免疫刺激寡核苷酸及其藥物用途的制作方法

專利名稱：：免疫刺激寡核苷酸及其藥物用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫刺激寡核苷酸及其藥物用途，具體來說，涉及干擾素(IFN)誘導活性增強、且炎癥性細胞因子誘導活性降低的新型免疫刺激寡核苷酸，以及含有上述寡核苷酸的藥物的用途。
背景技術：
：德永等人報道了特定類型的細菌性DNA可刺激免疫應答(Yamamoto等人.，Jpn.J.CancerRes.198879:866-873)。免疫刺激活性所必須的細菌性DNA的主要成分是含有不受甲基化修飾的CpG二核苷酸基序(以下稱為CpG)的特征性的短小序列結構。有報道指出合成的含有CpG的寡核普酸誘導巨噬細胞和自然殺傷細胞(NK)生成I型IFN(IFN-a和IFN-P)和IFN-y,具有NK細胞的細胞毒活性(日本特開平4-352724號公報)。另外，含有CpG的寡核普酸不僅作用于巨噬細胞，也可作用于樹狀細胞或B細胞等，誘導細胞增殖活性、炎癥性細胞因子的白細胞介素-12(以下稱為IL-12)、胂瘤壞死因子-a(以下稱為TNF-a)的生成、白細胞介素-6(以下稱為IL-6)的生成(Klinman等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.199693:2879-2883)。由此，含有CpG的寡核苦酸誘導細胞性免疫、并且誘導Thl應答，因此可用于疫苗的佐劑或變應反應性疾病的治療，另一方面，由于誘導生成TNF-a或IL-6,因此誘發敗血癥、發熱、關節痛、肌肉痛或紅腫等副作用的可能性也不容否定。德永等人發現在小鼠NK細胞的細胞毒活性中，含有由6個堿基的回文序列基序形成的CpG基序的寡核苷酸具有強活性，并報告5'曙AACGTT誦3'(SEQIDN0.92)、5'-AGCGCT-3'(SEQIDN0.93)、5'-GACGTC誦3'(SEQIDNO.61)的序列最強(Yamamoto等人.，J.Immunol.1992148:4072-4076)。還報道了其它類型的免疫調節寡核苦酸序列(國際公開第1998/018810號說明書、國際公開第2003/015711號說明書、國際公開第2004/058179號說明書)。也進行了以增強寡核苷酸的活性為目的的研究。德永等人發現在含有CpG的6個堿基的回文基序的外側插入脫氧烏苷酸的重復結構(polyG序列)，則NK細胞活性和ISN誘導活性增強(日本特開平4-352724號公報)。還明確了含有CpG的6個堿基序列的外側的序列至少對活性有影響。其它公知的含有CpG的序列已知有D型(或A型)和K型(或B型)的免疫刺激寡核普酸(國際公開笫2000/61151號說明書)。已知K型可活化B細胞。D型是在含有CpG的回文序列的外側附加polyG序列，誘導樹狀細l包的I型IFN的生成，活化人NK細胞。對于D型的ISN誘導活性，3'末端一側非常重要，3'末端一側的polyG序列的長度必須為4個石咸基以上(國際公開第2000/61151號說明書)。而在炎癥性細胞因子IL-12或TNF-a的生成誘導活性中，3'末端一側的polyG序列很重要，其效果的表達至少需要4個堿基以上的polyG序列(大韓民國KR2001-063153號公報)。因此，公知的提高免疫刺激活性的核苷酸序列、或者polyG序列的結構對于IFN的誘導和炎癥性細胞因子的誘導的獨立性并未明確。又發現回文基序為5'-GACGATCGTC-3'(SEQIDN0.76)的免疫刺激核苷酸通過將最多10個最佳長度的polyG序列插入到5'末端和3'末端，比以往的非修飾型(修飾型的效果如后所述)的含有CpG的免疫刺激寡核苷酸具有更強的IFN-a誘導活性(日本特開2005-237328號公報)。還有公開稱為了使具有5'-GACGATCGTC-3'(SEQIDNO,76)的免疫刺激核苷酸帶來高的IFN-a誘導活性，最好是將8-10個G配置在3'末端一側或5'末端一側，但為了抑制免疫調節性細胞因子白細胞介素-10(以下稱為IL-10)的生成，也可以存在于5'末端一側(日本特開2005-237328號公報)。還有報告稱炎癥性細胞因子TNF-a或IL-12的誘導活性與IFN-a誘導活性有較輕的相關性。這是由于，5'-GACGATCGTC-3'(SEQIDNO.76)以外的回文基序中，polyG序列插入5'末端一側的效果尚未明確。另外，含有CpG的寡核苷酸的使炎癥性細胞因子的誘導活性減弱、且使IFN-y和IFN-a兩者的IFN誘導活性均增強的最佳的polyG序列的堿基數尚未有公開。作為具有比以往的D型CpG高的免疫刺激活性的寡核苷酸，又發現了5'-GGTGCCGATCGGCAGGGGGG畫3'(SEQIDNO.l)(日本特愿2004-287102號公報)。該堿基序列的1個以及多個堿基被置換得到的衍生物也有公開。變換了3個以上的具體的序列尚未公開，但發現了置換了唯一的7個堿基的5'-GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG畫3'(SEQIDN0.5),即使3'末端的polyG序列為3個堿基也具有IFN誘導活性(國際公開第2006/035939號說明書)。其它的以活性增強為目的的研究中，已知寡核苷酸的化學修飾可帶來穩定。天然存在的磷酸二酯核苷酸在細胞內和細胞培養基中由于各種核酸分解活性而容易被分解。因此，正在研究通過置換作為核酸分解活性的攻擊耙的核苷酸之間的磷酸二酯鍵來實現穩定，并且結果導致的活性增加。經常使用的置換方法是置換為硫代磷酸酯。Klinman等人的研究中，通過硫代磷酸酯修飾免疫刺激寡核苷酸的回文基序外側的polyG序列，顯示免疫應答的誘導增強(國際公開笫2000/61151號說明書)。在使用TLR9敲除小鼠進行的研究中發現含有非曱基化CpG的細菌性DNA受體是Toll樣受體(TLR)家族成員之一TLR9(Hemmi等人.:Nature2000408:740-745)。還明確了活化人TLR9和小鼠TLR9的最佳的CpG序列現實為不同序列，存在種特異性(Bauer等人.，PNAS200198(16):9237-9242)。在以對人的治療為目的的開發中，CpG寡核苷酸必須對人TLR9顯示高親和性，但是在開發階段中的使用動物的前臨床實驗中，可作用于小鼠等動物也是很重要的。變應反應性疾病的治療中，人們希望不采用目前大多使用的對癥療法，而希望為免疫調節型且有效的根治療法。變應反應患者中，對于變應原的免疫應答存在于Th2,Thl的免疫應答受到抑制。因此，可誘導Thl免疫應答、抑制Th2免疫反應的治療藥有望對變應性體質的改善有效。有公開專利稱某一種類的含有非回文序列的CpG寡核苷酸(曰本特開2003-286174號公報)或含有6個堿基回文5'-AACGTT國3'的CpG寡核苷酸(日本特表2002-500159號公報，Tighe等人J.AllergyClin.Immunol.2000106:124-134)在小鼠哞喘模型中具有治療效果。但是，上述免疫刺激寡核苷酸不僅誘導Thl反應，還誘發炎癥性細胞因子，因此在給予藥理作用的有效量時會表現不優選的副作用。變應性癥狀的原因是肥胖細胞將含有組胺等的顆粒釋放到細胞外(去顆粒)，該去顆粒的結果是引起肥胖細胞上的IgE與變應原結合。近年來，抗原特異性的調節性T細胞(Treg)的保持其免疫平衡的功能受到關注。例如通過Treg抑制IgE受體FcsRI介導的去顆粒等(Till等人.，J.AllergyClin.Immunol.2004113:1025-1034)。另外，IFN國a和IFN-0顯示促進誘導IL-10的生成(Aman等人.，Blood.199687:4731-4736)。并且IL-10促進謙導IgG4或IgA生成細胞的分化，因此可以認為，免疫刺激核苷酸的變應反應治療效果中，IL-10的誘導也是其機理之一。因此，適合變應反應治療的免疫刺激核苷酸優選IFN-a誘導活性增強、也可保持IL-10誘導活性。肝炎是指由病毒、酒精、藥物、毒素以及自身免疫性等的原因而誘發的、包含肝臟炎癥的疾病。肝炎病毒導致的肝炎占大多數，特別是甲、乙、丙型較多，除此之外還已知存在丁、戊、己、庚型以及特發性肝炎病毒。另外，上述肝炎病毒可在RNA型、DNA型等多種不同的病毒家族之間擴散。乙型病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)分別引發急性和慢性感染。急性肝炎伴隨初期感染或慢性感染者的復發而表現癥狀。而在慢性丙型肝炎中，肝臟的炎癥持續六個月以上，細胞破壞，伴隨有肝功能的降低。HCV感染中，由急性肝炎向慢性肝炎發展的危險性高。針對上述狀況，人們希望能夠開發可對肝炎病毒感染癥治療早期介入和效果高的治療方法。丙型肝炎中，各種干擾素(以下稱為IFN)制劑的單獨治療或IFN-a制劑與利巴韋林等的結合療法是治療手段的第一選擇。聯合治療比單劑治療有望獲得持續性的反應，但是伴有更高的成本、更多的副作用。但是，即使進行這些治療，也只有全部治療患者的約60%具有治療效果。有效果后如果中斷治療，則半數以上的患者復發。基于上述狀況，人們希望進一步開發治療藥物。CpG寡核苷酸在肝炎治療中的效果有通過誘導干擾素增強抗病毒效果、誘導對病毒感染細胞的細胞性免疫和對抗性細胞抹出現的抵抗性等。關于CpG寡核苷酸對HBV或者HCV感染導致的肝炎的治療用途，有日本特表2003-526662號公報和日本特表2006-515277號公報中的技術信息。前者公開了無需將CpG寡核苷酸(免疫活化序列ISS)與肝炎病毒一起給予即可進行治療的方法。后者公開了對干擾素療法等的抗病毒藥無效的慢性丙型肝炎個體進行處置的方法，關于對患者的有用性，開發編號CpG10101的臨床實驗成果已在2006年歐洲肝臟學會等中公開。但是，臨床實驗結果已經表明，CpG10101的單劑治療效果與以往的治療方法相比極為不足，聚乙二醇修飾的IFN-a制劑與利巴韋林和CpG寡核普酸三劑的聯合治療與標準治療方法一聚乙二醇修飾的IFN-a制劑與利巴韋林的成績相比，有望有效性稍有提高，但是，與同其它抗病毒劑的聯合用藥(例如與聚合酶和蛋白酶等病毒酶的抑制劑的聯合治療)相比，并未得到充分的治療效果。現有的CpG寡核苷酸通過誘導炎癥性細胞因子TNF-a、IL-12或IL-6的生成，不可否定地可誘發敗血癥、發熱、關節痛、肌肉痛或紅肺或未預期的副作用，實際在使用小鼠肝炎模型進行的實驗例中已顯示肝炎癥狀惡化(Abe等人.，FukushimaJ.Med.Sci.200551:41-49)。因此，人們希望能夠創造出適合肝炎治療的、免疫刺激活性提高、且副作用降低的CpG寡核苷酸。免疫刺激寡核苷酸與活性相關，可以減輕給予量、給予次數，結果，發生毒性作用的可能性降低，QOL提高的可能性極高。基于以上考慮，在人體中發現了與上述現有的免疫刺激序列相比，IFN誘導活性提高、且炎癥性細胞因子誘導活性降低的序列，這在工業利用上非常有用，有益性極高。
發明內容本發明的目的在于提供干擾素(IFN)誘導活性增強、且炎癥性細胞因子誘導活性降低的新型免疫刺激寡核苷酸，以及含有該免疫刺激寡核苦酸的藥物及其用途。本發明人為解決上述課題進行了深入的探討，結果發現在IFN誘導活性中，含有CpG基序的序列外側的5'末端一側很重要。即，通過將6個堿基或以上的連續鳥噪呤序列插入到5'末端一側，可得到干擾素誘導活性比除此之外的更為優異的寡核苷酸。進一步研究的結果發現polyG序列以堿基數6-10的長度插入到5'末端一側、以堿基數0-3的長度插入到3'末端一側，且具有規定結構性特征的CpG寡核普酸比以往已知的D型的含有CpG序列的寡核苦酸，I型IFN、即IFN-a和IFN-P和IFN-Y誘導活性增強，炎癥性細胞因子誘導活性降低，并且具有高的IgE生成抑制活性、Th2抑制活性和Thl誘導活性。除此之外，還發現肝炎模型小鼠的實驗結果是在體內具有肝炎治療效果，從而完成了本發明。即，本發明提供以下各發明。免疫刺激寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸含有式5'-(G)mPXCGYQ(G)n-3'所示的械基序列，式中，C為胞嘧啶，G為鳥。票呤，X和Y是以各自獨立的0-10個核苷酸長度、且不含有4個堿基以上連續的鳥嘌呤的任意的序列，X+Y的長度為6-20個核苦酸長度，XCGY含有長度至少為8個核苷酸長度的回文序列，是長度為8-22的核苷酸長度；P和Q是除鳥嘌呤以外的互相獨立的單一核苦酸，M為6-10的整數，N為0-3的整數，X和Y的核苷酸長度未必相同；該寡核苷酸的全長為16-37個核苷酸長度(含有SEQIDN0.5的堿基序列(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)的序列除外)。[l]的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述M是6-8的整數，且全長為16-35個核苷酸長度。[1]或[2]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY的長度是9或10個核苷酸長度，且全長為17-23個核苷酸長度。[1]-[3]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY含有選自CGATCG(SEQIDN0.59)、ATCGAT(SEQIDNO.60)和GACGTC(SEQIDN0.61)中任一項的堿基序列。[1]-[3]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上迷XCGY含有CGATCG(SEQIDN0.59)。[4]或[5]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQIDN0.59)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQIDN0.6、7、9-11以及15-18、22、24、26、28、48、50-52、54、95和97所示的堿基序列。[4]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQIDNO.60)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQIDNO.30所示的堿基序列。[4]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQIDN0.61)的免疫刺激寡核苦酸含有SEQIDNO.40和42所示的石威基序列。[4]或[5]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，該寡核苦酸含有SEQIDN0.6、7、10以及15-17、24、26、28、48、50-52、95和97所示的》咸基序列。[1]-[9]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，所有或部分核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵進行了硫代磷酸酯修飾。[IO]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，5'-末端的連續G序列的核苷酸殘基之間至少一部分磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。[10]或[11]所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，3'-末端的核苷酸殘基之間至少一部分磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。藥物，該藥物含有[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為有效成分。過敏性疾病的治療或預防藥，該藥物含有[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為有效成分。[14]所述的過敏性疾病的治療或預防藥，其中，上述過敏性疾病是花4分過壽丈癥。疫苗，該疫苗含有[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為佐劑。肝炎的治療或預防藥，該藥物含有[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為有效成分。[17]所述的肝炎的治療或預防藥，其中，上述肝炎是病毒性肝炎。[18]所述的肝炎的治療或預防藥，其中，上述病毒性肝炎是乙型或丙型肝炎。[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核普酸作為過敏性疾病的治療或預防藥的應用。[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為疫苗佐劑的應用。[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為肝炎的治療或預防藥的應用。[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸對過敏性疾病的治療或預防的方法。利用[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為疫苗的佐劑的方法。[1]-[12]中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸對肝炎的治療或預防的方法。本發明中提供的新型免疫刺激寡核苷酸使IFN誘導活性增強、炎癥性細胞因子誘導活性降低，并具有高的IgE生成抑制活性、Th2抑制活性和Thl誘導活性等，具有優異的免疫刺激活性，因此具有高的治療效果。另外，肝炎模型小鼠的實驗結果證明在體內也具有肝炎治療效果。并且副作用的危險性低，因此可以以高用量使用。因此，本發明的免疫刺激寡核苷酸與以往的免疫刺激寡核苷酸相比，可作為短防。曰、'、'、A、'5、、、、圖l-l是表示在實施例1中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖l-2是表示在實施例1中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖l-3是表示在實施例1中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖l-4是表示在實施例1中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖l-5是表示在實施例1中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖l-6是表示在實施例1中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖2是表示在實施例2中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激小鼠J774細胞抹，測定培養上清中IL-12p40生成量的結果的圖。圖3-1是表示在實施例3中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖3-2是表示在實施例3中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激人PBMC，測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖3-3是表示在實施例3中，用本發明的免疫刺激寡核香酸(G6/7-PXCGYQ-G2)和回文基序相同的D型CpG(G2/3-PXCGYQ-G6)刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖4是表示在實施例4中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖5-1是表示在實施例7中，用本發明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖5-2是表示在實施例7中，用本發明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖5-3是表示在實施例7中，用本發明和公知的免疫刺激寡核普酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖5-4是表示在實施例7中，用本發明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC,測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖6是表示在實施例8中，用本發明和公知的免疫刺激寡核苷酸刺激人PBMC，測定培養上清中IFN-a生成量的結果的圖。圖7-1是表示在實施例9中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG刺激小鼠脾細胞，測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖7-2是表示在實施例9中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG刺激小鼠脾細胞，測定培養上清中IL-10生成量的結果的圖。圖8-1是表示在實施例10中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激小鼠J774細胞林，測定培養上清中IL-12生成量的結果的圖。圖8-2是表示在實施例10中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸(G6-PXCGYQ-G3)和回文基序相同的D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)刺激小鼠J774細胞抹，測定培養上清中TNF-a生成量的結果的圖。圖9是表示在實施例11中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸和回文基序相同的D型CpG和公知的免疫刺激寡核苷酸剌激小鼠J774細胞林，測定培養上清中TNF-a生成量的結果的圖。圖IO是表示在實施例12中，將本發明的免疫刺激寡核苦酸和回文基序相同的D型CpG和公知的免疫刺激寡核苷酸與抗CD40抗體和IL-4一起刺激人PBMC，測定培養上清中IgE生成量的結果的圖。圖11是表示在實施例13中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸以及杉樹花粉抗原Cryjl處置小鼠，引發變應反應后測定血清中IgE生成量的結果的圖。圖12-1是表示在實施例13中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸以及杉樹花粉抗原Cryjl處置小鼠，引發變應反應，然后用Cryjl刺激摘取的脾臟細胞，測定培養上清中IFN-y生成量的結果的圖。圖12-2是表示在實施例13中，用本發明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸以及杉樹花粉抗原Cryjl處置小鼠，引發變應反應，然后用Cryjl刺激摘取的脾臟細胞，測定培養上清中IL-5生成量的結果的圖。圖13是表示在實施例14中、在ConA誘發小鼠肝炎模型中，評價本發明的免疫刺激寡核苷酸對于血清中ALT值的升高的影響的結果圖。圖14-l是表示在實施例15中、在ConA誘發小鼠肝炎模型中，評價本發明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸對于血清中ALT值的升高的影響的結果圖。圖14-2是表示在實施例15中、在ConA誘發小鼠肝炎模型中，評價本發明的免疫刺激寡核苷酸和公知的免疫刺激寡核苷酸對于血清中ALT值的升高的影響的結果圖。具體實施例方式本發明的免疫刺激寡核苷酸的特征在于含有式5-'(G)mPXCGYQ(G)n-3'所示的械基序列(C為胞嘧啶，G為鳥噤呤，X和Y是以各自獨立的0-10個核苷酸長度、且不含有4個堿基以上連續的鳥噪呤的任意的序列，X+Y的長度為6-20個核普酸長度，XCGY含有長度至少為8個核苷酸長度的回文序列，是長度為8-22的核苷酸長度；P和Q是除鳥嘌呤以外的互相獨立的單一核苷酸，M為6-10的整數，N為0-3的整數，X和Y的核普酸長度未必相同)，全長為16-37個核苦酸長度(含有SEQIDNO.5的堿基序列(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)的序列除外)。構成本發明的免疫刺激寡核苷酸的堿基序列由式5'-(G)mPXCGYQ(G)n-3'表示。式中的"5'-"表示5'末端，"3'-"表示3'末端。另外，C為胞嘧啶，G為鳥噪呤，X和Y為含有各自獨立的任意序列和長度的部分，P和Q是各自獨立的任意的核苷酸。(G)m和(G)n分別表示只含有鳥嘌呤(G)的連續的序列部分，各M和N表示鳥嘌呤的數目。即，上式是通式表示本發明的免疫刺激寡核苷酸的5'末端至3'末端的堿基序列。本發明中，"XCGY"是指上式中的由X、C、G和Y構成的序列部分全體，"PXCGYQ"是指上式中的由P、X、C、G、Y和Q構成的序列部分全體。上式中的"長度"是指構成各序列部分的核苷酸數目(核苷酸長度)。"X+Y的長度"是指X的長度和Y的長度的總和。上式中，X和Y的長度分別為0-10個核苷酸長度的范圍。特別優選2-6個核苷酸長度。X和Y的序列只要含有各自獨立的任意的核普酸即可，^f旦必須是不含有4個;咸基以上的連續的鳥嘌呤。并且X+Y的長度必須是6-20個核苷酸長度。優選6-12個核苷酸長度，更優選7或8個核苷酸長度，最優選8個核苷酸長度。X和Y的核苦酸長度未必相同。上式中，XCGY必須含有回文序列。回文序列是指由相對于任意發明中，XCGY中所含的回文序列的長度必須是8個核苷酸長度以上。XCGY可以只含有8個堿基以上的回文序列，只要一部分中含有8個石咸基以上的回文序列即可，不必完全互補。XCGY優選含有選自CGATCG(SEQIDN0.59)、ATCGAT(SEQIDNO.60)和GACGTC(SEQIDN0.61)中任意一種堿基序列。特別是最優選含有CGATCG(SEQIDN0.59)。這些序列本身是回文序列，優選XCGY中所含的回文序列含有這些序列作為其一部分。上述本發明的回文序列的例子如下所示。XCGY中，8個堿基序列的回文序列有CCGATCGG(seqidno.62),GCGATCGC(seqid肌63)'ACGATCGT(seqidno.64),CATCGATG(seqidno.65),GATCGATC(seqidno.66),ATCGCGAT'(seqidno.67),GAACGTTC(seqidno.68)，CAACGTTG(seqidno.69),AGCGCGCT(seqidno.70),ACGTACGT(seqidno.71),TAGCGCTA(seqidno.72),ACGGCCGT(seqidno.73)，CGACGTCG(seqidno.74),CGTCGACG(seqidno.75)。其中優選CCGATCGG,GCGATCGC,ACGATCGT，CATCGATG,CGACGTCG。XCGY中，10個威基序列的回文序列有GACGATCGTC(seqidno.76),GGCGATCGCC(seqidno.77)'CG^V1、CGATCG(seqidno.78),GATCGCGATC(seqidno.79)、GCAACGTTGC(seqidno.80),GCATCGATGC(seqidno.81),CAGCGCGCTG(seqidno.82),GACGTACGTC(seqidno.83),CTAGCGCTAG(seqidno.84)，CCCGATCGGG(seqidno.85)，GACGGCCGTC(seqidno.86),GCCGATCGGC(seqidno.87),TCCGATCGGA(seqidno.88),ACGTCGACGT(seqidno.89),ACAACGTTGT(seqidno.90)和ACGACGTCGT(seqidno.91)。其中優選GCCGATCGGC,CCCGATCGGG,TCCGATCGGA,GGCGATCGCC,GACGATCGTC.GCATCGATGC，ACGACGTCGT。回文序列只要是其長度至少為8個核苷酸長度的序列即可，并不限于上述具體例子。XCGY的長度是8-22個核苷酸長度，可根據X和Y的各長度或回文序列的種類在該范圍內調整。優選8-14個核香酸長度，更優選9或10個核苷酸長度，最優選10個核苷酸長度。上式中的P和Q是除鳥嘌呤以外的一個核苷酸。具體有腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)的任意一種。上式中的M是6-10的整數，優選6-8。脫離上述范圍則IFN誘導活性不足，因此不優選。N為0-3的整數。脫離上述范圍，則無法使炎癥性細胞因子誘導活性充分降低，不優選。本發明的免疫刺激寡核苷酸的全長是16-37個核苷酸長度，根據上式中的M或N、X或Y的長度等而不同。如上所述，M為6-8的范圍時，全長是6-35個核苷酸長度。XCGY的長度為9或10個核苷酸長度時，全長是17-23個核苷酸長度。本發明的免疫刺激寡核苷酸的堿基序列的例子優選GGGGGG丁GACGATCGTCGGG(seqidn0.97:Mod92),GGGGGGTGACGA;i、CGTCAGGG(seqidNo.28:Mod46),GGGGGGTCCCGATCGGGAGGG(seqidn0.22:Mod43),GGGGGGTTCCGATCGGAAGGG(seqidno.24:Mod44),GGGGGGTGGCGATCGCCAGGG(seqid肌26:Mod45),GGGGGGTGCATCGATGCAGGG(s叫idn0.30:Mod47)，GGGGGGGTGCCGATCGGCAGGG(seqidn0.6:Mod53)'GGGGGGGGTGCCGATCGGCAGGG(seqidn0.7:Mod54),GGGGGGTGCCGATCGGCAGG(seqid亂9:Mod40),GGGGGGGTGCCGATCGGCAGG(seqidNo.lO:Mod55),GGGGGGTGCCGATCGGCAG(seqidno.11:Mod41),GGGGGGTGCCGATCGGCA(seqidn0.15:Mod61)，GGGGGGGTGCCGATCGGCA(seqid肌16:Mod62)'GGGGGGGGTGCCGATCGGCA(s叫idno.17:Mod63),GGGGGGGGGGTGCCGATCGGCA(seqid肌18:Mod64),GGGGGGGACGACGTCGTCGG(seqidn0.40:Mod71)和GGGGGGAACGACGTCGTTGG(seqidno.42:Mod73)，zf旦不限于此。例如式5'—(G)PXCGYQ(G)—3'的M為7、N為2時，可以是GGGGGGGAGCCGATCGGCTGG(seqidno.43)'GGGGGGGAGCCGATCGGCAGG(seqidno.44),GGGGGGGTGCCGATCGGCTGG(seqidno.45),GGGGGGGAGCCGATCGGCCGG(seqidno.46)'GGGGGGGCGCCGATCGGCCGG(seqidno.47),GGGGGGGTGACGATCGTCAGG(seqidno.48:Mod84)，GGGGGGGTGACGATCGTCTGG(seqidno.49),GGGGGGGAGACGATCGTCAGG(seqidn0.50:Mod85),GGGGGGGAGACGATCGTCTGG(seqidno.51:Mod83),GGGGGGGCGACGATCGTCAGG(seqidno.52:Mod87),GGGGGGGTGACGATCGTTAGG(seqidno.53),GGGGGGGTCGACGTCGTGG(seqidno.IOO)，GGGGGGGACGACGTCGTGG(seqidno.101)和GGGGGGGTCGACGTCGAGG(s叫idno.102),GGGGGGGACGACGTCGTCGG(seqidno.105),M為7、N為3時，可以是GGGGGGGCGACGATCGTCGGG(seqidno.54),GGGGGGGTGACGATCGTCGGG(seqidTO.94)'GGGGGGGTCGACGTCGTGGG(s叫idno.99)和GGGGGGGTCGACGTCGAGGG(seqidno.107),M為8、N為l時，可以是GGGGGGGGCGACGATCGTCG(seqidno.95;Mod93)，GGGGGGGGTGACGATCGTCG(s印idno.96),GGGGGGGGACGACGTCGTG(seqidno.103)和GGGGGGGGTCGACGTCGAG(seqidno.104)。M為8、N為0時，可以是GGGGGGGGACGACGTCGTC'(seqidno.106)。如下述實施例中具體所示，含有序列表的SEQIDN0.6、7、9-11以及15-18、22、24、26、28、48、50-52、54、95和97所示的堿基序列的寡核苷酸可以確認比在上式中滿足了PXCGYQ的條件、但未滿足其它條件的D型CpG序列的IFN誘導活性增強，炎癥性細胞因子誘導活性降低。即，在IFN誘導活性中，寡核苷酸的含有CpG基序的回文性的增強和炎癥性細胞因子誘導活性的降低中，重要的是插入到其外側的polyG序列的堿基數。因此，本發明的最重要的部分不是polyG序列與特定的回文序列的組合，而是最佳的polyG序列的插入方式。另夕卜，上述例舉的寡核苷酸中，含有SEQIDN0.6、7、10以及15-17、24、26、28、48、50-52的寡核苷酸、其中SEQIDN0.6、7、10、28、48、50-52的寡核苷酸具有強的干擾素(IFN)誘導活性，特別優選。本發明的免疫刺激寡核苷酸可以是核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵、各核苷酸的核糖部分、堿基部分中的全部或一部分可被化學修飾。不過，XCGY的C的曱基化使免疫刺激活性消失，不優選。上述被修飾的本發明的免疫刺激寡核苷酸的優選實施方案是在核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵中的磷酸基的氧原子的置換和/或修飾，例如有硫代磷酸酯、磷酸甲酯和亞磷酸酯。硫代磷酸酯修飾優選對5'-末端的polyG序列(上式中的(G)m)的一部分或全部核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵進行。對于5'-末端的polyG序列，優選構成該序列的全部堿基之間或該末端的磷酸二酯鍵進行疏代磷酸酯修飾。對于3'-末端的polyG序列，優選除去最末端的堿基之外的一部分或全部堿基之間的磷酸二酯鍵進行硫代磷酸酯修飾。另外，上述通式中的N=0或1的寡核苷酸可以是鳥。票呤以外的3'-末端一側的磷酸二酯鍵進行硫代磷酸酯修飾。優選5'-末端的polyG序列和3'-末端一側的最末端的磷酸二酯鍵進行硫代磷酸酯修飾。并且只要具有免疫刺激活性，CpG二核苷酸的胞嘧啶(上式中的中央部C)可以進行曱基化以外的化學修飾。具有磷酸二酯骨架的核苷酸的分解通過核酸外切酶和核酸內切酶進行。已知核苷酸之間的鍵通過硫代磷酸酯修飾，可以獲得對這些核酸酶獲的抗性。一部分核香酸殘基之間被修飾得到的寡核苷酸例如有5'和3'末端的核苷酸之間具有硫代磷酸酯修飾鍵的寡核苷酸、或polyG序列的核苷酸之間具有硫代磷酸酯修飾鍵的寡核香酸，對核酸外切酶具有抗性。所有的核苷酸殘基之間均被修飾的寡核苷酸對核酸外切酶和核酸內切酶具有抗性。核酸酶抗性的CpG寡核苷酸穩定，例如與把受體作用的時間的延長或可保持一定的濃度，結果，顯示增強的免疫刺激活性。上述本發明的免疫刺激寡核苷酸只要滿足上述堿基序列的相關要件，則具有免疫刺激活性、具體來說具有增強的IFN誘導活性和降低的炎癥性細胞因子誘導活性，可以結合核苷酸以外的分子。本發明中，免疫刺激寡核苷酸具有免疫刺激活性，這是指干擾素(IFN)誘導活性增強，且炎癥性細胞因子誘導活性降低。這里，炎癥性細胞因子是指白細胞介素-12(以下稱為IL-12)、腫瘤壞死因子-a(以下稱為TNF-a)、白細胞介素-6(以下稱為IL-6)和白細胞介素-l卩(以下稱為IL-1J3)。炎癥性是指誘導組織發熱或引起細胞浸潤和活化的性質。免疫抑制性表示具有抑制上述炎癥反應的功能或性質。白細胞介素-10(以下稱為IL-10)是免疫抑制性細胞因子之一，其功能與炎癥性細胞因有平均反應性的人檢樣的末梢血單核細胞(PBMC)、小鼠的來自骨髓的樹狀細胞或脾臟細胞、或對具有CpG序列的免疫刺激寡核苷酸為感受性的單核細胞系細胞株J774或RAW264.7的各細胞因子的生成的作用。本發明中，可以以免疫刺激寡核苷酸的處置來誘導人末梢血單核細胞(以下稱為PBMC)中IFN-a和IFN-y的生成作為指標的活性表示。還可以以免疫刺激寡核苦酸的處置來誘導小鼠脾細胞中IFN-y和IL-10的生成的活性表示。進一步可以以在小鼠樹狀細胞和J774細胞抹中，通過免疫剌激寡核苷酸處置來誘導白細胞介素-12p40(以下稱為IL-12p40)和TNF-a生成的作為指標的活性表示。本發明中，在將幾種免疫刺激寡核苷酸序列的活性進行比較時所使用的增強的IFN誘導活性表示將上述細胞用免疫刺激寡核苷酸刺激時，在比其它更低濃度可以誘導大量的IFN-a和IFN-y。而降低的炎癥性細胞因子誘導活性是指將上述細胞用免疫刺激寡核苷酸刺激時，比其它誘導較少量的IL-12p40和TNF-a。評價本發明的免疫刺激寡核苷酸體外誘導來自PBMC的IFN-y和IFN-a的活性的實驗的具體方法如下所示。使用Histopaque1077、以2000rpm、在室溫下進行25分鐘的密度梯度離心，從人血液中分離PBMC。將分離的PBMC用含有10%FCS的RPMI1640培養基制備成每1mL含有4.0xl()S個細胞，然后在圓底的96孔板上每個孔接種4.0xl()S個細胞，在免疫刺激寡核苦酸的存在下刺激24小時或7天，分別回收培養上清。分別使用刺激24小時和7天后的培養上清，通過ELISA法對IFNa和IFNy的生成量進行定量。評價本發明的免疫刺激寡核苷酸體外誘導來自PBMC的IL-12和TFN-a的活性的實驗的具體方法如下所示。使用Histopaque1077、以2000rpm、在室溫下進行25分鐘的密度梯度離心，從人血液中分離PBMC。將分離的PBMC用含有10%FCS的RPMI1640培養基制備成每1mL含有2.0x106個細胞，然后在平底的96孔板上每個孔接種2.0><105個細胞，在免疫刺激寡核苷酸的存在下刺激8小時或24小時，分別回收培養上清。分別使用刺激8小時和24小時后的培養上清，通過ELISA法對IL-12和TFNa的生成量進行定量。確認本發明的免疫刺激寡核苷酸是否誘導來自小鼠脾細胞的IFN-y和IL-10的生成的方法有體外誘導評價實驗。具體方法如下所示。摘取雄性10-25周齡CL57BL/6N小鼠的脾臟，轉移至加入了RPMI1640/FCS10。/o的培養皿中。使用兩片毛載玻片搗碎脾臟，邊用細胞篩分散邊轉移至圓底離心管中。以1000rpm、在4。C下離心10分鐘。舍去上清，加入5mL的溶血緩沖液(將0.83%NH4C1和170mMTris-HCl,pH7.65按照9:1混合制備)，通過移液操作拆散細胞團，使其懸浮。在室溫下溫育5分鐘，然后加入5mL的培養液，反轉混合，以1000rpm、在4。C下離心10分鐘。舍去上清，加入10mL培養液，通過移液操作拆散細胞團，懸浮。將洗滌操作重復2次，然后在培養液中再懸浮，用臺盼藍計數細胞數，制備1mL中活細胞數為4xl06。以每孔4.0xl()S個細胞向圓底96孔板接種，添加免疫刺激寡核苷酸，刺激3天。刺激結束后，通過ELISA法對培養上清中的IFN-y和IL-10的濃度進行定量。確認本發明的免疫刺激寡核苷酸是否誘導來自小鼠J774細胞的IL-12p40和TNF-a的生成的方法有體外的誘導評價實馬全。J774細胞抹用培養液(RPMI1640，FCS10%,50pM2-ME)調節為每1mL含有lx106個細胞。以每孔為1.0xl()S個細胞接種在圓底96孔板中，添加免疫刺激寡核苷酸，刺激4小時或8小時或48小時。刺激結束后，通過ELISA法對培養上清中的IL-12p40和TNF-a的濃度進行定量。本發明的免疫刺激寡核苷酸可通過以往的技術以及核酸合成裝置合成。這些合成方法包含酶法、化學方法、比本發明的序列長的序列的分解，但并不限于此。修飾寡核苷酸也可以用以往的技術合成。例如將寡核苷酸亞磷酰胺用硫處理，可以得到硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸，但并不限于此。這些寡核苷酸的合成技術、修飾技術是在本說明書中引用的專利文獻、非專利文獻中使用的，其它也是已有很多報道的公知的技術。上述本發明的免疫刺激寡核普酸可以是為了作為藥物應用而制成的核苦酸復合體的形態。復合體可以使用該免疫刺激寡核苷酸與其它物質(例如包含細胞因子類或由肽、蛋白質或非蛋白質形成的抗原)的混合物和結合體、攝入該免疫刺激寡核苦酸的膠體分散系統或脂基系統。膠體分散系統有高分子復合體、納米膠嚢、微膠嚢(74夕口夕口X7工7)、微珠。脂基系統例如可以選擇水包油型乳劑、膠束、混合膠束以及脂質體，但并不限于此。優選的實施方案是上述復合體包埋免疫刺激寡核苷酸而成的脂質體。包埋是指與脂質體的脂膜表面結合，攝入到脂膜中或者攝入到脂質體內腔中。另外脂質體可以通過特定的功能分子例如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質進行修飾或結合。構成脂質體的脂類可以將已知構成脂質體的任意的常用脂類單獨或多種組合使用。例如可使用天然物例如蛋黃、大豆或由其它動植物得到的脂類，將這些脂類氫化、使不飽和度降低的脂類。具體來說例如有甾醇類(例如膽甾醇)、磷脂酰乙醇胺類(例如二椋櫚酰磷脂酰二乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰二乙醇胺)、磷脂酰肌醇類、磷脂酰膽堿類(例如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、磷脂酰甘油類、磷酰絲氨酸類(例如二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸)、磷酯酸類(例如二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸)、鞘磷脂類或心磷脂類等，但并不限于此。脂質體的制備可采用公知的方法。通常是渦流法和超聲波法，除此之外還可采用乙醇注入法、醚法、機械化學法、加溫法、脂溶法或逆向蒸發法等，可以將它們組合使用。例如在渦流法和超聲波法中，將規定的脂類溶解于有機溶劑例如曱醇、乙醇、氯仿或它們的混合物例如甲醇和氯仿的混合物中，然后蒸發除去該有機溶劑，可獲得脂類的薄層。此時，通過將上述脂類進行各種組合，以不同的濃度比例溶解于有機溶劑中，由此可以制備各種脂質體。接著，向該脂類的薄層中加入水性介質，通過渦流處理或超聲波處理形成脂質體。此時，向上述水性介質中混入、例如溶解或懸浮要包埋在脂質體中的物質，可以將物質埋入脂質體內。溶解于水性介質的包埋物質的濃度沒有特別限定，蛋白質優選0.00375-375mg/mL，免疫刺激寡核苷酸則優選0.5pg-5000jxg/mL。通常脂質體粒經優選0.01-10pm的范圍內。上述本發明的免疫刺激寡核苷酸可用作各種用途的藥物的有效成分。實施方案之一的優選適應癥是各種過敏性疾病。過敏性疾病起因于來自花粉、螨、犬或貓等動物，食物、室塵等的抗原物質，出現鼻炎、結膜炎、皮膚炎、哮喘等炎癥的癥狀的疾病。更優選的實施方案是作為上述過敏性疾病、特別是花粉過敏癥的治療或預防藥的有效成分的用途。花粉過敏通常是特別以來自杉樹花粉的蛋白為抗原的變應反應，抗原也可以是來自扁柏、白樺、赤楊、豬草、艾草、鴨茅等的其它花粉的物質。例如，將用杉樹花粉抗原致敏的小鼠脾細胞用杉樹花粉抗原刺激，則通常誘導生成作為抗原特異性Th2應答的指標的IL-5或IL-4,而無法確認是否誘導生成作為Thl應答指標的IFN-y,但是如果用杉樹花粉抗原和本發明的免疫刺激寡核苷酸同時刺激，則可確認有效地誘導IFN-y。另外，將本發明的免疫刺激寡核苷酸對小鼠進行處置，然后用抗原和明礬的混合液引發Th2反應，則血清中抗原特異性的IgE的生成受到抑制，可見抗原特異性的IgG2a增加。在使用誘發哮喘的抗原作為致敏和治療中進行處置的抗原時，該實^r方法可以確認嗜喘的治療效果。因此，上述本發明的免疫刺激寡核苷酸對于各種變應反應具有高的治療、預防效果。上述本發明的免疫刺激寡核苷酸可以單劑使用，也可以與上述變應原一起使用，用作脫敏療法的治療藥。并且，本發明的免疫刺激寡核苷酸具有抑制人細胞的IgE生成的作用。作為確認該作用的方法，體外評價IgE生成抑制活性的試^^的具體方法如下所示。通過上述方法，將從人血液中分離的PBMC用含有10%FCS的RPMI1640培養基制備成每1mL中含有4.(^106個細胞，然后再以每孔4.0x105個細胞接種到平底96孔板中，與人IL-4和抗CD40抗體一起添加免疫刺激寡核苷酸，刺激14天，回收培養上清。IgE的生成量通過ELISA法定量。上述發明的實施方案的一個優選適應癥可以是含有本發明的免疫刺激寡核苷酸作為佐劑的疫苗。可使用疫苗的疾病是感染癥和過敏性疾病。感染癥是由于病毒、細菌、真菌和原蟲等原因而發病的疾病，但并不限于此。通常，疫苗是指給予患者、使其產生活性免疫的、含有感染性因子、具有感染因子的部分、或來自動植物的因子的抗原性懸浮液或溶液。構成疫苗的抗原性部分可以是蛋白質、肽、脂類、多糖、核酸的任意一種。優選的實施方案是本發明的免疫刺激寡核苦酸與上述疫苗的混合液，但并不限于此。還可以是本發明的免疫刺激寡核普酸與上述疫苗的抗原性部分的復合體。實施方案的一個優選適應癥是肝炎、具體來說是免疫系統伴隨有活化的肝炎、非病毒性肝炎和/或病毒性肝炎，進一步優選HBV和/或HCV感染導致的乙型肝炎和/或丙型肝炎。本說明書的HBV和/或HCV感染的癥狀中包含以急性和慢性肝炎為成因的癥狀。病毒性肝炎的臨床癥狀包含黃痘、腹痛、倦怠感、惡心和嘔吐、以及與肝炎相關的臨床性/檢查指標、肝酶水平升高(例如丙氨酸氨基轉移酶CALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、和/或乳酸脫氫酶(LDH))、膽紅素升高、HCV病毒血癥或抗原水平、門靜脈高壓癥和食欲不振等，但并不限于此。本發明的免疫刺激寡核苷酸對于乙型肝炎和/或丙型肝炎的治療效果是以上述臨床癥狀(例如黃疰、倦怠感、腹痛)、肝炎相關的檢查指標(例如血液中肝酶水平)、病毒擴增和復制、或病毒量(效價)作為指標進行評價。即，與未進行本發明的治療的個體比較，使用本發明的免疫刺激寡核苷酸進行治療的個體，有望其乙型肝炎和/或丙型肝炎臨床癥狀消失、緩解、改善或癥狀程度減輕，進一步有望縮短患病期間。肝炎相關的檢查指標或病毒復制以及病毒量也可以作為治療效果反映。病毒效價的降低包含從感染部位或個體排除病毒。評價方法可以選擇包含癥狀的檢測、通過臨床檢查對肝功能的評測、肝活;險、肝門靜脈壓的直接或間接測量、以及病毒顆粒、病毒核酸或病毒抗原效價的測量、以及抗病毒抗體的檢測和測量的本
技術領域：
已知的各種方法。腹痛或倦怠感等自覺癥狀通過癥狀的有無來判定，黃疽通過定性水平、血液或血清中膽紅素水平的測定來定量。肝炎相關的檢查指標、例如血液或血清中的肝酶AST和ALT的量通過血液學、血液生化學和組織學實驗來測量。血液和血清樣品中病毒效價可按照本
技術領域：
中周知的方法、例如對病毒顆粒的定量(例如通過分離和可視化，或者DNase抗性顆粒的測定)、血液或血清樣品中病毒抗原的檢測(通過ELISA法對抗原量的定量)、血液或血清樣品中抗病毒抗體的檢測、或病毒核酸(RNA和DNA)的檢測(使用HCV基因特異性引物的PCR擴增或使用病毒特異性探針的原位雜交)來測量。肝組織活檢也可以通過上述方法評價。上述發明的治療藥的治療對象是脊推動物，優選哺乳動物，更優選人。人以外的脊推動物有狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、猴、大鼠或小鼠，但并不限于此。本發明的免疫刺激寡核苷酸可以給予有HBV和/或HCV感染可能性的個體(例如沒有身體性癥狀時或者為HCV載體的母體內的胎兒)、可見HBV和/或HCV感染的個體、伴有上述乙型肝炎和/或丙型肝炎臨床癥狀的個體(例如包含慢性肝炎或初期感染或慢性感染后的復發等導致的急性肝炎)。根據HBV和/或HCV感染或其癥狀程度，免疫刺激寡核苦酸的給予可以以不同次數進行。使用免疫刺激寡核苷酸的治療也i免疫刺激寡i苦酸;以單次或多次給予:、、、'用作上述過敏性疾病或作為肝炎的預防、治療藥時，給予途徑沒有特別限定，優選皮下注射、皮內注射、靜脈內注射、肌內注射、患部組織的注入、口服給予、經鼻給予、經眼給予、經咽喉給予、經肺給予、透皮給予、舌下給予等。給予量根據患者的癥狀、治療目的、給予途徑等適當選擇，通常按照寡核苷酸的量，成人每天為0.1pmol-10pmol,優選1pmol-lpmol左右。用作佐劑時的給予量也根據給予目的、給予途徑等適當選擇，通常可以是與上述相同程度的給予量。另外，本發明的免疫刺激寡核苷酸可按照制成通常所采用的劑型的周知的制劑方法制成制劑。這些免疫刺激寡核苷酸可用作過敏性疾病的治療或預防藥、疫苗的佐劑或肝炎的治療或預防藥，也可用作過敏性疾病的治療或預防方法、作為疫苗佐劑而利用的方法、或肝炎的治療或預防方法。實施例以下詳細說明實施例。但本發明的技術范圍并不限于這些實施例。以下說明中所使用的免疫刺激寡核苷酸的序列的簡稱和特性記載于序列表中。實施例中所記載的公知的免疫刺激寡核苷酸的序列、簡稱和特性如表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例1:人PBMC中免疫刺激寡核苷酸的IFN誘導活性所必須的5'末端側polyG序列的堿基數的比較合成插入了含有各種堿基數的polyG序列的CpG寡核苷酸，對于IFN誘導活性所必須的長度進行研究。構建20種免疫誘導寡核苷酸(SEQIDN0.1-20)，該免疫誘導寡核苦酸是在含有德永等人給出的回文序列CGATCG(日本特開平4-352724號公報的序列49和序列15)的回文序列TGCCGATCGGCA的外側兩末端或只在5'末端一側插入了含有硫代磷酸酯修飾的polyG序列的寡核苷酸。對于Mod2(SEQIDNO.l)和Mod33(SEQIDN0.5),在國際公開2006/035939號說明書中顯示其具有IFN誘導活性。含有這些序列的寡核苦酸中，篩選具有人PBMC中的IFN-a和IFN-y生成誘導活性的序列(圖1-1-圖1-6，表2)。IFN-a和IFN-y誘導活性的評《介是4安照評價人PBMC中的IFN-a和IFN-y體外誘導活性實驗的具體方法中給出的順序和條件，根據分別刺激24小時和7天的培養上清中的生成量進行評價。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表2所表示的IFN生成量是免疫刺激寡核苷酸的濃度為100nM(終濃度)下的值。圖和表中的序列中的小寫字母表示硫代磷酸酯修飾的堿基。圖1-1和圖l畫2是Mod2(SEQIDN0.1,泳道2)、Mod52(SEQIDN0.2,泳道3)、Mod51(SEQIDN0.3,泳道4)、Mod42(SEQIDN0.4,泳道5)、Mod53(SEQIDN0.6,泳道6)、Mod54(SEQIDN0.7,泳道7)、Mod56(SEQIDNO.8,泳道8)、Mod40(SEQIDNO.9,泳道9)和Mod55(SEQIDNO.IO，泳道10)在寡核普酸濃度為100nM(終濃度)時IFN-a生成量，以及該濃度為300nM(終濃度)時IFN-y生成量的結果。關于IFN-a誘導活性(表2和圖1-1),在3'末端的polyG序列有3個堿基(N二3)的組(圖1-1，泳道3-7)中，5'末端具有6個堿基以上(M為7以上)的polyG序列的組的活性高(泳道6和7)。在3'末端的polyG序列具有2個堿基(N-2)的組(泳道8-10)中，5'末端具有6個堿基以上的polyG序列的活性高(泳道9、10)。并且，與具有典型的D型CpG序列的結構(]VH2/N-6,泳道2)的Mod2比較，Mod52(M=3/N=3,泳道3)、Mod51(M=4/N=3，泳道4)和Mod42(M=5/N=3,泳道5)的活性減弱或完全消失，由此表明，僅憑設計為使Mod2的polyG序列中4-6個數目的堿基變換的序列，未必可以得到具有增強的IFN-a誘導活性的寡核普酸。對于IFN-丫誘導活性(圖1-2),除Mod56(SEQIDN0.8,M=5/N=2,泳道8)之外均有同樣的傾向。特別是Mod53(M-7/N二3，泳道6)、Mod54(M=8/N=3，泳道7)和Mod55(M=7/N=2,泳道10)的IFN-y誘導活性比3'末端的polyG序列長度為6個堿基的Mod2顯著提高(t檢測PO.Ol)。該結果顯示，寡核普酸的IFN誘導活性與5'末端一側相關，至少6個堿基以上長度的polyG序列是必須的。接著，為了明確5'末端的polyG序列的長度與IFN誘導活性的相關性，對于將最多20個堿基的polyG序列插入到5'末端所得的寡核苷酸進行IFN誘導活性評價(圖1-3和圖1-4)。圖1-3和圖1-4分別表示Mod2(泳道1)、Mod61(SEQIDNO.15,泳道2)、Mod62(SEQIDN0.16，泳道3)、Mod63(SEQIDNO.17,泳道4)、Mod64(SEQIDNO.18,泳道5)、Mod65(SEQIDN0.19，泳道6)和Mod66(SEQIDNO.20,泳道7)在寡核普酸濃度為300nM(終濃度)時的IFN-a生成量和IFN-y生成量。結果，在濃度300nM下，具有最多8個堿基的polyG序列的IFN-a誘導活性顯著提高(圖1-3,M=6-8/N=0，泳道2-4),具有10個堿基的polyG序列的寡核苷酸(M-10/N二0)顯示比Mod2稍高的活性(圖1-3,泳道5)。而12個堿基以上(M42或20/N=0),則活性幾乎消失(泳道6、7)。IFN-y誘導活性與IFN-a誘導活性同樣傾向，但polyG序列即使為(圖l國4,泳道1、6、;)。"、'、5又對3'末端的polyG序列的堿基數與IFN誘導活性的相關性進行了評價。圖1-5以及圖l-6分別表示Mod2(泳道2)、Mod50(SEQIDNO.14,泳道3)、Mod49(SEQIDN0.13,泳道4)、Mod40(泳道5)、Mod41(SEQIDNO.ll,泳道6)在寡核苷酸濃度為100nM(終濃度)時的IFN-a生成量和該濃度為300nM(終濃度)時的IFN-y生成量。使5'末端的polyG序列的長度為2個堿基(Mod2:M=2/N=6,泳道2)-6個堿基(Mod50:M=6/N=6,泳道3),則IFN-a和IFN國y的生成量與Mod55(M=7/N=2,參照圖1-1和圖1-2的泳道10)同程度增力口(表2,圖1-5和1-6)。顯示5'末端具有6個堿基的polyG序列的寡核普酸(Iv^6/N-0-6)的IFN-a誘導活性與3'末端一側的polyG序列的長度有相關傾向，但是不會完全消失，超過Mod2(圖1-5,泳道3-6)。各寡核苦酸的濃度300nM下的IFN-y誘導活性均超過Mod2(圖1-6,泳道2-6)。由以上結果確認，5'末端一側的polyG序列的堿基數(M)為6-10、優選6-8時，3'末端一側即使是完全沒有polyG序列不的寡核普酸(M=6-8/N=0),序列更為增強的IFN誘導活性，實施例2:小鼠J774細胞中免疫刺激寡核普酸的炎癥性細胞因子誘導活性所必須的3'末端側polyG序列的堿基數的比較對于在5'末端一側插入長度為6個堿基的polyG序列的免疫刺激寡核苦酸，確認其是否誘導上述J774細胞的IL-12p40的生成的方法是進行體外誘導評價實驗。即，將J774細胞林用各寡核苦酸刺激48小時，評價培養上清中的炎癥性細胞因子IL-12(IL-12p40)的生成量。結果，(Mod50(泳道2)、Mod49(SEQIDN0.13,泳道3)、Mod48(SEQIDNO.12,泳道4)、Mod33(SEQIDNO.5,泳道5)、Mod40(泳道6)、Mod41(泳道7))在各終濃度300nM下的IL-12p40的生成受3'末端一側的polyG序列的堿基數為4以上(14=6^=4-6:泳道2-4)的寡核苷酸誘導，3個堿基以下(N^6/N^-3:泳道5-7)完全未見活性(圖2)。由以上結果可以確認，3'末端一側的polyG序列為3個堿基以下的寡核苦酸即使在5'末端一側有6個堿基的polyG序列插入，其炎癥性細胞因子誘導活性也降低或消失。實施例3:含具有CGATCG、ATCGAT和GACGTC的序列作為回文基序的本發明的刺激寡核苷酸等以及D型CpG寡核苷酸誘導人PBMC中IFN生成的效果的比較在式5'-(G)mPXCGYQ(G)n-3'的P為T(胸腺嘧啶)、Q為A(腺嘌呤)、XCGY為IO個堿基的6種回文基序中，各polyG序列插入到5'末端一側6個堿基、插入到3'末端一側3個堿基，合成本發明的免疫刺激寡核苦酸(G6-PXCGYQ-G3，M=6/N=3);以及polyG序列插入到5'末端一側2個堿基、插入到3'末端一側6個堿基，合成D型CpG(D型CpG:G2-PXCGYQ-G6,M=2/N=6),評價在人的PBMC中IFN誘導活性。各寡核苷酸的回文基序在序列表、圖3-1、3-2和3-3中表示，Mod29(SEQIDN0.21)和Mod43(SEQIDN0.22)為泳道1的CCCGATCGGG,Mod37(SEQIDN0.23)和Mod44(SEQIDN0.24)為泳道2的TCCGATCGGA,Mod38(SEQIDN0.25)和Mod45(SEQIDN0.26)為泳道2的GGCGATCGCC,Mod39(SEQIDN0.27)和Mod46(SEQIDN0.28)為泳道4的GACGATCGTC,D19(SEQIDN0.29)和Mod47(SEQIDNO.30)為泳道5的GCATCGATGC。人PBMC的IFN誘導活性的評價除使用上述寡核普酸之外，按照與實施例1同樣的順序和條件進行。對濃度100nM下的D型CpG和本發明的免疫刺激寡核普酸等的活性進行測定的結果顯示，在所評價的全部回文基序中，本發明的免疫刺激寡核苷酸(圖3-1,G6-PXCGYQ-G3)的IFN-a的誘導活性比D型CpG(G2-PXCGYQ-G6)亢進，在D型CpG在1.4-74.5倍的范圍內增強。另外，對于上述寡核苷酸濃度100nM下的IFN-y生成誘導活性也顯示與IFN-a同樣的傾向(圖3-2)。進一步對上式中的P為A(腺嘌呤)、Q為C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)，含有8個堿基的回文基序CGACGTCG的兩種本發明的免疫刺激寡核普酸和D型CpG對人PBMC中的IFN-a的誘導活性進行評價。結果，本發明的免疫刺激寡核苷酸的Mod71(SEQIDNO.40,M=7/N=2)和Mod73(SEQIDN0.42,M二6/TSH2)在濃度300nM下，其活性分別比D型CpG序歹'JMod70(SEQIDN0.39,M:3/N二6)和Mod72(SEQIDNO.41,M二2/N-6)顯著增強(圖3-3)。這些結果顯示，本發明的新型免疫刺激寡核苷酸所具有的polyG序列的插入方式與特定的回文結構非依賴性地使IFN誘導活性增強。實施例4:具有CGATCG作為基序的本發明的免疫刺激寡核苷酸對于人PBMC中的IFN-a生成誘導的效果對于本發明的免疫刺激寡核苷酸的最佳序列進行研究。進一步對M=7且N=2、XCGY為GACGATCGTC的本發明的免疫刺激寡核普酸的P和Q進行研究。合成P為A(腺噤呤)且Q為T(胸腺嘧啶)的寡核苦酸(Mod83,SEQIDN0.51)、P為T且Q為A的寡核香酸(Mod84,SEQIDN0.48)、P和Q均為A的寡核香酸(Mod85,SEQIDNO,50)、P為C且Q為A的寡核苷酸(Mod87,SEQIDN0.52)。對于在實施例3中發現的、在本發明的免疫刺激寡核苷酸中具有特別強的IFN誘導活性的Mod46和這些寡核苦酸對人PBMC中的IFN-a的誘導活性進行比較評價。人PBMC中的IFN誘導活性的評價是使用上述寡核苷酸、以及只測定IFN-a,除此之外按照與實施例1同樣的順序和條件進行。結果，在寡核苷酸的濃度100nM下，Mod83、Mod84、Mod85和Mod87顯示與Mod46相同程度的IFN-a誘導活性(圖4)。結果顯示，本發明的免疫刺激寡核苷酸的P和Q可以是G以外的堿基，即，可以是A、T和C的任意一種，即使不是互補的核苷酸也具有強的IFN-a誘導活性。實施例5:本發明的免疫刺激寡核苷酸與G9-GACGATCGTC-G1以及G7-GACGATCGTC-G3對人PBMC的IFN誘導活性的比較對本發明的免疫刺激寡核苷酸和日本特開2005-237328號公報中以具有強烈的IFN-a誘導活性的序列表示的寡核苷酸序列G9-GACGATCGTC畫G1(SEQIDN0.36)和G7陽GACGATCGTC國G3(SEQIDN0.98)對人PBMC中的IFN誘導活性進行比凈支。合成具有與G9-GACGATCGTC-G1以及G7-GACGATCGTC-G3最近似的序列、未經硫代磷酸酯修飾的本發明的免疫刺激寡核香酸Mod92(SEQIDN0.97)和Mod93(SEQIDN0.95),比較人PBMC中的IFN-a誘導活性(表3和表4)。人PBMC中的IFN誘導活性的評價除使用上述寡核苦酸之外，其余均按照與實施例1同樣的順序和條件進行。結果，Mod92和Mod93顯示比G7-GACGATCGTC-G3和G9-GACGATCGTC-G1高的IFN-a誘導活性。表3.由人PBMC生成IFN國aCpG序列5'-一3'IFN-a(pg/mL)M。d92GGGGGGTGACGATCGTGGGG3263.3±424.5G7-GACGATCGTC-G3GGGGGGGGAGGATCGTCGGG2515.1±307.0表3所示的IFN生成量是免疫刺激寡核苷酸的濃度為100nM(終濃度)下的值。各寡核苷酸均不使用硫代磷酸酯修飾堿基。表4.由人PBMC生成IFN-ocCpG序列5'-一3'IFN-a(Pg/mL)Mod93GGGGGGGGGGACGATCGTCG2442.5±171.4G9-GACGATCGTG-G1GGGGGGGGGGACGATCGTCG684,0±277.9表4所示的IFN生成量是免疫刺激寡核苷酸的濃度為100nM(終濃度)下的值。各寡核苦酸均不使用硫代磷酸酯修飾堿基。由以上結果表明，本發明的免疫刺激寡核苦酸即使未進行硫代磷酸酯修飾也具有強的IFN-a誘導活性。還顯示了通式中的P和Q為G以外的堿基的重要性。因此，通過在GACGATCG等顯示優異的IFN-a誘導活性的回文序列和polyG序列之間插入至少一個堿基的核苷酸，可以使IFN-a誘導活性提高。實施例6:本發明的免疫刺激寡核香酸與G9-GACGATCGTC-G1和G7-GACGATCGTC-G3對人PBMC中的IL-12誘導活性的比較對實施例5中使用的本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod93和日本特開2005-237328號公報中所示的寡核普酸序列G9-GACGATCGTC-G1對人PBMC中的IL-12誘導活性進行比較。測定可按照上述的體外評價對PBMC中的IL-12的誘導活性試驗的具體方法進行。結果，本發明的Mod93完全未誘導IL-12的生成，反之與未刺激的對照相比也顯示了抑制的傾向(表5)。而G9-GACGATCGTC-G1較弱，但可見IL-12生成的增加。因此，本發明的免疫刺激寡核苷酸在人體中顯示炎癥性細胞因子誘導活性低。表5.由人PBMC生成IL-12<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表5所示的IL-12生成量是未刺激(不含CpG-ODN)或免疫刺激寡核苦酸的濃度為300nM(終濃度)下的值。各寡核苷酸均未使用硫代磷酸酯修飾堿基。免疫刺激寡核苷酸單獨刺激下，未見人末梢血細胞中顯著的IL-12的生成，因此，與強的炎癥反應誘導因子一內毒素的脂多糖(LPS)—起刺激，評價對IL-12生成的影響。即，將按照上述方法分離的PBMC用含有10%FCS的RPMI1640培養基制備成每1mL含有2.0><106個細胞，然后以每孔2.0><105個細胞接種于圓底96孔板，在LPS和免疫刺激寡核苷酸的共存下處置24小時，回收培養上清，通過ELISA法對IL-12的生成量進行定量。免疫刺激寡核苦酸使用Mod92、Mod93、G9-GACGATCGTC-G1和G7-GACGATCGTC-G3。結果，在任何免疫刺激寡核苷酸中，LPS(50ng/mL)刺激下誘導的IL-12生成并未增強。相反可見抑制其生成的效果，本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod93顯示了最強的抑制活性(表6)。[表6〗表6.LPS存在下CpG-ODN引起的由PBMC生成IL-12CpG序列5'-一3'IL-12(pg/mL)noGpG-ODN620.2±49.9Mod92GGGGGGTGACGATCGTCGGG535.6±44.9G7-GACGATCGTC-G3GGGGGGGGAGGATCGTGGGG569.0±14.3Mod93GGGGGGGGCGACGATCGTCG488.1±17.3G9-GACGATCGTC-G1GGGGGGGGGGACGATCGTCG584.8±46.6表6所示的IL-12生成量是在LPS存在下、未刺激(不含CpG-ODN)或免疫刺激寡核苷酸的濃度為100nM(終濃度)下的值。各寡核苷酸均未使用硫代磷酸酯修飾堿基。以上結果可以確認，在人體中，本發明的免疫刺激寡核苷酸的炎癥性細胞因子誘導活性比公知的序列小、且具有抗炎癥作用。實施例7:本發明的免疫刺激寡核香酸與M26、M27、M26-GS、M27-GS、II、2006、2395、1018、C274、G9-GACGATCGTC-G1和D19對人PBMC的IFN誘導活性的比較對KR2001-0063153(大韓民國公開專利)中所示的寡核普酸序列M26(SEQIDN0.37)和M27(SEQIDN0.38)與各polyG序列的核苷酸之間用疏代磷酸酯修飾得到的M26-GS以及M27-GS、實施例1和3中發現的本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod55和Mod46的IFN-a誘導活性進行比較評價。本實施例5中的人PBMC中的IFN誘導活性評價除使用上述寡核苷酸、以及只測定IFN-a之外，均按照與實施例1同樣的順序和條件進行。結果，寡核苷酸濃度100nM下，本發明的免疫刺激寡核苷酸與其它寡核苷酸相比顯示顯著高的IFN-a誘導活性(圖5-1)。下面，對于日本特開2005-237328號公報中以具有強IFN-a誘導活性的代表性序列而給出的寡核苷酸序列G9-GACGATCGTC-G1(SEQIDN0.36)和在實施例1和3中發現的本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod53、Mod54、Mod55、Mod61、Mod62、Mod45、Mod46、Mod71和Mod73的IFN-a誘導活性進行比較評價，結果，顯本發明的免疫刺激寡核普酸在濃度1pM下顯示高的IFN-a誘導活性(圖5-2)。對于日本特表平10-506265號公報中所示的寡核苷酸序列11、和實施例3中發現的本發明的免疫刺激寡核普酸Mod46、以及與Mod46具有相同回文序列的D型CpG的Mod39、Mod33的IFN-ai秀導活性進行比較評價，結果，本發明的免疫刺激寡核普酸在濃度30nM下顯示顯著高的IFN-a誘導活性，而其它寡核苷酸幾乎不顯示活性(圖5-3)。對國際公開第00/61151號說明書中所示的寡核苷酸序列(D19)、曰本特表2001-503267號公報和國際公開第1998/018810號說明書中公開的寡核苷酸序列(2006)、國際公開笫03/015711號說明書中公開的寡核苷酸序列(2395)、日本特表2002-517156號公報以及日本特表2002-500159號公報中所示的寡核苷酸序列(1018)、以及國際公開第04/058179號說明書中所示的寡核苷酸序列(C274)與本發明的免疫刺激寡核苦酸Mod46(SEQIDN0.28)的人PBMC的IFN-a誘導活性進行比較。結果，寡核苷酸濃度100nM下，本發明的免疫刺激寡核苷酸具有最強的IFN-a誘導活性(圖5-4)。以上結果可知，本發明的免疫刺激寡核普酸比具有公知的CpG序列的免疫刺激寡核苦酸均顯示高的IFN-a誘導活性。實施例8:具有polyG序列和回文序列GACGATCGTC的本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod46、Mod83、Mod85、Mod87和公知的CpG寡核苦酸G10、G3-6、G9國GACGATCGTC-G1、G1隱GACGATCGTC-G9和2332的人PBMC中的IFN-a誘導活性的比較在回文序列GACGATCGTC的外側插入polyG序列所得的公知的CpG寡核苷酸有日本特開2005-237328號公報中公開的寡核苷酸序列G9畫GACGATCGTC-G1(SEQIDN0.36)和G1畫GACGATCGTC誦G9(SEQIDN0.55)、國際公開第2005/014110號說明書中公開的寡核苷酸序列G10(SEQIDN0.56)和G3-6(SEQIDNO,57)、日本特表2003-510290號公報中公開的寡核苷酸2332(SEQIDN0.58)。這里，對本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod46、Mod83、Mod85和Mod87對公知的CpG寡核苷酸的IFN-a誘導活性進行比較評價。對于人PBMC的IFN的誘導活性的評價除使用上述寡核普酸、以及只測定IFN-a之外，與實施例1按照同樣的順序和條件進行。結果，本發明的免疫刺激寡核苷酸在寡核苷酸濃度30nM下顯示高的IFN-a誘導活性(圖6)。實施例9:免疫刺激寡核苦酸Mod2、Mod33、Mod39和Mod46對小鼠脾臟細胞中細胞因子生成的誘導活性的比較使用來自C57BL/6系統的小鼠脾細胞，對于實施例1和3中所發明的免疫刺激寡核苷酸Mod46和Mod33、作為D型CpG的Mod39和Mod2之間進行細胞因子誘導活性比較評價。測定濃度100nM下的D型CpG和本發明的免疫刺激寡核苷酸對IFN-y和IL-10的誘導活性。測定是按照上述的確認小鼠脾細胞中是否誘導IFN-y和IL-10生成的具體方法中例舉的順序和條件進行。結果，本發明的免疫刺激寡核普酸Mod46對IFN-y的諸導活性比回文基序相同的D型CpG—Mod39增強，比Mod33有較大提高(圖7-1)。而Mod33和Mod46的IL-10誘導活性分別與Mod2或Mod39的誘導活性大致同等(圖7-2)。顯示免疫刺激寡核苷酸對免疫調節性細胞因子IL-10的誘導與對炎癥性細胞因子的誘導的機理可能不同。以上結果顯示，本發明的新型免疫刺激寡核苷酸在保持IL-10誘導活性的狀態下使回文基序非依賴性的IFN誘導活性增強。另外，免疫刺激活性根據CpG序列的不同而具有種特異性，但本發明的免疫刺激寡核苷酸并不受這些種差異的影響，是可以使IFN誘導活性增強的普遍性結構。實施例10:本發明的新型免疫刺激寡核苷酸對J774細胞抹中的炎癥性細胞因子的生成誘導活性的降低對于實施例3中發現的本發明的免疫刺激寡核普酸對炎癥性細胞因子生成的誘導活性，是與回文基序相同的D型CpG進行比較評價。各寡核苦酸的回文基序如序列表和圖8-1和8-2中所示，Mod37和Mod44是泳道1的TCCGATCGGA,Mod38和Mod45是泳道2的GGCGATCGCC,Mod39和Mod46是泳道3的GACGATCGTC。評價是按照上述評價小鼠J774細胞中IL-12和TNF-a誘導活性的實驗中例舉的順序和條件進行。結果，本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod44、Mod45和Mod46分別與具有相同回文序列的D型CpG—Mod37、Mod38和Mod39比較，在濃度300nM下,IL-12(圖8-l)和TNF-a(圖8-2)的誘導活性均顯著受到抑制。以上的結果顯示，本發明所發明的具有polyG序列插入式樣的新型免疫刺激寡核苷酸比含有相同回文基序的以往的D型CpG顯示更低的炎癥性細胞因子誘導活性。實施例11:本發明的免疫刺激寡核苷酸與2006、2395、1018和C274對J774細胞抹中TNF-a的誘導活性的比較對實施例8中發現的本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod46和公知的CpG寡核苷酸的TNF-a誘導活性進行評價。分別將各免疫刺激寡核苷酸以(終濃度300nM)或陽性對照脂多糖(LPS:終濃度100ng/mL)對J774細胞林刺激處置8小時，測定培養上清中TNF-a生成量。其它的順序和條件與實施例io同樣。結果，實施例4中所示的寡核苷酸序列2006(SEQIDN0.31)、2395(SEQIDN0.32)、1018(SEQIDN0.33)、C274(SEQIDN0.34)和Mod39與LPS相比，Mod46顯示減弱的TNF-a誘導活性(圖9)。由此，結合考慮實施例2和6所示的結果，顯示3'末端的癥性細胞因子誘;活性減弱,、、'、U,一、、、:實施例12:本發明的免疫刺激寡核苦酸Mod87和Mod39和1018對人PBMC中IgE生成的抑制活性的比較按照上述評價體外IgE生成抑制活性的實驗的具體方法所示的順序和條件，根據刺激14天后培養上清中的生成量，對實施例8中發現的本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87和公知的CpG寡核苷酸對人IgE生成的抑制活性進行評價。即，將PBMC用含有10%FCS的RPMI1640培養基制備成1mL中含有4.0xl()6個纟田胞，然后以每孔4.0"05個細胞接種到平底96孔板中，與20ng/mL人IL-4和0.2pg/mL的抗CD40抗體一起添加免疫刺激寡核苷酸，使終濃度為30或100nM,然后刺激14天，通過ELISA法測定培養上清中IgE的生成量(圖10)。結果，對于由IL-4和抗CD40抗體所誘導的IgE的生成，本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(圖10的泳道5)與國際公開2006/035939說明書中所示的Mod2(圖10的泳道3)、Mod39(泳道4)、日本特表2002-500159號公報中公開的1018(泳道6)或國際公開第03/015711號說明書中公開的2395(泳道6)相比，IgE的生成量低。以上結果顯示，本發明的免疫刺激寡核苷酸比具有公知的CpG序列的免疫刺激寡核苷酸具有高的IgE生成抑制活性，顯示對人的變應反應治療有效的可能性。實施例13:本發明的免疫刺激寡核苷酸對變應性疾病模型動物的IgE生成抑制效果的確認對于實施例12中顯示顯著的人IgE抑制活性的本發明的免疫刺激寡核普酸Mod87的變應反應治療效果，以在小鼠中誘發變應原特異性的Th2反應時所誘導的血清中的IgE的量作為指標進行評價。變應原使用已知為杉樹花粉癥的變應原一種的杉樹花粉抗原Cryj1。Cryjl的純化可按照公知的方法(H.Yasueda等人.(1983)J.AllcrgcyClin.Immunol.,71,77-86;M.Sakaguchi等人.(1990),45,309畫312)進行。在曰本特表2002-517156號公報中公開了作為提高變應反應治療效果的方法，使抗原與免疫刺激寡核香酸接近的方法。具體來說有使用共價鍵或脂質體等微膠嚢的方法，在國際公開第2006/035939號說明書中報道了包埋Mod2和Cryjl的脂質體復合體抑制暴露于變應原中時所誘導的小鼠血液中IgE。對于該IgE的抑制效果，已確認比公知的具有CpG序列的寡核香酸強。因此，采用通過脂質體與其接近的技術，通過上述實驗方法評價Mod87和Mod2的變應反應治療效果。包埋有Cryjl和免疫刺激寡核苷酸的脂質體復合物體的制備如下進行。作為陰性對照，制備未包埋免疫刺激寡核苷酸的Cryjl脂質體復合體。將膽甾醇與二棕櫚酰磷酰膽堿(DPPC)按照摩爾比1:1混合，溶解于氯仿:曱醇(=2:1)溶液中，在茄形燒瓶內制備脂類膜。接著，向脂類膜中加入混合3.75mg/mL的Cryjl或Cryjl與10-20的免疫刺激寡核苷酸的混合液，在40。C下攪拌，制備脂質體。Mod87的包埋量為1條件(lxMod87),Mod2按照與Mod87相同濃度(lxMod2)和3倍濃度(3xMod2)的2條件制備。對這些脂質體，用整粒裝置擠出機，邊在0.2-1MPa的范圍內對l|im的濾器加壓邊進行5次整粒。接著通過離心法回收脂質體液，在PBS(-)中懸浮、離心、除去上清3次，由此除去脂質體外側的Cry_jl和免疫刺激寡核普酸。所得脂質體的分析是通過市售的試劑盒、膽甾醇E尹只卜>73—(和光純藥，439-17501)、ModifiedLowryProteinAssayReagentKit(Pierce,23240)、OliGreenssDNAQuantitationKit(分子探針，O-l1492)分別進行膽甾醇量、Cryj1、免疫刺激寡核苷酸的測定。脂質體液中，每lpgCryjl中，lxMod87、lxMod2和3xMod2的量分別為4.751、5.425和16.867ng。以下的實施例中所示的脂質體復合體的簡稱如下。"Cryjl+lxMod2/L"是指在Cryjl和lxMod2的條件下包埋的脂質體復合體，"Cryjl+3xMod2/L，，是指在Cryjl和3xMod2的條件下包埋的脂質體復合體，"Cryjl+lxMod87/L"是指在Cryjl和lxMod87的條件下包埋的脂質體復合體。"lx的情形"表示每1iugCryjl中含有約5ng免疫刺激寡核苷酸。"3x的情形"表示每1嗎Cryjl中含有lx的3倍量約15ng免疫刺激寡核苷酸。"Cryj1/L"是指只將Cryj1包埋入脂質體中。"Cryjl"是指不包埋到脂質體中而只接給予Cryj1。對于6周齡的BALB/c小鼠(日本^弋一/k乂》J)以1周的間隔給予各供試物質，以開始給予供試物質的周為0W,在0、1和2W三次進行皮內給予(i.d.)。供試物質是將Cryj1、Cryj1/L、Cryj1+1xMod2/L、Cryjl+3xMod2/L以及Cryjl+lxMod87/L用PBS制備成Cryjl蛋白量為1|ng/100^L,每次各給予100^L。最后的供試物質處置1周后(3W)和2周后(4W)分兩次對于各固體腹腔內給予(i.p.)Cryjl和明礬混合液，誘發Th2反應。在6W時進行眼底采血，將血液進行離心操作，以血清的形式在-20。C下冷凍保存。所得血清用作作為Th2反應指標的血清中總IgE量的測定樣品。最后采血后，由各個體中摘出脾臟，摘取各個體的脾臟，勻漿，按照本說明書中確認是否誘導IFN-y和IL-lO生成的具體方法中所述的制備方法，制備脾細胞(RPMI1640培養基，10%胎牛血清)。各個體的脾細胞懸浮液是以每孔4xl05個細胞接種于圓底96孔板中，在Cryjl存在下(終濃度25pg/mL),在。02培養箱內進行72小時培養，回收培養上清。回收的培養上清中的IL-5(Th2反應指標)和IFN-y(Thl反應指標)通過ELISA法測定。測定6W時的血清中IgE的量，結果，Cryjl處置組的IgE的量比載體給予組顯示2倍以上的高值。IgE的量中，Cryjl+lxMod87/L處置組最低，Cryjl+3xMod2/L、Cryjl/L、Cryjl+lxMod2/L依次顯示低值(圖11)。Cryjl+lxMod2/L給予組和Cryjl+lxMod87/L給予組兩組間進行統計處理(t檢測)的結果顯示，IgE的生成量中，Cryjl+lxMod87/L顯著(pO.05)低。接著，為了確認供試物質對處置的小鼠的Th2反應或Thl反應的誘導，從小鼠中摘取脾臟，用Cryjl刺激，測定培養上清中誘導的脾細胞的IL-5(Th2反應指標)和IFN-y的生成量(圖12-1)。測定作為Thl反應指標的IFN-y的生成量，結果，Cryjl+lxMod87/L(14324.62pg±7444.07)處置組最高，接著按照Cryjl+3xMod2/L(3475.30pg土卯7.56)和Cryjl+L(1782.02pg土849.23)順序，生成量依次增加。另外，給予與Cryjl+lxMod87/L同樣量免疫刺激寡核苷酸，在Cryjl+3xMod2/L處置組中幾乎未見生成。接著測定IL-5的生成量。結果，Cryjl/L完全未抑制IL-5的生成，但是通過添加免疫刺激寡核苷酸則顯著減少。Cryjl+lxMod87/L給予組的抑制活性最強。包埋有CpG寡核苷酸和Cryjl的脂質體復合物對IL-5的抑制活性與IFN-y誘導活性逆相關，與IgE生成抑制活性良好相關。Cryjl+lxMod2/L給予組和Cryjl+lxMod87/L給予組兩組間進行統計處理(t沖企測)，結果IL-5的生成量在Cryjl+l><Mod87/L組中顯著(PO.05)低(圖12-2)。由此表明，包埋本發明的免疫刺激寡核苷酸和變應原的脂質體與公知的免疫刺激寡核苷酸和變應原的脂質體包埋變應原的技術比較，具有強烈抑制暴露于變應原中時的Th2反應和IgE生成的效果，可強烈誘導Thl誘導活性。以上結果顯示，本發明的免疫刺激寡核普酸在使用動物的過敏模型中，比/>知的D型CpG寡核普酸的IgE生成抑制活性、Th2抑制活性和Thl誘導活性提高，且低用量具有有效的治療效果，因此給予具有過敏性疾病的患者時，可用作過敏性疾病的治療或預防藥。實施例14:本發明的免疫刺激寡核苷酸對小鼠肝炎的治療效果使用通常作為小鼠的肝炎模型而利用的伴刀豆凝集素A(ConA)誘發肝炎模型，對本發明的免疫刺激寡核苷酸的體內抗炎癥效果進行評價。ConA誘發肝炎模型是由于引發劇烈的炎癥反應來使肝炎發病，作為伴隨有免疫反應活化的肝炎模型使用。另外，在ConA誘發肝炎模型中，在評價CpG寡核普酸的實驗中(Abe等人，FukushimaJ.Med.Sd.(2005)51，41-49)中，有K型的CpG—1688(SEQIDNO.108)顯示反而使肝炎的癥狀惡化的結果的公知例。另外，并未見到含有CpG的免疫刺激寡核苷酸在ConA誘發肝炎模型中可以抑制肝炎標志ALT值升高的報道。ConA誘發小鼠肝炎模型的制備和血清中ALT值的測定如下進行。使用5周齡的雌性BALB/c小鼠(日本f弋一^乂卩^一)。對于給予ConA的小鼠是在給予前一天的傍晚開始至給予ConA完成期間使其斷食，在給予ConA結束后重新給斜。未給予ConA的組為原態組。免疫刺激寡核苷酸是在給予ConA3、6、24小時之前進行一次給予。免疫刺激寡核苷酸用PBS(-)調節為濃度10|ug/mL,然后以各100注射到小鼠尾靜脈內。每只給予1|ig。ConA使用生理鹽水作為溶劑，制備成濃度4mg/mL,然后以各100給予小鼠尾靜脈內。每只給予0.4mg。給予ConA24小時后采血，將所得血液以10000rpm、在4。C下離心5分鐘，得到血清。血清中的ALT值用7^K"，4y厶(DRI-CHEM5500V,富士74A厶)測定。ConA誘發肝炎小鼠模型自誘發炎癥24小時后評價血清中ALT值的升高，結果(圖13)可見，本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(SEQIDN0.52)與處置時間相關，抑制血清中ALT值的升高(圖13，泳道3-5)。提前3小時處置后即可見抑制ALT值升高的傾向(泳道5),24小時前處置，則血清中ALT值顯著降低(泳道3),為載體組中ALT值(泳道2)的28.5Q/o(t檢測p<0.05)。以上結果確認，本發明的免疫刺激寡核苦酸在體內具有肝炎治療效果。實施例15:本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87和2395、1018以及G9-GACCGATCGTC-G1對于小鼠的肝炎治療效果的比較對于與適用于丙型慢性肝炎并與臨床實驗中的CpG10101為同一序列、國際公開笫03/015711號說明書和日本特表2006-515277號公報中公開的寡核香酸序列(2395,SEQIDN0.32)、日本特表2003-526662號公報中公開的寡核苷酸序列(1018,SEQIDN0.33)、以及日本特開2005-237328號公報中作為具有強的IFN-a誘導活性的代表性序列所公開的寡核苷酸序列G9-GACCGATCGTC-G1(SEQIDN0.36)、本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(SEQIDN0.52),進行使用小鼠ConA誘發肝炎模型的肝炎治療效果比較。按照實施例14所示的方法，以抑制血清中ALT值的升高為指標，評價免疫刺激寡核苷酸的肝炎治療效果。首先對Mod87和2395的肝炎治療效果進行比較評價。給予ConA6小時之前，將lpg免疫刺激寡核苷酸對小鼠進行處置，在ConA引發炎癥24小時后采血，測定血清中ALT值。結果，本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(圖14-1,泳道3)顯著抑制了ALT值的升高(t檢測p<0.05),而2395(泳道4)完全沒有效果。接著，對Mod87和1018以及G9-GACGATCGTC-G1的肝炎治療效果進行比較評價。在給予ConA24小時之前.將1嗎免疫刺激寡核苷酸對小鼠進行處置，在ConA引發炎癥24小時后采血，測定血清中ALT值。結果，ALT值的升高被本發明的免疫刺激寡核苷酸Mod87(圖14-2,泳道3)最強烈抑制，接著是按照1018(圖14-2,泳道4)和G9-GACGATCGTC-G1(圖14-2，泳道5)的順序依次具有抑制效果。Mod87和1018分別顯著抑制ALT值的升高(t檢測,:Mod87:p<0.01,1018:p<0.05),但G9-GACGATCGTC-G1并未見顯著抑制。由此確認，本發明的免疫刺激寡核苦酸比含有CpG的公知的免疫刺激寡核苷酸顯示更強的肝炎治療效果。實施例6中的使用人PBMC的體外比較實驗中可知，本發明的免疫刺激寡核苷酸顯示比近似序列的抑制IL-12生成的活性強，顯示體外的抗炎癥作用與小鼠肝炎的治療效果存在相關可能性。以上結果表明，本發明的免疫刺激寡核苷酸具有優異的干擾素誘導活性且較低的炎癥性細胞因子誘導活性，并且具有肝炎治療作用，權利要求1.免疫刺激寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸含有式5′-(G)MPXCGYQ(G)N-3′所示的堿基序列，式中，C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤，X和Y是以各自獨立的0-10個核苷酸長度、且不含有4個堿基以上連續的鳥嘌呤的任意的序列，X+Y的長度為6-20個核苷酸長度，XCGY含有長度至少為8個核苷酸長度的回文序列，是長度為8-22的核苷酸長度；P和Q是除鳥嘌呤以外的互相獨立的單一核苷酸，M為6-10的整數，N為0-3的整數，X和Y的核苷酸長度未必相同；該寡核苷酸的全長為16-37個核苷酸長度，但含有SEQIDNO.5的堿基序列(GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG)的序列除外。2.權利要求1所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述M是6-8的整數，且全長為16-35個核苷酸長度。3.權利要求1或2所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY的長度是9或10個核苷酸長度，且全長為17-23個核苷酸長度。4.權利要求1-3中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上述XCGY含有選自CGATCG(SEQIDN0.59)、ATCGAT(SEQIDNO.60)和GACGTC(SEQIDN0.61)中任一項的堿基序列。5.權利要求1-3中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，上迷XCGY含有CGATCG(SEQIDNO,59)。6.權利要求4或5所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上迷CGATCG(SEQIDN0.59)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQIDN0.6、7、9誦11以及15-18、22、24、26、28、48、50-52、54、95和97所示的石咸基序列。7.權利要求4所述的免疫剌激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQIDNO.60)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQIDNO.30所示的堿基序列。8.權利要求4所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，含有上述CGATCG(SEQIDN0.61)的免疫刺激寡核苷酸含有SEQIDNO.40和42所示的》咸基序列。9.權利要求4或5所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，該寡核苷酸含有SEQIDN0.6、7、10以及15-17、24、26、28、48、50-52、95和97所示的;威基序列。10.權利要求1-9中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，所有或部分核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵進行了硫代磷酸酯修飾。11.權利要求IO所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，5'-末端的連續G序列的核苷酸殘基之間至少一部分磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。12.權利要求10或11所述的免疫刺激寡核苷酸，其中，3'-末端的核苷酸殘基之間至少一部分磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。13.藥物，該藥物含有權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為有效成分。14.過敏性疾病的治療或預防藥，該藥物含有權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為有效成分。15.權利要求14所述的過敏性疾病的治療或預防藥，其中，上述過敏性疾病是花粉過敏癥。16.疫苗，該疫苗含有權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為佐劑。17.肝炎的治療或預防藥，該藥物含有權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為有效成分。18.權利要求17所述的肝炎的治療或預防藥，其中，上述肝炎是病毒性肝炎。19.權利要求18所述的肝炎的治療或預防藥，其中，上述病毒性肝炎是乙型或丙型肝炎。20.權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為過敏性疾病的治療或預防藥的應用。21.權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為疫苗佐劑的應用。22.權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為肝炎的治療或預防藥的應用。23.權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸對過敏性疾病的治療或預防的方法。24.利用權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸作為疫苗的佐劑的方法。25.權利要求1-12中任一項所述的免疫刺激寡核苷酸對肝炎的治療或預防的方法。全文摘要本發明提供IFN誘導活性增強、且炎癥性細胞因子誘導活性降低的新型免疫刺激寡核苷酸以及含有該寡核苷酸的藥物及其用途。即，本發明提供免疫刺激寡核苷酸及其藥物用途，其特征在于該免疫刺激寡核苷酸含有式5′-(G)_MPXCGYQ(G)_N-3′所示的堿基序列(X和Y各自獨立，為0-10個核苷酸長，且不含有4個堿基或以上的連續的G的任意序列，X+Y的長度為6-20個核苷酸長，XCGY至少含有8個核苷酸長度的回文序列，長度為8-22個核苷酸長；P和Q為G以外的各自獨立的一個核苷酸，M為6-10的整數，N為0-3的整數)、全長為16-37個核苷酸長度(SEQIDNO.5的堿基序列除外)。文檔編號C12N15/00GK101460620SQ20078002009公開日2009年6月17日申請日期2007年5月31日優先權日2006年5月31日發明者審良靜男,巖村智勝,成見英樹,曾根田明子,益本創,金田明仁申請人:東麗株式會社;國立大學法人大阪大學