專利名稱：：普伐他汀的生產的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于生產普伐他汀的一步發酵工藝。
背景技術：
：膽固醇和其它脂質在體液中由低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)轉運。執行降低LDL-膽固醇機制的物質可以作為有效的抗高膽固醇藥劑，因為LDL水平與冠心病風險正相關。抑制素類的降膽固醇劑是醫學上非常重要的藥物，因為它們通過抑制HMG-CoA還原酶降低血中的膽固醇濃度。后一酶催化膽固醇生物合成中的限速步驟，即(35)-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)))到甲羥戊酸的轉化。市場上存在若干種類型的干擾素，其中阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羥酶素、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀。阿托伐他汀通過化學合成制造，而上文提到的其它干擾素或者通過直接發酵或者通過前體發酵生產。這些(前體)發酵通過尸em'"'〃z'wm、^s^e/^'〃^禾卩Afowosct^屬的真菌進行。普伐他汀(pravastatin)是通過兩個連續的發酵生產的。首先尸em'"7/z'MW生產制甲羥酶素，其內酯環被氫氧化鈉化學水解；隨后將其補充至5Vre;tom3;ce51ow^o/Az7ws培養物中，所述■6V印to附7cescaAw/7w將其羥基化為普伐他汀。使用不同的方法對生產這些代謝產物的工業物種和方法進行最優化。藉此將尸ew'cz7/zY/mc"n>wm的工業制甲羥酶素生產從原始的40mg/L提高至5g/L。對生物催化的轉化而言，Metkinen獲得了下述S^eptomj;cM突變體菌株，其對具有80%轉化率的3g/L美伐他汀具有抗性(MetkinenNewsMarch2000，Metkinen0y，Finland;reviewedbyManzoniandRollini，2002,ApplMicrobiolBiotechnol58:555—564)。盡管這是有活力的商業方法但是其遠非最優，因為與例如工業氨基酸或青霉素G效價相比，制甲羥酶素效價相對較低。另外，制甲羥酶素需4要被稀釋，否則其變得對生物轉化中使用的5^^tom;;c"菌株具有毒性(Hosobuchi"a/.,1983,JAntibiotics36:887-891)，有并且20%的制甲羥酶素補料不能被&/^ptom_ycM菌株轉化。作為上述問題的解決方案，若干份出版物描述了用于普伐他汀的一步發酵工藝(WO99/10499、US6,274,360和EP1,266,967)。然而，作為本發明的部分，我們將展示出解決該問題的所有這些建議是無效的并且需要解決額外的問題，即制甲羥酶素到普伐他汀的細胞內轉化。WO99/10499描述了裝備有編碼p450酶的^^/:tom少c^c^^o//n7w基因的重組體尸em'cz加wmc//n'"wm菌株。而本文中顯示，根據WO99/10499構建的菌株不生產普伐他汀，只生產制甲羥酶素。US6,274,360描述了能夠從A^m^^/wm物種中分離的酶體系，所述酶體系可以將制甲羥酶素轉化為普伐他汀，還提出在異源物種中使用該酶體系生產普伐他汀。然而，因為沒有提供蛋白質或DNA序列，所以不可能驗證這類權利要求。另外，這類酶體系可能由不同的多肽組成和/或需要若干種宿主特異的氧化還原再生酶或陪伴分子，這會阻礙該酶體系所有適當成員的純化和分離。另外，如上文所討論的，即便是將已知的普伐他汀催化酶的DNA序列(5Vr印tomyc^ca^叩/n7wp450-sca2基因)轉移至制甲羥酶素生產者Pemc編mc麵畫也不能導致普伐他汀形成。EP1，266,967描述了Aspergt7Zi^te^rews禾卩Mowcwct^m6er的突變體菌株。盡管野生型菌株只生產洛伐他汀，但是這些突變體被描述為生產洛伐他汀和/或普伐他汀。作為本發明的部分，我們將證明根據EP1，266，967的突變體菌株不生產普伐他汀，而僅生產洛伐他汀。因此，不能獲得并且極度需要解決一步發酵法的問題的經濟上可行的方式。發明概述本發明提供了一種微生物，其含有制甲羥酶素生物合成基因和將制甲羥酶素轉化為普伐他汀的基因。更具體地，所述制甲羥酶素生物合成基因是w/d和/或m/o5和/或m/cC和/或m/cZ)和/或w/c五和/或m/cF和/或m/cG和/或m/c/7和/或w/ci，將制甲羥酶素轉化為普伐他汀的所述基因為羥化酶基因。另外，本發明提供了生產感興趣的化合物的方法，包括步驟(a)用包含感興趣的基因的多核苷酸轉化宿主細胞，所述感興趣的基因編碼制甲羥酶素生物合成的最低需要；(b)用下述多核苷酸轉化所述宿主細胞，所述多核苷酸包含編碼制甲羥酶素羥化酶的感興趣的基因和/或包含影響所述感興趣的基因表達的DNA序列；(c)選擇經轉化的細胞的克隆；(d)培養所述經選擇的細胞；(e)任選地對所述被培養的細胞補充營養來源；和(f)任選地從所述培養物中分離所述感興趣的化合物。發明詳述術語"表達"包括涉及多肽生產的任何步驟，其可包括轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。當核酸構建體含有編碼序列在特定宿主生物中表達所需的所有控制序列時，術語"核酸構建體"與術語"表達載體"或"盒"同義。術語"控制序列"在本文中被定義為包括對多肽的表達來說必需的或有利的所有組件。每種控制序列對編碼多肽的核酸而言可以是內源的(native)或外源的(foreign)。這類控制序列可包括，但不限于啟動子、前導序列、最適翻譯起始序列(如Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870中所述)、分泌信號序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、轉錄終止子。控制序列至少包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。控制序列可以是含有轉錄控制序列的適當的啟動子序列。啟動子可以是在細胞中顯示轉錄調控活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜交的啟動子，它們可得自編碼細胞外或細胞內多肽的基因。啟動子對細胞或多肽而言可以是同源的或異源的。啟動子可以源自供體物種，或源自任何其它來源。控制真核生物中表達水平的一種備選方式是使用內含子。高等真核生物具有由外顯子和內含子組成的基因。術語"外顯子"在本文中被定義為包括開放讀碼框6(ORF)的所有組件，其被翻譯為蛋白質。術語"內含子"在本文中被定義為包括所有不包括于開放讀碼框中的組件。術語"開放讀碼框"在本文中被定義為下述多核苷酸，其從甲硫氨酸的密碼子序列ATG開始，隨后是連續的一串編碼所有可能的氨基酸的密碼子，在一定數量后被終止密碼子打斷。該開放讀碼框可以被翻譯為蛋白質。含有分離自基因組的基因的多核苷酸是該基因的所謂的基因組DNA或gDNA序列，其包括所有外顯子和內含子。含有通過反轉錄反應分離自mRNA的基因的多核苷酸是該基因的所謂的拷貝DNA或cDNA序列，其僅包括外顯子，而內含子通過細胞機制被切除。后一類型的DNA尤其適用于在原核宿主中表達感興趣的真核基因。也可以合成制造兩種類型DNA的變體，這使得改變內含子的確切核苷酸序列或改變感興趣的基因中內含子數量成為可能。這也使得向來自原核起源的感興趣的基因中添加內含子以簡化或改進在真核宿主中的表達成為可能。另外，也可以在上述控制序列如啟動子、多聚腺苷酸化位點或轉錄終止子中引入內含子。內含子的存在、不存在、變異或引入是調節真核細胞中基因表達水平的一種手段。術語"可操作地連接"在本文中被定義為下述構型，其中控制序列被適當地置于與DNA序列的編碼序列相關的位置，使得控制序列能指導多肽的生產。術語"普伐他汀"在本文中被定義為具有a-或^-構象的制甲羥酶素的6'-羥基變體，或ce-和/3-構象二者的混合物，并包括閉合的結構(帶有內酯環)和開放的結構(具有羥基羧酸部件)二者。提供普伐他汀的一步發酵工藝的方法是本發明的一個目的。在本發明的第一方面中，提供了生產普伐他汀的菌株，其具有至少一種下述特征含有制甲羥酶素生物合成必需的所有基因，含有制甲羥酶素轉化為普伐他汀必需的所有基因(即表達制甲羥酶素羥化酶的宿主細胞)，能夠在一次發酵中生產普伐他汀。在本發明的上下文中，"普伐他汀生產細胞"被定義為下述細胞所述細胞展示至少一種上述特征，優選兩種上述特征，最優選所有上述特征。在一個實施方案中提供了來自生產菌株Pem'c廟wmc/io^ogewwm的制甲羥酶素生產宿主細胞。該生物經歷了若干輪的經典菌株改進和隨后的工藝適應和改進，達成目前的高效價青霉素G發酵工藝。生物的DNA中大量的改變不僅導致針對產物青霉素G的提高的通量和產量(見圖1)，而且還導致針對150，000-升發酵管中苛刻條件(即氧限制、剪切力、葡萄糖限制等等)的形態學改變和適應。通過缺失^-內酰胺生物合成機制，獲得了下述菌株，所述菌株缺乏^-內酰胺生產能力，但是仍然保持所有下述突變，所述突變導致工業規模上的良好性能，例如剪切力抗性、適合按比例放大、針對代謝產物的高代謝通量、適應確定的培養基、工業順流加工(downstreamprocessing)和低粘度模式(即形態學、調節和代謝突變)。在本發明的尸em'cz'肌wcA^ywge做m菌株中，至少編碼異青霉素N合酶的/3-內酰胺生物合成基因/c6C被失活。優選地，其它/3-內酰胺生物合成基因也被失活，所述基因是編碼L-(a-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-纈氨酸合成酶的pcZ^S和/或編碼酰基-輔酶A:異青霉素N酰基轉移酶的pwi)E。更優選地，通過去除基因的部分來失活基因。最優選的是完全去除基因序列。因為這些基因的完全去除產生下述尸em'"加wmc/o^ogemwz菌株，所述菌株缺乏任何(3-內酰胺生物合成能力并因此是非常適合于生產所有種類產物的菌株。盡管事實上工業生物可能是非常難以操作的，但是該尸em'"7/z'wmc/i0^ogem^菌株驚人地易于轉化，并能夠以比天然生產宿主高得多的效價生產抑制素。盡管不是本發明所必需的，但是優選地從能夠在工業環境中生產的生物獲得尸em'cz'肌wncAo^oge做w突變體。這類生物典型地可被定義為具有高生產力和/或基于消耗的碳源的高產物產率和/或基于產生的生物質數量的高產物產率和/或高生產力率和/或高產物效價。這類生物極其適合于轉化為制甲羥酶素宿主細胞。對生產青霉素G的尸e"/cz7/z'Mwc/o^ge做m菌株而言，這類高效價是高于1.5g/L青霉素G，優選地高于2g/L青霉素G，更優選地高于3g/L青霉素G，最優選地高于4g/L青霉素G的效價。前述數值應用于在復合發酵培養基(每升含有乳糖，40g/L;玉米浸漬固體；20g/L;CaC03,10g/L;KH2P04,7g/L;苯乙酸，0.5g/L;pH6.0)中96小時后的發酵效價。合適的工業菌株是實驗部分(一般方法)中提到的菌株。i^m'c/〃^mcA/jwgem/m的所有工業菌株系經歷了多輪經典的菌株改進，導致三種常見的突變類型(i)直接擴增生物合成基因，導致青霉素代謝產物途徑的酶活性提高(ii)修飾初級代謝基因，最后導致多種適應的代謝重排，均引起針對終產物的更高通量。例子增加的氨基酸構建塊合成，減少的苯乙酸的消耗等等。(iii)細胞結構修飾，導致形態學、膜組成、細胞器組織的改變，從而"有助于"高代謝通量和以工業規模發酵。例子增加的過氧化物酶體數，其為青霉素合成的"裝配線"之一。與第(ii)和(iii)類相比，在(i)類突變類型中DNA水平有顯著不同。盡管后兩類主要是堿基對水平上經分離的突變、缺失、重復和/或改變，但是(i)類中的突變是非常不同的60到100kb區的擴增，其導致基因組中若干直接的和反向的重復。這有時候導致顯著的遺傳不穩定性，得到不穩定和可變的群體。事實上，這表示在給定的青霉素生產菌株中，(ii)和(iii)類的所有突變是固定的，但是(i)類中突變的精確拷貝數可以波動。使用該原則和本領域技術人員己知的技術，可以獲得穩定的分離株，其中僅一個拷貝的青霉素生物合成基因仍然存在。取決于初始菌株的拷貝數，可以在一、二、三或若干輪篩選和選擇中獲得該狀況。就該特定的特征而言，然后分離株可與物種的模式株(typestrain)NRRL1951及經典菌株改進后其第一代后代直到Wisconsin54-1255相比，所有菌株均含有一個拷貝的青霉素生物合成基因。主要的差異是來自高生產菌株的一拷貝分離株仍然含有(ii)和(iii)類的所有其它突變，使其與從NRRL1951到Wisconsin54-1255的菌株相比成為工業高生產菌株。隨后，可以使用本領域工藝水平(state-of-the-art)重組技術缺失最后一組青霉素生物合成基因。這些步驟的詳細綜述在實施例中給出，并概括于以下的步驟中9(a)從Pemh7/z'Mm菌株分離分離株，其具有單個基因組拷貝的青霉素基因簇(b)從步驟(a)中獲得的分離株中缺失基因(c)從步驟(a)或(b)中獲得的分離株中任選地缺失基因蘆MS和/或基因可以被部分失活。更優選地，基因序列被完全去除。因為這些基因的完全去除產生下述尸em'cz'肌wmcA/^ogewwm菌株，所述菌株缺乏任何/3-內酰胺生物合成能力并因此是非常適合于生產所有種類產物的菌株。可以使用的重組技術是本領域技術人員公知的(即單交叉或雙同源重組(SingleCrossOverorDoubleHomologousRecombination))。缺失和置換的一個優選的策略是EP357,127中描述的基因置換技術。如EP635,574所述，優選地使用amc^基因作為選擇標記物，進行對基因和/或啟動子序列的特定缺失。借助于在氟乙酰胺培養基(EP635,574)上的反選擇，得到的菌株是不含選擇標記物的，并可用于進一步的基因修飾。或者可以使用，或與其它提到的技術組合使用基于^&c/^n'c/^aco//中粘粒體內重組的技術，如Chaverocheetal.(2000，NuclAcidsRes，28,E97)所述。該技術適用于其它絲狀真菌，例如尸em'c/〃z'wmcAo^oge肌w。此夕卜，用于去除擴增的基因組片段的相同原則也可用于其它工業生產物種中，其中經典的菌株改進程序已經誘導了基因和基因組重復。另夕卜，此處，(ii)和(iii)類的額外突變是固定的，并確保該菌株能夠在工業發酵過程中茁壯生長。這類尸em'c/肌wmc/o^ogewwm細胞可以用下述基因裝備，所述基因編碼制甲羥酶素生物合成必需的所有蛋白質和酶。九個尸em'c遊wmc"n'w謂基因被描述為涉及制甲羥酶素生物合成(Abeetal.，2002,MolGenetGenomics267:636-646;Abeetal"2002，MolGenetGenomics268:130-137):W/CJ編碼聚酮化合物合酶；w/c5編碼聚酮化合物合酶；m/cC編碼P450單加氧酶；m/cD編碼HMG-CoA還原酶；m/c五編碼流出泵；m/cF編碼氧化還原酶；m/cG編碼脫氫酶；m/c/Z編碼轉酯酶；m/cW編碼轉錄因子。為了獲得制甲羥酶素生產宿主細胞，用至少一種上述基因，優選地用10兩種或更多上述基因，更優選地用所有上述基因來轉化經分離的尸e/^cz'〃z'wmc/^>wogewi//w菌株。在另一實施方案中，同樣的原則可被用于得到其它真核物種的合適的制甲羥酶素生產宿主細胞，及其工業衍生物，例如但不限于^^Wgz7/M這些物種的工業衍生物經歷若干輪的經典誘變，隨后是針對改進的工業生產特性的篩選和選擇，這使得它們特別適用于本發明。通過去除(即缺失)不想要的產物的部分或全部途徑，該菌株保留其期望的工業發酵特性和朝向代謝產物(包括酶)的高通量。又在另一實施方案中，可以通過使用具有改進的動力學特性的同源蛋白質來改進制甲羥酶素的生產。這類"同源物"或"同源序列"被定義為編碼下述多肽的DNA序列，所述多肽顯示由分離自供體物種的原始DNA序列編碼的多肽的至少一種活性，并具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列與特定的DNA序列編碼的蛋白質的氨基酸序列具有一定程度的同一性。具有對制甲羥酶素生物合成基因"基本同源"的氨基酸序列的多肽被定義為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與特定的氨基酸序列具有至少25%、更優選地至少30%、更優選地至少40%、更優選地至少50%、進一步更優選地至少60%、進一步更優選地至少70%、進一步更優選地至少80%、進一步更優選地至少90%、進一步更優選地至少98%和最優選地至少99%的同一性程度，該基本同源的肽展示朝向制甲羥酶素和/或制甲羥酶素前體合成的活性。使用該途徑獲得了多種優點，例如克服了反饋抑制、促進了分泌和減少了副產物形成。同源序列可包括下述多態性，所述多態性由于天然的等位基因變異或菌株內(intra-strain)變異而存在于來自不同種群或一個種群的細胞中。同源物還可來源于除特定的DNA序列來自的物種之外的物種，或可以是人工設計和合成的。與特定的DNA序列相關的和通過密碼子簡并獲得的DNA序列也是本發明的部分。同源物也可包括全長序列的生物活性片段。尤其感興趣的是通過合成手段分離的同源序列。通過該方法可以在計算機芯片上設計要被引入制甲羥酶素生產宿主細胞中的基因的所有可能的變體。這帶來了下述機會適應基因的密碼子使用以便于它們在制甲羥酶素生產宿主細胞中被最優表達；去除和引入限制性酶和/或位點特異重組酶的相關序列；制造基因的不同組合等等。就本發明的目的而言，兩條氨基酸序列之間的同一性程度是指兩條序列之間相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法測定同一性程度，所述BLAST在Altschul,etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。用于進行BLAST分析的軟件是公眾可以通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的。BLAST算法參數W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述作為默認詞長(W)ll、BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))、比對(B)50、預期(E)IO、M=5、N二4并比較兩條鏈。基本同源的多肽可僅含有特定氨基酸序列的一個或多個氨基酸的保守取代，或非必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需的氨基酸是在這些序列之一中可以被改變而不顯著改變生物功能的殘基。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie,J.U.etal.,Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在兩種研究氨基酸序列對改變的耐受的途徑。第一種方法依賴于進化過程，其中突變被自然選擇接受或拒絕。第二種途徑使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入氨基酸改變，并選擇或篩選以鑒定維持功能性的序列。如作者所述，這些研究解釋了蛋白質驚人地耐受氨基酸取代。作者還指出在蛋白質的某位置上何種改變可能是允許的。例如，大部分被埋藏的氨基酸殘基需要非極性側鏈，而表面側鏈通常很少有特征是保守的。其它這類表型沉默取代被描述于Bowieetal和其中所引用的參考文獻中。術語"保守取代"旨在表示下述取代，其中氨基酸殘基被替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基。這些家族是本領域已知的，并包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有^-支鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。另外，可以使用下述生物合成基因簇，其不是同源的，但是遵循用于抑制素合成的相同的生物合成構建原則。本發明的核酸構建體，例如表達構建體，含有至少一個感興趣的基因，但是通常含有若干個感興趣的基因；每個基因與一條或多條控制序列可操作地連接，所述控制序列指導編碼的多肽在制甲羥酶素生產宿主細胞中的表達。核酸構建體可以在一條DNA片段上或在多條獨立的片段上。這些核酸構建體也可以被整合在一個染色體基因座上或若干個染色體基因座上。為了獲得可能的最高生產力，所有感興趣的基因的平衡表達是關鍵性的。因此，一系列啟動子可以是有用的。絲狀真菌細胞如尸em'd肌wmcAo^oge做m應用的優選的啟動子是本領域己知的，并可以是例如來自c/Wwww的基因的啟動子；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶gpdA啟動子；Pem'"'〃/MwcA/^oge"wwpcZ)^5、；c6C禾。pe"Z)五啟動子；蛋白酶啟動子如pe;v4，/ej:xg,j9印C;葡萄糖淀粉酶g/aj啟動子；淀粉酶flmj^，"mj;S啟動子；過氧化氫酶c"W或c^4啟動子；葡萄糖氧化酶goxC啟動子；/5-半乳糖苷酶啟動子；a-葡萄糖苷酶"g/i啟動子；翻譯延長因子te/乂啟動子；木聚糖酶啟動子如x/"，^^S,x/wC,x/"D;纖維素酶啟動子如egL4，eg/5,cMJ;轉錄調節子的啟動子如cm4,:c/wi,pacC,;wr，a/ci或任何其它。所述啟動子可尤其由技術人員在NCBI網站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上容易地發現。在來自除絲狀真菌物種外其它的制甲羥酶素生產宿主細胞的情況下，對啟動子的選擇由對宿主的選擇決定。在一個優選的實施方案中，啟動子可以來自高度表達(在本文中定義13為具有至少0.5X(w/w)的總細胞mRNA的mRNA濃度)的基因。啟動子可以來自中度表達(在本文中定義為具有至少0.01%直到0.5X(w/w)的總細胞mRNA的mRNA濃度)的基因。在另一個優選的實施方案中，啟動子可以來自低表達(在本文中定義為低于0.01%(w/w)總細胞mRNA的mRNA濃度)的基因。還在一個更優選的實施方案中，使用微陣列數據來選擇基因，并從而選擇具有某轉錄水平和調價的這些基因的啟動子。藉此，可以將基因表達盒改造為最適合其要發揮功能的條件。這些啟動子片段可以來自許多來源，即不同的物種、PCR擴增的、合成的等等。在最優選的實施方案中，為了在所有制甲羥酶素生產宿主細胞中最優生產，將原始的尸柳'"7//騰c/W"訓啟動子替換為不受途徑特異轉錄調節子控制的由基因m/c7編碼的啟動子。藉此基因m/ci不必須被包含在制甲羥酶素生產宿主細胞中，并可引入備選的控制機制。控制序列還可以包括合適的轉錄終止序列，這是被真核細胞識別為終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'末端可操作地連接。在細胞中有功能的任何終止子都可用于本發明中。絲狀真菌細胞優選的終止子得自編碼以下的基因AspergillusoryzaeTAKA淀粉酶；Pew'"'〃/wwc力^yi"ogeww柳pcZJ5，/cZC禾口/ewZXfi"纟冬止子；y^/erg〃/ws葡萄糖淀私、酶；Aspergz'〃t^m'dw/a朋鄰氨基苯甲酸合酶；As^ergz'〃^m'gera-葡萄糖苷酶；^perg7'〃M51m't/w/a朋印C基因；Aspez-g^/wsw油/a朋am必；As/erg77/wsm'^/a朋gp^L4;i^a"'畫o，ponwz姨蛋白酉每樣蛋白酉每。進一步更優選的終止子是來自天然生產者尸em'd肌"mc^/wwm的基因的終止子。在來自除絲狀真菌物種以外其它的制甲羥酶素生產宿主細胞的情況下。對終止序列的選擇將由對宿主的選擇決定。控制序列也可以是合適的前導序列，這是對細胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區。前導序列與編碼多肽的核酸序列的5'端可操作地連接。在細胞中有功能的任何前導序列可以用于本發明中。絲狀真菌細胞優選的前導序列得自編碼力5perg"/wsoo^reTAKA淀粉酶禾B爿s/ergz'〃t^wWw/a似磷酸丙糖異構酶和A;ergz'〃^m'gerglaA的基因。控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，其與核酸3'端可操作地連接，并且在轉錄后被絲狀真菌細胞識別為對經轉錄的mRNA添加多聚腺苷殘基的信號。在細胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列可以被用于本發明中。對絲狀真菌細胞來說優選的多聚腺苷酸化序列得自編碼下述的基因AspergillusoryzaeTAKA淀粉酶；As/e/^7/w5葡萄糖淀粉酶；^spergz'〃wsm'GwAmy鄰氨基苯甲酸合酶；Ft^an'wmoxj^orwm胰蛋白酉每樣蛋白酶禾卩^sperg/〃wsm'gera-葡萄糖苷酶。對于待分泌的多肽而言，控制序列也可包括編碼與多肽氨基端連接的氨基酸序列的信號肽-編碼區，其能夠指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核酸編碼序列的5'端可固有地含有與編碼區區段按照翻譯讀碼框天然連接的信號肽-編碼區，所述編碼區區段編碼被分泌的蛋白質。或者，編碼序列的5'端可含有信號肽-編碼區，其對于編碼序列來說是外源的。當編碼序列不正常地含有信號肽-編碼區時，外源信號肽-編碼區可能是必需的。或者，外源信號肽-編碼區可以簡單地替換天然的信號肽-編碼區，從而獲得多肽的增強的分泌。在真核制甲羥酶素生產宿主細胞的情況下，控制序列可包括細胞器靶向信號。這類序列由與多肽連接的氨基酸序列編碼，其能夠針對細胞中最終的目的地(即區室或細胞器)。核酸序列編碼序列的5'或3'端可固有地含有與編碼區區段按照翻譯讀碼框天然連接的這些靶向信號編碼區，所述編碼區區段編碼多肽。多種序列是本領域技術人員公知的，并可被用于將蛋白質靶向區室如線粒體、過氧化物酶體、內質網、高爾基體、液泡、細胞核等等。核酸構建體可以是表達載體。表達載體可以是任何載體(例如質粒或病毒)，其可便利地進行重組DNA步驟并可導致編碼多肽的核酸序列的表達。載體的選擇應典型地取決于載體與要引入載體的細胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環狀質粒。載體可以是自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如質粒、染色體外元件、小染色體或人工染色體。用于絲狀真菌的自主維持的克隆載體可包括AMAl-序列(見例如AleksenkoandClutterbuck(1997),FungalGenet.Biol.21:373-397)。或者，載體可以是下述載體，當其被引15入細胞時整合進基因組中，并與其被整合在其中的染色體一起復制。整合型克隆載體可以隨機或在預先確定的靶基因座上整合進宿主細胞的染色體中。在本發明的一個優選的實施方案中，整合型克隆載體包括與宿主細胞基因組中預先確定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于將克隆載體的整合靶向該預先確定的基因座上。為了促進定向整合，克隆載體優選地在轉化宿主細胞前被線性化。優選地進行線性化使得克隆載體的至少一端(但是優選任一端)側翼是與靶基因座同源的序列。靶基因座側翼的同源序列的長度優選地至少0.1kb，進一步優選地至少0.2kb，還更優選地至少0.5kb，進一步更優選地至少1kb，最優選地至少2kb。優選地通過增強的宿主細胞的同源重組能力來提高核酸構建體通過同源重組定向整合進宿主細胞基因組中(即預先確定的靶基因座中的整合)的效率。細胞的這類表型優選地涉及如WO05/95624中所述的缺陷的/^/^或/z^B基因。WO05/95624公開了獲得包含提高的定向整合效率的絲狀真菌細胞的優選方法。載體系統可以是單個載體或質粒，或者可以是兩個或多個載體或質粒，其共同含有要被引入宿主細胞基因組中的總DNA。然而在本發明中，構建體優選被整合進宿主菌株的基因組中。因為這是隨機的過程，所以這甚至能夠導致基因組基因座中的整合，其高度適合于驅動基因表達，產生大量的酶并由此產生高的生產力。可以通過原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生來轉化真菌細胞。用于轉化真菌宿主細胞的合適步驟被描述于EP238,023和Yeltonetal.(1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474)中。使用爿graZ^ctehw柳似we/ac&似轉化絲狀真菌宿主細胞的合適步驟由deGrootM丄etal.(1998,NatBiotechnol16:839-842;Erratumin:1998,NatBiotechnol16:1074)描述。也可使用針對A^wrai^oracra^a描述的其它方法，如電穿孔。使用共轉化來轉化真菌細胞，即與感興趣的基因一起還轉化了可選擇的標記物基因。其可以與感興趣的基因物理連接(即在質粒上)，或位于獨立的片段上。轉染后，針對該選擇標記物基因的存在篩選轉化體，并隨后分析感興趣的基因的存在。可選擇的標記物是提供針對殺生物劑或病毒16的抗性、針對重金屬的抗性、針對營養缺陷型的原養型等等的產物。有用的可選擇標記物包括"m"S(乙酰胺酶)、"^萬(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、(膦絲菌素酰基轉移酶)、gS(潮霉素磷酸轉移酶)、m'"Z)(硝酸鹽還原酶)、(乳清苷-5'-磷酸鹽脫羧酶)、sC或(硫酸鹽腺嘌呤基轉移酶)、化pC(鄰氨基苯甲酸合酶)、We(腐草霉素抗性蛋白質)或其等價物。在另一實施方案中，同樣的原則可被用于得到原核物種的合適的制甲羥酶素生產宿主細胞，及其工業衍生物，例如但不限于5^印tom;;c"5Vre/to，cascoe//co/or、》印to，c^s//vz'^ms、5W/tom少casco^o/A,/ms、這些物種的工業衍生物經歷了若干輪的經典誘變，隨后是針對改進的工業生產特性的篩選和選擇，這使得它們特別適用于本發明。通過去除(即缺失)不想要的產物的部分或全部途徑，該菌株保留其期望的工業發酵特性和朝向代謝產物(包括酶)的高通量。此處，選自尸em'c涯"mc/,n力"m制甲夢5酶素基因(m/cj,m/c萬，w/cC,附/cZ)，m/c￡,wkF,w/cG,m/c//禾口/或m/ciO列表中的所有基因需要通過本領域工藝水平(state-of-the-art)方法被修飾，從而在原核細胞中被功能性地表達。本領域技術人員應當明白這涉及可與上文針對真核生物所列出的比較的多個步驟，包括但不限于獲得cDNA或合成的DNA(以排除真核內含子)任選地施用密碼子最優化在原核生物中裝配啟動子在原核生物中裝配終止子通過載體功能引入原核生物中。在本發明的另一實施方案中，提供了一種宿主微生物，其包含將制甲羥酶素轉化為普伐他汀必須的基因。實施例3中尸em'c/肌wncA^wge/mm制甲羥酶素生產宿主細胞的青霉素生產親本菌株驚人地尤其適用于將制甲羥酶素轉化為普伐他汀。編碼p450酶的&wptom_yc"cfl^o^AZ/t^基因P-450sca-2被Watanabeetal.(1995,Gene163:81-85)描述為制甲羥酶素轉化為普伐他汀的催化劑。迄今為止，該基因僅在&w/tom_yc^cfl^c^Az7w和&r^tomj;cas/ZvWara中成功表達(Watanabeatal.，1995)。己知p450需要相當特異的輔因子再生體系(綜述見PylypenkoandSchlichting,2004,Annu.Rev.Biochem.73:991-1018)，因此為了良好的異源表達，需要共同引入該再生體系(見例如Kubotaetal.，2005,Biosci.Biotechnol.Biochem.69:2421-2430)。僅裝配有來自5Vr印to/w少cMca^o;/n7w的結構性P-450sca-2基因的制甲羥酶素生產尸em'"7/^mc/o^ogem/m宿主細胞驚人地能夠將制甲羥酶素轉化為普伐他汀，并因此是普伐他汀一步發酵的第一個例子。也可以通過用鐵氧還蛋白裝配所述Pem'c"/i'wmc/u7s0ge"wm宿主細胞來顯著提高普伐他汀的生產水平。優選地，所述鐵氧還蛋白基因如US20060172383中所述來自5^一omjFcesAe/varicws或來自》，o附少casca廠6opMiw。本發明的范圍不限于這些特定的例子。本發明第二方面中公開了生產感興趣的化合物的方法，包括步驟(a)用包含感興趣的基因的多核苷酸轉化宿主細胞，所述感興趣的基因編碼制甲羥酶素生物合成的最低需要；(b)用下述多核苷酸轉化所述宿主細胞，所述多核苷酸包含編碼制甲羥酶素羥化酶的感興趣的基因和/或包含影響所述感興趣的基因表達的DNA序列；(c)選擇經轉化的細胞的克隆；(d)培養所述經選擇的細胞；(e)任選地對所述被培養的細胞補充營養來源；和(f)任選地從所述培養物中分離所述感興趣的化合物。在一個優選的實施方案中，感興趣的化合物是普伐他汀。在另一個實施方案中，可以通過使用具有改進的動力學特性的同源蛋白質來改進制甲羥酶素羥化酶表達宿主細胞中普伐他汀的生產。這類"同源物"或"同源序列"被定義為編碼下述多肽的DNA序列，所述多肽顯示由分離自供體物種的原始DNA序列編碼的多肽的至少一種活性，并具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列與特定的DNA序列編碼的蛋白質的氨基酸序列具有一定程度的同一性。具有對制甲羥酶素羥化酶合成基因18"基本同源"的氨基酸序列的多肽被定義為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與特定的氨基酸序列具有至少25%、更優選地至少30%、更優選地至少40%、更優選地至少50%、進一步更優選地至少60%、進一步更優選地至少70%、進一步更優選地至少80%、進一步更優選地至少90%、進一步更優選地至少98。^和最優選地至少99%的同一性程度，該基本同源的肽展示朝向普伐他汀合成的活性。使用該途徑獲得了多種優點，例如克服了反饋抑制、促進了分泌和減少了副產物形成。同源序列可包括下述多態性，所述多態性由于天然的等位基因變異或菌株內(intra-strain)變異而存在于來自不同種群或一個種群的細胞中。同源物還可來源于除特定的DNA序列來自的物種之外的物種，或可以是人工設計和合成的。與特定的DNA序列相關的和通過密碼子簡并獲得的DNA序列也是本發明的部分。尤其重要的是通過合成手段分離的同源序列。通過該方法可以在計算機芯片上設計編碼合適的p450酶的基因的所有可能的變體。這打開了下述機會適應基因的密碼子使用以便于它們在制甲羥酶素生產宿主細胞和/或制甲羥酶素羥化酶表達宿主細胞中被最優表達；去除和引入限制性酶和/或位點特異重組酶的相關序列；制造基因的不同組合等等。或者，可以施用體外進化途徑如易錯PCR(errorpronePCR)、家族改組(familyshuffling)和/或定向進化作為獲得具有改進的動力學特性的同源序列的方法。同源物也可包括全長序列的生物活性片段。另外，也可使用不是同源的，但是確實能催化從制甲羥酶素或任何制甲羥酶素前體形成普伐他汀的基因。在又一實施方案中，可以如下改進制甲羥酶素到普伐他汀轉化的效率分離p450酶需要的特定的氧化還原再生系統并將其引入表達制甲羥酶素羥化酶的宿主細胞中。在宿主細胞中引入這類系統的方法與下述方法相同，所述方法被描述用于引入制甲羥酶素羥化酶并在上文列出。這樣的氧化還原再生系統可以得自與下述物種相同的物種，編碼制甲羥酶素羥化酶(即p450)的多核苷酸來自所述物種或在其中異源表達；所述物種的例子是尸em'"'〃/w/w物禾中(艮卩尸em'cz'〃/wwcA/3^0geww附、Pem'cz'〃z'wmczYn>mm)、J5/erg7'〃ws物禾中(艮卩J5pergz'〃wsm'ger、v4s/ergz'〃twm'^M/a似、J5/er^〃wsfe/reMs)、Mwcor物禾中(艮卩A/wcor/n'ewafc)、Mowoscws物禾中(艮卩A/owawctwn/Zer、A/owoscms/ax//)、；5^e^to/nycas物禾中(艮卩coWco/or、》e/tow少ces/z'v油/is、；SV廠e/7to，ces//afes、》一謹少waverm^fo、5Vz-e/tomycesc/flvw/z'gems)、Jmyco/ato/w/5物禾中(艮卩J，co/ato戸'sNRRL18098、Jmj;co/ato戸'sATCC19795)、5acz'〃ws物禾中(艮卩5acz'〃Ms犯Z"/tw、^6a"'〃t^am少/o/z々w咖c/e/w、5ad〃ws/z'c/emyb/7W^)、C0/7weZ)a"en-w/w物禾中(艮卩CbA7weZacten't/mg7wtam/cwm)或Esc/en'c/n'fl物禾中(艮卩^&c/^hcA/aco/z')。也可以使用備選的系統。備選系統的例子包括，但不限于將本發明的制甲羥酶素羥化酶整合進IV類p450系統中從而將其與氧化還原配偶體(見例如Robertsetal.，2002,JBacteriol184:3898-3908禾卩Nodateetal.,2005,ApplMicrobiolBiotechnolSep30;:1-8[Epubaheadofprint])融合，或通過產生NAD(P)H的非-p450連接酶如亞磷酸鹽脫氫酶(Johannesetal.，2005，ApplEnvironMicrobiol.71:5728-5734)或通過非酶手段(見例如Hollmannetal.，2006，TrendsBiotechnol24:163-171)。由此獲得的宿主細胞可被用于生產普伐他汀。在另一實施方案中，如下進行普伐他汀的一步發酵將制甲羥酶素生產宿主細胞與制甲羥酶素羥化酶表達宿主細胞混合，隨后將兩種宿主細胞作為混合培養物培養，應理解由制甲羥酶素生產宿主細胞生產和分泌的制甲羥酶素應被制甲羥酶素表達宿主細胞輸入并轉化為普伐他汀。圖l是本發明的圖示。野生型(WT)菌株具有將輸入的碳在生長、產物(青霉素G)和維持之間分配的固定的比例。在制甲羥酶素生產宿主細胞中，該平衡朝向產物遷移。在平臺菌株中，青霉素G途徑被去餘，因此碳通量在生產和維持之間再平衡。在新產物菌株中，通過引入新的產物途徑恢復工業碳通量平衡。圖例1=野生型尸em'cz7/z'wwc/zowgem/m菌株；II=工業尸ewz'cz'〃^mc/^)^ogewMm菌株；11I二尸em'cz'〃/t/mc/j/^sogewi/m無/3-內酰胺菌株；IV二生產新產物的尸em'"'仏'謹cAo^ogewwm無^-內酰胺菌株；S二碳源(即糖)；G二青霉素G;X-生物質；M二維持；P二制甲羥酶素和/或普伐他汀。圖2顯不了用于在尸em.cz7/z'w/wc/3^ogewww禾口尸em'"7/z'wmc"n'www中表達5^，謹戸scar—Az7twp-450sca-2酉每的p-450sca-2表達載體pANp450a。圖3顯示了對具有單拷貝青霉素生物合成基因簇的工業尸em'c廟騰c/o^ogem/m分離株的Southern印跡分析。圖例#=分離株數量；N=npel0;W=Wis54-1255;1=中間體親本;N二m'^4基因片段;P=—C基因片段。圖4顯示了搖瓶中在含有苯氧乙酸的礦物培養基上生長的多種菌株的相對青霉素V效價。在Y軸上給出了青霉素V的百分比(工業親本的水平設定在100)。圖例C二工業親本；1=中間體親本；W=Wis54-1255;N=npel0;#=分離株數量。圖5是對從工業尸e"/"7/^/wc/^wge肌w菌株的衍生物中去除青霉素基因簇最終拷貝的缺失策略的圖示。圖例八=;7^^8基因；B二；cZ)C基因；C:/ewD5基因；M:am必基因盒；3:3kb側翼；5-5kb側翼；7二7kb側翼長度。劃陰影線的區域指出同源側翼區；對角陰影線指出左側翼，豎直陰影線指出右側翼。圖6顯示了搖瓶中在含有苯乙酸的礦物培養基上生長的多種菌株的相對青霉素G效價。Y軸上給出青霉素G的百分比，工業親本的水平設置為100。圖例C-工業親本；1=中間體親本；W=Wis54-1255;N=npelO;#=分離株數量。圖7是制甲羥酶素基因簇的圖示(長度為38231bp)。虛線箭頭指出基因及其方向。小實線箭頭指出克隆策略中使用的PCR引物的位置。頂部的大小指出通過PCR擴增的片段的長度(通過若干個克隆步驟將10和8kb片段與一個18kb片段組合，細節見實施例)。圖例A二m/d基因；B二m/cS基因；C二m/cC基因；D二w/cD基因；E-m/c五基因；F=m/cF基因；G:m/cG基因；H二m/c/7基因；R-m/ci基因。21圖8顯示了對制甲羥酶素基因簇中間部分(14.3kb)和右側部分(6kb)的PCR擴增。圖9是制甲羥酶素簇左側部分18kb的克隆策略的圖示概括。圖A:在pCR2.1TOPOT/A中克隆的10kb和8kb片段的PCR擴增。圖B:10和8kb片段的融合克隆。A/ort-5^I消化8kb片段，連接進經A^I-J仿al消化的10kb質粒中。PCR擴增中間6kb片段，恢復m/c」開發讀碼框。圖C:最終18kb片段。通過Gateway反應將轉移至pDONR41Zeo。圖例CGC=制甲羥酶素基因簇；N=Notl;A=Acc65I;X=Xbal;S=Spel。圖10展示了發酵液上清液的HPLC分析。圖A:缺乏所有青霉素生物合成基因簇的尸e"/cz'肌wmc力o^ogem/m菌株。圖B:整合了制甲羥酶素基因簇的尸em'cz7/z'wwcAo^ge"wm轉化體之一。在2.6分鐘可以看到對應于ML-236-A的峰。圖例X-軸二分鐘；Y-軸二指出相對峰強度的任意單位。圖11顯示了通過HPLC檢測的普伐他汀形成。圖A是來自下述尸抓'cz'肌畫c/，ogew畫菌株的發酵液，其裝配有制甲羥酶素生物合成基因和來自5Vre;7tow_yce5cw^o;^7m的P-450sca-2基因。圖B如圖A，但是用純普伐他汀使其有尖峰(spiked)，指出對應于該化合物的峰。在9.7分鐘可以看到對應于普伐他汀的峰。其它主峰來自ML-236A(8.7分鐘)和制甲羥酶素(11.5分鐘)。圖例X-軸二分鐘；Y-軸二指出相對峰強度的任意單位圖12顯示通過LC/MS/MS檢測的普伐他汀形成。圖A是通過LC分析的來自下述尸柳'"7//謂cA，ogew騰菌株的發酵液，其裝配有制甲羥酶素生物合成基因和來自&reptom_ycasca/^o;/n7^的P-450sca-2基因。在8.7分鐘可以看到對應于普伐他汀的峰。圖例X-軸二分鐘；Y-軸二指出相對峰強度的任意單位。圖B是圖A樣品的MS/MS分析。峰圖式對應于具有正確質量(423)和裂解譜(fragmentationpattern)(321、303禾B198)的普伐他汀。圖例》軸=分鐘；Y-軸二指出相對峰強度的任意單位。實施例22一般方法如其它地方所述，進行標準的DNA步驟(Sambrook,etal.,1989，Molecularcloning:alaboratorymanual,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)。如果應用了特定的DNA方法，則將其列出。使用保真酶Herculase聚合酶(Stratagene)來擴增DNA。限制性酶來自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。比較實施例1通過EP1,266,967中描述的菌株生產抑制素Manzonietal.在三份不同的出版物(1998，BiotechnolTechn12:529-532;1999，BiotechnolLett21:253-257;EP1,266,967)中描述了對生產抑制素的多種菌株的分離。盡管不能獲得前兩份出版物的菌株，但是能夠獲得EP1，266,967中描述的菌株。Mo"ascwsn/Z)erGN/33禾卩v4s;erg"/twtewei^GN/2218得自GermanNationalResourceCentreforBiologicalMaterial,其收藏號分別為DSM13554和DSM13596。使用尸em'c/〃/wmc"n'm/mNRRL8082和^pergz'〃wte/re^ATCC20542作為對照菌株。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面上于25。C下對菌株的孢子形成誘導2-7天。孢子被收集在0.5%Tween80中并用于接種如EP1,266,967中所述的預培養基(葡萄糖(25g/L);酪蛋白水解產物(10g/L);酵母提取物(15g/L);NaN03(2g/L);MgSO4.7H20(0.5g/L);NaCl(lg/L);用1MNaOH調節至pH6.2)，如EP1，266，967中所述孵育培養物。兩天后，使用來自預培養物的發酵液接種主培養物。這用EP1,266,967中所述培養基(甘油(60g/L);葡萄糖(20g/L);胨(10g/L);全大豆粉(30g/L);NaN03(2g/L);MgSO4.7H20(0.5g/L);用1MHCl調節至pH5.8)中10%的終體積完成，培養物如EP1,266,967中所述孵育144小時。取出發酵液樣品(lmL)用于分析產生的抑制素。為此，向樣品中添加CH3CN(0.5mL)并劇烈振蕩混合物。在14,000rpm將細胞碎片離心30分鐘。上清液用于LC/MS分析。普伐他汀、洛伐他汀和制甲羥酶素被用作若干稀釋度(15、5、5、2.5、1、0.5和0.25mg/mL)下的對照。使用以下的條件進行LC/MS:23裝置LC:流動相針洗滌劑:梯度WatersAlliance2795LC溶劑A:含0.1%HC02H的水溶劑B:含0.1%HC02H的CH3CN50%Milli-Q水+50%乙腈時間(分鐘)A%B%流速(ml/分鐘)曲線0.0085.015.01.0011.5040.060.01.0061.700.0100.01.5061.8085.015.01.5062.0085.015.01.0062.10結束柱柱溫度注射體積裝置MS:來源毛細管錐體(cone》去溶劑化溫度來源溫度提取器(Extractor):RF透鏡錐體氣流去溶劑化氣流LM1重溶液HM2重溶液離子能量l:倍增器(Multiplier):掃描質量范圍(m/z)Varian,MonoChromCN，20x2.0mm,顆粒大小3/mi25°C5MlWatersZQ2000ES+3.50kV30V360。C140°C2V0.3V1301/小時6101/小時15.015.00.1650V200-600amu，掃描持續時間0.20s，掃描間延遲0.05s6個頻道的SIR:361.3、413.30、431.3、445.3、447.3、459.3;暫停(dwell)0.07s;掃描間延遲0.05s在如EP1,266,967中所述的條件下，菌株均不生產普伐他汀(表1)。表1:用mg/L表示的由多種菌株生產的多種抑制素。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>比較實施例2通過WO99/10499中描述的菌株生產抑制素分離P-450sca-2基因根據WO99/10499對野生型尸em'"7/^m細胞裝配/SVe/7tom_ycascarZop/7w>sP-450sca-2基因。因而將菌株5^ep/o，cesca^opMwFERM-BP1145接種在25mL液體培養基(以g/L表示酵母提取物，1;水解酪蛋白氨基酸4;甘油4;MgS04，1;CaCl2，0.1;微量元素溶液，2ml(0.1%ZnSO4.7H20、0.1%FeSO4.7H20、0.1%MnCl2.4H20);0.5%甘氨酸)中，并在28°C、280rpm下孵育72小時。通過離心收獲菌絲體，用0.7%NaCl洗滌一次，然后根據Hopwoodetal.(1985,Geneticmanipulationof》eptom;yces,alaboratorymanual,JohnInnesFoundation,Norwich)分離基因組DNA。通過PCR克隆制甲羥酶素羥化酶基因P-450sca-2，所述PCR使用基因特異的正向和反向引物(SEQIDN01和2)在經分離的染色體DNA上進行。PCR反應混合物在50pi中進行，含有125ng基因組DNA作為模板、250ng兩種引物、2單位的Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)、lxPwo緩沖液、0.2mMdNTP，s和4DMSO。在載體pCR-blunt(Stratagene)中克隆1.2kb平末端的PCRDNA-片段，得到構建體pCRP450a。通過DNA序列分析檢驗pCRP450a中含有羥化酶基因的PCR插入物。在用Ncol部分消化和用EcoRV完全消化后，從pCRP450a中分離1.2kb的DNA片段，并克隆在用Ncol和Smal消化的真菌表達載體中pAN8-I(Punt&vandenHondel,1993，Meth.Enzymology216:447-457)。通過限制性分析檢驗的獲得的整合構建體pANP450a在A^e^z7/ws"/^/a朋gpdA啟動子下游含有S^;tomj;c^cwk^/n'/w制甲羥酶素羥化酶基因。獲得的質粒在圖2中顯示。獲得帶有P-450sca-2基因的尸gw'cz.肌t/mczYn>wm轉化{本通過原生質體轉化將pANP450a引入尸ew'c/〃/wmc"WwwwNRRL8082中，所述原生質體轉化是用于絲狀真菌的典型步驟。該方法的細節被描述于WO99/10499中。我們還共同引入了pANP450a和pAN7-l(PuntandVandenHondel,1993)并在潮霉素上選擇轉化體。獲得潮霉素陽性的轉化體并將其在新鮮的潮霉素平板上重新劃線。進行PCR驗證潮霉素陽性的克隆是否也獲得pAN450a質粒。為此將一小塊菌落材料重懸于50plTE緩沖液(Sambrooketal.,1989)中并在95。C孵育10分鐘。在3000rpm將細胞碎片離心5分鐘。5pl上清液用于PCR反應，所述PCR反應使用P-450sca-2特異的正向和反向引物(SEQIDNO3和4)。獲得了總計8個潮霉素抗性的、P-450sca-2陽性的且穩定的轉化體。搖瓶測試具有P-450sca-2基因的Pem'c///^mc"n'肌m轉化體在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面上于25"C下對菌株的孢子形成誘導2-7天。孢子被收集在0.5%Tween80中并用于接種如實施例1中所述的預培養基。兩天后，使用來自預培養物的發酵液接種主培養物。這用實施例1中所述培養基中100%的終體積完成。取出1mL發酵液樣品用于分析產生的抑制素。為此，向樣品中添加0.5mL乙腈并劇烈振蕩混合物。在2614,000rpm將細胞碎片離心30分鐘。上清液用于如實施例1中所述的LC/MS分析。如從表2中可以看出，在如WO99/10499中所述的條件下菌株均不生產普伐他汀。表2:由尸em'cz.〃/wmc"n7wmWT禾口具有來自5Vre/tom少cescar6o//n7w51的P-450sca-2基因的轉化體生產的多種抑制素(以mg/L表示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例3分離生產制甲羥酶素的尸em'c涯'wmcAnAWgem/w宿主細胞Pem'c涯wnc"n'wwm是天然的制甲羥酶素生產者(Y.Abeetal.,2002,MolGenetGenomics267,636-646)。編碼代謝途徑的基因簇生于基因組中一個片段中。文獻中描述了這些基因中的一些的功能，以及整個簇或者特定的調節子的過表達提高制甲羥酶素效價(Abeetal.，2002，Mol.Genet.Genomics268,130—137;Abeetal.,2002，Mol.Genet.Genomics,268，352-361)。然而，野生型菌株和重組菌株的生產效價都非常低，因此更好的生產宿主會是有利的。可以使用經受了若干輪菌株改進以改進菌株性能的任何工業尸ew'cz'肌wmc力o^ogem/m菌株作為制甲羥酶素生產宿主細胞的起始菌株。這些菌株的例子是CBS455.95(Goukaetal.,1991,J.Biotechnol.20,189-200);PanlabsP2(Lein,1986,ThePanlabsPem'"7/z'wmstrainimprovementprogram,in'Overproductionofmicrobialmetabolites',VanekandHostalek(eds.),105-140;Butterworths，Stoneham,MA);El禾口AS-P-78(Fierroetal.,1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92:6200-6204);BW1890和BW1901(Newbertetal.，1997,J.Ind.Microbiol.19:18-27)。為了分離可被用作制甲羥酶素生產宿主細胞的不含e-內酰胺的衍生物，必須缺失工業尸em'd肌wmcAo^og朋wm菌株的編碼/3-內酰胺生物合成蛋白質的所有基因拷貝。因為這些基因在尸em'"'肌wmc/o^oge"ww菌株譜系中被擴增為多個拷貝，所以這不能通過單基因缺失來實行。最好的途徑是首先分離僅具有一個拷貝的生物合成基因集合的工業菌株的衍生物。因為所有基因擴增是在相同染色體上的直接重復(Fierroetal.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6200-6204)，所以在不同的重復之間能夠存在導致拷貝喪失的重組(Newbertetal.,1997,J.Ind.Microbiol.19:18-27)。這是一個隨機過程，并可以通過誘變處理被誘導。應當針對減少的青霉素生產和減少的青霉素生物合成基因拷貝數篩選衍生物。如果篩選了足夠的衍生物，則能夠找到這些單拷貝分離株。然后將這些分離株用于通過同源重組的定向基因敲除。分離單拷貝分離株如Cantoraletal.，1987，Bio/Technol.5:494—497中所述，使用glucanex代替novozyme作為裂解酶進行尸em'"'〃z'wmc/^sogewwm原生質體的制備。從菌絲體分離原生質體，洗滌，并涂布在礦物培養基瓊脂(US2002/0039758)上，所述礦物培養基瓊脂不含苯乙酸，但是補充有15g/L瓊脂和1M蔗糖。將再生菌落轉移至不含蔗糖的平板上，以誘導孢子形成。收集孢子，用0.9mMNaCl洗滌，稀釋并涂布在YEPD瓊脂平板(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和15g/L瓊脂)上。將經分離的菌落轉移至礦物培養基瓊脂平板上作為儲存培養物平板。選擇27個隨機的分離株用于Southern印跡分析，以確定相對的基因拷貝數。為此，在液體礦物培養基中于25"C和280rpm下將細胞培養48小時。收集細胞，用0.9mMNaCl洗滌并將沉淀物冷凍在液氮中。使用研缽和研杵研磨冷凍的細胞，轉移至塑料管中并添加等體積的苯酚CHCl3:異戊醇(25:24:l)。將混合物劇烈振蕩，離心并將水相轉移至新管中。重復兩次，每次使用新鮮的苯酚:CHCl3:異戊醇(25:24:l)。最后，通過乙醇沉淀(Sambrooketal.，1989)從水相中分離DNA。用五coiI消化DNA(3gg)，在0.6%瓊脂糖上分離并通過Southern印跡轉移至尼龍膜上。使用pd)C和作為探針。前者代表了青霉素生物合成基因的拷貝數，后者是在尸em'd肌wmc/o^oge，w菌株中作為單拷貝存在的內部對照(編碼亞硝酸鹽還原酶的基因)。使用基因特異引物(見表3)擴增探針序列，并根據供應商的說明書，用ECL非放射性雜交試劑盒(Amersham)加以標記。使用兩種信號強度之間的比例(pACW^4)，來評價青霉素基因簇的相對基因拷貝數。親本菌株和單拷貝實驗室菌株Wisconsin54-1255被用作對照。表3:用于擴增探針序列的引物序列耙基因正向引物反向引物SEQIDNO5SEQIDNO6SEQIDNO7SEQIDNO8在含苯氧乙酸的液體礦物培養基中針對青霉素生產測試具有最低比例的菌株。用NMR測定青霉素V生產。所有具有降低的pd)C'.m'"比例的菌株也顯示降低的青霉素V效價。選擇了一個經受了第二輪原生質體化、篩選和分析的菌株，其與上文所述相同。還選擇了27個隨機分離株并詳細分析。根據Southern印跡(見圖3)，鑒定出了若干個推定的"單拷貝"青霉素生物合成基因簇后選擇(由箭頭指出)，因為它們顯示與實驗室菌株Wisconsin54-1255可以比較的pAC:m'"比例。選擇其中三個并在搖瓶中針對青霉素V生產進行測試。使用原始的工業尸em'c廟wmcAoAwge"wm親本、中間體親本、實驗室菌株Wisconsin54-1255和該實驗室菌株的不生產衍生物npel0(Cantoraletal.,1993，J.Biol.Chem.268:737-744)作為對照。所有三個分離株都顯示顯著降低的青霉素V效價，并可與單拷貝實驗室菌株Wisconsin54-1255比較，從而得出結論這三個分離株是工業單拷貝分離株，其僅維持一個拷貝的青霉素基因簇，但是也維持通過經典菌株改進引入的所有突變(圖4)。缺失最終拷貝的青霉素生物合成基因為了失活最終維持的青霉素基因簇拷貝的三個生物合成基因，使用雙同源重組策略。使用與生物合成基因相鄰的序列作為側翼，將am^S選擇29標記物耙向該基因座。如果會發生雙同源雜交，則轉化體應使用乙酰胺作為唯一的碳源(歸因于amtiS基因的存在)，不應生產青霉素并且不應與pc6C探針雜交。因為雙同源雜交在Pem'c/肌wmcAowgewwm中是罕見的事件，所以產生了三種構建體一個在fl^/S基因的任一惻具有3kb的側翼，一個具有5kb側翼，一個具有7kb的側翼(見圖5)。使用的寡核苷酸在表4中列出。表4:用于構建雙同源交換盒的引物集合<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在PCR擴增后，通過TOPOT/A克隆(Invitrogen)將片段克隆進pCRXL中。隨后用^cc651和A^I消化三個左側翼(3、5禾B7kb)，然后連接在用Jcc651和A^I預先消化的pBluescriptIISK+(Invitrogen)中。用WWI消化獲得的左側翼質粒以便于克隆右側翼，所述右側翼用7VWI和五co521預先消化。獲得的3、5和7kb側翼質粒均在左側翼和右側翼之間具有獨特的A^I位點，給位點被用于克隆"mJ5"基因作為選擇標記物。這通過用iVM消化pHELY-Al(描述于WO04/106347中)并分離3.1kbPs^4-^wm必表達盒獲得。由此獲得的缺失片段在用^ml消化后分離，并轉化至青霉素基因簇單拷貝分離株中。根據其在乙酰胺選擇平板上生長的能力選擇轉化體，隨后通過將菌落復制涂布在礦物培養基上并在生長4天后用i3-內酰胺敏感的指示物生物五^/^n'c/n'aco/z'菌株ESS覆蓋，針對抗生素生產對其進行篩選。如果菌落仍然生產^-內酰胺，則這抑制」&cAen'c/n'aco/纟的生長。測試的27,076個轉化體中有22個顯示無抑制區(0.08。/。)并被選擇用于進一步的分析。通過菌落PCR用三個引物組對這22個分離株進行分析m'^4，作為單拷貝基因的內部控制；flm^S"，用作選擇標記物；p^Z)凡作為青霉素生物合成基因存在或不存在的指示物。表5:用于菌落PCR的引物序列基因FWD引物REV引物片段大小(bp)SEQIDN07SEQIDNO8251爿w必SEQIDNO17SEQIDNO18653SEQIDNO19SEQIDNO201000表6:對推定的尸ew'd〃z'wmc/^o^ogewww菌株分離株的菌落PCR菌株用于缺失的片段NpelO-+--Wisconsin54-1255-+-+CBS455.95-+-+缺失突變體3kb側翼++-缺失突變體3kb側翼++-缺失突變體5kb側翼++-缺失突變體5kb側翼++-缺失突變體5kb側翼++-缺失突變體5kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼+--缺失突變體3kb側翼++-缺失突變體3kb側翼++-缺失突變體3kb側翼++-缺失突變體5kb側翼++-缺失突變體5kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼++-缺失突變體7kb側翼+--缺失突變體7kb側翼++-所有22個推定的突變體均未給出編碼酰基轉移酶的基因；^wZ)五的信號，所述酶催化青霉素生物合成中的最后一步。兩個突變體未給出"mdS的信號，提示選擇標記物基因的自發丟失。結論是所有22個分離株均是31工業尸em'cz'肌wwcAowgem/m菌株不含/3-內酰胺生物合成基因的衍生物，具有制甲羥酶素生產的可能宿主的資格。搖瓶測試通過在含有苯乙酸作為前體的液體礦物培養基中接種突變體，在搖瓶中測試所有22個突變體，以證實青霉素陰性的表型。用NMR分析樣品，證實沒有一個突變體能夠生產青霉素G(圖6)，因此結論是它們均是正確的不含/3-內酰胺的尸em'cz7/z'wmcAowge"wm分離株。分離制甲羥酶素基因集合從尸em'c廟^ncz加'"MmNRRL8082分離染色體DNA。因為整個基因簇由于其大小(38kb;圖7)而難以通過PCR擴增，所以將其分為三個片段18kb、14kb和6kb。14和6kb的片段被容易地PCR擴增(圖8)，并根據供應商的說明使用Gateway(Invitrogen)用所謂的LRgateway反應克隆進輸入載體pD0NRP4-PlR禾QpDONR221中。在兩步步驟中克隆18kb片段。首先擴增10kb和8kb的片段。兩個片段被獨立地克隆進pCR2.1TOPOT/A(Invitrogen)中并隨后通過限制性酶克隆和連接融合在一起(見圖9)。最后，使用Gateway技術將片段轉移至pDONR41Zeo載體。通過測序驗證被擴增的片段。使用所謂的多位點Gateway反應(見Invitrogen手冊)，含有制甲羥酶素生物合成基因簇的所有基因的這三個基因片段可以被重組進跨越整個區域的一個片段中。表7:用于擴增制甲羥酶素生物合成基因簇的寡核苷酸耙DNA正向引物反向引物簇序列Gateway序歹ll簇序列Gateway序歹U制甲羥酶素簇的左側部分(10kb片段)SEQID21attB4SEQID22-制甲羥酶素簇的左側部分(8kb片段)SEQID23-SEQID24attBl制甲羥酶素簇左側部分的內部6kbSEQID25-SEQID26-32<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>將三個制甲羥酶素基因簇片段共轉化進帶有編碼下述蛋白質的We表達盒的尸em'c涯wmcA/^oge"wm平臺菌株，所述蛋白質介導腐草霉素抗性。該表達盒可以作為1.4kb片段從pAMPF7從分離(Fierroetal.，1996，Curr.Genet.29:482-489)。在礦物培養基瓊脂平板上進行轉化體的選擇，所述平板含有50pg/ml腐草霉素和1M蔗糖。將在這些原生質體再生平板上出現的腐草霉素抗性菌落在含/不含蔗糖的新鮮腐草霉素瓊脂平板上再劃線，并培養直至孢子形成。通過菌落PCR針對一個或多個制甲羥酶素基因片段的存在篩選腐草霉素抗性轉化體。為此，將一小塊菌落材料懸浮于50plTE緩沖液(Sambrooketal.,1989)中并在95。C孵育10分鐘。為了棄去細胞碎片，將混合物在3000rpm離心5分鐘。上清液(5pl)被用作PCR反應的模板，該反應使用來自HTBiotechnologyLtd.的SUPERTAQ。在來自Invitrogen的E-gel96體系上分析PCR反應。表8:菌落PCR中用于測定制甲羥酶素生物合成基因簇存在的寡核苷<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>首先檢驗18kb片段的存在。在480個菌落中檢驗了112個具有穩定整合的18kb片段(23。/。)。隨后驗證其它兩個片段(14和6kb)的存在。45個18kb陽性的轉化體也具有制甲羥酶素基因簇的其它兩部分，從而具有推定的制甲羥酶素生產菌株的資格。制甲羥酶素搖瓶測試在液體礦物培養基(不含苯乙酸)中，針對(經水解的)制甲羥酶素和ML-236A(6-(2-(l，2,6，7,8，8a-六氫-8-羥基-2-甲基-l-萘基)乙基)四氫-4-羥基-2H-吡喃-2-酮)的存在評價具有完整制甲羥酶素基因簇的尸em'c識訓c/owge做m平臺菌株轉化體。在25。C下于25ml中培養168個小時后，用HPLC分析上清液，使用以下的設備和條件-柱WatersXTerraRP18-柱溫度室溫-流速lml/分鐘-注射體積10^1-發射箱溫度室溫-設備WatersAlliance2695-檢測器Waters996光二極管陣列-波長:238nm-洗脫液A:milliQ水中33%CH3CN、0.025%CF3C02H;B:milliQ水中80%乙腈;C:milliQ水使用兩種不同的梯度梯度l時間(分鐘)洗脫液(0/0)ABc0.0_8.0100008.0-8.1100~>00^10008.1-120100012.0-13.00~>100IOO一O013.0—14.010000梯度2時間洗脫液(％)(分鐘)ABc0.0—5.0500505.0-5.150^100050~>05.1-9.0100009.0-9.1100—00~>10009.1_13.00100013.0-13.10—50100~>00—5013.1-15.050050滯留時間(梯度l)滯留時間(梯度2)經水解的制甲羥酶素10.4分鐘制甲羥酶素10.9分鐘ML-236A2.6分鐘經水解的制甲羥酶素11.5分鐘制甲羥酶素11.8分鐘ML-236A8.6分鐘野生型尸em'c廟i/mc/的'm/m菌株不能生產任何抑制素，但是34尸em'd肌wmcAo^oge肌m轉化體生產顯著的量(表9)。HPLC色譜圖的一個例子在圖IO中展示。這些數據證實了使用尸em'cz'仏'wmcAowgem/m工業生產菌株的衍生物作為宿主細胞用于生產制甲羥酶素的高潛能。表9.不同菌株生產的抑制素水平(制甲羥酶素和ML-236A)。菌株制甲羥酶素(mg/L)ML陽236A(mg/L)P側'"7/iwmc"n'w訓NRRL8082<0,50尸em'a7/Zwmc"n.nwmNRRL8082<0，50c/Zn'wwmNRJIL80820.90尸em'c/〃Zw附c"r/ww附NRRL8082<0，50不含-內酰胺的尸em.c/〃/w附c/^soge"wm分離株00不含-內酷月安的/^"/(^'///wmc/z/jsogcwwm分離株00制甲羥酶素簇轉化體10465制甲羥酶素簇轉化體7420實施例4分離生產普伐他汀的尸em'cz'〃^mcAn^ogg/wm宿主細胞菌株構建使用實施例2中所述的質粒pAN450a轉化實施例3中所述的不含P-內酰胺的尸em'"說wnc/o^oge做m菌株。為此如實施例3中所述將所有三個制甲羥酶素基因片段、pAN450a和腐草霉素基因盒共同轉化至尸em'c廟訓c/zo^ogem^宿主細胞。在腐草霉素選擇平板上最初選擇后，將菌落在選擇性平板上重新劃線并用于菌落PCR。首先，如實施例3中所述使用表8中所示的引物證實制甲羥酶素基因的存在。其次，如實施例2中所述使用引物SEQIDNO3和4證實P-450sca-2基因的存在。兩個轉化體T1.48和T1.37顯示含有所有的基因，并隨后被用于搖瓶分析。普伐他汀搖瓶培養和HPLC分析將兩種轉化體均在真菌礦物無尿素培養基中培養，所述培養基含有(g/L):葡萄糖(5);乳糖(80);(NH4)2S04(2.5);Na2S04(2.9);KH2P04(5.2);K2HP04(4.8)和10ml/l含檸檬酸(150)的溶液；FeS04.7H20(15);MgS04.7H20(150);H3B03,0.0075;CuS04.5H20，0.24;CoS04.7H20,0.375;ZnS04.7H20(0.5);MnS04.H20(2.28)和CaCl2.2H20(0.99);在滅菌35前pH為6.5。在25'C于定軌搖床中以280rpm將培養物孵育120小時。HPLC分析與實施例3中相同。使用梯度2時滯留時間為水解的制甲羥酶素11.5分鐘；普伐他汀8.7分鐘，ML-236A8.6分鐘。盡管實施f列2的親本尸em'cz'〃/wwcA^^ogewww菌株、尸ew/cz.〃/wmcA^AWgewwm帝U甲羥酶素轉化體、野生型尸em'"7/z'wmc"n>ww菌株或尸e"/d肌簡c/^'w謂轉化體不生產任何制甲羥酶素，但是裝配有制甲羥酶素和P-450sca-2基因二者的尸em'cz'〃z'w/wc/o^ogem/附轉化體生產普伐他汀。轉化體T1.47的HPLC色譜圖在圖11中顯示。轉化體T1.48發酵液的LC/MS/MS分析為了驗證通過HPLC鑒定的峰的確是普伐他汀，進行LC/MS/MS分析。為此用水將樣品1:1稀釋并注射在如下的LC/MS/MS體系中洗脫液A:水中0.1。/。HCO2H;B:CH3CN中0.1%HC02H梯度-時間(分鐘)流速(ml/分鐘)A%B%0.00.2703020.00.2109020.10.2703025.00.27030柱VarianInertsil3ODS3CP22568150*2.1mm3,柱溫度55。C注射體積-50^發射箱溫度4°C設備LCQ(SM05)LC/MS:對普伐他汀為ESI/negLC/MS/MS:普伐他汀iw=2.1aa=25%滯留時間普伐他汀8.7分鐘m/z范圍200-訓微掃描-1注射時間500ms36使用LC方法在8.7分鐘時洗脫普伐他汀。ESI/neg模式中普伐他汀被表征為m/z423處質子化的分子[M-H]-。在MS/MS模式中觀察到102(甲基丁酸)禾n120(102-H2O)的特征性丟失(圖12)，證實裝配有制甲羥酶素和P-450sca-2基因的該尸em'"'〃/t/mcAo^ogertwm轉化體能夠在單次發酵培養中從簡單和確定的營養素開始生產普伐他汀。權利要求1.微生物，其含有制甲羥酶素生物合成基因和將制甲羥酶素轉化為普伐他汀的基因。2.根據權利要求1的微生物，其為真菌。3.根據權利要求2的微生物，其來自尸ew'c淑wm、A/7^^〃m、Mo"fiwcws、Mwcor或5"acc/wrow7ces的屬。4.根據權利要求3的微生物，其為c//n>ww、尸e"/"'〃/ww5.根據權利要求1到4中任一項的微生物，其中所述制甲羥酶素生物合成基因為和/或w/cS和/或m/cC禾口/或m/cD禾口/或m/c五和/或m/cF禾口/或m/cG禾口/或m/c/Z禾口/或w/c/。6.根據權利要求1到5中任一項的微生物，其中所述制甲羥酶素生物合成基因不是mfc幾且其中所述原始的宿主啟動子被替換為不受途徑特異轉錄調節子控制的由基因m/ci編碼的啟動子。7.根據權利要求1到6中任一項的微生物，其中將制甲羥酶素轉化為普伐他汀的所述基因是羥化酶基因。8.根據權利要求1到7中任一項的微生物，其中所述羥化酶基因是P-450基因或其同源物。9.根據權利要求8的微生物，其中所述P-450基因是來自^reptom;;c"ca/^o;/n7tw的P-450sca-2或其同源物。10.根據權利要求1到9中任一項的微生物，其還包含鐵氧還蛋白基因。11.一種生產感興趣的化合物的方法，包括步驟(a)用包含感興趣的基因的多核苷酸轉化宿主細胞，所述感興趣的基因編碼制甲羥酶素生物合成的最低需要；(b)用下述多核苷酸轉化所述宿主細胞，所述多核苷酸包含編碼制甲羥酶素羥化酶的感興趣的基因和/或包含影響所述感興趣的基因表達的DNA序列；(c)選擇經轉化的細胞的克隆；(d)培養所述經選擇的細胞；(e)任選地對所述被培養的細胞補充營養來源；和①任選地從所述培養物中分離所述感興趣的化合物。12.根據權利要求11的方法，其中所述宿主細胞是權利要求1到10中任一項的微生物。13.根據權利要求11到12中任一項的方法，其中所述感興趣的化合物是普伐他汀。14.根據權利要求13的方法，其中所述宿主細胞包含具有改進的動力學特征的同源蛋白質。15.根據權利要求13到14中任一項的方法，其中所述宿主細胞包含氧化還原再生系統。16.—種生產普伐他汀的方法，包括步驟(a)將產制甲羥酶素的宿主細胞與表達制甲羥酶素羥化酶的宿主細胞混合.(b)將兩種宿主細胞作為混合的培養物培養；和(C)任選地從所述混合培養物中分離普伐他汀。17.在也生產制甲羥酶素的宿主細胞中生產的普伐他汀。全文摘要本發明提供了一種微生物，其含有制甲羥酶素生物合成基因和將制甲羥酶素轉化為普伐他汀的基因。在一個優選的例子中，所述制甲羥酶素生物合成基因為mlcA和/或mlcB和/或mlcC和/或mlcD和/或mlcE和/或mlcF和/或mlcG和/或mlcH和/或mlcR，將制甲羥酶素轉化為普伐他汀的所述基因為羥化酶基因。另外，本發明提供了生產感興趣的化合物如抑制素的方法。在一個優選的例子中，所述抑制素為普伐他汀。文檔編號C12N15/80GK101490263SQ200780023192公開日2009年7月22日申請日期2007年6月19日優先權日2006年6月22日發明者伯納德·邁瑞克,馬可·亞歷山大·伯格·范德申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司