合物形式的組合物
其中，基團Y-J可以是任何報告物基團。合適的報告物基團的性質已在本文中前面描述過。合適的報告物基團的性質還在美國公開專利申請No.US 2004-0219685-A1中，尤其是第41-47段中描述過。
例如，報告物可包含可被取代或未取代的5、6或7元雜環，所述雜環可任選地可斷開地連接到載體上，其中所述雜環包含通過共價鍵連接到基團J上的至少一個環氮原子。基團J可以是由式-CJ’2-所代表的取代或未取代的亞甲基，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3。基團K可以是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4。基團L可以是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；關于基團R1和R2，要么(1)R1是氫、氘或者R6，R2是氫、氘或R7；要么(2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6。原子或基團X1可以是＝O、＝S、＝NH或＝NR7，每個X2可以彼此獨立地是＝O或＝S，每個X3可以彼此獨立地是-O-或-S-。基團Z可以是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；其中，V+是帶正電荷的反離子。每個R3、R4、R5、R6和/或R7彼此獨立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。例如每個R3、R4、R5、R6和/或R7彼此獨立地可以是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。每個R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此獨立地可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。例如，每個R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此獨立地可以是亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞環丙基、亞正丁基、亞環丁基、亞正戊基、亞環戊基、亞正己基或亞環己基。
所述組合物可以是同位素富集的(即編碼的)。所述組合物可以是同位素富集的以包含一種或多種重原子同位素。所述組合物可以是同位素富集的以包含兩種或更多種重原子同位素。所述組合物可以是同位素富集的以包含三種或更多種重原子同位素。所述組合物可以是同位素富集的以包含四種或更多種重原子同位素。
所述5、6或7元雜環可以是包含至少一個氮原子的任何5、6或7元雜環，所述基團J可與所述氮原子共價連接。例如，所述雜環可以是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌嗪。可能的取代基已在前面“定義”部分描述過，其中所述雜環可包括一種或多種所述取代基。例如，取代基可以是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或其它烷基。所述取代基可與所述環的雜原子相鍵合。例如，所述雜環可以是N-甲基哌嗪。所述雜環可以是芳香性或非芳香性的。
在一些實施方案中，報告物部分可以可斷開地連接到載體上。各種載體是本領域中眾所周知的。例如，各種包含三苯甲基部分的載體是商業出售的或者可制得的(例如三苯甲基氯載體(三苯甲基-Cl)或2-氯三苯甲基氯載體)。參照圖5，舉例說明了載體結合的標記試劑的一個實施方案。參照圖5，可用分析物處理載體從而制得標記的分析物。如舉例說明的，然后可用酸處理載體以釋放出標記的分析物用于分析。
因此，在一些實施方案中，所述5、6或7元雜環可包含促進所述雜環與合適的載體的可斷開結合的原子或基團。例如，所述基團可以是含有氨基、羥基或硫醇基的亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基基團。所述原子可以是哌嗪環上的仲氮。關于示例性哌嗪化合物及其制備方法的討論可見于公開的美國專利申請US 2004-0219685 A1中。例如，可使所述載體結合的N-烷基哌嗪乙酸化合物與二胺反應，然后通過與二酸反應從而形成可用作標記試劑的載體結合的化合物，其中基于反應物的性質，同量異位編碼是可能的。
再參照式I，基團Y-J-(不論其是否可斷開地與載體連接)可形成報告物部分。所述報告物部分可包含至少一個同量異位富集部位。所述報告物部分可包含至少兩個同量異位富集部位。所述報告物部分可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或更多個同量異位富集部位。例如，圖6a舉例說明了包含21個同量異位富集部位的N-甲基哌嗪報告物。
所述報告物部分可包含固定電荷或者在質譜儀中是可電離的。例如，含有堿性基團(例如胺基團)的化合物易于質子化以引入電荷，而含有酸性基團的化合物(例如羧酸基團)則易于脫質子而引入電荷(參見Roth，Kenneth等“Charge Derivatization of Peptides for Analysis byMass Spectrometry”，Mass Spectrometry Reviews，17255-274(1998))。
平衡物(連接物)部分可通過由式I#所代表的基團而形成
其中R1、R2、X1、X2、K和L如上定義。所述平衡物部分可包含至少一個同量異位富集部位。所述平衡物部分可包含至少兩個同量異位富集部位。所述平衡物部分可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或更多個同量異位富集部位。例如，圖6b舉例說明了包含28個同量異位富集部位的平衡物部分，其中質量總增量可多達31道爾頓。
在一些實施方案中，所述組合物可由式II所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中W是取代六元雜環的至少一個M基團的原子或基團并且位于所述六元環的氮的鄰位、間位或對位。基團W可以是-N(H)-、-N(R”)-、-N(R”’)-、-P(R”)-、-P(R”’)-、-O-或-S-。如果選為-N(R”’)-或-P(R”’)-，則該基團可用于將所述組合物與載體可斷開地連接。每個余下的基團M可以彼此獨立地是-CM’2-，其中每個M’可以彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R8、-OR8、-SR8、-R8’OR8或-R8’SR8。基團J、K、L、X1、X2、R1、R2和Z如前面所定義。每個R”彼此獨立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基，每個R”’可以是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或將所述化合物可斷開地與載體連接起來的可斷開連接物。每個R8和/或R10可以彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基，R9’可以彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
在一些實施方案中，所述組合物可由式III所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中s可以是1～5的整數，t可以是1～10的整數。基團R1、R2和Z如前面所定義。原子和基團R11可以是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’，其中R”’如前面所定義。例如，可從如圖2a和2b中所示的化合物V-XIII中之一選擇所述組合物。
在一些實施方案中，所述組合物可由式IV所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，t、R11和Z如前面所定義。例如，可從如圖3a和3b中所示的化合物XV-XXIII中之一選擇所述組合物。
如所述，所述組合物可以其鹽形式和/或水合物形式而存在。所述組合物是否作為鹽形式存在通常取決于取代基的性質和數目以及組合物所存在和/或分離的條件。眾所周知，通過用酸處理可以使堿性基團(比如胺)質子化，從而形成胺的鹽。例如，含有哌嗪的標記試劑可作為單TFA鹽、單HCl鹽、二TFA鹽或二HCl鹽而得到(參見例如美國專利申請公開No.US 2005-0148771 A1)。還眾所周知，通過用堿處理可以使酸性基團(比如羧酸)脫質子而形成羧酸鹽。同上，例如，可以使羧酸的-OH或硫代羧酸的-SH脫質子而分別形成-O-V+和-S-V+，其中V+是堿性反離子(例如Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+或NH4+)。還眾所周知，包含堿性基團(比如胺)和酸性基團(比如羧酸)的化合物可以兩性離子形式存在。所有這些均被視為鹽形式，組合物的這些官能團的離子化狀態將取決于其所存在的任何溶液的pH，或者如果分離時，則取決于所分離的任何溶液的pH。本領域普通技術人員一定會理解，如何僅利用常規實驗方法和本文中所公開的內容控制本文中所公開組合物的任何反離子鹽形式的電荷狀態和性質。
是否組合物作為水合物存在也將取決于其存在或分離的條件。水合物僅包含一個或多個絡合的水分子。本發明涉及任何可能的水合物形式。
如上所述，基團Z可以與分析物共價鍵合。所述分析物可以通過使分析物與標記試劑反應而制得。所述分析物可以是任何分析物。例如，基團Z是肽或蛋白質。
基團Z可以是如前所述的反應活性基團。因此，在一些實施方案中，所述化合物可以是選自如下所述的化合物I’-XIII’或XV’-XXIII’中的任何的標記試劑。在一些實施方案中，所述組合物可以是標記試劑，比如如圖25a和25b中化合物80’-87’所示的那些。
基團Z還可以是-OH、-SH、-O-V+或-S-V+。可將所述基團活化，從而產生反應活性基團的離去基團。所述活化的基團通常指活化的羧酸基團。例如，可使用如前所述的水溶性碳二亞胺EDC將羧酸基團(COOH)的-OH基原位活化。
基團Z還可以是反應活性基團(比如活化的羧酸基團或硫代羧酸基團(例如活性酯))的離去基團。例如，所述反應活性基團的離去基團可以是如前所述的式7-19的醇或硫醇離去基團。所述活性酯可以是N-羥基琥珀酰亞胺酯(即在所述離去基團是化合物7且X’是-O-的情況下)。如前所述，可以使活性酯與分析物的親核基團(比如氨基基團)反應，從而形成標記的分析物。因此，這樣的化合物是標記試劑。
所述標記試劑可以是同分異構的和/或同量異位的。已經公開了所述標記試劑的其它性質。例如，所述標記試劑可用于同一樣品或兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的多重分析。
所述標記試劑可以是同位素富集的(即編碼的)。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含一種或多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含兩種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含三種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含四種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含五種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含六種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含七種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含八種或更多種重原子同位素。所述標記試劑可以是同位素富集的以包含九種或更多種重原子同位素。
在一些實施方案中，組合物可以是標記的校正標準物。如本文中所述，可以將已知量的校正標準物加入到混合物中以促進感興趣的分析物的絕對定量分析。因此，在一些實施方案中，本發明還涉及已用同分異構和/或同量異位的標記試劑標記的分析物，比如感興趣的肽。因此，所述標記的校正標準物可以是用如本文中所述的標記試劑標記的任何分析物。通常，所述標記試劑可選自同分異構和/或同量異位的標記試劑組，以便其包含相比于用于標記一種或多種感興趣樣品的標記試劑的獨特的報告物。
在一些實施方案中，標記分析物組合物可選自以下描述的化合物I”-XIII”或XV”-XXIII”中的任何一個。在一些實施方案中，組合物可以是標記的分析物，比如如圖26a-26b中80”-87”所示的那些。
在一些實施方案中，所述組合物可以是片段離子。例如在一些實施方案中，所述組合物可以是在標記的分析物分子斷裂后存在于質譜儀中的片段離子。例如，所述產生片段離子的標記的分析物分子可選自如圖26a-26b所示的化合物80”-87”。因此，所述片段離子可具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。在一些實施方案中，所述分子式選自13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+和13C3C3H1315N2+。
所述片段離子可通過以下方式產生在質譜儀中使包含至少兩種不同標記的分析物分子的樣品混合物的一部分離子化，并以選定的斷裂m/z值選擇至少兩種不同標記的分析物分子。然后可通過施加解離能級而斷裂所選的不同標記的分析物分子，其中至少一種所述不同標記的分析物分子是選自以下式的化合物80”、81”、82”、83”、84”、85”、86”和87”。
III.標記和分析的方法 根據本發明的一些實施方案，可將分析物標記并然后測定。可通過質量分析測定標記的分析物、分析物自身、分析物的一種或多種片段和/或標記物的片段。在一些實施方案中，本發明的方法可用于同一樣品中不同分析物的分析以及兩個或多個不同樣品中的同樣和/或不同分析物的多重分析。可將所述兩個或多個不同樣品混合以形成樣品混合物。在多重分析中，可用標記試劑測定分析物所來源的樣品混合物。可測定形成樣品混合物所組合的兩個或多個樣品中每一個之中的分析物的絕對和/或相對(相對于不同樣品中的同樣分析物)量(常以濃度或量表示)此外，可使用分析物片段(即子片段離子)的質量分析來鑒定分析物和/或分析物前體，比如所述降解成所述分析物的前體分子。
分析中使用的樣品可以是包含可用標記試劑標記的分析物的任何樣品。例如，樣品可以是粗的或處理的細胞溶解物、體液、組織提取物或細胞提取物。樣品可以是來自分離過程的一部分。其它可能的樣品類型已在本文中描述過。
樣品中的分析物可以是可用標記試劑標記的任何分析物。例如，所述分析物可以是肽和/或蛋白質。其它可能的分析物類型已在本文中描述過。
所述方法的一個區別在于來自不同樣品的分析物可以用獨特的標記物(其為同分異構和/或同量異位的(具有相同的總質量)并且鑒別所述分析物所來源的樣品)進行不同標記(即編碼)的事實。所述不同標記的分析物在質譜儀的MS模式下是不被區分的，因為它們具有相同的(總)質荷比。通常選擇標記試劑組以便標記的分析物也不能通過分離技術(比如色譜法或電泳法)(其可在一級質譜分析之前應用于混合物)進行區分。然而，當施加解離能級(比如通過碰撞誘發解離(CID))時，則所述標記物可被斷裂而形成可通過質譜儀中的質量(質荷比)分辨出的獨特的報告物離子。可通過蘊含式(implication)使在MS/MS質譜中檢測到的每種獨特的報告物離子的相對量與樣品混合物中標記分析物的相對量以及所述分析物來源樣品中的分析物的相對量相關聯。因此，報告離子(即信號離子)的相對強度可用于測定組合形成樣品混合物的兩個或多個不同樣品中的一種或多種分析物的相對量。如果將絕對定量所需的每種分析物的校正標準物都以已知量引入樣品混合物中，則可由報告物離子的信息推導出兩個或多個樣品中的一種或多種分析物的絕對量(常以濃度或量表示)。
例如，所述分析物可能是利用處理樣品的酶消化反應由蛋白質降解而形成的肽。蛋白質降解可通過利用一種或多種蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶)處理樣品而實現。通過測定樣品混合物中肽的鑒定和量以及鑒定其所來源的樣品，并任選測定該樣品的其它肽，可鑒定和/或并相對于其所來源的樣品而定量所降解肽的前體蛋白。因為此方法允許進行蛋白質的多重測定，所以在多于一個樣品(即來自樣品混合物)的情況下，它是一種多重方法。
因此，在一些實施方案中，本發明涉及包括使兩個或多個樣品(每個樣品包含一種或多種反應活性分析物)與標記試劑組中的不同標記試劑反應而產生兩種或多種不同標記的樣品(每種包含一種或多種標記分析物)的方法。所述標記試劑可選自同分異構和/或同量異位的標記試劑，其中所述不同的標記試劑各自包含獨特質量的報告物部分。所述報告物部分可以是任何報告物部分。例如，所述報告物部分可包含取代或未取代的哌啶、哌嗪或嗎啉基團。
例如，所述組中的不同標記試劑可由式I’所代表，包括其鹽形式或水合物形式
其中原子或基團Y、J、K、L、R1、R2、X1和X2如前面所定義并且其中所述組中的不同標記試劑具有相同的總質量，但其中形成每個不同標記試劑的報告物部分的基團Y-J在一個或多個同位素富集部位被獨特編碼，從而當基團Y-J的基團J與所述標記試劑片段的其余部分之間的鍵在質譜儀中斷裂時，產生具有獨特質量的報告物部分。原子或基團Z’可以是反應活性基團或反應活性基團的離去基團。
例如，所述反應活性基團可以是N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮酯(Dhbt)、羥基吡咯烷酮酯(NHP)、2，4-二鹵代苯基酯(參見圖8及標題“制備標記試劑的示例性方法”下的論述)、2，2，2-三氟乙基酯或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯(即反應活性基團的離去基團可以是化合物7-19中的一個)。
因此，樣品混合物的標記的分析物可由式I”所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中原子或基團Y、J、K、L、R1、R2、X1和X2如前面所定義。例如，變量Y可以是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌嗪基團。基團Z”可以是共價連接的分析物。
所述標記方法可產生兩種或多種不同標記的樣品，每種樣品包含一種或多種標記的分析物。一旦利用對樣品而言獨特的標記試劑對每種樣品的分析物進行標記，則可將兩種或多種不同標記的樣品或其部分混合以產生樣品混合物。所述樣品混合物可任選地包含一種或多種校正標準物。
可記錄經組合而產生樣品混合物的每種樣品的體積和/或量。每種樣品相對于樣品混合物的總樣品體積和/或量的體積和/或量可用來在樣品混合物分析中測定每種樣品中的被鑒定的分析物的量(常以濃度或量表示)。因此，樣品混合物可包含復雜混合物，其中可通過對兩種或多種樣品的每一種中分析物的量的相對定量，或者通過其中向樣品混合物中加入校正標準物的絕對定量而鑒定和/或定量相同和/或不同分析物的相對量。
例如，可將混合物應用于光譜技術，其中可利用一級質譜分析儀對所述樣品混合物或其部分進行一級質譜分析。然后可選擇來自所述一級質譜分析的特定質荷比的離子。可對所選的離子施加解離能級(即碰撞誘導解離(CID))而引起所選離子的斷裂。通過對標記分析物的所選離子施加解離能級，所選離子至少一部分中的鍵RL和LA(參見標題“RL鍵和LA鍵”下的論述)可以斷裂。鍵RL和LA的斷裂可引起報告物/連接物部分的斷裂并導致離子化的報告物部分(即報告物部分或信號離子)從所述分析物釋放出來。通過解離能對所選離子的斷裂還可產生分析物的子片段離子。然后可將所述離子(余下的所選離子、子片段離子和離子化的報告物部分)導向二級質譜分析儀。
在所述二級質譜分析儀中，可對所選的離子及其片段進行二級質譜分析。所述二級質譜分析可測定以所選質荷比存在的每種獨特報告物離子的總質量(或m/z)和相對量以及樣品混合物中至少一種標記分析物的子片段離子的一些或全部的質量(總質量和/或絕對質量)。對于以所選質荷比存在的每種分析物而言，可利用所述子片段離子鑒定以所選質荷比存在的一種和/或多種分析物。例如，可按照前面標題為“通過計算機輔助數據庫分析的分析物測定”的部分中所述進行此分析。
在一些實施方案中，所述方法的某些步驟可重復一次或多次。例如，在一些實施方案中，如前所述，可對來自一級質譜分析的所選質荷比(與任何先前的所選質荷比不同)的離子施加解離能級，從而產生離子化的報告物部分(即報告物離子)和至少一些所選離子的子片段離子。可對所選離子、報告物離子和子片段離子或其一部分進行二級質譜分析。還可測定所述二級質譜分析中每種獨特的報告物離子的總質量和相對量以及所述子片段離子的質量(總質量和/或絕對質量)。在此方法中，可得到可用于來自所述一級質譜分析的一種或多種其它分析物的鑒定和/或定量的信息。
在一些實施方案中，在樣品混合物已被分級(例如通過色譜法或電泳法分離)的情況下，可重復所述方法一次或多次。例如，通過對樣品的一種或多種其它部分重復所述方法，可分析全部樣品混合物。可以預計，在一些實施方案中，可重復整個過程一次或多次，并且如上所述，在這些重復中的每一次中，某些步驟都可重復一次或多次。在此方法中，可最大程度地探尋并測定樣品混合物的含量。還可對兩種或多種樣品的新組重復所述整個過程。
質譜領域的普通技術人員將會明了，可在串聯質譜儀中進行一級和二級質譜分析。適于進行串聯質量分析的儀器已在本文中前面描述過。雖然優選串聯質譜儀，但也可使用單級質譜儀。例如，可通過錐孔電壓斷裂法導致分析物斷裂，然后使用單級的四極桿質譜儀或飛行時間質譜儀對所得片段進行分析。在其它實例中，可利用激光源對分析物施加解離能，并在源后衰變之后在飛行時間或串聯飛行時間質譜儀(TOF-TOF)中記錄所得的片段。
在一些實施方案中，本發明方法還可包括在進行樣品分析物的標記之前，利用至少一種酶消化每一種樣品以部分或全部地降解樣品組分(另外參見標題為“樣品處理”的上述部分)。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質和/或肽)或核酸酶(以降解核酸)。可一起使用兩種或多種酶以進一步降解樣品組分。例如，所述酶可以是蛋白水解酶，比如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶(例如羧肽酶A、B、C等)。
在一些實施方案中，方法還可包括在進行一級質譜分析之前分離樣品混合物(另外參見標題為“包括分離樣品混合物的分離”的上述部分)。按這種方式，可僅對樣品混合物的一部分進行一級質譜分析。可通過任何分離方法，包括通過色譜法和/或電泳法進行分離。例如，可在質量分析之前使用色譜/質譜法(LC/MS)實現這樣的樣品分離。此外，還可使用適于分離感興趣的分析物的任何色譜分離方法。本文中已經描述了合適的色譜和電泳分離方法的非限定性實例。
在一些實施方案中，可利用消化和分離步驟實踐所述方法。盡管這些步驟是任選的，但它們常常一起進行，例如，當進行蛋白質組分析以測定細胞內蛋白質的上調和下調時。在一些實施方案中，可重復所述方法的步驟(具有或不具有消化和/或分離步驟)一次或多次以鑒定和/或定量樣品中的分析物或兩種或更多種樣品(包括用載體結合的標記試劑標記的樣品)中的每種樣品的一種或多種分析物。取決于在樣品混合物中是否存在校正標準，具體樣品的定量可以相對于其它標記的分析物，或者它可以是絕對的。
如前所述，通過對子片段離子的質量(總質量或絕對質量)的分析，可測定與所選離子相關的分析物。一種這樣的測定方法在標題為“通過計算機輔助數據庫分析的分析物測定”的部分中作了描述。一旦已測定分析物，則關于二級質譜分析中每一種獨特的報告物離子的總質量和相對量以及子片段離子的質量的信息提供了確定有關樣品化合物其它信息的基礎。
可通過質譜圖中的峰強度確定報告物離子的相對量。在一些實施方案中，可利用質譜儀通過對所獲得的報告物離子(信號離子)的峰高或峰寬(或峰面積)的分析而確定每種獨特的報告物離子的量。因為可用不同的標記試劑標記每種樣品，并且每種標記試劑可包含產生獨特的報告物離子的獨特報告物部分，所述報告物離子可與用于配制樣品混合物的特定的不同標記的樣品相關聯，對二級質譜分析中不同報告物離子的測定可用于鑒定所選分析物的報告物離子所來源的不同標記的樣品。在發現多個報告物離子的情況下(即根據本發明的多重方法)，可相對于其它報告物離子確定每種獨特報告物離子的相對量。因為在二級質譜分析中測定的每種獨特報告物離子的相對量可與樣品混合物中分析物的相對量相關聯，所以可測定每種不同標記的形成樣品混合物的樣品中的分析物的相對量(常表示為濃度和/或量)。此外，可使分析物的定量信息與最初不同標記樣品中的組分相關聯，其中測定的分析物是感興趣的另一種化合物的副產物(即分析物是降解產物，比如在分析物是通過蛋白質的消化而形成的肽的情況下)。
如上所述，可針對不同質荷比的所選離子重復此分析一次或多次，從而獲得組合形成樣品混合物的每種樣品中一種或多種其它分析物的相對量。另外，如在前述標題為“分析物的相對定量和絕對定量”的部分中所述的，在適當的情況下，可針對與每種獨特報告物離子相關的峰強度而校正天然或人工產生的同位素豐度。
在一些實施方案中，所述分析物可以是樣品或樣品混合物中的肽。對樣品或樣品混合物中的肽的分析可用于確定樣品或樣品混合物中可鑒定蛋白質的量(常表示為濃度和/或量)，其中在一種或多種樣品中的蛋白質可在一級質譜分析之前降解。而且，可將來自不同樣品的信息進行比較以做出測定，比如用于比較對細胞中蛋白質的量的作用，所述細胞與不同濃度的影響細胞生長、發育、分化和/或死亡的物質一起孵育。另外，非限定性的實例可包括對患病或健康的組織或細胞培養物的表達的蛋白質組分的比較。這可包括在利用感染劑(如細菌或病毒)感染或其它疾病狀態(如癌癥)后比較細胞中表達的蛋白質水平。在其它實例中，可進行蛋白質濃度隨時間(時間-進程)變化的研究，以檢驗藥物治療對細胞或組織的表達的蛋白質組分的作用。在另一些實例中，可利用所取來自不同樣品的信息以檢測并監測作為疾病(例如癌癥)或感染結果的組織、器官或生物流體中具體蛋白質的濃度。這些實驗可包含一種或多種對照樣品。在一些實施方案中，本實驗可用于測定感興趣的上述兩個或多個性質。
在一些實施方案中，所述分析物可以是樣品或樣品混合物中的核酸片段。有關核酸片段的信息可用來確定樣品或樣品混合物中可鑒定核酸分子的量(常表示為濃度和/或量)，其中所述樣品在一級質譜分析之前被降解。此外，可比較來自不同樣品的信息以做出科學上感興趣的測定。
在包含獨特報告物部分的校正標準物與已經以已知量(常表示為濃度和/或量)加入到樣品混合物中具有所選質荷比的分析物相連接的情況下，可利用所述與校正標準物相關的獨特報告物的量測定組合形成樣品混合物的每種樣品中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。這是可能的，因為與樣品混合物中校正標準物的獨特報告物離子相關聯的分析物的量是已知的，所以可測定與所選離子相關聯的標記分析物的所有獨特報告物離子的相對量。既然每種所述獨特報告物部分(包括校正標準物的報告物部分)的所測的每種獨特報告物離子的相對量與和組合形成樣品混合物的每種不同標記的樣品相關聯的分析物的量成比例，則可基于相對于用于制備樣品混合物的制劑的計算比率而測定每種樣品中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。需要時，可針對與獨特報告物離子相關聯的峰強度進行天然或人工產生的同位素豐度的校正。這樣的分析方法尤其可用于具有復雜性質的多樣品的蛋白質組分析中，特別時在進行一級質譜分析之前進行標記分析物的預分離(例如液相色譜或電泳分離)的情況下。
例如，如果樣品混合物包含100fmol/mL的校正標準物，并且與所述校正標準物相關聯的獨特報告物離子的相對強度是1，而與第一樣品相關聯的第一其它獨特報告物離子的相對強度是二分之一(1/2或0.5)，與第二樣品相關聯的第二其它獨特報告物離子的相對強度是2，則在所述第一不同標記樣品(混合而形成樣品混合物)中分析物的量(假定等量的樣品1和樣品2混合以形成樣品混合物)是50fmol/mL(0.5 x 100fmol/mL)，而在所述第二不同標記樣品(混合而形成樣品混合物)中分析物的量是200fmol/mL(2 x 100fmol/mL)。而且，例如如果所述分析物是與特定蛋白質相關聯的肽，則可推斷樣品1中蛋白質的量是50fmol/mL，而樣品2中蛋白質的量是200fmol/mL。因此，校正標準物的存在使得可進行混合而形成樣品混合物的每種不同標記樣品中標記分析物(以及在某些情形下其前體)的絕對定量。
如前所述，此分析可針對具有不同質荷比的所選離子而重復一次或多次，從而獲得組合以形成樣品混合物的每種樣品中一種或多種其它分析物的絕對量。此外，如前所述，在需要時，可針對與獨特報告物離子相關聯的峰強度進行天然或人工產生的同位素豐度的校正。
在一些實施方案中，可用載體結合的標記試劑實踐本文中所述的方法，其中組中每種不同的標記試劑是載體結合的并通過可斷開連接物連接到所述載體上，從而使每種不同的樣品與所述組中帶有不同標記試劑的載體相連接。示例性的載體已在前面標題為“組合物”的部分中討論過(另參見圖5和下面的實施例部分)。根據所述方法，可任選地在已使分析物與載體結合的標記試劑反應之后但在混合樣品之前洗滌載體以除去不與標記試劑的反應活性基團反應的樣品組分。一旦已使所述分析物與標記試劑反應而形成標記的分析物并任選地進行了洗滌步驟，則可通過在斷開可斷開的連接物的條件下處理載體而從載體釋放出標記的分析物。一旦斷開，則可任選地采集兩種或更多種不同標記樣品中的每一種，每種樣品包含一種或多種標記的分析物，其中與特定樣品相關聯的標記的分析物通過連接到其上的獨特報告物部分是可鑒定的和/或可定量的。不論是否單獨采集斷開產品，都可將它們混合以形成樣品混合物。
在一些實施方案中，可利用由式II’所代表的標記試劑，包括其鹽形式和/或水合物，實踐本文中所述的方法
其中W、M、J、K、L、R1、R2、X1、X2和Z’如前所定義。
在一些實施方案中，可利用由式III’所代表的標記試劑，包括其鹽形式和/或水合物，實踐本文中所述的方法
其中s、t、R1、R2、R11和Z’如前所定義。
在一些實施方案中，可利用至少一種由以下各式所代表的標記試劑，包括其鹽形式和/或水合物，實踐本文中所述的方法

或
其中R1、R2和Z’如前所定義。符號＊表示在適當時13C替代12C的情形或者15N替代14N的情形。
在一些實施方案中，可利用由式IV’所代表的標記試劑，包括其鹽形式和/或水合物，實踐本文中所述的方法
其中t、R11和Z’如前所定義。
在一些實施方案中，可利用至少一種由以下各式所代表的標記試劑，包括其鹽形式和/或水合物，實踐本文中所述的方法
或
其中＊和Z’如前所述。
IV.蛋白質組學工作流程 在一些實施方案中，可在進行樣品處理步驟之前進行樣品分析物的標記。在一些實施方案中，可在進行樣品處理步驟之后進行樣品分析物的標記。在一些實施方案中，可在其它的樣品處理步驟之間進行樣品分析物的標記。在一些實施方案中，分析物的標記是樣品處理的最后步驟和/或恰在制備樣品混合物之前。
用蛋白質組學分析作為非限定性的實例，存在可能使用的至少幾種可能的流程。為幫助理解以下論述，有時在前體蛋白和分析物肽之間做出區分。然而，應當理解，在不同的實施方案中，蛋白質和/或肽中的任一種或兩種均可被看作本文中所述的分析物。
在一種流程中，所述前體蛋白可被消化成隨后可被標記的肽分析物。在另一種流程中，可用標記試劑將所述前體蛋白標記，然后被消化成標記的肽分析物。在又一種流程中，所述前體蛋白可被捕獲到固體載體上、消化、然后可將所述載體結合的肽標記。任選地，所述通過肽的流程也可被標記。在另一種流程中，所述前體蛋白可被捕獲到固體載體上、標記、然后可將所述載體結合的蛋白消化以產生標記的肽。任選地，所述通過肽的流程也可被分析。不管流程如何，可在MS和MS/MS分析之前按照需要對標記的肽進行其它樣品處理(例如分離步驟)。
A)涉及消化并隨后標記的示例性流程 參考圖13，例如可能存在待分析的“對照”樣品和“測試”樣品。如果對于圖13中所示的實例而言，目的是分析“對照”和“測試”樣品蛋白的肽(作為分析物)，在一些實施方案中，樣品的蛋白質可任選地被還原、任選地將半胱氨酸封閉和被酶消化，從而產生可被標記用于序列分析的分析物肽。在一些實施方案中，分析物肽不經進一步的樣品處理而被標記(加標簽)。不管如何標記，都可用各自包含獨特質量報告物部分的不同標記試劑(例如同分異構和/或同量異位的標記物的標記試劑組)將每種不同樣品的分析物標記。
在一些實施方案中，可能需要在標記之前和/或標記之后進行進一步的樣品處理。例如，可進行分離步驟以除去不感興趣的某些種類的肽，從而減少樣品的復雜性。可將標記的樣品混合以獲得樣品混合物。在一些實施方案中，可在質譜分析之前將標記的分析物肽進行分離(例如高效液相色譜法(HPLC))或其它分級過程。
另一種示例性流程示于圖14a和圖15中。圖15與圖14a主要的不同在于圖15舉例說明了可能涉及到肽捕獲的半胱氨酸硫醇基的封閉和再生的任選步驟。為清楚起見，雖然在圖13、14a、15和16-18中的描述都表明了針對兩種樣品的流程的應用，但不言自明，只要可獲得其它的不同標記物以編碼每種不同的樣品或樣品級分，也可處理其它的樣品。
圖14a闡明了在一些實施方案中可如何將“對照”樣品和“測試”樣品用酶消化然后將樣品組分通過可斷開的連接物捕獲到固相上。例如，載體可包含可斷開的連接物和與肽的結構部分反應的反應活性基團(參見圖14b對這樣載體的基本成分的舉例說明)。在圖14c中舉例說明了適于捕捉包含半胱氨酸的肽的載體的具體實例。包含半胱氨酸的硫醇基的肽可與所舉例說明的載體的碘乙酸基團反應。因為并非所有的肽都預計含有半胱氨酸，所以這是用于降低待分析樣品復雜性的方法，因為不含半胱氨酸部分的那些肽將流過載體且不被捕獲。一旦被固定，根據如圖14a中所示的處理方法，可用標記試劑將所述肽的胺基團標記(參見圖14a)。例如，每種“對照”樣品和“測試”樣品都可用同分異構和/或同量異位的標記試劑組中的不同標記物進行標記。然后可將標記的肽分析物從載體上斷開和/或進一步處理(包括形成混合物)和/或分析(圖14a)。
在一些實施方案中，可將流過載體的肽(因為它們不與所述載體的官能團反應)收集(而不是棄掉)、用同分異構和/或同量異位的標記試劑組中的標記試劑標記以及單獨或與從所述載體上收集到的標記的肽一起分析。這種流程示于圖16和17中。如圖16和17中所示，可用相同或不同的同分異構和/或同量異位的標記試劑組中的標記試劑標記流過固體載體的肽。不管標記試劑如何，都可將其任選地與通過MS/MS分析進行分析的樣品混合物混合。還可獨立地對其進行分析。圖16和17的不同之處在于當肽仍在載體上時(圖16)或在已將肽從所述載體上斷開之后(圖17)可標記保留在載體上的肽。
參考圖18，可使用固體載體捕獲前體蛋白。如所舉例說明的，可存在平行處理的兩個樣品。一種用于捕獲蛋白質的半胱氨酸部分的合適載體示于圖14c中。可利用洗滌將不含半胱氨酸部分的蛋白質從載體上除去并任選地收集(例如流過)。還可任選地將它們消化、標記和/或與樣品混合物一起分析或單獨分析。
根據圖18，可將載體結合的蛋白質消化。然后可利用標記試劑將所述載體結合的包含半胱氨酸的肽標記并從載體上斷開(此選擇已示于圖18中)。或者首先可將所述載體結合的包含半胱氨酸的肽從載體上斷開，然后用標記試劑標記(此選擇未示于圖18中)。可將來自不同樣品的標記肽(任選地包含不含半胱氨酸部分的標記肽)混合、處理和/或與樣品混合物一起分析或單獨分析。
根據圖18，作為進行消化的結果，可收集從載體釋放的任何肽。通常這些是不包含硫醇基的肽。可任選地將這些肽用標記試劑標記并任選地混合、處理和/或與樣品混合物一起分析或單獨分析。
B)涉及標記并隨后消化的示例性流程 不論是否使用載體捕獲用于分析的分析物，都可在消化或其它化學處理之前或之后進行利用標記試劑標記分析物的步驟，只要所述處理不改變所述標記物。對于蛋白質樣品，還可將樣品蛋白質還原和半胱氨酸封閉、用標記試劑標記樣品蛋白N-ε-賴氨酸的側鏈胺基，然后將蛋白質消化成標記的肽。
不管來源如何，可將標記的分析物分析或者進一步處理(包括制備樣品混合物)，例如，通過分離和/或通過固定到載體上。例如，可通過使標記試劑與樣品蛋白N-ε-賴氨酸的側鏈胺基反應而標記前體蛋白，然后任選地將所述標記的前體蛋白固定到載體上。可將標記的蛋白從所述載體上斷開然后消化，或者可在所述標記的蛋白仍與載體結合期間將其消化。在后一種情形下，載體結合的消化將從載體上釋放不含半胱氨酸部分的肽。可將其收集并任選地單獨分析或作為包含后者釋放的含有半胱氨酸部分的標記肽的樣品混合物的一部分而分析。
當在將前體蛋白消化成肽之前標記前體蛋白時，可對消化方式做出改變。例如，利用胰蛋白酶的消化可預期產生占優勢的C-末端精氨酸肽，因為N-ε-賴氨酸側鏈胺基被標記物修飾了。因此，胰蛋白酶的活性很象Arg-C。因為僅僅是還含有精氨酸側鏈的C-末端精氨酸肽可被標記并因此在質譜儀中可檢測到，所以這提供了一種進一步減少樣品復雜性以進一步處理和/或分析的方法。
在一些實施方案中，可將蛋白質還原并用標記試劑(即硫醇特異性的標記試劑)將半胱氨酸基標記，然后將蛋白質消化成用于分析的標記的肽。可將所述標記的肽分析物分析或進一步處理，例如通過分離和/或固定到載體上。例如，可通過賴氨酸側鏈上的N-α-胺基和/或N-ε-胺基與載體官能團間的反應而將標記的肽固定到載體上。用于固定包含胺基官能團的化合物的具有可斷開連接物的載體包括含有三苯甲基連接物的載體(參見可購自Novabiochem(San Diego，CA)的三苯甲基氯載體(Trityl-Cl)或2-氯三苯甲基氯載體)。此流程與前述那些截然不同。可將標記的分析物從載體上斷開，進一步處理和/或分析。此方法可能不能實質上減少復雜性，因為所有消化的肽都預計包含至少一個N-α-胺基。
上述實施例并非意在排除多種可能的流程。它們僅是示例性的。關于在消化之前標記的實施方案，還可在進行消化之前實施進一步的樣品處理。
c)總結 盡管前面通過具體實例的方式對蛋白質組學分析和作為分析物的蛋白質和/或肽的測定進行了詳細論述，但所述概念旨在包括可應用前述流程而不需進行過多實驗的多種分析物。因此，本發明公開內容的范圍不意在限于任何這些所述具體實例中。
IV.混合物 在一些實施方案中，本發明涉及混合物(即樣品混合物)。例如，所述混合物可包含同量異位和/或同分異構的標記分析物。標記分析物的示例性混合物及其制備和/或分析方法已在前述標題為“標記和分析的方法”的部分中描述過。
可通過將兩個或多個標記反應的全部或部分產物混合而形成混合物，其中將每種樣品用標記試劑組的不同標記試劑標記，其中每種標記試劑包含獨特(總)質量的報告物部分。可由兩個或更多標記的分析物中的每一種被得到(即來源)的標記反應而鑒定每種不同標記試劑的獨特報告物部分。所述標記試劑可以是同位素編碼的同分異構和/或同量異位的標記試劑。因此，混合物的兩種或更多種標記的分析物可以使同分異構的和/或同量異位的。標記試劑的性質和與那些方法相關的標記的分析物已在前面論述過。
混合物的分析物可以是肽。混合物的分析物可以是蛋白質。混合物的分析物可以是肽和蛋白質。混合物的分析物可以是核酸分子。混合物的分析物可以是碳水化合物。混合物的分析物可以是脂質。混合物的分析物可以是類固醇。混合物的分析物可以是質量小于1500道爾頓的小分子。混合物的分析物包含兩種或更多種不同類型(即(1)脂質和類固醇；或(2)肽、脂質、類固醇和碳水化合物)。
混合物可包含任何類型的不同標記的分析物，所述分析物包含本文中所公開的新的報告物/連接物部分。例如，所述混合物可包含至少兩種不同標記的可由式I”代表的分析物，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中原子或基團Y、J、K、L、R1、R2、X1和X2在前面已定義過，其性質已公開過。在一些實施方案中，兩種標記的分析物中的每種都可源自不同的樣品。根據式I”，基團Y-J(形成不同標記的分析物的報告物部分)可在一個或多個同位素富集部位被獨特編碼，從而當基團Y-J的基團J與所述標記的分析物的其余部分之間的鍵在質譜儀中斷裂時，形成具有獨特質量的報告物離子。基團Z”可以與分析物共價連接。對于每種不同的標記物而言，混合物中一些標記的分析物的可以相同，一些標記的分析物可以不同。
在一些實施方案中，混合物可包含至少兩種不同標記的可由式II”所代表的分析物，包括其鹽形式和/或其水合物形式
其中W、M、J、K、L、R1、R2、X1、X2和Z”如前所述。
在一些實施方案中，混合物可包含至少兩種不同標記的可由式III”所代表的分析物，包括其鹽形式和/或其水合物形式
其中s、t、R1、R2、R11和Z”如前所述。
在一些實施方案中，混合物可包含至少兩種不同標記的可由下式所代表的分析物，包括其鹽形式和/或其水合物形式
或
其中＊、R1、R2、和Z”如前所述。
在一些實施方案中，混合物可包含至少兩種不同標記的可由式IV”所代表的分析物，包括其鹽形式和/或其水合物形式
其中t、R11和Z”如前所述。
在一些實施方案中，混合物可包含至少兩種不同標記的可由下式所代表的分析物，包括其鹽形式和/或其水合物形式

或
其中，＊和Z”如前所述。
在一些實施方案中，本發明涉及片段離子的混合物。例如，可通過下列方式產生混合物的片段離子在質譜儀中使包含至少兩種不同標記的分析物分子的樣品混合物的一部分電離，并選擇至少兩種具有選定的m/z值的不同標記的分析物分子用于斷裂。然后可通過施加解離能級而使所述選定的不同標記的分析物分子斷裂。在一些實施方案中，至少一種不同標記的分析物分子是選自下式的化合物如圖26a-26b中所示的80”、81”、82”、83”、84”、85”、86”和87”。因此，片段離子可具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。在一些實施方案中，所述分子式選自13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+和13C3C3H1315N2+。
V.試劑盒 在一些實施方案中，本發明涉及試劑盒。所述試劑盒可包含如本文中所述的標記試劑和一種或多種其它試劑、容器、酶、緩沖劑和/或使用說明。所述試劑盒可包含兩種或更多種標記試劑的組和一種或多種其它的試劑、容器、酶、緩沖劑和/或使用說明。試劑盒中的兩種或更多種標記試劑可以是同分異構的和/或同量異位的。例如，所述試劑盒中的一種或多種標記試劑可以是如本文中前面所公開的以下各式的化合物(包括化合物組)I’、II’、III’、IV’、V’、VI’、VII’、VIII’、IX’、X’、XI’、XII’、XIII’、XV’、XVI’、XVII’、XVIII’、XIX’、XX’、XXI’、XXII’和/或XXIII’。在一些實施方案中，所述試劑盒可包含如本文中前面所公開的以下各式的標記的分析物(例如作為校正標準物)I”、II”、III”、IV”、V”、VI”、VII”、VIII”、IX”、X”、XI”、XII”、XIII”、XV”、XVI”、XVII”、XVIII”、XIX”、XX”、XXI”、XXII”和/或XXIII”。試劑盒中標記試劑的其它性質已公開。所述試劑盒可以例如可用于同一樣品中或兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的多重分析。
VI.制備標記試劑的示例性方法 參考圖7a-7c、圖27a-27c和20-21，可用于制備同量異位編碼的標記試劑的一般合成策略將作為本發明的另一個實施方案而論述。應當理解，這些所示的方法各自代表了可用于制備同量異位編碼的標記試劑的多種可能合成方法中的一種。還應當理解，本領域普通技術人員僅通過常規試驗和本文中所公開的內容，即可容易地調整該方法用于制備具有類似化學結構的其它標記試劑。因此，本方法的公開內容旨在舉例說明而并非是意在以任何方式的排除或限制。
盡管在圖7a-7c、圖27a-27c和20-21中所示的方法是針對未編碼的化合物而給出的，但不言自明，同量異位編碼的試劑可替代未編碼的化合物，從而產生同量異位編碼的產物，因為編碼的物質與未編碼的物質相比在反應活性上應該是基本上相同的。圖7a-7c中給出的方法得到以下實施例1-9的支持。這些實施例也支持圖20-21中所示的方法。可利用所示方法制備的示例性的同量異位編碼的化合物描述于本說明書和附圖(例如圖9a-9c、10a-10c、12a-12e、28a-28b和29a-29b)以及權利要求書中。
參考圖7a和27a步驟1以及圖20-21，可使取代或未取代的二胺與取代或未取代的二羧酸或酸酐反應。反應產物是包含至少一個將所述二羧酸或酸酐與所述二胺連接起來的酰胺鍵(或硫代酰胺鍵)的氨基酸。例如，所述取代或未取代的二胺可具有如圖20中化合物200所示的結構，所述取代或未取代的酸酐可具有如圖20中化合物201所示的結構。所述反應的氨基酸產物可具有如圖20中化合物202所示的結構。
所述取代或未取代的二胺的一個或兩個胺基都可包含N-烷基化的基團，在各圖中以R1和/或R2表示(參見例如圖27a)。所述二胺可被胺基保護基團如叔丁氧基羰基(t-boc)或9-芴基羰基(Fmoc)部分保護。其它合適的胺基保護基團及其使用方法可見于Green等ProtectiveGroups In Organic Synthesis，Third Edition，John Wiley & Sons，Inc.New York，1999。本領域普通技術人員僅利用常規實驗和本文中所公開的內容，即能夠選擇和使用其它合適的保護基團。
如果選擇二羧酸作為起始原料，則可通過保護(比如通過形成大體積的酯(例如叔丁酯))將羧酸基之一保護起來。應當理解，當在本文中使用時，所述羧酸或酸酐可包含取代所述兩個羧酸基或酸酐基的氧原子的硫原子。
在一些實施方案中，二羧酸和二胺都未被保護。通常，保護針對反應使用以便避免形成雜質。然而，如果試劑反應形成所期望的化合物和/或純化容易實現，則保護并不是必須的。例如，如果起始原料是對稱的，則常可免去保護。
還應當理解，在某些實施方案中，并非所有公開的步驟都需要進行。如實施例中所述，選擇Fmoc保護的二胺時可免去所示方法的步驟2(圖7a-7c和圖27a-27c)。
參考圖20，所述取代或未取代的二胺可包含由K所代表的烷基(例如化合物200)，其中K可以是式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所示的橋接兩個胺基的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4，其中R4是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。所述取代或未取代的二胺還可包含環狀環比如哌嗪，其中所述二胺的兩個胺基中的一個或兩個是環氮原子(例如化合物205，圖21)。在一些實施方案中，所述取代或未取代的二胺的一個或多個原子可以被重原子同位素取代。參考圖20和21，通過取代或未取代的二胺與酸酐的反應而形成的氨基酸化合物分別由202和206所代表。
所述取代或未取代的二羧酸或酸酐可包含基團L(例如化合物201，圖20)，其中L由橋接兩個羧酸基或酸酐的兩個羰基的式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5，其中R5是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。所述取代或未取代的二羧酸或酸酐可包含環狀環如環己烷或環戊烷環，其中所述羧酸部分中的一個或兩個(或通過兩個羧酸基形成的酸酐的羰基)是所述環狀環的取代基。在一些實施方案中，所述取代或未取代的二羧酸或酸酐中的一個或多個原子可以被重原子同位素取代。
如圖7a步驟1中所示，N-(t-boc)-N-甲基-乙二胺101可與琥珀酸酐102反應。該反應形成產物N-甲基乙二胺-N’-琥珀酸(N-methylethylenediamine-N’-succinate)103。對于那些由式I’-XIII’和VI’-XXIII’所示的化合物而言，該反應可代表一種用于連接物部分的同位素編碼的方法。可利用所述公開方法(除步驟2以外)制備式I’-XIII’和VI’-XXIII’的化合物的可能的二胺和酸酐的起始原料在圖9a-9c和10a-10c中舉例說明。
參考圖7a和7b以及圖27a和27b的步驟2-4，出于制備載體結合部分(包含報告物部分的化合物可最終與其連接)的目的，可控制步驟1的氨基酸產物的胺和酸官能團。如圖7a步驟2中所示，t-boc胺保護基被置換為Fmoc胺保護基，從而產生Fmoc保護的化合物104。在步驟3(圖7a)中，化合物通過其羧酸官能團經由可斷開連接物被固定到載體上，從而形成了載體結合的化合物105。所述載體(所述連接物部分固定到其上)可包含空間阻礙的可斷開連接物。多種包含可斷開連接物的載體對本領域普通技術人員來說是眾所周知的。空間阻礙的固體載體的非限定性實例包括三苯甲基氯載體(trityl-Cl，Novabiochem，P/N01-64-0074)、2-氯三苯甲基氯載體(Novabiochem，P/N 01-64-0021)、DHPP(Bachem，P/N Q-1755)、MBHA(Applied Biosystems P/N400377)、4-甲基三苯甲基氯載體(Novabiochem，P/N 01-64-0075)、4-甲氧基三苯甲基氯載體(Novabiochem，P/N 01-64-0076)、羥基-(2-氯苯基)甲基-PS(Novabiochem，P/N 01-64-0345)、Rink酸載體(NovabiochemP/Ns 01-64-0380，01-64-0202)和NovaSyn TGT醇載體(Novabiochem，P/N 01-64-0074)。如圖中所示，可使用三苯甲基氯載體(參見實施例3)。
如圖7b步驟4中所示，可除去載體結合的化合物105的末端胺的保護基團，從而促進所述載體結合的產物化合物106的所述胺與包含報告物部分的化合物進行反應。
因此，通常可使氨基酸產物的胺基與包含報告物部分的化合物反應以形成報告物/連接物組合。如圖7a-7c和27a-27c中所示，在一些實施方案中，可通過將所述連接物部分固定到固體載體上而促進該反應。然而，應當理解，雖然可用在一些實施方案中，但連接物部分的固定并非必須的。
包含報告物部分的化合物通常具有兩個特征。一個特征可以是取代或未取代的N-烷基化的乙酸部分，其中所述乙酸部分的羧酸(或硫代羧酸)基可與氨基酸產物的胺基反應而形成酰胺鍵(或硫代酰胺鍵)。第二個特征可以是與所述乙酸部分的亞甲基碳共價鍵合的氮原子。包含氮原子的部分可以是取代的仲胺，如二甲胺、二乙胺或丙胺。包含氮原子的部分可以是環狀化合物，如取代或未取代的哌啶、哌嗪或嗎啉。如圖7b所示，所述含氮原子部分是N-甲基-哌嗪。
參考圖20和21，可使所述氨基酸產物(分別為202和206)與包含報告物的化合物(即化合物203)反應。此反應的產物可形成報告物/連接物部分(即分別為化合物204和207)。
參考圖7b步驟5，可使化合物106的末端胺與取代或未取代的N-烷基哌嗪乙酸部分(107)反應，從而形成載體結合的報告物/連接物組合物108。
當然包含報告物部分的化合物可包含一個或多個同量異位富集部位。例如，取代或未取代的圖7c的N-烷基化的乙酸部分或N-烷基哌嗪可包含一個或多個同量異位富集部位(另外參見圖9a-9c和10a-10c)。因此，可根據二胺、二酸(或酸酐)和包含報告物部分的化合物(例如取代或未取代的N-烷基哌嗪乙酸)的編碼而控制報告物和連接物的編碼。
在一些實施方案中，代表報告物/連接物的分子的羧酸基或硫代羧酸基可以被原位活化，從而促進分析物的標記。因此，在一些實施方案中，不需要額外的反應。
在一些實施方案中，代表報告物/連接物組合的分子的酸基或硫代酸基可被修飾以形成能與分析物的官能團反應的反應活性基團。在一些實施方案中，這可能涉及到與一種或多種產生所期望的反應活性基團的試劑的反應，所述反應活性基團能與分析物的官能團反應。在一些實施方案中，這可能涉及到酸基團或硫代酸基團向活化的化合物的轉化。例如，可以將所述報告物/連接物組合的羧酸基或硫代羧酸基活化，從而制備包含醇或硫醇離去基團的活性酯，其中所述活性酯可與分析物的官能團反應而形成標記的分析物。
參考圖20和21，可將代表報告物/連接物化合物的化合物(分別為化合物204和207)修飾，從而分別產生由I’或I”所代表的化合物。例如，可將羧酸基或硫代羧酸基轉化為活性酯，比如N-羥基琥珀酰亞胺酯。
參考圖7c步驟6，可將所述報告物/連接物化合物從載體上斷開，從而產生中間體109。如所示地，所述中間體包含羧酸基，所述羧酸基可被活化用于與親核物(比如蛋白質或肽的胺基)的反應。盡管在一些實施方案中，所述羧酸可如前所述被原位活化，參考圖7c步驟7，舉例說明了通過與三氟乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(110)的反應而形成N-羥基琥珀酰亞胺酯111。適于形成報告物/連接物化合物的活性酯的其它方法可見于共同未決和共有的美國公開專利申請No.US 2005-0148771A1中。示例性的合成示于圖8。一些示例性活性酯的離去基團作為7-19而描述。
圖9a-c舉例說明了可能來源的同量異位編碼的起始原料，所述起始原料可與所示方法一起用于制備化合物V’-XIII’。圖10a-c，其中編碼的哌嗪可被圖7a-7c中的N-甲基乙二胺衍生物取代，舉例說明了可能來源的同量異位編碼的起始原料，所述起始原料可用于制備化合物XV’-XXIII’。用于從簡單、易得的起始原料(比如編碼的氨基乙酸和氨基乙酸的衍生物(例如肌氨酸)制備編碼的哌嗪的方法是本領域中已知的。例如，用于制備所有不同類型(flavor)的編碼的哌嗪和N-烷基哌嗪化合物的方法可見于共同未決和共有的美國公開專利申請No.US2004-0219685 A1、US 2005-0147982、US 2005-0147985和2005-1048774A1中。圖12d和12e也舉例說明了示于圖10c中的編碼的哌嗪化合物的合成路線的實例。示于圖12d和12e中的合成路線基于如公開的專利申請中所述的制備編碼的哌嗪化合物的方法。
如前所述，編碼的起始原料(比如編碼的氨基乙酸、肌氨酸和琥珀酸酐)可得自不同的商業來源，比如Cambridge Isotope Laboratories、Andover、MA(參見www.isotope.com上的列表或“基本起始原料”)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支機構)。Cambridge Isotope Laboratories和Isotec還根據客戶合成協議制備所需要的化合物。同上，各種同量異位編碼的起始原料的來源和部分編號的參考文獻可見于本發明公開內容各處，包括實施例和附圖中。然而，這些參考文獻僅為提供信息的目的，并非旨在是對所要求保護的本發明的限制或窮盡所有可能的商業來源。
參考圖11a、11b和實施例8～9，通過適用已知的合成反應，舉例說明并描述了用于制備各種編碼的N-甲基-氨基乙酸(即肌氨酸)的方法。例如，這些編碼的原料可用于制備編碼的N-甲基哌嗪乙酸部分，所述N-甲基哌嗪乙酸部分用于如在圖9a-c和10a-c中所引用的多個美國公開專利申請中所述的報告物中。因此，顯然這些舉例說明和實施例可用于從可商購的簡單的編碼的原料制備本文中所述的各種編碼的標記試劑。
參考圖12a、12b、12c、28a和29a，通過適用已知的合成反應，舉例說明了用于制備各種編碼的N-甲基-乙二胺的方法。因此，顯然這些舉例說明可用于從可商購的簡單的編碼的原料制備本文中所述的各種編碼的標記試劑。例如，參考圖12c，可以預計，在Michel等Structuralstudy of bonding in thioamides.Synthesis and conformation ofthioalanines and thioglvcines.Canadian Journal of Chemistry，67(8)1312-1318(1989)中所描述的方法可用作進行所示反應的步驟1的一般指導原則。此外，可以預計，由Gallery Chemical(a BASF Company，Florham Park，New Jersey，USA)提供的關于硼烷-四氫呋喃絡合物的產品文獻(及其中所公開的參考文獻，如Amedia等，Syn.Comm.292377(1999))可用作進行所示反應的步驟2的一般指導原則。
實施例 可根據以下實施例，進一步理解本發明所教導的各方面，所述實施例不應解釋為以任何方式限制本教導的范圍。
實施例1N-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-琥珀酸(103)的合成(步驟1-圖7a) 向充分攪拌的N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-乙二胺101(5.5g，0.032mol)溶于二氯甲烷(CH2Cl2，30mL)的溶液中一次性加入琥珀酸酐102(3.2g，0.032mol)。在室溫下將反應混合物攪拌1小時后，得到淤漿。將此淤漿不經進一步處理而用于步驟2。
注如果可能，使用N-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-N-甲基-乙二胺將不必進行步驟2。為此原因，圖9a-c顯示了Fmoc保護的N-甲基乙二胺的使用。
實施例2N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸(104)的合成(步驟2-圖7a) 向由步驟1產生的化合物103的淤漿中加入20mL 80％的溶于CH2Cl2中的三氟乙酸(TFA)。然后將反應混合物在室溫下攪拌，并通過薄層色譜法(TLC)監測。2小時后，混合物的TLC表明起始原料完全消失，并形成了極性產物。然后在旋轉蒸發儀中除去過量的溶劑和TFA并將殘留物與四氫呋喃(THF，30ml x 3)共蒸發。然后將余下的油狀殘留物溶于丙酮(50ml)中，并通過小心加入NaHCO3(水)溶液而將pH調至堿性。然后一次性加入N-(9-芴基甲氧基羰基-氧基)琥珀酰亞胺(Fmoc-Osu，13.5g，0.0399mol)溶于丙酮(70mL)中的溶液。然后將反應混合物在室溫下攪拌過夜。此時進行的TLC證實了起始原料已耗盡。然后在旋轉蒸發儀中除去丙酮/水，以水(50mL)稀釋殘留物，并用乙醚洗滌(Et2O，30mL x 3)以除去非極性的雜質。然后用2NHCl將水層酸化至pH～2并以乙酸乙酯萃取(EtOAc，100mL x 3)。然后用水(30mL x 4)、鹽水(1 x 30mL)洗滌合并的有機部分，并以硫酸鈉(Na2SO4)干燥。然后在旋轉蒸發儀中除去EtOAc，并將殘留物保持在高真空下過夜而得到吸濕性白色固體N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸104(10.5g，82％)。MS397.2(MH+) 實施例3載體接合的N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸(105)的合成(步驟3-圖7a) 向N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸(104)(595mg，1.5mmol)溶于CH2Cl2(10mL)的溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(DIPEA，776mg，6mmol)，然后加入三苯甲基氯載體(1g，1mmol，P/N SC5028，Advanced Chemtech)。然后在室溫下將淤漿攪拌1小時，然后用CH2Cl2/MeOH/DIPEA(17:2:1，3 x 10mL)的溶液、CH2Cl2(3 x 10mL)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，2 x 10mL)洗滌，最后再用CH2Cl2(2 x 10mL)洗滌。在真空下干燥負載的載體(105)并分析樣品的Fmoc負荷。平均負荷為0.5mmol/g。將此載體不經進一步處理而用于步驟4。
實施例4載體接合的N-(2-甲基氨基-乙基)-琥珀酸(106)的合成(步驟4-圖7b) 用20％的哌啶/DMF(使用10mL，然后允許排出)處理載體接合的琥珀酸N-(Fmoc)-N-甲基乙二胺(105)。然后再加入20％的哌啶/DMF(10mL)并攪拌淤漿10分鐘。然后用DMF(10mL x 2)、CH2Cl2(10mL x 2)洗滌載體，最后用DMF(10mL x 2)洗滌。然后將脫保護的載體(106)迅速用于步驟5。
實施例5載體接合的N-(2-{甲基-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基]-氨基}-乙基)-琥珀酸(108)的合成(步驟5-圖7b) 將(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸二(三氟乙酸)鹽107(965mg，2.5mmol)溶于無水DMF(8mL)和DIPEA(646mg，5mmol)中。向此溶液中加入O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU，950mg，2.5mmol)。將混合物渦旋1分鐘并向其中加入載體(106)。將淤漿攪拌25分鐘，過濾，以DMF(10mL x　3)、CH2Cl2(10mL x 2)和DMF(10mL x 2)洗滌。然后使用等量的試劑將載體進行二次偶聯(second round of coupling)(即雙偶聯(double coupling))，然后用DMF(10mL x 3)和CH2Cl2(10mL x 3)洗滌。然后在真空下將載體(108)干燥并不經進一步處理用于步驟6。
實施例6N-(2-{甲基-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基]-氨基}-乙基)-琥珀酸(109)的合成(步驟6-圖7c) 將載體(108)用TFA/CH2Cl2(10mL)處理并放置5分鐘。然后使溶劑從載體排出，再次用TFA/CH2Cl2(15mL)處理載體并收集溶劑。將TFA/CH2Cl2的兩部分混合，然后在旋轉蒸發儀中濃縮。將殘留物與THF(20mL x 3)一起共蒸發。在高真空下除去痕量的TFA。然后用無水乙醚研磨殘留物。得到膠粘團塊。利用攪拌棒將此產物置于強烈攪拌下過夜。通過離心分離所得的白色固體，以乙醚洗滌(5mL x 3)，在高真空下干燥而得到白色吸濕性固體109(320mg，總產率59％)。MS315(MH+) 實施例7N-(2-{甲基-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基]-氨基}-乙基)-琥珀酸的NHS酯(111)的合成(步驟7-圖7c) 向109(100mg，0.18mmol)溶于無水THF(2mL)的溶液中加入三氟乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯110(48mg，0.22mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。在旋轉蒸發儀下除去THF，通過與額外的THF(2mL x 2)共蒸發而除去痕量的TFA。然后在冰箱中將膠狀殘留物靜置于無水乙醚中過夜。傾析出乙醚并將殘留物保持在高真空下而得到泡沫狀的111(110mg，93％)。MS412(MH+) 實施例8編碼的N-(t-boc)-肌氨酸(21)的合成(參見圖11a) 將無水THF(100ml)通過套管轉移至氮氣吹洗的容納有BOC-15NH-13CH2-13COOH(7g，39.29mmol，1當量，Cambridge IsotopeLab，P/NCNLM-2412-0)和磁力攪拌棒的500mL圓底燒瓶中。將混合物在室溫下攪拌直到得到澄清的溶液。然后利用冰浴將溶液冷卻至0℃。用氮氣吹洗配有隔片的量筒并向其中轉移叔丁醇鉀(t-BuOK，157mL，1M，在THF中，4當量)溶液。然后將所述t-BuOK溶液加入到反應混合物中同時利用套管和壓力差在0℃下攪拌。起初形成了凝膠，所述凝膠在約一分鐘內溶解。使反應在0℃下再攪拌10分鐘。
將數安瓿的13CH3I(2 x 10g，140mmol，3.56當量，CambridgeIsotope Lab，P/NCLM-287-10)在冰箱中冷卻(3CH3I是高度揮發性的，應僅在冷凍下打開)并在氮氣覆蓋下打開。將內容物通過套管迅速轉移到反應混合物中。然后在0℃下強烈攪拌反應混合物1小時。將反應的小的等分試樣(100μL)用水(1mL)處理、通過加入1M HCl而酸化至pH1并用EtOAc(2mL)萃取。EtOAc層的TLC分析表明反應完成(Rf 20＝0.51，Rf 21＝0.70；1:4 MeOH-CH2Cl2-AcOH(10μl/10mL)；通過用3％(w/v)的茚三酮在乙醇(EtOH)中的溶液加熱而使TLC顯色。
然后在減壓下除去THF溶劑，將固體溶于100mL水中，然后以1M HCl酸化至pH＝1。用EtOAc(300mL x 2)萃取水介質。將合并的EtOAc層用2％(w/v)NaHSO3(50mL)+鹽水(50mL)溶液處理并強烈混合以除去在處理過程中形成的I2。將EtOAc層用鹽水(50mL)進一步洗滌并用Na2SO4干燥。然后在減壓下除去EtOAc和任何叔丁醇(t-BuOH)而得到稠厚無色油或低熔點固體的化合物21(7.42g，產率97％)。ES-MS(直接加入甲醇(MeOH)中)計算的MNa+(C513C3H1515NO4Na)＝216.10，實測的MNa+＝216.10。
實施例9編碼的肌氨酸甲酯(23)的合成(參見圖11b) 將BOC-15N13CH3-13CH2-13COOH(21，7.42g，38.41mmol)、二甲基氨基吡啶(DMAP，470mg，3.41mmol)和MeOH(7.8mL，5 x 38.41mmol)溶于EtOAc(200mL)中并冷卻至0℃。然后向反應混合物中加入溶解在EtOAc(30mL)中的二環己基碳二亞胺(DCC，8.32g，1.05x 38.41mmol)。然后將反應混合物攪拌過夜，同時逐漸溫熱至室溫。TLC分析表明反應已完成(Rf 21＝0.00，Rf 22＝0.50；7:3 己烷-EtOAc；通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。通過過濾(Whatman #2濾紙)除去二環己基脲(DCU)沉淀并將濾液濃縮至50mL。將濃縮溶液吸收進硅膠中并通過快速色譜純化(進行兩次；120g SiO2，柱Isco.；85mL/min，0～5分鐘溶于己烷的10％ EtOAc，5～20分鐘溶于己烷的25％ EtOAc)。
合并含有純產物22的級分并使用旋轉蒸發儀在室溫下濃縮至50mL(化合物22的沸點低，不應施加高真空)。向濃縮溶液中加入HCl(60mL，4M HCl在二氧六環中)并攪拌。觀察到強烈產生氣泡。在30分鐘后，TLC分析表明已完全脫去t-Boc的保護(Rf 23＝0.00，Rf 22＝0.50；7:3 己烷-EtOAc；通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。在減壓下除去揮發物而得到白色吸濕性固體化合物23(5.2g，兩步總產率94％)。ES-MS(直接加入甲醇(MeOH)中)計算的4MH+(C13C3H1015NO2)＝108.09，實測的MH+＝108.08，計算的M2H+＝215.18，實測的M2H+＝215.17。
實施例10載體接合的[Glu1]-人血纖維蛋白肽B的合成 [Glu1]-人血纖維蛋白肽B[Glu-Fib，CAS#103213-49-6]利用標準的Fmoc-肽合成方案(Novabiochem catalog，2004-2005)和以下的氨基酸衍生物在三苯甲基氯樹脂(P/NNovabiochem，01-64-0074)上人工裝配所述肽Fmoc-Arg(Pbf)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1145)、Fmoc-GIu(OtBu)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1020)、Fmoc-Gly-OH(P/NNovabiochem，04-12-1001)、Fmoc-Val-OH(P/NNovabiochem，04-12-1039)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1089)、Fmoc-Asp(Mpe)-OH(P/NBachem，B-3560)、Fmoc-Phe-OH(P/NNovabiochem，04-12-1030)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1033)、Fmoc-Ala-OH(P/NNovabiochem，04-12-1006)。[Glu1]-人血纖維蛋白肽B的氨基酸序列Seq ID.No.1Glu-Gly-Val-Asn-Asp-Asn-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg。
實施例11Fmoc-N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成 將NH(Me)-CH2CH2-NH(Me)(1.6mL，15mmol，P/NAlfa-Aesar，USLF006653，)溶于THF(15mL)的溶液加入到三苯甲基氯樹脂(P/NNovabiochem，01-64-0074，1g，1.5mmol)中并在環境溫度下攪拌混懸液1小時。然后將樹脂過濾并以N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，15mL x 3)洗滌，以MeOH-DMF-二異丙基乙胺(DIPEA，15mL，4:7:2 v/v，P/NAldrich，387649)處理15分鐘。最后將樹脂過濾并以NMP(15mL x 3)洗滌。
然后向樹脂中加入溶解在DMF(10mL)中的琥珀酸酐(P/NAldrich，2399690，1.5g，15mmol)，隨后加入DIPEA(2.61mL，15mmol)。然后在環境溫度下攪拌樹脂20分鐘。然后將樹脂過濾并以NMP(15mL x 3)洗滌，然后以乙腈(CH3CN，15 x 3mL)洗滌。
將樹脂以TFA-DCM(20％ v/v，40mL)處理、過濾并再次用TFA-DCM(20％ v/v，10mL x 5)洗滌。在減壓下將濾液濃縮成油狀殘留物(TFA，N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH，1.07g)，將所述殘留物溶解在飽和NaHCO3(pH 8-9)中。然后向所述水溶液中加入Fmoc-OSu的溶液(P/NAdvance ChemTech RC8015，1.43g，4.24mmol，溶于丙酮(20mL)中)并在環境溫度下攪拌2小時。TLC分析表明形成了產物(Rf＝0.50；9:1:0.01 DCM-MeOH-AcOH，UV 254nm，通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。然后濃縮反應混合物以除去丙酮，然后以水(150mL)稀釋殘留物。通過利用Et2O(100mL x 2)萃取除去非極性雜質。將水層酸化(pH～1，HCl，1M)并用EtOAc(100mL x 2)萃取。將合并的EtOAc層通過Na2SO4干燥并濃縮而得到0.95g無色粘稠油Fmoc-N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH。ES-MS(直接加入MeOH中)計算的MH+(C22H24N2O5H+)＝397.17，實測的MH+ 397.16。
實施例12Fmoc-NH-CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-COOH·DIPEA的合成 使Fmoc-NH-CH2CH2-NH2·HCl(P/NNovabiochem，01-63-0064，1當量(eqv.))在DIPEA(1eqv.)存在下與琥珀酸酐(1eqv.)在DCM中反應而得到所述標題化合物。
實施例13Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成 向充分攪拌的Boc-NMe-CH2CH2-NH2(265mg，1.52mmol)溶于丙酮(15mL)的溶液中加入Fmoc-OSu(564mg，1.67mmol，溶于15mL丙酮中)的溶液。然后在環境溫度下攪拌混合物2小時。在此階段對反應混合物的TLC分析表明形成了Boc-NMe-CH2CH2-NH-Fmoc(Rf＝0.35；3:7 EtOAc:己烷，UV 254nm，通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。
蒸發丙酮后將產物通過快速色譜(40g Isco-二氧化硅柱，40mL/min，254nm，3:7 EtOAc:己烷，收集18mL級分，級分15-24含有純的產物)純化，得到泡沫狀的Boc-NMe-CH2CH2-NH-Fmoc(520mg，產率＝86％)。
在環境溫度下用TFA-水(15ml，95:5，v/v)處理Boc-NMe-CH2CH2-NH-Fmoc(520mg，1.31mmol)1小時，此時TLC分析表明已完全脫除了Boc的保護。在減壓下除去TFA-水并將所得的油溶解在DCM(30mL)中。向此溶液中加入琥珀酸酐(131mg，1.31mmol)，然后加入DIPEA(至pH～10(通過濕的pH試紙))。然后攪拌混合物30分鐘。然后將反應混合物HCl(1M)酸化(pH＝1)并以EtOAc(100mL x 3)萃取。用鹽水(100mL x 2)洗滌合并的EtOAc層并通過Na2SO4干燥。在減壓下除去EtOAc而得到無色油狀的標題化合物。ES-MS(直接加入MeOH中)計算的MH+(C23H26N2O5H+)＝411.10，實測的MH+ 411.09。
實施例14N-(Fmoc)-N’-琥珀酰基-哌嗪的合成(圖20) 向Boc-哌嗪(P/NLancaster L13363，500mg，2.68mmol)溶于DCM(30ml)的溶液中加入琥珀酸酐(269mg，2.68mmol)。在環境溫度下攪拌反應2小時。TLC分析表明形成了琥珀酰化的Boc-哌嗪(Rf＝0.50；9:1:0.01 DCM-MeOH-AcOH，通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。向此溶液中加入TFA(30mL)，然后在環境溫度下攪拌混合物1小時。在減壓下除去混合物中的揮發性成分并將所得的油溶于含有最少量水的THF(30mL)中，通過加入DIPEA將pH調節到9。加入Fmoc-OSu(907mg，2.69mmol)溶于THF(10mL)中的溶液并在環境溫度下攪拌1小時。TLC分析表明形成了產物(Rf＝0.55；9:1:0.01 DCM-MeOH-AcOH，UV 254nm，通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。然后在減壓下除去混合物中的揮發性成分并將所得的油溶于最小體積的飽和NaHCO3中。然后用Et2O(100mL x 2)萃取水溶液，用HCl(1M)酸化(pH～1)并用EtOAc(150mL x 2)再萃取。將合并的EtOAc層通過Na2SO4干燥并濃縮而得到無色油狀產物。
實施例15琥珀酰化的Fmoc-二胺和哌嗪乙酸與Glu-Fib肽的偶聯 將約10mg的載體接合的[Glu1]-人血纖維蛋白肽B樹脂(參見實施例10)用20％(v/v)溶于DMF中的哌啶處理(2mL x 1分鐘，過濾，然后2mL x 5分鐘)，過濾并洗滌(NMP)。將琥珀酰化的Fmoc-二胺(或其DIPEA鹽，如在實施例11-14中所示[除了用于制備化合物125的、從無關原料自制的、但可利用本文中所公開的方法制得的Fmoc-NH-CH2CH2CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-COOH以外]，相對于樹脂上Glu-Fib量的10eqv)用HATU(P/NApplied Biosystems 4317033，9.5eqv)和DIPEA(30eqv)在NMP(～1mL)中活化。將所述活化的化合物加入到樹脂中并混合30分鐘。然后將樹脂過濾，用NMP洗滌，并通過如上所述的用20％(v/v)溶于DMF中的哌啶處理而除去Fmoc基團。然后利用HATU(9.5eqv)和DIPEA(60eqv)在NMP(～1.5mL)中活化哌嗪乙酸-TFA鹽(10eqv)。然后將此活化的化合物的溶液加入到樹脂中。30分鐘以后將樹脂用NMP洗滌，然后用CH3CN洗滌。然后使用95:5 TFA-水(200μL，2小時)將標記的肽從樹脂上斷開(和脫保護)并用乙醚(Et2O)沉淀。
各種標記肽的質譜分析數據(ES-MS，在水中直接輸入) 化合物120(N-甲基-哌嗪)乙酰基-N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib計算的MH+＝1880.9，實測的MH+＝1880.3 化合物121(N-甲基-哌嗪)乙酰基-NH-CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib計算的MH+＝1853.8，實測的MH+＝1853.8 化合物122(N-甲基-哌嗪)乙酰基-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib計算的MH+＝1867.9，實測的MH+＝1867.9 化合物123(N-甲基-哌嗪)乙酰基-N(Me)-CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib計算的MH+＝1867.9，實測的MH+＝1867.9 化合物124(N-甲基-哌嗪)乙酰基-哌嗪-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib計算的MH+＝1879.9，實測的MH+＝1879.0 化合物125(N-甲基-哌嗪)乙酰基-NH-CH2CH2CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib計算的MH+＝1880.90，實測的MH+＝1880.94。
實施例16關于圖22a、22b、23a、23b、24a和24b的討論 圖22a是化合物122的MS分析圖。觀察到標記肽具有+2和+3電荷的離子的強峰。圖22b是對所選的在圖22a中觀察到的+2峰和其片段的MS/MS分析圖。除了肽的子片段離子以外，還觀察到在m/z 113.10處的未編碼的報告物離子的強信號。此數據表明同樣總體結構的編碼的標記試劑將斷裂而產生具有獨特質量的報告物離子，所述報告物離子可用于分析物的多重分析。
圖23a是化合物124的MS分析圖。觀察到標記的肽具有+2和+3電荷的離子的強峰。圖23b是對所選的在圖23a中觀察到的+2峰和其片段的MS/MS分析圖。除了肽的子片段離子以外，還觀察到在m/z113.10處的未編碼的報告物離子的強信號。此數據表明同樣總體結構的編碼的標記試劑將斷裂而產生具有獨特質量的報告物離子，所述報告物離子可用于分析物的多重分析。
圖24a是化合物125的MS分析圖。觀察到標記的肽具有+2和+3電荷的離子的峰。圖24b是對所選的在圖24a中觀察到的+2峰和其片段的MS/MS分析圖。除了肽的子片段離子以外，還觀察到在m/z 113.10處的未編碼的報告物離子的強信號。此數據表明同樣總體結構的編碼的標記試劑將斷裂而產生具有獨特質量的報告物離子，所述報告物離子可用于分析物的多重分析。
在MS和MS/MS分析下，化合物120、121和123也表現出與化合物122、124和125所觀察到的相似性質。在所有情形下，都觀察到了報告物離子和子片段離子。因此，此數據表明同樣總體結構的編碼的標記試劑將斷裂而產生具有獨特質量的報告物離子，所述報告物離子可用于分析物的多重分析。
實施例17編碼的N-(t-boc)-氨基乙醇的合成(圖28a) 步驟1(圖28a) 利用套管在氬氣壓下向N-Boc-肌氨酸(C3，15N)140(10g，51.7mmol)溶于無水THF(200ml)的冰冷溶液中滴加1M的BH3·THF溶于THF中的溶液(15.56g，181ml，181mmol)。起初控制加入速率保持適度的泡騰。一旦泡騰結束，就增加加入速率。加入后，在0℃攪拌混合物約1.5小時。通過TLC分析確認反應完成。然后通過小心加入0℃的甲醇而將反應猝滅。在旋轉蒸發儀中濃縮反應混合物。然后將油狀殘留物與另外加入的甲醇(500mL)共蒸發。利用Combi-flash儀器，將所得的油狀殘留物通過快速色譜純化而得到8g(90％)無色油狀的N-Boc-N-Me-氨基乙醇(13C，15N)141。MS(178，M+H) 步驟2，(圖28a) 在超過4分鐘的時間下向141(7.8g，48mmol)、Et3N(16.7mL，120mmol)溶于DCM(700mL)的冰冷溶液中加入MsCl(P/NFluka 64260，4.5mL，57.6mmol)并同時攪拌。在0℃下又過15分鐘后，通過TLC分析反應混合物，表明形成了新的產物(Rf 2＝0.20，Rf 3＝0.42；1:1 己烷-EtOAc，通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使TLC顯色)。
蒸發DCM并將黃色固體溶于EtOAc(1.5L)中。將EtOAc層用HCl(1M，800mL)洗滌，然后用鹽水(400mL x 2)洗滌，通過Na2SO4干燥并濃縮而得到黃色油。將所述油通過柱色譜(120g SiO2柱Isco(X2)；40mL/分鐘，0～5分鐘溶于己烷的35％EtOAc，5～15分鐘溶于己烷的40％EtOAc。收集多個18mL-級分；級分9-24含有純的化合物)純化而得到無色油狀的Boc＊NH＊CH2CH2OMs 142(～11.5g)，其直接用于下一步。
步驟3；圖28a 用最小量的THF(～60ml)將化合物142(48mmol，假定前面反應的產率為100％)轉移到化學玻璃壓力容器中，并向其中加入500mL2M的甲胺溶液(P/NAldrich 395056，31g，1000mmol)，封口并在40～45℃下加熱(同時攪拌)過夜(使用安全罩)。TLC分析(1:1 EtOAc-己烷)表明142已完全耗盡并生成了新產物(Rf 4＝0.52；1:1DCM-MeOH+1％(v/v)Et3N；先將TLC板加熱5分鐘以除去Et3N，然后通過用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加熱而使其顯色)。然后將反應混合物在旋轉蒸發儀中濃縮，將殘留物溶于二氯甲烷(1.5L)中并轉移到分液漏斗中。加入1N NaOH(200mL)和鹽水(200mL)并萃取。進一步用1N NaOH(200mL)和鹽水(200mL)洗滌有機層。通過Na2SO4干燥。將殘留物通過Combi Flash純化而得到無色油的143(6.45g，76％)。MS(177M+H)。
實施例18包含6個同位素編碼部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成(圖28b) 向攪拌的143(6.4g，36.5mmol)溶于丙酮(200mL)的溶液中一次性加入琥珀酸酐-13C4(3.8g.36.5mmol)。然后滴加三乙胺(5mL，36.5mmol)并將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。在此時TLC確認起始原料已完全消失。在旋轉蒸發儀中濃縮反應混合物并將殘留物溶于二氯甲烷(100mL)中。然后加入140mL 4M的HCl溶于二氧六環中的溶液。在5分鐘內形成白色沉淀。通過TLC分析上清液以確認起始原料的完全消失。在旋轉蒸發儀中濃縮反應混合物并將白色固體殘留物溶于飽和NaHCO3溶液(pH 8-9)中。然后向上述溶液中加入Fmoc-Osu(14.5g，43mmol)溶于丙酮(400mL)中的溶液并在室溫下攪拌3小時。在此時TLC表明反應完成。然后在旋轉蒸發儀中濃縮反應混合物，并使用乙醚(200mL)和水(200mL)將固體殘留物轉移到分液漏斗中。分出乙醚層，并用乙醚(200mL X 3)萃取水層。然后用6M HCl將乙醚溶液酸化至pH 2并用EtOAc(4 X 200mL)萃取。將合并的EtOAc萃取物用鹽水(50mL X 3)洗滌并通過Na2SO4干燥。在旋轉蒸發儀上蒸發EtOAc，得到泡沫，將此泡沫保持在高真空下得到白色固體144，產率95％。MS(403，M＝H) 實施例19編碼的N-(Fmoc)-N’-(甲基)-乙二胺·HCl的合成(圖29a) 步驟1(圖29a) 利用套管在氬氣壓下向N-Boc-肌氨酸(13C3，15N)150(10g，51.7mmol)溶于無水THF(200ml)的冰冷溶液中滴加1M的BH3·THF溶于THF中的溶液(15.56g，181ml，181mmol)。起初控制加入速率保持適度的泡騰。一旦泡騰結束，就增加加入速率。加入后，在0℃攪拌混合物約1.5小時。通過TLC分析確認反應完成。然后通過小心加入0℃的甲醇而將反應猝滅。在旋轉蒸發儀中濃縮反應混合物。然后將油狀殘留物與另外加入的甲醇(500mL)共蒸發。利用Combi-flash儀器，將所得的油狀殘留物通過快速色譜純化而得到8g(90％)無色油狀的N-Boc-N-Me-氨基乙醇(13C3，15N)151。MS(180，M+H) 步驟2(圖29a) 利用套管在氬氣壓下向N-Boc-N-Me-氨基乙醇(13C3，15N)151(8g，44.6mmol)、四溴化碳(17.8g，53.5mmol)和疊氮化鈉(8.7g，133.8mmol)的混合物中加入無水DMF(240ml)，并攪拌所得的淤漿5分鐘。在單獨的燒瓶中制備三苯基膦(14g，53.5mmol)溶于無水二甲基甲酰胺(45ml)中的溶液并在氬氣下保存。利用套管在氬氣壓下向上述淤漿中滴加所述三苯基膦溶液。再用DMF(5ml)沖洗燒瓶以確保定量轉移。溫熱反應混合物，顯現出亮黃色。然后在室溫下攪拌混合物30分鐘。取出等分試樣并加入幾滴乙醚。沉淀出白色固體，通過TLC分析上清液。通過起始醇(Rf0.24)的消失和較小極性產物(Rf0.65)的形成表明了反應的完成。向反應混合物中加入乙醚(1.5L)以沉淀三苯基鏻氧化物。然后通過有硅藻土層的燒結漏斗過濾所得的淤漿。再次用乙醚(500ml)充分洗滌白色固體。然后用鹽水(300ml X 4)洗滌合并的濾液并通過Na2SO4干燥，過濾并在低于25℃的溫度下于適度的真空度下在旋轉蒸發儀上蒸發。然后使用Combi-Fash儀器將殘留物通過快速色譜純化而得到無色油的疊氮化物152，將其不經任何分析迅速用于下一步。
步驟3(圖29a) 將從上述步驟得到的疊氮化物152溶于甲醇(900ml)中。然后加入飽和氯化銨溶液(180ml)并將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘。然后向反應混合物中小批量地加入鋅粉(8.7g，133.8mmol)。觀察到有氮氣放出。然后在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。通過TLC分析等分試樣，通過起始原料(Rf0.65)的消失確認反應的完成。濾出固體(未反應的鋅和氫氧化鋅)并用甲醇(200ml)洗滌。在旋轉蒸發儀中濃縮合并的濾液。將殘留物溶于二氯甲烷中并用6N NaOH溶液(800mL)萃取。用二氯甲烷(800ml)反萃水層。將合并的二氯甲烷萃取物通過Na2SO4干燥并在旋轉蒸發儀中蒸發而得到淺黃色稠厚油的Boc-胺153。步驟2和3的總產率為80％。MS(179，M+H) 步驟4(圖29a) 向N-Me-Boc-胺153(5.62g，31.5mmol)的丙酮(200ml)溶液中加入Fmoc-Osu(10.64g，31.5mmol)的丙酮(200ml)溶液。在室溫下攪拌反應混合物5分鐘后，加入80mL飽和NaHCO3溶液。繼續攪拌反應混合物2小時。在此時TLC表明起始原料完全消失且形成了較小極性的產物。在旋轉蒸發儀中蒸發丙酮。將半固體殘留物在EtOAc(2L)、1M HCl(125ml)、鹽水(125mL)和水(250mL)中分配。將EtOAc層進一步用1M HCl(100mL)、鹽水+水(150mL+250mL)和鹽水(250ml X 2)洗滌。通過Na2SO4干燥并在旋轉蒸發儀中蒸發而得到灰白色的固體產物(12.6g)，將其溶于二氯甲烷(200mL)中并以4N HCl(188mL)處理30分鐘而得到白色固體的Fmoc胺鹽酸鹽154(10.4g)。MS(301，M+H) 實施例20包含8個同位素編碼部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成(圖29b) 向Fmoc-胺鹽酸鹽154(7.25g，21.5mmol)的二氯甲烷(600mL)混懸液中一次性加入琥珀酸酐(13C4)。然后滴加Et3N(4.5ml，32.3mmol)。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘后，TLC分析表明起始原料已完全消失。在旋轉蒸發儀中蒸發二氯甲烷。將所得的殘留物在EtOAc(2L)和1M HCl(350mL)中分配。將有機層進一步用1M HCl(200mL)和鹽水(200mL X 4)洗滌，通過Na2SO4干燥并蒸發而得到白色泡沫，將所述白色泡沫保持在高真空下48小時，得到白色固體的編碼的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH 155(7.5g，86％)。MS(405，M+1) 利用基本上如上述實施例1-7中所述的合成方案(另外參見圖7a-7c)，可將根據實施例19和20制備的組合物用于根據圖27a-27c的編碼的標記試劑的合成。圖25a-25b舉例說明了可利用本發明中公開的一般方法制備的一些標記試劑。另外，圖26a-26b舉例說明了可利用圖25a-25c中公開的標記試劑制備的一些標記的分析物。根據在質譜儀中的斷裂，所述標記的分析物將產生可用于定量上述各種樣品中的分析物的片段離子和片段離子的混合物。
還應當理解，通過選擇合適的編碼的起始原料，上述方法與常規實驗方法相結合可用于制備各種其它的編碼的組合物，所述組合物可用作根據在此公開的一種或多種發明的標記試劑。因此，上述實施例在任何方式下都不是限制性的。
盡管已描述了本發明的教導連同多種實施方案，但并非旨在將本發明的教導限制在這些實施方案中。相反，本領域技術人員將會理解，本發明的教導包括各種替代、修改和等同物。
權利要求
1.式I所代表的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
Y是可被取代或未取代的并可任選地可斷開地連接到載體上的5、6或7元雜環，其中所述雜環包含通過共價鍵連接到基團J上的至少一個環氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基團，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-；和
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；
其中，
V+是帶正電荷的反離子；
每個R3、R4、R5、R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和
每個R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此獨立地可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
2.權利要求1的化合物，其中形成報告物部分的基團Y-J包含至少一個同位素富集部位。
3.權利要求1的化合物，其中形成平衡物部分的由式I#所代表的基團包含至少一個同位素富集部位
其中，
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；和
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-。
4.權利要求1的化合物，其中形成報告物部分的由式Y-J所代表的基團包含至少一個同位素富集部位，并且形成平衡物部分的由式I#所代表的基團包含至少一個同位素富集部位
其中，
Y是可被取代或未取代的并可任選地可斷開地連接到載體上的5、6或7元雜環，其中所述雜環包含通過共價鍵連接到基團J上的至少一個環氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基團，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；和
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-。
5.權利要求1的化合物，由式II所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
W是取代六元雜環的至少一個M基團的原子或基團，并且位于所述六元環的氮的鄰位、間位或對位，并且是-N(H)-、-N(R”)-、-N(R”’)-、-P(R”)-、-P(R”’)-、-O-或-S-；
每個余下的基團M彼此獨立地是-CM’2-，其中每個M’可以彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R8、-OR8、-SR8、-R8’OR8或-R8’SR8；
J是由式-CJ’2-所代表的基團，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-；
每個R”彼此獨立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；
每個R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或將所述化合物可斷開地與載體連接起來的可斷開連接物；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；
其中，
V+是帶正電荷的反離子；
每個R3、R4、R5、R6、R7、R8和/或R10彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和
每個R3’、R4’、R5’、R6’、R8’和/或R9’彼此獨立地可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
6.權利要求5的化合物，由式III所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
s是1～5的整數，t是1～10的整數；
R1是氫、氘或R6；
R2是氫、氘或R7；
R11是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；
其中，
V+是帶正電荷的反離子；
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或將所述化合物可斷開地與載體連接起來的可斷開連接物；和
其中，
每個R6、R7和/或R10彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和
每個R9’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
7.權利要求6的化合物，其中所述化合物由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在適當時替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
R1是氫或R6；
R2是氫或R7；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；
其中，
V+是帶正電荷的反離子；和
R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。
8.權利要求6的化合物，其中所述化合物由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
9.權利要求5的化合物，由式IV所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
t是1～10的整數；
R11是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或-R”’；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；
其中，
V+是帶正電荷的反離子；
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或將所述化合物可斷開地與載體連接起來的可斷開連接物；和
其中，
每個R9’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基；和
每個R10’彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。
10.權利要求9的化合物，其中所述化合物由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在適當時替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；和
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反應活性基團、反應活性基團的離去基團或共價鍵合的分析物；
其中，V+是帶正電荷的反離子。
11.權利要求1、5、6或9中任一項的化合物，其中所述化合物包含至少一個同位素富集部位。
12.權利要求1、5、6或9中任一項的化合物，其中所述化合物包含兩個或更多個同位素富集部位。
13.權利要求1-12中任一項的化合物，其中Z是肽或蛋白質。
14.權利要求1-12中任一項的化合物，其中Z是-OH。
15.權利要求1-12中任一項的化合物，其中Z是活性酯的離去基團。
16.權利要求15的化合物，其中Z是N-羥基琥珀酰亞胺。
17.權利要求1-13中任一項的化合物，其中所述化合物是校正標準物。
18.一種方法，包括
a)使每種包含一種或多種反應活性分析物的兩種或多種樣品與標記試劑組中不同的標記試劑反應，從而形成兩種或多種不同標記的樣品，每種標記的樣品包含一個或多個標記的分析物，其中所述組中的不同的標記試劑由式I’所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
Y是可被取代或未取代的并可任選地可斷開地連接到載體上的5、6或7元雜環，其中所述雜環包含通過共價鍵連接到基團J上的至少一個環氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基團，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-；
Z’是反應活性基團或反應活性基團的離去基團；
其中，
每個R3、R4、R5、R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；
每個R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基；和
其中，
所述組中每種不同的標記試劑具有相同的總質量，但其中每種不同的標記試劑的形成報告物部分的基團Y-J在一個或多個同位素富集部位被獨特地編碼，從而當基團Y-J的基團J與所述標記試劑的其余部分之間的鍵在質譜儀中斷裂時，產生具有獨特質量的報告物離子；和
b)混合兩種或多種不同標記的樣品或其一部分以及任選的一種或多種校正標準物，從而產生樣品混合物。
19.權利要求18的方法，還包括
c)對樣品混合物或其一部分進行一級質譜分析；
d)給來自所述一級質譜分析的具有選定質荷比的標記的分析物的離子施加解離能級，從而形成至少一些所選離子的報告物離子和子片段離子；以及
e)對所選離子、報告物離子和子片段離子或其一部分進行二級質譜分析。
20.權利要求19的方法，還包括
f)測定所述二級質譜分析中每種報告物離子的總質量和相對量以及一些或全部子片段離子的總質量和/或絕對質量。
21.權利要求19的方法，還包括
g)通過對子片段離子的分析，確定與所選的質荷比相關的標記的分析物。
22.權利要求21的方法，還包括在不同選定質荷比下對標記的分析物的所選離子重復步驟(d)到(g)一次或多次。
23.權利要求22的方法，還包括重復步驟(c)到(g)一次或多次，每次用樣品混合物的不同部分。
24.權利要求18～23中任一項的方法，其中基團Y是取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌嗪部分。
25.權利要求18～24中任一項的方法，其中每種樣品是粗的或處理過的細胞溶解物、體液、組織提取物或細胞提取物。
26.權利要求18～24中任一項的方法，其中每種樣品是由分離過程得到的級分。
27.權利要求18～26中任一項的方法，其中一種或多種分析物是肽和/或蛋白質。
28.權利要求18～26中任一項的方法，其中所述由Z’代表的反應活性基團是活性酯的離去基團，所述活性酯是N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮酯(Dhbt)、羥基吡咯烷酮酯(NHP)、2，4-二鹵代苯基酯、2，2，2-三氟乙基酯或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯。
29.權利要求19～27中任一項的方法，其中每種具有獨特質量的報告物離子鑒定作為每種標記的分析物的來源的樣品。
30.權利要求18～29中任一項的方法，其中所述組中每種不同的標記試劑是載體接合的并通過可斷開連接物與載體相連接，從而使每種不同的樣品與載有所述組中不同標記試劑的載體反應；其中所述方法在進行步驟(b)之前還包括下列步驟
i)任選地洗滌所述載體以除去不與標記試劑的反應活性基團反應的樣品組分；
ii)使所述可斷開連接物斷開，從而釋放供采集的兩種或更多種不同標記的樣品，每種樣品包含一種或多種標記的分析物，其中與特定樣品相關聯的標記的分析物通過連接到其上的具有獨特質量的報告物部分是可鑒定的和/或可定量的；和
iii)在混合樣品之前，任選地采集標記的分析物的每種樣品。
31.權利要求18的方法，還包括
c)用至少一種酶消化每種樣品以部分或完全地降解所述樣品或樣品混合物的組分；或
d)分離所述樣品混合物；或
e)上述c)和d)。
32.權利要求21的方法，其中測定在所述二級質譜分析中具有獨特質量的每種報告物離子相對于其他報告物離子的相對量。
33.權利要求32的方法，其中將與被鑒定的分析物相關的每種具有獨特質量的報告物離子的相對量與組合形成所述樣品混合物的每種不同標記的樣品的量相關聯，從而確定在組合形成所述樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品中的每種之中的分析物的量。
34.權利要求33的方法，其中
i)所述樣品混合物包含已知量的用于所述被鑒定分析物的校正標準物，該校正標準物包含具有獨特質量的報告物部分；并且參照與所述校正標準物相關的獨特報告物離子的量來測定具有獨特質量的每種報告物離子的絕對量；以及
ii)參照具有獨特質量的每種不同報告物離子的相對量來測定所述樣品混合物的每種不同樣品中被鑒定分析物的絕對量。
35.權利要求33的方法，還包括在不同的選定質荷比處對標記的分析物的所選離子重復步驟(d)到(g)一次或多次，從而鑒定和/或測定在組合形成所述樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品的每種之中的一種或多種其它分析物的相對量。
36.權利要求34的方法，還包括在不同的選定質荷比處對標記的分析物的所選離子重復步驟(d)到(g)一次或多次，從而鑒定和/或測定在組合形成所述樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品的每種之中的一種或多種其它分析物的絕對量。
37.權利要求34的方法，其中所述分析物是肽，并且基于組合形成所述樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品的每種之中的一種或多種肽的鑒定和相對量來確定組合形成所述樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品的每種之中的一種或多種蛋白質的鑒定和相對量。
38.權利要求35的方法，其中所述分析物是肽，并且基于組合形成所述樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品的每種之中的一種或多種肽的鑒定和絕對量來確定組合形成樣品混合物的兩種或多種不同標記的樣品的每種之中的一種或多種蛋白質的鑒定和絕對量。
39.權利要求18的方法，其中所述標記試劑由式III’所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
s是1～5的整數，t是1～10的整數；
R1是氫、氘或R6；
R2是氫、氘或R7；
R11是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’；
Z’是反應活性基團或反應活性基團的離去基團；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或將所述化合物可斷開地與載體連接起來的可斷開連接物；和
其中，
每個R6、R7和/或R10彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和
每個R9’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
40.權利要求39的方法，其中至少一種標記試劑由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在適當時替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
R1是氫或R6；
R2是氫或R7；
Z’是反應活性基團或反應活性基團的離去基團；
其中，
R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。
41.權利要求39的方法，其中至少一種標記試劑由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
42.權利要求18的方法，其中所述標記試劑由式IV’所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
t是1～10的整數；
R11是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、或-R”’；
Z’是反應活性基團或反應活性基團的離去基團；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或將所述化合物可斷開地與載體連接起來的可斷開連接物；和
其中，
每個R9’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基；和
每個R10彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。
43.權利要求42的方法，其中至少一種標記試劑由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在適當時替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；和
Z’是反應活性基團或反應活性基團的離去基團。
44.包含至少兩種標記的分析物的混合物，其中所述標記的分析物中的至少兩種源自不同的樣品，其中所述混合物的每種標記的分析物由式I”所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
Y是可被取代或未取代的5、6或7元雜環，其中所述雜環包含通過共價鍵連接到基團J上的至少一個環氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基團，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-；
Z”是共價連接的分析物；
其中，
每個R3、R4、R5、R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；
每個R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基；和
其中，形成報告物部分的所述基團Y-J在一個或多個同位素富集部位被獨特地編碼，從而當所述基團Y-J的基團J與所述標記的分析物的其余部分之間的鍵在質譜儀中斷裂時，產生具有獨特質量的報告物離子，所述報告物離子鑒定作為所述兩種或更多種標記的分析物中的每一種的標記反應來源的所述樣品。
45.權利要求44的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是肽和/或蛋白質。
46.權利要求44的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是核酸。
47.權利要求44的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是脂質和/或類固醇。
48.權利要求44的混合物，其中所述分析物中的一種或多種是質量小于1500道爾頓的小分子。
49.權利要求44的混合物，其中所述分析物中的兩種或更多種是不同的分析物類型。
50.權利要求44的混合物，其中至少一種標記的分析物由式III”所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
s是1～5的整數，t是1～10的整數；
R1是氫、氘或R6；
R2是氫、氘或R7；
R11是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’；
Z”是共價連接的分析物；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-或HS-R9’-；和
其中，
每個R6、R7和/或R10彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和
每個R9’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
51.權利要求50的混合物，其中至少一種標記的分析物由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在適當時替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
R1是氫或R6；
R2是氫或R7；
Z”是共價連接的分析物；
其中，
R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。
52.權利要求50的混合物，其中至少一種標記的分析物由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
53.權利要求44的混合物，其中至少一種標記的分析物由式IV”所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
t是1～10的整數；
R11是氫、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、或-R”’；
Z”是共價連接的分析物；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-或HS-R9’-；和
其中，
每個R9’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基；和
每個R10彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基。
54.權利要求53的混合物，其中至少一種標記的分析物由以下各式所代表，包括其鹽形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在適當時替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
Z”是共價連接的分析物。
55.包含至少一種根據權利要求1～17中任一項的化合物的試劑盒。
56.權利要求55的試劑盒，還包含至少一種選擇的其它試劑，以便通過對樣品進行不同標記而進行用于定量兩種或多種不同樣品中的一種或多種分析物的測定。
57.權利要求55的試劑盒，其中所述化合物是包含具有獨特質量的報告物部分的標記的校正標準物。
58.權利要求55的試劑盒，其中所述化合物是包含具有獨特質量的報告物部分的標記試劑。
59.一種方法，包括
a)使取代或未取代的二胺與取代或未取代的二羧酸或酸酐反應，從而形成包含至少一個酰胺鍵或硫代酰胺鍵的氨基酸產物；
b)使所述氨基酸產物與包含報告物部分的化合物反應，其中所述包含報告物部分的化合物包含取代或未取代的N-烷基化的乙酸部分和與所述乙酸部分共價連接的氮原子；以及
c)修飾所述氨基酸產物的酸基團或硫代酸基團，從而形成能與分析物的官能團反應的反應活性基團，
其中在步驟(c)的產品中包含至少一個同位素富集部位。
60.權利要求59的方法，其中所述方法產生由式I’所代表的化合物，包括其鹽形式和/或水合物形式
其中，
Y是5、6或7元雜環，其中所述雜環包含通過共價鍵連接到基團J上的至少一個環氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基團，其中每個J’彼此獨立地為氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基團，其中n是2～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個K’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基團，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個L’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者1)R1是氫、氘或者R6，并且R2是氫、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起為由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基團，所述基團形成了橋接兩個氮原子的環，其中q是1～10的整數，每個m彼此獨立地是1～5的整數，p是1～4的整數，每個R’彼此獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每個X2彼此獨立地是＝O或＝S；
每個X3彼此獨立地是-O-或-S-；
Z’是反應活性基團或反應活性基團的離去基團；
其中，
每個R3、R4、R5、R6和/或R7彼此獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基或芳基烷基；和
每個R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或亞烷基芳基。
61.一種片段離子組合物，所述片段離子組合物在至少兩種不同標記的分析物分子斷裂后存在于質譜儀中，其中所述標記的分析物分子中的至少一種是選自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段離子是帶正電荷或帶負電荷的。
62.權利要求61的片段離子組合物，所述片段離子組合物具有以下分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
63.權利要求61的片段離子組合物，所述片段離子組合物具有以下分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
64.一種混合物，所述混合物包含由分析物的不同標記的分子發生斷裂而衍生的片段離子，其中所述不同標記的分析物分子的所述片段離子在質譜儀中產生，并且其中至少一種所述不同標記的分析物分子是選自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段離子是帶正電荷或帶負電荷的。
65.權利要求64的混合物，其中至少一種片段離子具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
66.權利要求64的混合物，其中至少一種片段離子具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
67.一種片段離子，所述片段離子是由包含同量異位標記的分析物分子的組合物在質譜儀中發生斷裂而產生，其中所述同量異位標記的分析物分子中的至少一種是選自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段離子是帶正電荷或帶負電荷的。
68.權利要求67的片段離子的組合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
69.權利要求67的片段離子的組合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
70.一種通過以下方法產生的片段離子
在質譜儀中電離包含至少兩種不同標記的分析物分子的樣品混合物的一部分；
在選定的m/z值處選擇至少兩種所述不同標記的分析物分子以進行斷裂；以及
通過施加解離能級使所選的分析物分子發生斷裂；
其中至少一種所述不同標記的分析物分子是選自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段離子是帶正電荷或帶負電荷的。
71.權利要求70的片段離子的組合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
72.權利要求70的片段離子的組合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
全文摘要
本發明涉及與通過質譜法進行分析物測定相關的方法、混合物、試劑盒和組合物。
文檔編號G01N24/00GK101421609SQ200780009989
公開日2009年4月29日 申請日期2007年1月23日 優先權日2006年1月24日
發明者薩西·K·皮拉伊, 蘇巴卡爾·戴伊, 蘇巴西什·普爾什亞斯塔, 達里爾·J·C·帕平 申請人:阿普里拉股份有限公司