監測酶混合物的制作方法

專利名稱：監測酶混合物的制作方法
專利說明監測酶混合物 發明領域 本發明涉及監測樣品中至少兩種酶的存在的方法。可以認為所述酶是酶混合物。在本發明的實施方案中，本發明包括連續或近似連續地監測酶混合物。本發明的方法還可以用于確定組成酶混合物的酶的濃度。本發明的公開內容還包含用于本方法的產品和裝置。

背景技術：
各種類型的酶廣泛用于諸如制藥業、生物技術業、肥皂和洗滌劑業和食品業等多種工業。現已觀察到，吸入釋放到工作場所的空氣中的酶可以對受暴露工人的健康造成呼吸致敏導致的有害影響。已鑒定諸如蛋白水解酶枯草桿菌蛋白酶和相關酶的法定暴露限度，法定要求，對于這類酶，實施40ng/m3的工作場所暴露限度(WEL)[1]。為了遵行這一要求，有必要規則間隔地或連續地長期監測暴露的酶。
用于監測空氣傳播的酶的系統目前由以下步驟組成從空氣捕獲該酶，將所捕獲的酶提取進溶液中，以及分析所得溶液的酶組分。最常用的捕獲方法包括使空氣通過過濾器，而分析主要基于分光光度分析法或分光熒光分析法，其中所述酶使溶液中被標記的底物分子水解[2]；所述分析或者是以諸如ELISA的免疫分析形式進行的[3]。無法開發出將過濾器捕獲和之后的復雜提取和分析相組合的技術來獲得靈敏的、無需試劑的且連續的近似實時監測空氣傳播的酶的方法；并且由于不能監測酶的間歇釋放，因此獲得的結果代表時間平均值。
已描述組合了經壓緊至旋流器表面而自空氣捕獲和立即分析來自該旋流器的已清洗表面的所捕獲的酶的方法。使用特異于所關注酶的熒光標記的底物完成后者，所述底物固定于固定床或生物反應器內所包含的固相支持物。使所述酶通過生物反應器導致部分消化所述底物以及檢測下游的熒光標記片段[4]。該系統允許連續和近似實時地監測空氣中可能存在的單一酶[5]。
至今還未描述能夠連續地和近似實時地同時監測包含至少兩種空氣傳播的酶的混合物的系統。本發明實施方案的目的在于提供連續地或頻繁間隔地監測酶混合物的方法。
發明概述 本發明的目的在于提供監測酶的改良方法，所述方法適于連續使用或適于頻繁短間隔地監測。特別地，本文所述方法和裝置能夠快速而無需冗長分析步驟地監測樣品中多種酶的存在。所述方法和裝置應用于多種領域，例如，在空氣傳播的酶的存在能夠對在該區域工作的人員健康產生有害影響的地方監測所述酶。
本文所述方法實現了同時定性和/或定量監測樣品的至少兩種待采用的酶的存在。
根據本發明的一方面所述，提供了同時檢測樣品中至少兩種酶的方法，所述方法包括以下步驟 (a)使第一酶的用第一熒光團標記的第一底物(i)和第二酶的用第二熒光團標記的第二底物(ii)暴露于所述樣品，以使所述樣品中存在的第一和第二酶，如果存在的話，與單獨的第一和第二熒光團標記的底物相互作用，從而形成單獨的第一和第二熒光團標記的底物片段；以及 (b)檢測所述熒光團標記的底物片段的存在。
在一實施方案中，本發明的方法是檢測環境中空氣傳播的酶的存在和/或濃度水平的方法，在所述環境中，酶被產生和/或被使用，所述環境例如實驗室或工廠地面。
在本發明的另一方面，提供用于同時檢測樣品中至少兩種酶的存在的容器，所述容器包括第一酶的第一底物和第二酶的第二底物，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記。
在本發明的另一方面，提供用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，所述裝置包括包含第一酶的第一底物和第二酶的第二底物的容器，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括檢測熒光底物片段的檢測設備。
本發明還包括本文所述裝置在檢測樣品中至少兩種酶上的用途。該用途可以用于檢測空氣傳播的酶的存在。該用途還可以定量空氣樣品內存在的至少兩種酶的水平。
發明詳述 一方面，本發明提供同時檢測樣品中至少兩種酶的方法，所述方法包括以下步驟 (a)使第一酶的用第一熒光團標記的第一底物(i)和第二酶的用第二熒光團標記的第二底物(ii)暴露于所述樣品，以使所述樣品中存在的第一和第二酶，如果存在的話，與單獨的第一和第二熒光團標記的底物相互作用，從而形成單獨的第一和第二熒光團標記的底物片段；以及 (b)檢測所述熒光團標記的底物片段的存在。
本方法用于同時檢測樣品中多種酶的存在。如本文所用，術語“同時”指在同一時間或基本上在同一時間檢測至少兩種酶的存在，例如，對所述至少兩種酶的檢測發生在所述方法的單一操作內。所述方法能夠涉及同一樣品內多種酶的檢測，所述檢測不需要在檢測第一酶和檢測第二酶之間由使用者另外操作。
顯然，盡管所述方法用于檢測樣品中至少兩種酶，但是在某些實施方案中，在某些時候，所述樣品可以僅包含一種酶或不包含酶。然而，如果至少兩種酶存在于所述樣品中，那么所述方法會適于檢測至少兩種酶。
本文所述方法主要指監測兩種酶。對技術人員顯然易見的是，本發明的方法還可以用來檢測超過2種(例如，3、4、5、6種或更多種)的酶的存在和/或定量其水平。如果將所述方法用于檢測樣品中超過兩種酶，那么會提供相應數量的被標記底物。例如，如果所述方法用于檢測樣品中的三種酶類型，則提供三種被標記底物，每一種底物對應一種酶，即，對于每一種待檢測的酶，提供可檢測地與所述酶相互作用的被標記底物。
在一實施方案中，所述方法用于檢測至少兩種空氣傳播的酶的存在。
在該實施方案中，所述方法可以包括首先將第一空氣樣品與液體混合以形成溶液，從而形成與所述底物接觸的樣品。在該實施方案中，所述方法可以包括將所述第一空氣樣品吸入收集空氣中所攜帶的顆粒(例如酶顆粒)的裝置。所述方法還可以包括向所述裝置提供與所收集的顆粒混合的液體以產生所述溶液。在一實施方案中，所述裝置是圓錐。在一實施方案中，所述方法能夠包括監測流進所述裝置的空氣流速，以及，如果需要，調節空氣流速以確保它大致模擬人吸氣時空氣的吸入速率。這實現了在通過使用所述方法獲得的數據和個體正常呼吸期間吸入的空氣傳播的酶的可能量之間所要進行的比較。
在一實施方案中，將所述液體從儲器連續加入所述裝置。在該實施方案中，通過連續加滿使所述儲器中的液體水平保持恒定。在另一實施方案中，沒有使所述儲器中的液體水平保持恒定。相反，所述方法包括有規則地清空并重新填充所述儲器，所述規則例如，在每次取第一空氣樣品后，或者例如在已取一定量(例如第二、第三、第四或第五或更多空氣樣品)的空氣樣品后。可以在所述方法的循環已發生后，清空并重新填充所述儲器。在一實施方案中，當使用所述儲器時，可以約每10至20分鐘(例如，約每10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多分鐘)將所述儲器清空并重新填充。
在一實施方案中，所述方法能夠包括將所述樣品從上述裝置傳送至反應區域，在所述反應區域使所述樣品與熒光團標記的底物接觸。所述反應區域可以包括一個或多個反應容器。所述方法包括使所述樣品與所述底物接觸足夠的時間，使得所述酶和其相應底物反應以形成反應產物，如被標記的底物片段。隨后能夠檢測所述反應產物。在一實施方案中，檢測步驟包括使用檢測設備，所述檢測設備檢測由附著于所述底物片段的熒光團發射的信號的水平。在一實施方案中，所述檢測設備是分光光度計，其隨后能夠用于確定存在于樣品中的一種或多種酶的存在和/或量。在一實施方案中，所述檢測設備包含與流動池相連的光纖，所述光纖與預調節光源(激發)和多種光子增效器管(光電倍增器-檢測系統(pmt-detection systems))相連。
在一些實施方案中，使所述樣品與所述第一和第二底物接觸至少約1秒、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、11分鐘、12分鐘、13分鐘、14分鐘、15分鐘、16分鐘、17分鐘、18分鐘、19分鐘、20分鐘、21分鐘、22分鐘、23分鐘、24分鐘、25分鐘、26分鐘、27分鐘、28分鐘、29分鐘、30分鐘、31分鐘、32分鐘、33分鐘、34分鐘、35分鐘、36分鐘、37分鐘、38分鐘、39分鐘、40分鐘、41分鐘、42分鐘、43分鐘、44分鐘、45分鐘、46分鐘、47分鐘、48分鐘、49分鐘、50分鐘、51分鐘、52分鐘、53分鐘、54分鐘、55分鐘、56分鐘、57分鐘、58分鐘、59分鐘或60分鐘的反應時間。優選地，使所述樣品與所述被標記底物接觸至少約1分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘或至少約15分鐘的反應時間。
通常，本方法所用底物選自與待監測的酶反應或被待監測的酶所消化的那些物質。如本文所用，術語“底物”指以造成所述底物變化的方式與酶相互作用的物質。例如，所述酶能夠與所述底物反應和/或其能夠將所述底物消化成片段。以實現對所述酶和所述底物間相互作用的檢測的方式標記本發明所用底物。特別地，所述標記是熒光團。
在本發明的優選實施方案中，所述底物是蛋白或多肽。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互換地使用，指任一長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線性的或支鏈的，它可以包括修飾的氨基酸或氨基酸類似物，并且它可以被非氨基酸中斷。所述術語還包括已天然修飾或通過干預修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任一其它操作或修飾，諸如與標記組分偶聯。
氨基酸替換的范圍能夠從改變或修飾一個或多個氨基酸到完成諸如可變區等區域的重新設計。氨基酸替換優選保守性替換，所述替換不會對所述肽的折疊或功能性性質產生有害影響。在功能上相關的氨基酸內可以完成保守性替換，所述功能上相關的氨基酸的組是甘氨酸/丙胺酸、纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸、天冬酰胺/谷氨酰胺、天冬氨酸/谷氨酸、絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸、賴氨酸/精氨酸，以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。本發明所用多肽可以是糖基化或非糖基化的形式，可以是翻譯后修飾的(例如，乙酰化和磷酸化)或者可以是合成修飾的(例如，附著標記基團)。
在一實施方案中，所述第一底物選自明膠、豬甲狀腺球蛋白、膠原、免疫球蛋白或牛血清白蛋白。在一實施方案中，所述第二底物選自明膠、豬甲狀腺球蛋白、膠原、免疫球蛋白或牛血清白蛋白。在一實施方案中，所述第一底物是明膠。所述第一和第二底物可以是一樣的或者可以彼此互不相同。
選擇本發明的方法中用于標記所述底物的熒光團，使其可以被普通熒光測定方法檢測。此外，所述熒光團被特別地選擇，以使得每一熒光團的光譜性質不干擾其它熒光團的熒光信號，所述熒光信號經所述混合物中存在的其它酶與其特異性底物的反應而共同釋放。優選地，所選擇的熒光團不受諸如pH水平等環境條件變化的影響。在一實施方案中，所述第一和第二熒光團獨立地選自熒光素及其衍生物、若丹明、德州紅(Texas Red)、甲酚紫和熒光黃。優選地，用于標記第一底物的熒光團不同于用于標記第二底物的熒光團。
在許多情況中，被標記的底物有利地被合適的支持物所承載，所述支持物，例如但不限于，玻璃珠、纖維狀纖維素或溶膠凝膠顆粒。支持物，例如固相支持物，為本領域所公知，并且其能夠是生物的、非生物的、有機的、無機的或這些的任一組合，前提是它們不干擾被標記底物和樣品中存在的任何酶之間的反應。能夠用于本發明的固體支持物的實例包括但不限于，顆粒、珠、線股、沉淀、凝膠、片、管、球、容器、毛細管、墊、切片、膠片、板、載玻片。粒徑可以從直徑100nm至100μm。
借助本領域已知的多種方法能夠使被標記的底物附著于所述支持物。例如，所述底物能夠共價附著于所述支持物的表面。在一實施方案中，所述底物能夠經直接吸收而與所述支持物的表面連接。
在本發明的另一優選實施方案中，所述支持物包括能磁化的珠。在一實施方案中，所述支持物包括多個硅顆粒，所述一種或多種底物附著在所述硅顆粒上。固體支持物的其它類型為本領域已知并且被本發明所包括。
在一些實施方案中，所述底物可以不在支持物上。例如，在纖維素的情況中，鑒于它不溶于水，所述底物可以被用作固體顆粒而無需所述支持物。
所述方法用于監測樣品中至少兩種酶的存在。可以應用本公開內容的方法檢測的酶類型的實例包括但不限于，蛋白酶、纖維素酶、脂酶、淀粉酶或膠原酶家族的成員。在一實施方案中，將被標記的纖維素用作所述底物中的一種能夠監測纖維素酶，和/或將被標記的膠原用作所述底物中的一種能夠監測膠原酶。
在一實施方案中，所述至少兩種酶中的一種是蛋白酶。在一實施方案中，所述蛋白酶能夠選自枯草桿菌蛋白酶類型酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、益瑞蛋白酶(esperase)或水解蛋白酶(alcalase)。
在本發明的一實施方案中，第一底物是明膠。在該實施方案中，待檢測和/或待定量的第一酶是枯草桿菌蛋白酶類型酶。在一實施方案中，第二底物選自淀粉，即直鏈淀粉和支鏈淀粉。在該實施方案中，第二酶是α-淀粉酶。可以通過本公開內容的方法來檢測酶的多種組合。
如果所述樣品包含一種或多種與至少一種所述底物相互作用的酶，那么一旦將所述樣品暴露于所述底物，便發生所存在的一種或多種酶與相應底物之間的反應。在一實施方案中，所述酶和所述底物之間的反應導致所述底物片段的形成。使用調節至特定熒光團或多種熒光團的一個或多個分光熒光計在下游監測暴露于含有所述酶的樣品后的每一容器釋放的被標記底物片段。所述方法還可以包括將所述分光熒光計調節至檢測所述第一和第二熒光團的步驟。
如上所述，在本方法的一應用中，所述樣品源自第一空氣樣品。本方法的一應用是在工作場所，其中對雇員暴露于空氣傳播的酶有法定限度。特別地，所述方法可以在酶被用于產生例如洗滌粉和食品的區域進行。
能夠以多種方式實踐所述方法。在一實施方案中，通過連續地將所述樣品連續地傳送至含有溶液的收集器來實施所述方法。所述樣品隨后在含有例如一個或多個容器的反應區接觸被標記底物。
如上所述，在所述樣品衍生自第一空氣樣品的實施方案中，所述空氣被置于溶液中。在一實施方案中，所述溶液是緩沖液，所述緩沖液考慮到它具有適用于所述系統的特定pH而被選擇。因而，在一實施方案中，所述溶液是水性緩沖液。在一實施方案中，所述水性緩沖液例如是磷酸鹽緩沖的鹽水。
在一實施方案中，通過在所述溶液中摻雜少量的洗滌劑而進一步增強所述熒光信號的再現性。在一實施方案中，所述方法包括向所述溶液提供洗滌劑。所述洗滌劑可以是，例如，吐溫20。可以利用所述洗滌劑來減少流動注射分析系統內的所釋放片段和表面之間的非特異性結合。
在本發明方法的一實施方案中，在反應容器內提供所述底物，以使得樣品中所含的一種或多種酶同時接觸第一底物和第二底物。例如，在用珠支持底物的實施方案中，所述反應容器包含珠的異質性混合物，它們中的一些支持被標記的第一底物而它們中的一些支持被標記的第二底物。在一實施方案中，一個或多個反應容器是柱。在一實施方案中，一個或多個反應容器可以是小的，例如易于運送至或安裝在待監測部位的尺寸。
在本發明方法的另一實施方案中，源自所述樣品的酶順序地接觸第一底物和第二底物。例如，所述反應容器包含分層的不同底物的同質性層。因此，該反應容器能夠包含支持物層，每一層本質上含有一種類型的底物。因而，包含酶混合物的樣品會與例如所支持的第一底物的層相接觸，然后再與所支持的第二底物的層相接觸。
可選擇地，所述方法包括提供連續的多個反應容器，每一反應容器包含單一類型的被標記底物。因而，所述樣品接觸第一底物并隨后接觸第二底物。
因此，在一實施方案中，本發明利用至少兩個位置相連的反應容器，每一反應容器包含不同的底物。能夠將所述容器與使所述樣品在容器間傳送的導管相連接。在本發明的該實施方案中，第一容器能夠包含第一底物并且第二容器能夠包含第二底物。可以提供包含其它酶的更多底物的更多的反應容器。
在一種實施方案中，本發明能夠包括提供不同容器類型的混合，從而使所述樣品經多個反應容器順序地與第一底物和第二底物相接觸。
在預計被分析的樣品包含蛋白酶的實施方案中，第一或第二底物中的一種是所述蛋白酶的底物。在該實施方案中，優選確保所述樣品與所述底物順序接觸。更優選地，所述蛋白酶的底物的位置與檢測設備相鄰。已發現所消化的蛋白酶底物的片段能夠粘著于所述支持物，例如，固相支持物，所述支持物具有一種或多種其它底物。因此，例如，當所述方法用于檢測包含α-淀粉酶和枯草桿菌蛋白酶類型酶的酶混合物時，枯草桿菌蛋白酶類型酶的底物的位置優選地與檢測設備相鄰，即，相對于一種或多種其它底物的下游。因此，含有蛋白酶底物的反應容器位于一個或多個含有其它類型的酶的底物的反應容器下游。
如果可以獲得合適的設備，例如分光光度計，那么可以原地(例如，在工廠)檢測被熒光標記的底物片段。可選擇地，能夠將所述反應容器帶到進行所述分析的實驗室。
所述方法還可以包括通過比較標準值和所述樣品中存在的至少兩種酶的量來校準所述結果。
根據本發明的另一方面，提供用于同時檢測樣品中至少兩種酶的容器，所述容器包括第一酶的第一底物和第二酶的第二底物，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記。
在本發明的實施方案中，如上所述，被標記的底物被合適的支持物所承載。在一實施方案中，所述支持物是或包括，例如，玻璃珠、纖維素(如纖維狀纖維)、硅(如硅顆粒)或溶膠凝膠顆粒。如果所述支持物包括微粒物質，則所述粒徑可以從直徑約100nm至約100μm。
在本發明的一實施方案中，當所述支持物是例如珠或硅顆粒時，所述反應容器包含珠或顆粒的異質性混合物。也就是說，一部分的珠或顆粒支持第一底物，而一部分的珠或顆粒支持第二底物，并且所述珠的安排沒有可辨別的順序。在本發明的另一實施方案中，所述反應容器包含分層的所述底物的同質性層。
根據本發明的另一方面，提供用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，所述裝置包括包含第一酶的第一底物和第二酶的第二底物的容器，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括檢測熒光反應產物的檢測設備。在一實施方案中，第一和第二熒光團是不同的熒光團。所述熒光團可以如本文所述。
在一實施方案中，第一和第二底物能夠在所述容器內形成分層的層。在一實施方案中，第一或第二底物中的一種是蛋白酶的底物。在該實施方案中，所述容器包括蛋白酶底物的層，所述層位于比其它底物更靠近檢測設備的位置。因此，在一實施方案中，蛋白酶的底物的位置鄰近所述檢測設備，即其它底物的下游。
優選地，所述檢測設備是分光光度計。
根據本發明的另一方面，提供用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，在使用中所述裝置包括包含第一酶的第一底物的第一容器，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第一裝置可以與第二容器相連，其中所述第二容器包含第二酶的第二底物，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括用于檢測熒光反應產物的檢測設備。所述反應產物由酶和其被熒光團標記的底物之間的相互作用產生。
在本裝置的一優選實施方案中，第二容器中的底物是蛋白酶，所述第二容器的位置與所述檢測設備相鄰。
在一實施方案中，所述裝置包括超過2個反應容器，例如3，4，5個或更多個反應容器。每一反應容器可以包含酶的被熒光團標記的底物。
優選地，所述檢測設備是分光光度計。
貫穿本申請文件的說明書和權利要求書，詞語“包括(comprise)”和“包含”以及所述詞語的變形，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，指“包括但不限于”，而非意在(并且也沒有)排除其它部分、添加劑、組分、整數或步驟。
貫穿本申請文件的說明書和權利要求書，單數詞包括復數詞，除非上下文另有要求。特別地，當使用不定冠詞時，本申請文件應理解為涉及復數和單數，除非上下文另有要求。
與本發明的特定方面、實施方案或實施例結合描述的特征、整數、特性、化合物、化學部分或基團應理解為可以應用于本文所述的任一其它方面、實施方案或實施例，除非與其不相容。
附圖簡述 現僅通過實施例并參考附圖來描述本發明，其中

圖1a僅有枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶(賽威蛋白酶(SavinaseTM))的校準圖。
圖1b僅有α-淀粉酶(特妙(TermamylTM))的校準圖。
圖1c在枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶和α-淀粉酶的等濃度混合物中α-淀粉酶的校準圖。
圖2本發明實施方案的監測系統的示意性代表圖。
實施例 實施例1 描述能夠連續地監測工作場所空氣中多種空氣傳播的酶的空氣傳播濃度的系統，所述酶包括例如枯草桿菌蛋白酶類型的酶。取樣包括兩個階段使用設計為在約1ms-1流速下且以6001min-1的取樣速率下模擬人呼吸的取樣頭。在第二階段，通過將所述氣流壓緊至使用緩沖溶液噴射連續清洗的旋流器的內表面，來保藏所捕獲的顆粒。隨后將所保藏顆粒清洗至儲器，每5至6分鐘從該儲器取樣，并且將其自動注射進連續流動注射分析系統。所述樣品中的蛋白水解酶通過維持約40℃的生物反應器。在一實施方案中，該生物反應器包含纖維素固相基質，其上是共價固定的作為底物的用德州紅所標記的明膠。所述生物反應器還能夠包含另一酶的第二底物。可選擇地，含有第二底物的單獨的生物反應器與第一生物反應器相連接(未顯示)。
在本發明的其它實施方案中，所述底物能夠固定在硅顆粒上。通過的一種或多種酶部分地消化一種或多種底物，從而釋放一個或多個熒光團，其在偶聯熒光計的流動池下游被檢測。使用酶標準物校準所述系統，并且使用PC編程的數學模型將從空氣樣品得到的峰的強度轉變成空氣傳播濃度。該系統的檢測極限是4.8ng m-3，動態范圍是5-60ng m-3。分析內精度(RSD)在該范圍為6.3％-9.6％。批內精度在20ng m-3下是20.3％，對應的批間值是19.5％。該系統運行的時段多達8小時和多達4小時，所獲得的值與由常規的Galley取樣器和內部分析獲得的時間平均值進行比較，觀察到合理一致的結果。研究在用定時注射的標準物連續使用21天的系統的穩定性。對于所有標準圖，始終都觀察到線性。在21天結束時，在相當于2395ng ml-1的賽威蛋白酶的總暴露后，仍然容易地檢測到歸因于5.0ng ml-1標準物的信號。
實驗裝置 所述系統如圖2所示。它包括取樣頭，該取樣頭包含經塑料管與玻璃旋流器(B)相連的一對圓形金屬板(A)。使用可商購的吸塵器(C)通過A和B吸入空氣。使用孔板監測氣流速率并且按需要調節該速率。針(D)與B相連，并且使用可調節蠕動泵(E)，將緩沖溶液經其孔板注入。由于空氣流經該旋流器，水的這一噴射覆蓋了該旋流器的內表面，并流入儲器(F)，水又從該儲器經E循環回到該旋流器。下文更為詳細地描述該旋流器。
在空氣取樣后，將已知體積的緩沖液從F定時輸入到自動化流動注射系統(G)，所述系統與恒溫控制柱狀加熱器(H)內的一個或多個生物反應器相連。光流動池(I)位于下游，所述池裝配有與光源(J)和分光光度計(K)連接的兩條光纖。使用蠕動泵(L)使磷酸鹽緩沖鹽水通過FIA系統，使用筆記本電腦(M)記錄來自K的信號。該電腦還控制自動化流動注射系統。在兩種情況中，所用程序均由這兩種系統的制造商(FIAlab，Medina，WA，USA)提供。
在另一方法中，所述儲器沒有被連續加滿而未能使該儲器保持水平恒定。而是，如上所述，取樣約12分鐘。隨后分析所述樣品，并且徹底沖洗所述儲器并重新充滿。隨后開始獲得樣品和分析的新的循環。該方法的優點在于不需要計算重新充滿該儲器對酶濃度的影響的復雜系統。因而，該方法能夠更簡單地實施。
自動化流動注射系統(G)是來自FIAlab Instruments的3500型號。所述柱狀加熱器(H)是Eppendorf CH500加熱器(Phenomenex，Macclesfield，Cheshire，UK)，所述加熱器被設置為在流速為0.7mlmin-1，流出緩沖液溫度為40℃下操作。所述流動池(I)是來自FIAlab的X型號，FIAlab還提供了兩條不銹鋼包被的光纖(P400-2)、LS-1鎢鹵素光源和S2000分光光度計(J)。所述蠕動泵(K)是來自Pharmacia的P-1型號(Milton Keynes，Buckinghamshire，UK)。
旋流器的設計 構建一定尺寸的玻璃旋流器(直徑40mm，出口20mm，矩形入口3010mm，以及主體長度80mm和錐長80mm)，所述旋流器在空氣進入管中具有三個預先鉆好的洞，以允許所述針在多達三個位置導入循環流體。這些洞位于進入管的中央，距每邊6mm。使不銹鋼皮下注射針彎曲適當角度(自尖端10mm)以使循環流體被泵入所述旋流器。
測試所述旋流器以測量其分級效率，所述測量通過經經旋流器入口加載細塵，并使用空氣動力學粒徑篩選器(APS)測量輸入旋流器的塵與排出該旋流器的塵的粒徑和濃度差異。
用于流動注射分析系統的試劑和材料 用于流動注射系統和生物反應器生產的緩沖液的組分、酶的來源以及化學試劑和其它材料是此前描述的那些5-8。B型明膠(約75勃魯姆強度)來自Sigma(Poole，Dorset，UK)。德州紅(Texas

)琥珀酰亞胺酯來自Molecular Probes(Eugene，OR，USA)。所研究的絲氨酸型蛋白水解酶是Purafect(Genencor International Inc.，Rochester，USA)，以及賽成蛋白酶來自Novozymes，Bagsvaerd，Denmark，該公司還提供脂肪酶和纖維素酶。木瓜蛋白酶來自木瓜乳并由Sigma提供。
明膠-德州紅偶聯物的合成 所述底物中的一種是明膠-德州紅偶聯物。使明膠(0.105g)溶解于碳酸氫鈉緩沖液(10ml，0.1M，pH 8.3)，并溫和加熱(40℃)。使德州紅(Texas

)琥珀酰亞胺酯(5mg)溶解于500ml的二甲亞砜。隨后將該混合物加入至溶解的明膠溶液中。用錫箔包裹所述容器，并于室溫下在旋轉混合器上混合1小時。當被標記的明膠溶液儲存于4℃時，它在約3-4周是穩定的。
纖維素-明膠-德州紅固相的合成 將培養基纖維素纖維(5g)在去離子水中洗滌并離心(2000rpm，6min)，然后移除上清溶液。將其重復3次，此后使用2號燒結玻璃漏斗(BDH Poole，Dorset)在真空下過濾所述纖維素。將高碘酸鈉溶液(80ml，0.5M)加入潮濕的纖維素，室溫下混旋所述混合物210min。隨后過濾活化的纖維素，并如上用21去離子水清洗。將活化的纖維素在4℃下儲存于含有0.02％疊氮化鈉的去離子水中，該纖維素在3-4周是穩定的。
將活化的纖維素(過濾后2.5g)懸浮于0.1M無水磷酸氫二鈉緩沖液(65ml)中。向它加入明膠-德州紅偶聯物(10ml)。用鋁箔包裹所述容器，并于室溫下混旋45min，然后加入氰基-硼氫化鈉(250mg)。將所述管放回混旋器，并使該管于室溫下混合過夜。在偶聯后，如上在真空下過濾纖維素-明膠-德州紅固相，并使用21的去離子水清洗。當所得的纖維素-明膠-德州紅固相冷藏于含有0.02％疊氮化鈉的去離子水中時，該固相在3-4周也是穩定的。
流動注射分析系統的開發 FIA條件。FIA緩沖液和用于酶標準物的緩沖液是磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBST)。它每升含有氯化鈉(7.2g)、無水磷酸氫二鈉(1.48g)、正磷酸二氫鈉一水化物(0.5g)、疊氮化鈉(0.5g)和聚氧化乙烯-山梨聚糖單月桂酸酯(1.0ml)(吐溫20sICI Americas，Inc.)。使用小調節幅度的蠕動泵將FIA流速維持在0.7ml min-1。使用Windows版本5的FIALab編譯取樣程序。所用取樣體積是100ml，12ml s-1的速率下總注射體積是180ml。將590nm過濾器插入光源(J)的路徑，將分光光度計(K)設在612nm。
結果 空氣取樣系統的設計 測試旋流器的設計及其表現。用一定跨度范圍的氣流(從176至7321min-1的9個不同氣流)測試該旋流器，據顯示，在6081min-1下該旋流器的d50為約0.77mm以及SD為1.1％。可見，該旋流器能夠被認為當氣流為B6001min-1時，其有效地捕獲至少90％的粒徑不小于1.5mm的顆粒。這就確定了該旋流器能夠捕獲如本工程所需要的顆粒大小，且該顆粒具有與用于Galley取樣器的1.2mm孔徑的過濾器相似的尺寸。
將所述旋流器的設計與空氣取樣入口系統聯系。將它設計成在約6001min-1的取樣速率和約1ms-1的輸入流下操作時模擬人的呼吸。
在所述分析系統內，使用新的底物以產生所述酶中的一種所需的信號。使明膠與德州紅(Texas

)偶聯以產生熒光標記，隨后使其共價固定在纖維素支持基質上。因為明膠提供用于熒光偶聯和潛在酶水解的許多位點，所以選擇它作為本發明的一種底物。在暴露于枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶時，發生被固定的明膠的蛋白水解切割，從而產生被分光光度計記錄的熒光信號。其它底物也被用于本方法。
上述裝置構成用于確定例如工業中酶的空氣傳播濃度的近似實時系統。所選緩沖液適于維持該酶的蛋白酶活性及維持該熒光團信號。它的使用還使熒光團的浸出最小化，從而延長了該生物反應器的壽命(數據未顯示)。
該系統具有良好的分析內精度以及合理的批內和批間變化性。所述變化主要源于生物反應器制造期間柱的填塞不一致。當前這是人工進行的，而自動化系統將很可能導致大幅度改善批次的一致性。
該系統相對便于攜帶，并且已成功地經長期驗證。該系統還提供貫穿取樣期的近似連續的酶空氣傳播濃度的記錄。該系統是近似實時系統，響應時間為5分鐘且能夠在工業條件下連續監測8h。
實施例2 在另一實施方案中，所述方法使用所述底物的另一種支持物。使用用德州紅(Texas

)預標記的明膠處理用縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷活化的溶膠凝膠顆粒，以產生枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶(例如，賽威蛋白酶(SavinaseTM))的固相底物包被的固相支持物。
使用用熒光素亞乙基二酰胺標記的淀粉處理用氨丙基三甲氧基硅烷活化的其它溶膠凝膠顆粒，以產生α-淀粉酶(例如，特妙(TermamylTM))的固相底物。
使等質量的兩種固相試劑分層，隨后將其填塞進迷你柱，以使得底層由包被枯草桿菌蛋白酶類型酶的底物的顆粒構成，上層由包被α-淀粉酶的底物的顆粒構成。用溶于具有吐溫20(0.1％)的磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7.4)的樣品含有以0.7ml/min的流速填充迷你柱，所述樣品含有5ng/ml至25ng/ml的賽威蛋白酶和淀粉酶的混合物或個體酶組分。使用上述旋流器獲得所述樣品。使迷你柱在下游連接連續相連的兩個分光熒光計，將第一分光熒光計設在熒光素熒光(490nm激發，535nm發射)，將第二分光熒光計設在德州紅熒光(590nm激發，620nm發射)，并且同時且連續地監測兩種熒光團的熒光強度。盡可能每5分鐘重復樣品，觀察到每種酶的響應時間為2分鐘。當注射進所述柱時，獲得單一酶(圖1a，僅蛋白酶；圖1b，僅淀粉酶)以及這兩種酶的混合物在該濃度范圍的線性信號/濃度標準曲線。
實施例3 制備用于填塞生物反應器的α-淀粉酶的熒光底物 制備熒光素標記的乙二胺(EDA-FITC) 所用材料是熒光素異硫氰酸酯異構體I(FITC)，Sigma(F-7250)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，Aldrich(31，993-7)；1，4-二噁烷，Aldrich(27，053-9)和乙二胺，Aldrich(E 2，626-6)。
取干凈的干燥50ml玻璃瓶，準確稱量39mg的FITC。通過加入200μl的DMF溶解FITC。將4.8ml的1，4-二噁烷加入FITC溶液中。隨后將6.68μl的乙二胺加入FITC溶液中。用鋁箔包裹EDA-FITC溶液于室溫下在磁力攪拌器上將該溶液攪拌1小時。應形成暗橙色沉淀。
攪拌1小時后，移開該瓶，于3000rpm下離心3分鐘。棄去廢溶劑中的上清液，加入5ml的1，4-二噁烷，渦旋并于3000rpm下離心3分鐘。棄去廢溶劑中的上清液，使用最小量的1，4-二噁烷將所述沉淀轉移至圓底燒瓶。通過50℃下旋轉蒸發約3小時將所述溶劑蒸發。一旦沉淀被干燥，將其稱量并轉移至干凈的干燥玻璃瓶，在4℃下儲存于干燥器中，確保它用鉑包裹。
活化被標記的乙二胺(EDA-FITC) 所需材料是氰尿酰氯，Aldrich(C 9，550-1)；被標記的乙二胺(EDA-FITC)(參照以上1)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，Aldrich(31，993-7)；三乙胺，Fluka(90340)和具有疊氮化物的磷酸鹽緩沖的鹽水，pH 7.4(具有疊氮化物的PBS)，(見SOP-緩沖液003)。
通過在干凈的干燥玻璃瓶中稱量如1所制備的43mg的EDA-FITC并將其溶于4.3ml的DMF來制備4.3ml，10mg/ml的EDA-FITC溶液。稱量21.5mg的氰尿酰氯并加入到所述EDA-FITC溶液中。通過將27.5μl的三乙胺加入20ml的具有疊氮化物的PBS而制備1mg/ml的三乙胺溶液，向活化的EDA-FITC溶液中加入20ml，1mg/ml的三乙胺溶液。渦旋所述混合物以確保徹底混合。應當形成沉淀。在4℃下于暗處儲存所述沉淀。
將活化的被標記的乙二胺(ACT-EDA-FIFC)與淀粉底物(也可以使用支鏈淀粉和直鏈淀粉)偶聯。
所需材料是可溶性淀粉，Sigma(S-9765)；具有疊氮化物的磷酸鹽緩沖的鹽水，pH 7.4(具有疊氮化物的PBS)；活化的EDA-FITC(見上)和碳酸鈉，Sigma(S-7795)。
制備0.5M碳酸鈉溶液 在100ml容量瓶中稱量5.495g的碳酸鈉，使用最小量的去離子水溶解。一旦溶解完成，補充至標志線。
使Act-EDA-FITC與淀粉底物偶聯 在干凈的干燥25ml玻璃瓶中稱量0.5g的可溶性淀粉。將15ml的PBS加入所述淀粉中并在約維持在60-70℃的水浴中將其加熱，同時連續攪拌，直至形成透明懸浮液。應當形成厚凝膠的透明懸浮液。
向所述淀粉懸浮液中加入2ml活化的EDA-FITC(參照以上2)，將其渦旋以形成均一的懸浮液。將該懸浮液放回水浴，并通過在暗處連續攪拌而繼續加熱(約60-70℃)。10分鐘后，加入200μl，0.5M的碳酸鈉溶液，在70℃下于暗處繼續攪拌1小時。1小時后，從熱水浴中移開所述懸浮液，將其放在通風櫥中以使其冷卻至室溫。
一旦冷卻完成，將所述懸浮液移至滲析管，對維持在37℃的去離子水進行滲析。繼續滲析直至去離子水中觀察不到熒光。這應當需要約3至4天。一旦滲析完成，將所述懸浮液移至30ml Sterilin管，并用鉑將其包裹，存放在冰箱中。
制備氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)包被的溶膠凝膠、硅或硅膠顆粒 所需材料是溶膠凝膠顆粒，氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，Sigma(A3648)和磷酸鹽緩沖的鹽水，pH 7.2(具有疊氮化物的PBS)。
在50ml Sterilin管中稱量約10g的干燥溶膠凝膠顆粒(125-180μm)。加入20ml的PBS，渦旋所述顆粒。于3000rpm下離心3分鐘。棄去所述上清液，并加入2ml的APTES并于混旋器中混旋2小時。從所述混旋器中將其移開并于3000rpm下離心3分鐘。棄去廢溶劑的上清液，加入20ml的PBS，渦旋30秒并混旋5分鐘。按步驟5和步驟6(即，從所述混旋器中將其移開以及于3000rpm下離心3分鐘)再將所述清洗重復3次。棄去廢溶劑的上清液，加入20ml的PBS，渦旋30秒并混旋5分鐘。APTES包被的顆粒已作好使用準備。就儲存而言，使所述顆粒懸浮于最小量的PBS中，于4℃下儲存。
將淀粉-EDA-FITC固定于APTES包被的溶膠凝膠顆粒以及類似的硅顆粒 所需材料是APTES包被的溶膠凝膠顆粒(見上)；磷酸鹽緩沖的鹽水，pH 7.2(具有疊氮化物的PBS)和淀粉-EDA-FITC(見上)。
在30ml Sterilin塑料管中稱量約5g的濕重的APTES包被的溶膠凝膠顆粒(125-180μm)。加入20ml的PBS疊氮化物并渦旋所述顆粒。加入5ml的淀粉-EDA-FITC底物，混旋一整夜。從所述混旋器中將其移開并于3000rpm下離心3分鐘。棄去廢溶劑的上清液，加入20ml的PBS，渦旋30秒，混旋5分鐘。按步驟(即，從所述混旋器中將其移開，于3000rpm下離心3分鐘，隨后棄去廢溶劑的上清液，加入20ml的PBS，渦旋30秒以及混旋5分鐘)再將所述清洗重復3次。固定于溶膠凝膠顆粒的淀粉底物已作好填塞準備。
在4℃下，將被固定的淀粉顆粒儲存于最小量的PBS疊氮化物中，并在制備3天內使用。如以上對明膠-纖維素所述，并以對蛋白酶生物反應器柱的條件，將約0.8g的濕的衍生顆粒填塞進柱中。
參考文獻
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8.Tang，LX.，Rowell，F.J.，Cumming，R.H.，Anal.Proc.Incl.Anal.Comm.1995，32 519 包含在本公開內容的還有下列段落的主題 1.同時檢測樣品中至少兩種酶存在的方法，所述方法包括以下步驟 提供第一酶的第一底物，所述第一底物用第一熒光團標記， 提供第二酶的第二底物，所述第二底物用第二熒光團標記， 使所述被標記的底物暴露于所述樣品，以使所述樣品中存在的第一和第二酶與單獨的第一和第二熒光團標記的底物相互作用，從而形成單獨的第一和第二熒光團標記的底物片段； 檢測所述熒光團標記的底物片段的存在。
2.如段落1所述的方法，其中所述第一和/或第二底物是蛋白或多肽。
3.如段落2所述的方法，其中所述蛋白或多肽選自明膠、豬甲狀腺球蛋白、膠原、免疫球蛋白或牛血清白蛋白。
4.如前述任一段落所述的方法，其中至少一種所述底物由支持物所承載。
5.如段落4所述的方法，其中所述支持物是包括玻璃珠或溶膠凝膠珠或纖維素纖維的固相支持物。
6.如段落4或5所述的方法，其中所述珠是能磁化的。
7.如前述段落所述的方法，其中所述第一和第二酶選自蛋白酶、纖維素酶、脂酶、□-淀粉酶或膠原酶。
8.如段落7所述的方法，其中所述蛋白酶選自枯草桿菌蛋白酶類型酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、益瑞蛋白酶或水解蛋白酶。
9.如前述任一段落所述的方法，其中所述第一和第二熒光團是熒橙紅、若丹明、德州紅

或熒光黃。
10.如前述任一段落所述的方法，其中所述樣品是空氣。
11.如前述任一段落所述的方法，其中衍生自所述樣品的一種或多種酶同時接觸所述第一底物和所述第二底物。
12.如前述任一段落所述的方法，其中衍生自所述樣品的一種或多種酶順序地接觸所述第一底物和所述第二底物。
13.如段落11或12所述的方法，其中所述第二底物是蛋白酶的底物。
14.用于同時檢測樣品中至少兩種酶存在的容器，所述容器包含第一酶的第一底物和第二酶的第二底物，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記。
15.如段落14所述的容器，其中至少一種所述底物由支持物所承載。
16.如段落15所述的容器，其中所述支持物是包括玻璃珠或溶膠凝膠珠或纖維素纖維的固相支持物。
17.如段落16所述的容器，其中所述容器包含所述第一底物和所述第二底物的異質性混合物。
18.如段落16所述的容器，其中所述容器包含所述第一底物的層和所述第二底物的層。
19.用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，所述裝置包括包含第一酶的第一底物和第二酶的第二底物的容器，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括檢測熒光底物片段的檢測設備。
20.如段落19所述的裝置，其中所述第一和第二底物在所述容器內分層并且所述第二底物的層的位置與所述檢測設備相鄰，所述第二底物是蛋白酶的底物。
21.用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，所述裝置包括第一容器，所述第一容器包含第一酶的第一底物，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第一裝置可以與第二容器相連，其中所述第二容器包含第二酶的第二底物，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括用于檢測熒光底物片段的檢測設備。
22.如段落21所述的裝置，其中所述第二容器中的底物是蛋白酶，并且所述第二容器的位置與所述檢測設備相鄰。
23.參考隨附實施例和圖1而在本文中充分描述的方法、容器或裝置。
權利要求
1.同時檢測樣品中至少兩種酶存在與否的方法，所述方法包括以下步驟
(i)使第一酶的用第一熒光團標記的第一底物(a)和第二酶的用第二熒光團標記的第二底物(b)暴露于所述樣品，以使所述樣品中存在的所述第一和第二酶，如果存在的話，與單獨的第一和第二熒光團標記的底物相互作用，從而形成單獨的第一和第二熒光團標記的底物片段；
(ii)檢測所述熒光團標記的底物片段的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述方法用于檢測至少兩種空氣傳播的酶的水平，并且所述方法包括以下步驟
(i)在將所述底物暴露于所述樣品之前，獲得第一大氣空氣樣品；以及
(ii)捕獲存在于所述第一樣品中的任意酶顆粒。
3.如權利要求2所述的方法，所述方法還包括將所捕獲的酶顆粒與液體混合以形成所述樣品。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述液體是水性緩沖液。
5.如權利要求4所述的方法，所述方法還包括將所述樣品從第一樣品與所述液體混合的區域傳送至使所述樣品暴露于所述底物的反應區域。
6.如前述任一項權利要求所述的方法，其中將使所述樣品暴露于所述底物的步驟實施足夠的時間，使得所述第一和/或第二酶與所述單獨的底物之間相互作用，從而形成熒光團標記的底物片段。
7.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述檢測步驟涉及檢測由所述第一和/或第二熒光團標記的底物片段發射的信號。
8.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述第一和/或第二底物是蛋白或多肽。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述蛋白或多肽選自明膠、豬甲狀腺球蛋白、膠原、免疫球蛋白或其片段和牛血清白蛋白。
10.如前述任一項權利要求所述的方法，其中至少一種所述底物由支持物所承載。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述支持物是固相支持物。
12.如權利要求10或權利要求11所述的方法，其中所述支持物產生自或包括玻璃珠、溶膠凝膠珠、纖維素纖維或硅顆粒。
13.如權利要求10至12中任一項權利要求所述的方法，其中所述支持物是能磁化的。
14.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述第一和/或所述第二酶選自蛋白酶、纖維素酶、脂酶、α-淀粉酶或膠原酶。
15.如權利要求15所述的方法，其中所述蛋白酶選自枯草桿菌蛋白酶類型酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、益瑞蛋白酶和水解蛋白酶。
16.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述第一和/或所述第二熒光團選自熒光素或其衍生物、若丹明、德州紅
甲酚紫和熒光黃。
17.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述樣品源自第一空氣樣品。
18.如權利要求14至17中任一項權利要求所述的方法，其中所述第一底物和所述第二底物中的一種或兩者都是蛋白酶的底物。
19.如前述任一項權利要求所述的方法，所述方法包括首先將所述樣品暴露于所述第一或第二底物之一以及隨后將所述樣品暴露于所述第一或第二底物的另一者。
20.如權利要求18或19所述的方法，其中被監測的至少一種所述酶是蛋白酶并且所述第一底物和第二底物中的至少一種是蛋白酶的底物。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述酶是枯草桿菌蛋白酶類型酶并且所述底物是α-淀粉酶。
22.如權利要求1至18中任一項權利要求所述的方法，所述方法包括將所述樣品同時暴露于所述第一底物和所述第二底物。
23.用于同時檢測樣品中至少兩種酶存在的容器，在使用中所述容器包含第一酶的第一底物和第二酶的第二底物，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記。
24.如權利要求23所述的容器，所述容器包含支持物，所述支持物支持所述第一和第二底物中的至少一種。
25.如權利要求23或權利要求24所述的容器，其中所述支持物是包括玻璃珠或溶膠凝膠珠、硅顆粒或纖維素纖維的固相支持物。
26.如權利要求25所述的容器，其中所述容器包含所述第一底物和所述第二底物的異質性混合物。
27.如權利要求26所述的容器，其中所述容器包含基本上由所述第一底物組成的至少一層和基本上由所述第二底物組成的至少一層。
28.用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，所述裝置包括包含第一酶的第一底物和第二酶的第二底物的容器，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括檢測熒光底物片段的檢測設備。
29.如權利要求28所述的裝置，其中所述第一和第二底物在所述容器內分層。
30.如權利要求29所述的裝置，其中當第一底物和第二底物中的一種是蛋白酶的底物時，其位于其它底物的下游。
31.用于同時檢測樣品中至少兩種酶的裝置，所述裝置包括第一容器，所述第一容器包含第一酶的第一底物，所述第一底物用第一熒光團標記，所述第一裝置可以與第二容器相連，其中所述第二容器包含第二酶的第二底物，所述第二底物用第二熒光團標記，所述裝置還包括用于檢測熒光底物片段的檢測設備。
32.如權利要求31所述的裝置，其中當所述第一底物或第二底物的一種是蛋白酶的底物時，其位于其它容器下游的容器中并且與所述檢測設備相鄰。
全文摘要
本發明提供了同時檢測樣品中至少兩種酶存在的方法，所述方法包括以下步驟i)提供第一酶的第一底物，所述第一底物用第一熒光團標記；ii)提供第二酶的第二底物，所述第二底物用第二熒光團標記；iii)使所述被標記的底物暴露于所述樣品以使樣品中存在的第一和第二酶與單獨的第一和第二熒光團標記的底物相互作用，從而形成單獨的第一和第二熒光團標記的底物片段；以及，檢測所述熒光團標記的底物片段的存在。
文檔編號C12M1/34GK101405402SQ200780010339
公開日2009年4月8日 申請日期2007年2月8日 優先權日2006年2月8日
發明者弗雷德里克·約翰·羅威爾, 萊瑟·散達爾 申請人:分析納米技術有限公司