在轉基因植物中增加抗大豆銹病抗性的方法

專利名稱：：在轉基因植物中增加抗大豆銹病抗性的方法在轉基因植物中增加抗大豆銹病抗性的方法
背景技術：
：本發明涉及在轉基因植物和/或植物細胞中增加抗大豆銹病抗性的方法，以及用于核酸分子產生這些植物和/或植物細胞的用途。在這些植物中，與野生型植物相比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性被改變。此夕卜，本發明涉及具有增加的抗大豆銹病抗性的轉基因植物和/或植物細胞，以及包含下述序列的表達載體，所述序列與編碼功能性或非功能性MLO或其片段的序列同一、同源或互補。植物普遍遭遇致病微生物。由多種病原體如病毒、細菌和真菌引起的植物疾病可以導致栽培植物的生長中顯著的作物損失，一方面是經濟后果，另一方面還引起對人食品的安全性威脅。從上個世紀開始已經使用了化學殺真菌劑來控制真菌疾病。盡管使用這些物質使得植物疾病程度減少，但是直到現在還不能排除這些化合物是否對人、動物和環境具有有害作用。為了將常規殺蟲劑的使用減到最小，因此重要的是檢查多種植物對于不同的病原體的天然病原體防御，并且除了經典的培育方法外，系統性使用遺傳工程(例如通過引入外部抗性基因或通過操作植物中內源基因表達)以產生病原體抗性植物。抗性通常意思是植物防止或至少是減少有害病原體侵染和建群的能力。在天然存在的抗性中可以辨別出不同的機制，應用所述機制植物抵御致植物病生物的建群。病原體和宿主之間這些特異性的相互作用確定了感染過程(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanze叩hysiologie，SpringerVerlag，Berlin-Heidelberg,德國)。在品種特異性抗性(也稱為宿主抗性)方面，相容和不相容相互作用之間有差異。在相容相互作用中，在強毒病原體和易感植物之間發生相互作用。病原體生存并且可以建立繁殖結構，而同時宿主死亡。另一方面，13當病原體感染植物但是在弱的癥狀a之前或之后其生長^皮抑制時，不相容相互作用發生。在后一種情形中，植物對各個病原體有抗性(Schopfer和Brennick,見上)。在相容和不相斜目互作用中，發生了宿主對病原體的防御和特異性反應。但是，在大自然中，由于病原體迅速的進化t艮，這一宿主抗性通常被克服(Neu等人(2003)AmericanCytopathol.Society,MPMI16No.7:626-633)。與此相比，非宿主抗性提供了強的、廣泛的和持久的對植物病原菌的保護。非宿主抗性意思是這樣的現象，即病原體可以在某些植物物種中誘導疾病，但是在其他植物物種中不誘導(Heath(2002)Can.J.PlantPathol.24:259-264)。除了這一有意思的特征外，迄今為止對于非宿主抗性的遺傳和分子生物學基礎理解的纟艮少。存在這樣的指示，即非宿主抗性是由不確定的物質誘導的，而且單個病原體蛋白質誘導非宿主抗性反應(Heath(1981)Phytopathology71:1121-1123;Heath(2001)Physiol.Mol.PlantPathol.58:53-54;Kamoun等人(1998)PlantCell10:1413-1425;Lauge等人(2000)Plant丄23:735-745;Whalen等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6743-6747)。非宿主抗性的現象也可以;L基于植物物種的結構或化學性質，例如角質層的厚度或抑制性物質的存在。除了基于形成的物理屏障的抗性外，植物最有效的非宿主防御系統是由保守的分子微生物結構的識別所代表的，這也被稱為PAMP(病原體相關性分子圖式)。由PAMP-受體識別PAMP觸發了導致多個抗性機制活化的信號級聯^L大，所述抗性機制包括細胞壁強化、毒性化合物分泌和程序性細胞死亡。這些防御機制足夠有效地停止大多數微生物嘗試的襲擊。這完整部分。僅有一些病原體物種進化出了特異性機制來避免或阻斷單個植物物種的基礎防御系統，并且因此成為這些物種的病原體。可以想象這些物種特異性防御破壞的關鍵步驟是靶向和操作特定的宿主蛋白質。白粉病是許多單子葉植物和雙子葉植物(如甜菜、多種谷類、黃瓜、萵苣、胡蘿卜、豌豆、番茄，草莓，蘋果，葡萄等)的普通真菌疾病。白粉病菌(白粉菌目(Erysiphales))屬于子囊菌門(Ascomycota)。禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminis)是引起草類中白粉病的真菌。大麥白粉病真菌(禾本科布氏白粉菌大麥專化型(Blumeriagraminisf.sp.hordei，Bgh))是攻擊大麥(T/onsfewMvw/gfl^L.)表皮細胞的專性活體營養病原體。在將孢子與大麥葉的角質層相接觸后，形成了附著器。真菌侵襲的下一關鍵步驟是細胞壁的穿入，接著是被稱為"吸器"的特化的細胞內攝食結構的建立(不破壞質膜的完整性)。在單子葉植物大麥中，七螺旋質膜定位的MLO蛋白質家族同種型的存在是白粉病菌成功侵入宿主細胞壁所需要的。缺乏這些MLO蛋白質(由于天然遺傳變異或者在各個附/o基因中經誘導的損傷引起的)導致真菌孢子不能穿過植物細胞壁。缺乏功能性附/o基因的所有大麥基因型對于所有已知的大麥白粉菌的分離群是有抗性的。此外，在田地條件下，隱形遺傳的mlo抗性是非常持久的。在過去的25年中，已經在大多數歐洲春季大麥品種中使用mlo突變。MLO蛋白質是必需的質膜定位的蛋白質并且包含7個疏水跨膜結構域。細胞質C-末端具有兩親性a-螺旋，其作用為鈣調蛋白結合結構域，這對于MLO蛋白質的完全活性是必需的。在體外和體內都顯示了與這一肽結構域的鉤-依賴性鈣調蛋白結合，所述結合貢獻了大約一半的mlo的易感性-賦予的活性(KimM.C.Nature.2002Mar28;416(6879):447-51)。當被突變時會阻抑mlo-介導的抗性的基因fw26wto拔^2摩;f的J被發現編碼質膜-停留的突觸融合蛋白，所述突觸融合蛋白是屬于SNARE蛋白質超家族的蛋白質。缺乏野生型ROR2部分損害了mlo基因型中的穿入抗性，表明突觸融合蛋白活性是有效的mlo抗性所需的(FreialdenhovenA.PlantCell.1996Jan;8(l):5-14)。MLO和ROR2似乎都在嘗試的真菌細胞壁侵入位點處主要聚集。因此，看起來MLO和ROR2在生物脅迫的位點處形成新的病原體觸發的微域(BhatR.A.Proc.15Natl.Acad.Sci.USA.20052月22;102(8):3135-40)。在這些亞細胞區域中，在成功的真菌宿主細胞侵襲過程中，MLO和細胞質鈣傳感器釣調蛋白之間的相互作用瞬時增加(BhatR.A.，見上)。此外，顯示了MLO和ROR2之間的直接的物理相互作用。在單氨基酸取代mlo突變蛋白質的子集和野生型ROR2之間，以及在野生型MLO和由大麥ror2突變體所編碼的大麥變體之間這一相互作用的強度被強烈降低。MLO可以在質膜處調節SNARE蛋白質依賴性和小泡轉運相關的過程。因此，白粉病菌似乎特異性地破壞MLO來調節植物細胞外圍的小泡相關的過程用于成功發病。MLO的這一機制在植物中似乎是保守的。雙子葉植物鼠耳芥(爿r"A/^;w's)包含大麥MLO的15個同源物，凈皮稱作AtMlol-AtMlolS。AtMlo2的敲除賦予了針對白粉病菌二孢白粉菌(￡>,v—ec/r/c/iomm^"附)和G"o/v/"o附j^51ow/"/,.的抗性。這些數據表明白粉菌感染機制在單子葉植物和雙子葉植物中是保守的。認為可能是每種病原體物種進化其自己的特異性方式來阻抑和克服一般化或特化的宿主防御機制。由mlo介導的抗性表型似乎對于白粉病菌(子嚢菌門一盤菌亞門(Pezizomycotina)-錘舌菌綱(Leotiomycetes)—白粉菌目(Erysiphales))是高度特異性的。迄今為止，從文獻中已知mlo突變并不賦予針對除白粉病菌外的任何其他病原體的抗性。例如，mlo突變并不賦予任何對子嚢菌門的其它真菌(與白粉病菌相近)的抗'1"生。在用小麥全蝕病真菌(禾丁貞嚢殼(GV1ew附ffww0附yc&sgni附/w/s):子嚢菌門-盤菌亞門-糞殼菌綱(Sordariomycetes)-不確定的糞殼菌纟岡(Sordariomycetesincertaesedis)—巨座殼科(Magnaporthaceae);JorgensenJ.H.InducedMutationsAgainstPlantDiseases,Proc.Symp.Wien，1977.Wien:Int.AtomicEnergyAgency,第533-547頁)接種大麥后沒有觀察到mlo的作用。與附/o野生型植物相比，大麥mlo突變體在對一定范圍的其他才直物病原體的感染表型上并沒有不同，所述其他植物病原體例如大麥葉銹病菌(條形柄銹菌(Pw"'/"/fl"nVybr附Zs);擔子菌門(Basidomycota)—銹菌綱(Urediniomycetes)—銹菌亞綱(Urediniomycetidae)—銹菌目(Uredinales)-柄銹科(Pucciniaceae))或條銹病菌(大麥柄銹菌(尸wc"Vi/fl);擔子菌門-銹菌綱-銹菌亞綱-銹菌目-柄銹科)此外，nilo突變體對于大麥對半活體營養的稻瘋病真菌稻痙病菌(A/^rt"/7^幼eg/^e")(子嚢菌門-盤菌亞門-糞殼菌綱-不確定的糞殼菌綱—巨座殼科；JaroschB.Mol.Plant-MicrobeInteract.12(6):508-514，1999)和對于壞死營養型真菌小麥根腐病菌(fi//w/"〃's^wA;Z",Vmfl)(子嚢菌門—盤菌亞門—座嚢菌綱(Dothideomycetes)-格孢腔菌目(Pleosporales)-格孢腔菌科(Pleosporaceae))的增強的易感性有作用。總之，除了白粉病菌外，已知沒有病原體受到mlo突變的負面影響。大豆銹病(SR)也已知為亞洲大豆銹病(擔子菌門(Basidiomycota)-銹菌綱-銹菌亞綱-銹菌目-層銹菌科(Phakopsoraceae))，是影響大豆和其他豆科植物的疾病。其由兩種類型的真菌豆薯層銹菌(尸/m/^/wom/7"(7i>r/"'z/)和山馬埴層銹菌(尸/iflA^/woni附do/mVie)引起,后者是兩者中較弱的病原體。當夏孢子萌發產生單芽管、形成附著器并且總是通過直接的角質層穿透感染時，大豆銹菌的感染過程開始。穿透隨著附著器錐體(cone)的形成開始，所述形成隨著穿透菌絲的細胞壁持續。穿透菌絲^表皮細胞、橫斷其并且達到葉肉的胞間隙，在該處形成第一隔膜(spetum)，將穿透菌絲與初級菌絲分開。在接種后24和48小時之間可見第一吸器。吸器在葉肉和表皮細胞中形成。在最優條件下，孢子經過6-7天成熟。然后，在感染健康大豆植物后，新的孢子產生大約10天。這些新的孢子可以再次感染同一植物，或者被攜帶到其他易感植物。大豆銹病引起大豆和其他宿主植物的子葉、莖、葉柄、葉和莢果的損傷。對大豆植物的主要影響是對光合組織的破壞，這隨后引起過早的脫葉、早熟和嚴重的產量減少(通過莢果和種子的數量減少以及減少的種子重量)。17目前，在任何美國商業大豆栽培種中都沒有對大豆銹病的抗性。已知對豆薯層銹菌(尸.尸flC/^T/^/)的特異性抗性，并且已經鑒定了4個單顯性基因，為Rppl、Rpp2、Rpp3和Rpp4。這些四基因條件抗性是對有限的銹菌分離群組。單基因抗性不是持久的，在鑒定了來源后很快就丟失了單基因的有效性。本發明的目標是提供在轉基因植物和/或植物細胞中增加對大豆銹病抗性的方法。該目標是通過主要權利要求的主題來實現的。其他獨立權利要求的特征用來解決說明書中表明的這一和其他目標。本發明的優選的實施方案由從屬權利要求的特征來限定。發明詳述令人驚訝地，發明人發現了mlo突變在針對大豆銹病的抗性反應中的影響。這一相互作用表型是完全出乎意料的，這是由于下述一些原因1,除了白粉病抗性外，迄今為止沒有描述任何其他的基于MLO影響(即MLO過量表達或MLO表達不足(underexpression))的抗性表型。對于真菌稻瘟病菌和小麥根腐病菌，甚至在mlo突變體中觀察到增強的易感性。2.在用其他銹菌感染后，mlo-大麥的表型與野生型植物沒有區別，所述其它銹菌銹病與大豆銹菌緊密相關，所述銹菌即條銹病菌(大麥柄銹菌，擔子菌門；銹菌綱；銹菌亞綱；銹菌目；柄銹科)和大麥葉銹病菌(條形柄銹菌，擔子菌門；銹菌綱；銹菌亞綱；銹菌目；柄銹科)。3.此外，MLO不影響使用與大豆銹菌類似的感染過程(例如表皮細胞的直接穿透和/或葉肉中的胞間生長)的其他致病真菌。例如，稻瘟病真菌稻瘋菌(Mflg"fl/w幼eoo^e)也直接穿透表皮以在葉中生長。4,最后，白粉病真菌來自子囊菌門，而亞洲大豆銹菌來自擔子菌門。因此，在第一個方面中，本發明涉及在轉基因植物和/或植物細胞中增加對大豆銹病的抗性的方法，其特征在于與野生型植物或植物細胞相比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性分別被改變。在本發明的范圍內，"轉基因"植物細胞(或植物)是待被引入核酸分子的細胞。該分子可以是DNA/cDNA分子或RNA分子，其可以是雙鏈或單鏈，此類分子的實例是雙鏈RNA分子或栽體，例如質粒、黏粒、重組病毒或小染色體。核酸分子可以包含來自宿主細胞物種或來自其他生物/物種的序列。此外，這些序列可以是天然的或經修飾的或合成的。根據本發明，"植物"可以是任何單子葉植物或雙子葉植物。優選是單子葉或雙子葉的農業、食物或飼料植物。優選地，單子葉植物選自大麥屬(//。n/e"附)(大麥)、燕麥屬(Jvewfl)(燕麥)、小麥屬(7V7Y/c"附)(小麥)、黑麥屬(5""/e)(黑麥)、稻屬(Orw")(稻)、高粱屬(5wgA"附)(黍)、玉蜀黍屬(Zm)(玉米)、稷屬(尸朋/cw附)、《良尾草屬(尸ewm、"w附)、狗尾草屬(SWflW")等。優選地，雙子葉植物選自大豆、棉花、油菜、番茄、糖蘿卜、馬鈴薯、向日葵、豌豆、觀賞植物、煙草、三葉草(車軸草屬物種(Trifoliumspec.))、野葛(Puerarialobata)、樹和豆科植物如苜蓿。其他農業植物可以包括水果(特別是蘋果、梨、櫻桃、葡萄、柑橘水果、鳳梨和香蕉)、油棕類、茶、可可和咖啡樹、煙草、劍麻，以及醫用植物如蘿芙木屬和digitales。特別偏好的是谷類小麥、黑麥、燕麥、大麥、稻、玉米和黍、糖蘿卜、歐洲油菜、大豆、番茄、馬鈴薯和煙草。其他農業植物可以取自美國專利US6，137，030。最優選的^:物是大豆。根據本發明的植物細胞包括經分化的和未經分化的植物細胞(包括原生質體)，所述細胞是通過本發明的方法產生的，已經向植物基因組中被整合了下文描述的核酸分子，或已經接受它們作為自主復制的分子。在本發明的范圍內，大豆銹病病原體是豆薯層銹菌或山馬蝗層銹菌。優選地，病原體是豆薯層銹菌。病原體"抗性"意思是在病原體攻擊后減少或削弱植物致病癥狀。該癥狀可以是多種類型的，但是優選包含直接或間接導致植物的質量、收成的大小、用作動物飼料或用于人消耗的食物的適合性損傷的那些，或者妨礙作物的纟番種、栽種、收獲或加工的那些。19根據本發明，術語"增加的抗性"(針對大豆銹病)被理解為意思是根據本發明的轉基因植物或植物細胞，與另外被以相同方式(例如氣候和栽培條件、病原體類型等)進行處理的未經轉化的野生型植物或植物細胞相比，更弱、和/或更不頻繁地被大豆銹菌感染。根據本發明，術語"野生型，，被理解為各自的未經遺傳修飾的親本生物。穿透效率以及乳突形成率提供了定量植物對病原體侵染的反應的可能性(見實施例)。術語"增加的抗性"也包括已知的瞬時病原體抗性，即與各自的野生型相比，根據本發明的轉瞬時沉默或瞬時抗性可以是有利的，因為其是其它允許產生具有增加的大豆銹病抗性，但是影響表型的方法的有價值的添加。通過本發明的方法產生并且在感染發展期間顯示出瞬時抗性的植物沒有表現出表型的任何顯著的改變，因此引起瞬時抗性的根據本發明的方法與其他方法一起有助于產生特征在于更持久和更穩定的抗性的植物，而沒有由該方法引起的對于表型限制的任何不利影響。大豆銹病的4曼染優選減少了至少10%或20%，更優選至少30%或40%，尤其優選至少50%或60%，特別優選至少70%或80%,以及最優選至少90%、95%或100%，這表現為致病癥狀發展的減少。根據本發明，"MLO蛋白質，，是具有如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的M酸序列的蛋白質，或者具有與所述序列基本同源的序列的蛋白質，或者與所述MLO蛋白質功能等價的蛋白質。上述序列所指定的MLO蛋白質來源于下列植物物種大麥(Hordeumvulgare)、大豆(Glycinemax)、稻(Oryzasativa)、亞麻(Linumusitatissimum)、普通小麥(Triticumaestiv腿)和鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)。但是許多其它物種例如玉蜀黍(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、金魚草(Antirrhinummajus)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、火炬松(Pinustaeda)、臺灣耬斗菜(AquilegiaFormosa)、Aquilegiapubescens、中果咖叫甘(Coffeacanephora)、野萵苣(Lactucaserriola)、萵苣(Lactucasativa)、姜(Zingiberofficinale)、野草莓(Fragariavesca)、Helianthuspetiolaris、蕪青(Brassicarapa)、日本百務沐(Lotusjaponicus)、展葉劍葉蘚(Physcomitrellapatens)、辣椒(Capsicumannuum)、番癡(Lycopersiconesculentum)和煙草(Nicotianatabacum)包含MLO蛋白質，所述MLO蛋白質也包含在本發明的范圍內。下列表l將給出對于MLO蛋白質的數據庫研究結果的概述。Hit—n)生物登錄號專利號/GI號FastAlertN|EP1586645.43647鼠耳芥EP1586645FastAlertN|JP2005185101.15616—稻JP2005185101FastAlert_N|US2004123343.11552一稻US2004123343FastAlertN|US2004214272.113197—玉蜀黍US2004214272FastAlertN|US2006107345.16980US200610734FastAlert，S2006135758.8510US2006135758FastAlert—N|US2006141495.4465US200614149FastAlertN|US2006143729.3731—US2006143729FastAlertN|US2006150283.101384US2006150283FastAlertN|US6680427.1US6680427GENBANK—EST2|BX837230鼠耳芥BX83723042531313GENBANK—EST2|CA084154甘蔑CA08415434937465(;F細ANK一EST2ICB642264稻(日本栽培種組(japonicacultivar-groupCB6422642963725521<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>GENBANKHTC|BX827067—鼠耳芥BX82706742462173GENBANKHTC|BX831968一鼠耳芥BX83196842458075GENBANKHTC|BX832580鼠耳芥BX83258042459139GENBANKHTC|BX841625鼠耳芥BX84162542406472GENBANK|A92828大麥A928286741365GENBANK|A92837稻A928376741373GENBANK|A92838大麥A928386741374GENBANK|AF361932普通小麥AF36193215290588152卯589GENBANK|AF361933普通小麥AF3619331S2905卯15290591GENBANK|AF369563鼠耳芥AF3695631409157314091574(;ENBANK|AF369565鼠耳芥AF3695651409157714091578GENBANK|AF369566鼠耳芥AF3695661409157914091580GENBANK|AF369568鼠耳芥AF3695681409158314091584GENBANK|AF369569鼠耳芥AF3695691409158514091586(;ENBANK|AF369572鼠耳芥AF3695721409159114091592(;ENBANK|AF369573鼠耳芥AF3695731409159314091594(;ENBAN単F369574鼠耳芥AF3695741409159514091596GENBANK|AF384030稻(印度栽培種組)AF384030152卯60415290605GENBANK|AF384144普通小麥AF3841441433416614334167GENBANK|AF384145普通小麥AF3841451433416814334169GENBANK|AF388195稻(印度栽培種組)AF388195147186031471860424<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>GENBANK|AX063304鼠耳芥AX0633041254109412541095GENBANK|AX063306鼠耳芥AX0633061254109612541097GENBANK|AX063308鼠耳芥AX0633081254109812541099GENBANK|AX412295鼠耳芥AX41229521444753(;ENBANK|AX506391鼠耳芥AX50639123387628GENBANK|AX506652鼠耳芥AX50665223387889GENBANK|AX506994鼠耳芥AX50699423388231GENBANK|AX507353鼠耳芥AX507353233885%GENBANK|AX507573鼠耳芥AX50757323388810(;ENBANK|AX653006稻AX65300629155820GENBANK|AX653229稻AX65322929156043GENBANK|AX653497稻AX65349729156311GENBANK|AX653740稻AX65374029156554GENBANK|AX654786粕AX65478629157600GENBANK|AY029312玉蜀黍AY0293124445850144458502GENBANK|AY029313玉蜀黍AY0293131378497613784977GENBANK|AY029314玉蜀黍AY0293141378497813784979GENBANK|AY029315玉蜀黍AY0293151378498013784981GENBANK|AY029317玉蜀黍AY0293171378498413784985GENBANK|AY029318玉蜀黍AY0293181378498613784987GENBANK|AY029319玉蜀黍AY0293191378498813784989(;ENBANK|AY029320養蜀黍AY029320137849卯13784991GENBANK|AY054241鼠耳芥AY0542411580994515809946GENBANK|AY057502鼠耳芥AY057502159827卯15982791GENBANK|AY072135鼠耳芥AY072135181759522618175953GENBANK1AY086586鼠耳芥AY0865862140529621554658GENBANK|AY113992鼠耳芥AY1139922128082421280825GENBANK|AY581255大麥vulgare亞種(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)AY5812554640514246405143GENBANK|AY584534普通小麥AY5845344640585446405855GENBANK|AY599871展葉劍葉蘚AY5998714702856247028563GF駕ANKiAY934528辣椒AY9345286061725660617257GENBANKJAY967408番茄AY9674086220813862208139GENBANK|AY967409蕪青AY9674096220814062208141GENBANK|AY967410曰本百J3^艮AY9674106220814262208143GENBANK|BT000434鼠耳芥BT0004342330636723306368GENBANK|BT002581鼠耳芥BT0025812731195027311951GENBANK1BT002918鼠耳芥BT0029182775457327754574GENBANK|BT004356鼠耳芥BT0043562839388428393885GENBANK|BT009442普通小麥BT00944232128993(;EIVBA]VK|BT010322鼠耳芥BT0103223394204033942041GENBANK|DW486556GENBANK|Z83834大麥vulgare亞種Z8383418772201877221GFNBANK|Z95352鼠耳芥Z9535227658162765817GEINESEQDNA|AAA52708普通小麥.AAA52708WO20003611027GENESEQDNA|AAA527;15普通小麥.AAA52715WO200036110:GENESEQDNA|AAA527i18普通小麥.AAA52718WO200036110GENESEQDNA|AAC44660鼠耳芥.AAC44660EP1033405GENESEQDNA|AAF24583小麥屬物種AAF24583WO200078799GENESEQDNA|AAF24584小麥屬物種AAF24584WO200078799GENESEQDNA|AAF24585—小麥屬物種AAF24585WO200078799GENESEQDNA|AAF24586鼠耳芥.AAF24586WO200078799(;ENFSEQDNA|AAF24587鼠耳芥.AAF24587WO200078799GENESEQDNA|AAF24588一鼠耳芥.AAF24588WO200078799(;F駕SEQDNA(AAF24589鼠耳芥.AAF24589WO200078799GENESEQDNA|AAF245卯鼠耳芥.AAF245卯WO200078799(;ENESEQDNA|AAS01109玉蜀黍.AAS01109US6211433GENESEQ_DNA|AAV35022大麥.AAV35022WO9804586GF:NESEQ一DNAiAAV35026大麥.AAV35026WO9804586GENESEQ—DNA|AAV350'28—稻.AAV35028WO9804586;GENESEQ—DNA|AAV35030大麥.AAV35030WO9804586GENESEQD闊AAV35031鼠耳芥.AAV35031WO9804586SEQD闊AAX582i70一玉蜀黍.AAX58270W09923235GENESEQDNA|AAX58273一玉蜀黍.AAX58273W09923235;GENESEQ—DNA|AAX582|74玉蜀黍.AAX58274W0992323528<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>GENESEQDNA|ABZ14243鼠耳芥.ABZ14243WO200216655GENESEQDNA|ABZ14463鼠耳芥.ABZ14463WO20021665GENESEQDNA|ADA67959鼠耳芥.ADA67959WO2003000898GENESEQDNA|ADA68054鼠耳芥.ADA68054WO2003000898GENESEQDNA|ADA69553稻.ADA69553WO2003000898GENESEQDNA|ADA69776稻.ADA69776WO2003000898GENESEQDNA|ADA70044稻.ADA70044WO2003000898GENESEQDNAJADA70287稻.ADA70287WO2003000898(;FNESEQDNA|ADA71333一稻.ADA71333WO2003000898GENESEQDNA|ADG87617—鼠耳芥.ADG87617WO200222675GENESEQDNA|ADG87618鼠耳芥.ADG87618WO20022267GF息SEQDNA|ADT16339植物界ADT16339US2004216190GENESEQD酬ADT18635植物界ADT18635US2004216190GENESEQDNA|ADX12455未鑒定的ADX12455US2004034888GENESEQDNA|ADX27198未鑒定的ADX27198US2004034888GENESEQDNA|ADX30090一未鑒定的ADX30090US2004034888GENESEQDNA|ADX31306—未鑒定的ADX31306US2004034888GENESEQDNA|ADX46115未鑒定的ADX46115US2004034888GENESEQDNA|ADX474:77—未鑒定的ADX47477US2004034888GENESEQ—DNA|ADX54605一未鑒定的ADX54605US200403488830<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>CLUSTAL方法(Higgins等人，1989，Comput.Appl.Biosci.，5(2)，151)來確定。本領域技術人員可用于比較序列并且基于算法的其它程序是例如Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法。其它有用的程序是PileAupa程序(丄Mol.Evolution.(1987)，25，351-360;Higgins等人，(1989)，Cabgos，5，151-153)或者空位和最佳適配程序(theGapandBestFitprogram)(Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol"48，443-453，以及Smith和Waterman(1981)，Adv.，Appl.Math.，2，482-489)或遺傳計算機公司(theGeneticsComputerGroup)的GCG軟件包的程序(575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)。序列比對也可以用CIustalW程序從網頁hftp:〃www.ebi,ac.uk/clustahv或者用NCI3IBlast序列比對程序從網頁hltp:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/或http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi進行。本領域的技術人員可以在網絡(例如http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez或http:〃www.tigr.org)可用的數據庫中發現足夠的核酸或M酸序列。除了已知的在本發明中公開的MLO序列外，以后在這些數據庫中可以發現其它序列，這些序列可以用于本發明的上下文中。另外，本領域的技術人員已知允許其從其它生物中分離同源序列的技術。其可以進行同源性比較(通過CLUSTAL、BLAST、NGBI)，然后通過標準實驗室方法分離經鑒定的同源核苷酸序列，所述標準實驗室方法例如引物設計、PCR、雜交或用足夠的探針篩選cDNA文庫(參見例如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NY)。然后可以確定經鑒定的蛋白質的功能。與MLO氨基酸序列"基本同源"(=基本相似)的M酸序列意思是，在本發明的范圍內，該序列與在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中描述的任何MLO蛋白質的M酸序列或者其功能等價的部分或片段有至少40%或50°/0，優選至少55%或60%，更優選至少65%或70%，尤其優選33至少75%或80%，特別優選至少85%或卯％，以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相似。優選地，在那些蛋白質的整條序列長度上確定同源性。相同的定義類似地應用于核酸序列。如果一些上述M酸序列僅僅是全長MLO蛋白質的部分序列(例如SEQIDNO:7)，那么術語"基本同源的氨基酸序列"也是針對全長序列或者可以在將來被鑒定的全長序列的新的部分。根據本發明，與MLO蛋白質"功能等價"的蛋白質是這樣的蛋白質，其與具有在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所描述的氨基酸序列的任何MLO蛋白質具有相同的細胞功能、相同的結合性質和/或相同的結構性質。細胞功能尤其是指蛋白質與其病原或生理性結合伙伴蛋白(partner)的相互作用，即在MLO蛋白質的情形中，是它們與鈣調蛋白和/或ROR2的相互作用。另一可能的MLO蛋白質的生理性結合伙伴蛋白是腺苷三磷酸酶蛋白質家族。將來將公開的任何其它可能的相互作用伙伴蛋白也意味著包括在本發明的范圍內。功能等價的蛋白質也可以是所述MLO蛋白質的部分(片段)，例如在N-末端和/或C-末端具有氨基酸缺失或添加的蛋白質。其還可以是具有一個或多個氨基酸改變、插入或缺失(不導致改變的細胞功能、結合性質和/或結構性質)的蛋白質。功能性點突變是例如通過保守性M酸改變來實現的，所述保守性氨基酸改變即將氨基酸改變為另一個氨基酸，所述另一個氨基酸具有相當的物理化學性質，例如疏水、親水、帶正電荷、帶負電荷的氨基酸等。保守性氨基酸改變的一個實例是纈氨酸替換成丙氨酸(或者反過來)。技術人員需要記住要實現改變的區域，即如果其是對于MLO蛋白質與其結合伙伴蛋白的相互作用關鍵的區域。例如，MLOC-末端包含釣調蛋白結合位點。與已知MLO序列的序列比對給出了這樣的指示即一個區域是否對于蛋白質的結合性質來說是關鍵的。與保守性氨基酸改變相反，本領域的技術人員假設改變(例如帶正電荷的M酸改為帶負電荷的M酸(例如賴氨酸-谷氨酸))將導致MLO蛋白質的功能或結構的變化。相同的考慮應用于產34生mlo的功能性插入或缺失突變體。技術人員將注意到這樣的問題即插入的或缺失的氨基酸或氨基酸范圍是位于對于Mlo的結合性質來說關鍵還是不關鍵的區域中。在本發明的上下文中，MLO的"片段"是MLO蛋白質的一部分，其中原始MLO蛋白質具有例如如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的氨基^列。通常，該片段缺乏N-末端或C-末端的氨基酸。在MLO片段需要有功能的情形中，該片段具有"完整"MLO蛋白質長度的優選至少40°/。或50%、優選至少55%或60%、更優選至少65%或70%、尤其優選至少75%或80%、特別優選至少85%或90%,以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。但是，下文描述的一些方法并不需要編碼MLO蛋白質"片段"的核,列必須編碼功能性蛋白質。在那些情形中，核酸的"片段，，或"部分，，可以是短至20個核苷酸，在一些情形中甚至更短。(氨基酸或核酸)片段的長度的細節將于下文描述。優選地，用于本發明的MLO是植物MLO，更優選的是選自以下的植物MLO:大麥MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO,尤其優選AtMlol、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlolO、AtMloll、AtMlol2、AtMlol3、AtMlol4或AtMlol5，亞麻MLO、普通小麥(小麥)MLO、大豆Mlo，尤其優選GmMIol、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或與任一所述MLO蛋白質基本功能等價的MLO。特別優選地，用于本發明的MLO是選自以下的MLO:具有如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有與在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等價的M酸序列的MLO。在本發明的范圍內，MLO蛋白質的"含量"被認為是MLO蛋白質的量，可以刻對其進行測定。適合于在植物細胞中確定MLO的量的一些方法將在下面描述。所有那些技術是對于技術人員來說熟知的常規實驗室方法。確切的方案可以從任何標準的實驗室教科書中習得。ML()RNA的量(是蛋白質的量的直接指示)可以通過反轉錄酶PCR(RT-PCR)來確定1.分離總RNA，2.使用聚-T-引物或隨機六聚體引物反轉錄為cDNA，3.使用cDNA作為模板，用Mlo特異性引物進行PCR。(或使用Quiagen試劑盒的一步RT-PCR)。定量MLORNA的量的另一種可能性是Northern印跡技術。這一方法是基于電泳分離的RNA分子從凝膠向吸收層(absorbentsheet)的轉移，所述吸收層隨后被浸入到將與目的RNA雜交的經標記的探針中來顯現其存在。可以通過Western印跡(免疫印跡)技術來確定蛋白質的量這是在組織勻漿或提取物的給定樣品中檢測蛋白質的方法。其使用電泳來通過質量分離變性的蛋白質。然后將蛋白質轉移出凝膠并且轉移到膜(通常為硝化纖維素)上，在所述膜上其被使用對該蛋白質特異性的抗體"探測到"。免疫組織化學染色也是在組織中檢測特異性抗原的有價值的工具。為了進行標準的染色步驟，首先將組織切片脫蠟，然后在應用一抗之前將其再水合。然后應用酶綴合的二抗并且在添加酶特異性底物后可以觀察到特異性染色。有時候，當觀察到弱染色或無染色時，可能需要通過酶消化進行抗原"解掩蔽"。MLO蛋白質的"活性，，意思是其進行其細胞功能，尤其是與其生理或病原性結合伙伴蛋白(最尤其是與ROR2和/或鈣調蛋白)相互作用的能力。或Ror2的相互作用。在酵母雙雜交(分裂-泛素(split-ubiquitin))系統中顯示了釣調蛋白與MLO的相互作用(見KimM.C.JournalofBiologicalChemistry.277(22):19304-19314，20025月31日；和KimM.C.Nature.416(6879):447-450,20023月28日)。另外，在GST-下拉實驗中也顯示相互作用(見KimM.C.Nature.416(6879):447-450，2002Mar28)。ROR2突出融合蛋白與MLO的相互作用通過FRET顯示(見BhatR.A.Proceedings102(8):3135-3140,2005-2-22)合伙伴蛋白。分裂-泛素系統M現新的相互作用伙伴蛋白的適當的系統(如Kim等人，2002，見上所述)，但是也可以使用基于瞬時轉化(高通量)FRET或雙-熒光互補(BiFc)篩選。在兩種情形中，MLO誘何都與熒光蛋白質(對于FRET為YFPf.l.，對于BiFC為YFP的N或C末端)融合。對于捕獲物，cDNA文庫與CFP(FRET)或YFP的互補半部分(BiFC)融合。誘餌和捕獲物在表皮細胞或原生質體中共-表達。通過CLSM或熒光光度計測量熒光。當在植物或植物細胞中改變MLO蛋白質的含量和/或活性時，可以比野生型減少或增加。增加MLO的含量可以通過增加內源MLO的量(即MOL)或者通過將額外的MLO的量引入植物或植物細胞來實現。根據本發明在植物或植物細胞中的MLO含量的減少通常通過減少內源MLO的量來實現。因此，MLO活性的增加可以通過增加內源MLO活性和/或引入額外量的功能性MLO來實現。MLO活性的減少可以通過減少內源MLO的活性來實現。類似地，MLO活性的減少也表示內源MLO活性未被修飾，但是其與生理或病原性結合伙伴蛋白的相互作用^皮抑制，例如通過非功能性MLO或抗MLO抗體或MLO抑制劑的表達。換句話說，MLO蛋白質與其結合伙伴蛋白的相互作用被基本上阻抑和/或被充分阻止。因此，本發明優選的實施方案涉及在轉基因植物和/或植物細胞中增加針對大豆銹病的抗性的方法，其特征在于與野生型相比，至少一種內源MLO蛋白質的含量和/或活性減少。根據本發明的轉基因植物或植物細胞中MIo含量和/或活性的減少優選為至少10%、15%、20%或25%，更優選為至少30%、35%、40%或45%,尤其優選是至少50%、55%、60%或65%，特別優選是至少70%、75%、3780%或85%，并且最優選是至少卯％、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。MLO蛋白質的含量和/或活性的減少可以通過不同的方式來實現。一種優選的方法是向植物細胞轉移至少一種核酸分子，所述核酸分子包含至少一種序列，所述序列與編碼內源MLO或其片段的序列同一、同源或互補。根據本發明，"核酸分子"可以是DNA分子，例如包含基因組序列或cI)NA序列；或者是RNA分子。分子可以是雙鏈或單鏈。此類分子的實例是雙鏈RNA分子或載體，例如質粒、勦粒、重組病毒或微型染色體。核酸分子可以包含來自宿主細胞物種或來自其它生物/物種的序列。此外，所述序列可以是天然的或經修飾的或合成的。核酸分子向植物或植物細胞的"轉移"可以通過不同的方法進行。優選地，轉移通過轉化、轉染(穩定或瞬時)、注射、生物射彈方法和/或電穿孔來發生，尤其是當核酸分子是DNA時。DNA可以以例如載體或無常規載體主鏈的線性"啟動子-基因-終止子構建體"的形式存在。當分子是雙鏈RNA時，轉移可以通過生物射彈方法進行。技術人員熟悉那些方法并且能容易地鑒定對于其實際需要所最佳的轉移方法。將詳細描述一些轉移方法(見下)。與編碼MLO蛋白質(或其片段)的序列"同一"的核*列意思是在序列之一的某一區域，優選在序列之一的完整區域上同一。與編碼MLO蛋白質(或其片段)的序列"同源"的核^列意思是，在本發明的范圍內，該序列與編碼在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中描述的任何MLO蛋白質或者其功能等價的部分或片段的核苷酸序列有至少40%或50%，優選至少55%或60%,更優選至少65%或70%，尤其優選至少75%或80%，特別優選至少85%或卯％，以及最優選至少92%，94%，95%，96%，97%,98%或99%相似。優選地，在核酸分子的整條序列長度上確定同源性。編碼核酸序列的MLO可以由任何技術人員容易地自所述氨基*列推論出。一些各自的編碼核,列示于SEQIDNO:1、3、5、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47。當然所述序列是非限制性的。技術人員將使得核酸序列適用于宿主細胞的優選的密碼子選擇。下"2給出了上述M酸和核^列的概述。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>28AtMlo53￡l02281529AtMlo611330—AtMlo633Q94KB73rAtMlo711332~—AtMlo702275233，AtMlo8na34A薩o8犯02275735—AtMlo93S一AtMlo933Q94KB437AtMlolOus3[AtM函33Q9FKY539A麵ollii340AtMloll33Q9FI0041A翻o1242AtMlol2犯08096143AtMlol344AtMlol3Q94KB245AtMlol446AtMloHQ94KB147—AtMlol54廠AtMlol5asNP973686根據本發明的一個優選的實施方案，經轉移的核酸分子的一部分與編碼內源MLO或其片段的序列至少50%、優選至少60%、尤其優選至少70%、特別優選至少80%、還特別優選至少90%、以及最優選至少95%同源。與編碼MLO蛋白質(或其片段)的序列"互補"的核紗列意思是，在本發明的范圍內，該序列可以與編碼MLO蛋白質(或其片段)的核*列在嚴格條件下雜交，所述雜交是由于互補堿基之間的氫鍵。這一雜交必須是特異性的。本領域的技術人員已知為了彼此雜交，兩個序列不需要具有100%互補性。在本文中，"互補，，核酸序列與編碼在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO蛋白質或其功能等價的部分或片段的核^f列有至少40%或50%，優選至少55%或60%、更優選至少65%或70%、尤40其優選至少75%或80%、特別優選至少85%或卯％，以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%互補。在本發明的上下文中，術語"在嚴格條件下雜交"意思是在嚴格到足以確保特異性雜交的條件下在體外進行雜交。嚴M外雜交條件是本領域技術人員已知的，并且可以在文獻中找到(例如Sambrook和Russe11(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NY)。術語"特異性雜交，，是指這樣的事實，即分子優選與某一核酸序列(靶序列)在嚴格條件下結合(如果該靶序列是例如DNA或RNA分子的復雜混合物的一部分)，但是不與其它序列結合或者至少以相當更低的程度與其它序列結合。嚴格條件取決于a。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。通常，選捧嚴格條件使得雜交溫度低于特異序列在給定的離子強度和給定的PH值下的解鏈溫度(Tm)大約5。C。Tm是在平衡狀態中50。/。的與靶序列互補的分子雜交耙序列時的溫度(在給定的pH值、給定的離子強度和給定的核酸濃度)。通常，嚴格條件是那樣的，其中鹽濃度在pH為7.0至8.3之間至少是大約0.01至1.0M的鈉離子濃度(或另一種鹽的濃度)，且對于短分子(即例如10至50個核苷酸)而言溫度至少是30。C。此外，嚴格條件可以包括添加去穩定雜化物的物質例如甲酰胺。嚴格雜交條件的優選的非限制性實例是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在大約45。C雜交，接著是一步或多步在0.2xSSC、0.1。/。SDS在50至65。C的洗滌步驟。溫度，例如，在依據核酸類型的標準雜交條件下，在濃度為0.1至5xSSC(pH7.2)的含水緩沖液中范圍在42。C和58。C之間。如果有機溶劑例如50%的甲酰胺存在于上述援沖液中，則標準條件下的溫度為大約42。C。優選地，DNA:DNA雜化物的雜交條件是例如O.lxSSC，以及20。C至45。C，優選30。C至45。C。優選地，DNA:RNA雜化物的雜交條件是例如O.lxSSC和30。C至55°C，優選在45。C至55。C之間。例如對于具有大約100個堿基對的長度且G/C含量為50。/。的的核酸來說，在甲酰胺不存在時確定上述雜交溫度。本領域的技術人員已知如何使用上述或下列教科書來確定所需的雜交條件CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，Hames和Higgins(出版者)1985NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLOxfordUniversityPress印刷，Oxford;Brown(出版者)1991，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,OxfordUniversityPress進行IRL印刷，Oxford.典型的雜交和洗滌緩沖液具有例如下列組成(這一實例是非限制性的):^雜it溶濕0.5%SDS5xSSC50mMNaPO4，pH6.80.1%焦磷酸鈉5xDenhardt，s溶液100|ag/ml鮭精染it溶濕預雜交溶液lxl()6cpm/ml探針(5-10分鐘95。C)，^CV3MNaCl0.3M檸檬酸鈉用HCI加至pH750x/)e由^，s試浙5g菲可5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血、清白蛋白添加500ml蒸餾水(A.dest)用于雜交的典型方法如下(該實例是非限制性的)任逸她；在65。C在lxSSC/0.1%SDS中洗滌印跡30分鐘42在50-55°C至少2小時在55-60°C過夜遂恭05分鐘2xSSC/0.1%SDS雜交溫度。30分鐘2xSSC/0.1%SDS雜交溫度。30分鐘lxSSC/0.1%SDS雜交溫度。45分鐘0.2xSSC/0.1%SDS65。C5分鐘O.lxSSC室溫。本領域的技術人員已知所示的專用溶液和方案可以或必需根據應用而被修改。根據本發明的一個優選的實施方案，經轉移的核酸分子的一部分與編碼內源MLO或其片段的序列有至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、尤其優選至少80%、特別優選至少90%,以及最優選至少95%互補。根據本發明的另一優選的實施方案，與編碼內源MLO或其片段的序列同一、同源或互補的經轉移的核酸分子的部分包含20至1000個核苷酸，優選20至750個核苷酸、更優選20至500個核苷酸、尤其優選20至250個核苷酸、特別優選20至150個核苷酸，也特別優選20至100個核苷酸，以及最優選大約20至50個核普酸。可以通過不同方法實現至少一種內源MLO含量和/或活性的減少，例如通過RNA干擾(RNAi)、反義構建體、共-阻抑構建體、轉錄后基因沉默(PTGS)、核糖核酸酶P構建體、同源重組、核酶構建體或病毒誘導性基因沉默(VIGS)。將在下文中解釋方法。在具有減少的MLO含量/活性的轉基因植物或植物細胞中抗大豆銹病的抗性增加可以例如通過"沉默，，方法來實現。在該方法中，將編碼至少一種MLO或其片段的核酸和/或與其互補的核酸轉移至植物細胞中。為了確保該植物細胞對于經轉移的核酸是轉基因的，通常待轉移的核酸是載體的部分，所述載體例如質粒能夠在細胞中穩定復制或者確保經轉移的核酸整合到植物基因組中。優選地，通過RNAi方法實現mlo的沉默。在該方法中，將載體轉移到植物細胞中，所述載體以5，-3，的方向包含下列元件在植物中有功能性活性的啟動子序列；與其有效連接的與編碼至少一種MLO或其片段的序列互補的反義序列(或這一反義序列的同源物)，其中所述序列在其3，端具有可為剪接體所識別的3，外顯子序列；與其有效連接的內含子；與其有效連接的與編碼至少一種MLO或其片段的序列同一或同源的正義序列，其中所述序列在其5，端具有可為剪接體所識別的5，外顯子序列，以及任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列。當然，正義和反義序列的位置可以互換。在這一情形中，本領域技術人員顯而易見，各自的3，剪接位點和5，剪接位點需要適合。當那些載體^f皮穩定轉移到植物細胞中時，轉錄導致前-mRNA的產生，所述前-mRNA包含含有反義序列的第一外顯子、內含子，以及包含正義序列的第二外顯子。然后通過剪接過程將內含子移除，產生了具有彼此互補的區域的連續RNA分子。這一分子將發展出雙鏈結構(Smith等人，2000，Nature,407:319-320)。那些雙鏈RNS分子能夠通過誘導PTGS(轉錄后基因沉默)系統特異性沉默mlomRNA。因此，MLO蛋白質不能再表達。反義和正義序列的選擇使得能夠確定應當阻抑哪種類型的mlo。技術人員能夠鑒定作為蛋白質特征的序列。他還知道當使用許多對應的特征性序列時可以沉默多種MLO蛋白質。這一RNAi方法可以包括下列步驟a)構建栽體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，_與其有效連接的與編碼至少一種MLO或其片段的序列互補的反義序列，或這一反義序列的同源物，其中所述序列在其3，端具有可為剪接體所識別的3，外顯子序列，_與其有效連接的內含子，-與其有效連接的正義序列，所述正義序列與編碼至少一種MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列在其5，端具有可為剪接體所識別的5'外顯子序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的所述載體轉移到植物細胞中，以及任選地整合進植物基因組。技術人員已知選擇何種載體用于RNAi方法或PTGS方法的執行。所述載體可以例如以下述方式構建，所述方式允許正義和反義序列被從任何適當的啟動子轉錄，在細胞中雜交以及誘導PTGS系統(Tuschl，2002，Nat.Biotechnol.20,446-448;Miyagishi等人，2002,Nat.Biotechnol.，20，497-500;Lee等人，2002，Nat.Biotechnol.，20，500-505)。其它載體通過"環"序列組合了正義和反義序列，并且被從任何適當的啟動子轉錄。環的反-折疊(back-folding)與允許正義和反義序列雜交，形成雙鏈RNA以及誘導PTGS系統(Tuschl，2002，見上；Paul等人，2002，Nat.Biotechnol.，20,505-508;PaddisonP.J.GenesDev.20024月15日；16(8):948-58;Brumwielkamp等人，2002，Science,296，550-553)。在另一RNAi方法中，包含上述正義和反義序列的預合成的雙鏈RNA分子被直接轉移到植物細胞中，例如通過生物射彈方法。因此，這一RNAi方法可以包括下列步驟a)構建雙鏈RNA分子，其具有15至100個核苷酸，優選20至75個核苷酸，更優選20至50個核苷酸，尤其優選20至40個核苷酸，特別優選20至30個核苷酸以及最優選20至25個或者21、22或23個核苷酸的長度，包含具有正義鏈的核^f列，所述正義鏈與編碼至少一種內源MLO的序列的片段同一或同源，b)將來自步驟a)的分子轉移到植物細胞中。在另一個優選的實施方案中，用于核酸轉移的載體以5，-3，方向包含啟動子序列；與編碼至少一種內源MLO或其片段的序列同一或同源的正義序列，其中所述序列具有自身-互補區域；以及任選地終止序列。植物細胞45中那些栽體的轉錄導致產生了RNA分子，所述RNA分子包含能夠與其自身雜交的序列區域。這可以導致細胞內部雙鏈RNA分子的形成，其可以誘導PTGS系統并且導致mlomRNA的特異性降解。沉默植物蛋白質的這一方法也被稱為共-阻抑，需要待被阻抑的MLO的mRNA包含彼此互補的區域。序(例如來自DNAStar有P艮公司，Madison,USA)來鑒定。這一共-阻抑方法可以包含下列步驟a)構建載體，所述栽體以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，一與其有效連接的正義序列，所述正義序列與編碼至少一種內源MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列具有自身-互補的區域，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞中并且任選地整合進植物基因組中。在本發明的另一個優選的實施方案中，用于轉移核酸的栽體以5，-3，方向包含啟動子序列，任選地與其有效連接的與編碼至少一種內源MLO或其片段的序列互補的反義序列(或這一反義序列的同源物)，以及任選地終止序列。植物細胞中那些載體的轉錄導致產生了RNA分子，其序列與編碼MLO或其部分的mRNA互補。反義序列與mlo的內源mRNA序列的在體內的雜交隨后導致植物細胞中mlo表達的阻抑。這一反義方法可以包括下列步驟a)構建載體，所述載體以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，_與其有效連接的與編碼至少一種內源MLO或其片段的序列互補的反義序列，或這一反義序列的同源物，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的所述載體轉移到植物細胞中，以及任選地整合進植物基因組。在本發明的另一優選的實施方案中，用于核酸轉移的載體以5，-3，方向包含啟動子序列，與其有效連接的編碼特異性識別至少一種mlo的mRNA的核酶的DNA序列，以及任選地終止序列。本領域技術人員已知如何產生具有直接針對特異性mRNA的內切核酸酶活性的核酶。詳細地，這一方法例如描述在SteineckeP等人(EMBO丄19924月；11(4):1525-30)中。在本發明的上下文中，術語"核酶"還包含那些RNA序列，其除了核酶自身外還包括前導序列，所述前導序列與mlo的mRNA或其片段互補并且因此能夠將mRNA特異性核酶更加有效地導向mRNA底物。這一核酶方法可以包括下列步驟a)構建栽體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼特異性識別至少一種內源mlo的mRNA的核酶的DNA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。在轉基因植物或植物細胞中增加抗大豆銹病抗性的另一備選是通過載體的核酸轉移，所述載體以5，-3，方向包含啟動子序列，與其有效連接的與編碼至少一種mlo或其片段的mRNA的序列互補的DNA反義序列，與其有效連接的編碼核糖核酸酶P(RNAseP)的序列，以及任選地，與其有效連接的終止序列。這些載體在細胞中的轉錄產生RNA分子，所述RNA分子包括前導序列(反義序列)，所述前導序列將RNAseP導向mlomRNA，然后發生通過RNAseP的mRNA降解(見美國專利5，168，053)。優選地，前導序列包含與mlo的DNA序列互補的10至15個核苷酸，一條^-NCCA核苷酸序列，其中N優選為嘌呤。外部前導序列的轉錄物通過形成堿基對結合草巴mRNA,這允許通過RNAseP在成對區域的5，核苷酸處進行mRNA的降解。這一被降解的mRNA不能被翻譯成功能性蛋白質。這一RNAseP方法可以包括下列步驟47a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的與編碼至少一種MLO或其片段的mRNA的序列互補的DNA序列，-與其有效連接的編碼核糖核酸酶P的序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。此外，下述載體可以用于本發明的方法，所述栽體以5，-3，方向包含下列序列與編^馬至少一種內源MLO的5，端的序列同一或同源的DNA序列，啟動子序列，與其有效連接的編碼抗性基因或報道基因的DNA序列，任選地終止序列，以及與編碼至少一種內源MLO的3，端的序列同一或同源的l)NA序列。可以使用那些栽體來通過同源重組誘導目的iiilo的特異性敲除。抗性基因或報道基因的序列被插入到同源重組已經發生的那些植物細胞中，從而在該細胞中不能產生功能性mlomRNA。通過選擇抗性或報道基因鑒定其中已經發生重組的植物細胞。技術人員已知如何產生用于通過同源重組進行遺傳敲除的那些載體，它們需要包含哪些元件(啟動子、增強子、側翼序列)，以及如何鑒定分別的植物細胞。通常，抗生素抗性基因用作為抗性基因(Amp、Kan等)。當然，可以使用允許選擇其中已經發生了重組的細胞的所有其它可能的抗性基因。除了經典的抗性基因外，可以使用其它報道基因用于檢測和/或選擇其中已經發生了同源重組的植物和植物細胞，例如GUS、GFP等。這一同源重組方法可以包括下列步驟a)構建栽體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-與編碼至少一種內源MLO的5，端的序列同一或同源的DNA序列，-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼抗性基因或才艮道基因的DNA序列，植物中有功能性活性的終止序列，-與編碼至少一種內源MLO的3，端的序列同一或同源的DNA序列，b)將來自步驟a)的栽體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。根據本發明，編碼MLO或其片段的核酸序列可以是MLO的完整編碼I)NA序列，或完整mRNA序列，或其片段。由于用于產生轉基因植物的上述方法(涉及mlo表達的顯著減少)中的一些A^于內源ml0mRNA與在上述載體轉錄過程中產生的序列的特異性雜交(例如反義策略)，技術人員已知經轉移的核酸不必需包含編碼MLO的完整序列，而不問其是正義還是良義序列。事實上，編碼MLO的序列的相對短的區域足以用于特異性雜交和有效沉默。對應于mlomRNA的序列區域并且被轉錄以產生雙鏈RNA分子的載體的那些序列可以具有大約25個核苷酸，優選21、22或23個核苷酸的長度。被轉移用于反義策略的序列通常包含20至1000個之間的核苷酸，優選20至8()()個之間的核苷酸、更優選400至800個之間的核苷酸、尤其優選500至750個之間的核苷酸。但是也可能使用包含20至500之間、20至300之間、20至150之間、20至100之間或20至50個之間的核苷酸的序列。技術人員已知對于RNAi或PTGS方法，用于產生雙鏈RNA分子的正義和反義RNA也可以包含大約21、22或23個核苷酸，其具有特征性3，突出端(Tuschl,2002，Nat.Biotechnol.20，446-448)。當將核酸轉移到植物細胞并且細胞中那些序列的轉錄產生了與mlomRNA互補的序列(例如使用反義策略)時，那些經轉移的序列不需要與mRNA100。/。互補。如果序列至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、尤其優選至少80%、特別至少90。/。以及最優選至少95。/。互補即足以。差異可以是由于插入、缺失和/或取代，優選取代。但是技術人員已知隨著互補性減少，沉默若干mlomRNA的可能性將增加。49通常，僅那些能夠與mlomRNA的區域特異性雜交的互補序列可以用于本發明。在體內與除MLO之外的其它蛋白質的RNA區域雜交并且引起它們沉默的序列不適用于本發明。根據所選擇的序列和互補性的程度，可以沉默多種MLO蛋白質或僅一些MLO蛋白質。還可能是僅一種特異性mlo的表達^皮抑制。互補序列的長度優選在20和1000個核苷酸之間，更優選在20和750個核香酸之間，尤其在20和500個核苷酸之間，特別優選在20和300個核苷酸之間，以及最優選在20和150、20和75或20和50個核苷酸之間。還可能是序列僅包含大約20或25個核苷酸。也可以使用下述序列進行上述方法中的一些，所述序列并非mlomRNA的編碼區域的一部分，或者不與其互補。例如，如果那些調節序列是各個MLO的mRNA的特征，那么那些序列來自于5，或3，未翻譯區就足夠了。尤其是當沉默經由雙鏈RNA構建體被誘導時或者當mRNA的翻譯受到反義構建體抑制時，可以使用那些序列。因此，在本發明的上下文中，術語"mRNA"不僅包含編碼區域，而且還包含在前-mRNA或在成熟mRNA中存在的并且是mlomRNA的特征的調節區域。對于DNA序列，例如未經轉錄的序列、啟動子序列、上游激活序列、內含子等，情況也是如此。如果使用下述載體，其中所述栽體的轉錄導致產生具有前導序列和RNAseP的RNA分子，那么前導序列需要充分互補以特異性識別mlomRNA。條件允許4支術人員選擇mlomRNA的哪一部分凈皮前導序列識別。優選地，前導序列包含大約20個核苷酸，但是它們應當不短于大約15個核苷酸。在具有100%互補性的前導序列時，12個核苷酸就足夠了。當然，前導序列可以包含高達大約100個核苷酸，或者甚至更多，因為這將增加對于各個mRNA的特異性。在本發明的上下文中，"正義序列"(或正義鏈)是對應于附/o基因編碼鏈或其片段的那些序列。所述序列不必須與編碼目的Mlo的序列100V。相的表達導致mlo的有效和特異性的沉默(例如通過RNA干擾或共-阻抑)即可。如果那些序列至少50。/。、優選至少60%、更優選至少70%、尤其優選至少80%、特別是至少90%以及最優選至少95%同源即足夠。差異可以是由于插入、缺失、添加和/或取代。當序列具有那些程度的同一性時，它們通常被稱為同源(見上)。但是技術人員已知隨著同一性或同源性的減少，沉默若干mlomRNA的可能性將增加。具有非常低的程度的相似性或同源性的序列(即也將沉默除MLO外的其它蛋白質的序列)并非是充分特異性的，因此不適合于本發明。因此，"反義序列"(或反義鏈)是對應于目的MLO基因的非編碼DNA鏈的那些序列。所述序列不必需與目的基因的非編碼DNA鏈的序列100。/。相同，而是可以具有上述程度的同源性。例如，反義序列可以是至少40%或50%，優選至少55%或60%，更優選至少65%或70%，尤其優選至少75%或80%，特別優選至少85%或卯％，以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的與非編碼附/0鏈同源(或與編碼鏈互補)。如上所述，所述反義序列能夠與各自的mlomRNA特異性雜交即足以。雜交可以在體內在細胞條件下發生，或者在體外發生。反義序列與內源mRNA序列的雜交通常在體內在細胞條件下發生。術語"正義，，和"反義，，是本領域技術人員熟知的。在植物中沉默基因的領域中的技術人員從文獻中已知用于沉默的核酸分子需要多長，以及它們需要與目的序列表現出何種程度的同源性或互補性。在本發明的上下文中，不能使用不與mlo編碼正義序列特異性雜交(即也與其它蛋白質的編碼正義序列雜交)的反義序列。反義策略可以與核酶方法組合。核酶是有催化活性的RNA序列，其與反義序列組合，催化性切割其耙序列(Tanner等人，(1999)FEMSMicrobiolRev.23(3)，257-75)。這可以增加反義策略的效率。特別在植物中減少mlo表達的其它方法包含過量表達mlo核酸序列或其同源物以導致共-阻抑(Jorgensen等人，(1996)PlantMol.Biol.31(5)，957-973)或者通過病毒表達系統(擴增子)誘導特異性RNA降解(Angell等人，(1999)Plant丄20(3)，357-362)。那些方法也被稱為PTGS(見上)。51其它方法為通過將RNA/DNA寡核苷酸轉移到植物中來在內源基因中引入無義突變(Zhu等人，(2000)Nat，Biotechnol.18(5)，555-558)，或者通過T-DNA誘變(Koncz等人，(1992)PlantMol.Biol.20(5)963-976)或同源重組(Hohn等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，8321-8323)產生敲除突變體。此外，基因阻遏(但也有基因過量表達)也可以通過特異性DNA結合因子(例如鋅指轉錄因子類型的因子)來進行。同樣，可以將抑制耙蛋白質的因子引入細胞。蛋白質結合因子可以是例如適配體(Famulok等人，(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.243,123-36)。它們通過基于栽體的過量表達來表達，并且它們的設計和選擇可以由技術人員容易地實施。上述方法的綜述可以在例如Waterhouse等人，(2001)，Nature411，834-842;Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol.20,446-448;Paddison等人，(2002)，GenesDev.,16，948-958;Brummelkamp等人，(2002)，Science296，550-553中找到。本發明的另一方面是在轉基因植物和/或植物細胞中增加抗大豆銹病抗性的方法，其中通it^達至少一種非功能性MLO或其片段來減少至少一種內源MLO的含量和/或活性，所述非功能性MLO或其片段具有至少一處點突變、缺失和/或插入。非功能性MLO蛋白質已經完全喪失或者以非常重要的程度喪失了它們與常規的生理或病原性結合伙伴蛋白相互作用的能力。所述非功能性突變體可以包含一個或多個氨基酸插入、缺失或點突變。它們可以用于產生轉基因植物或植物細胞，在所述轉基因植物或植物細胞中內源MLO蛋白質的含量未被改變，但是內源MLO的活性被通過所述非功能性MLO突變體的過量表達所阻斷。此外，這些抗性植物具有表現出基本上正常的表型的優點。非功能性MLO蛋白質或突變體具有與其功能性相似物基本相同的核酸和氨基酸序列。但是，它們包含一處或多處核苷酸或氨基酸的插入、缺失或點突變，這使得經突變的MLO蛋白質與其結合伙伴蛋白相互作用的能力顯著減少。技術人員在手邊具有一系列方法使得他能夠將點突變、缺失或插入插入到編碼功能性或非功能性MLO蛋白質的核酸序列中(Sambrook(2001)，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdspringHarbourLaboratoryPress;"PCRtechnology:Principle和ApplicationsforDNAAmplification",H.Ehiiich，id,StocktonPress)。與野生型(未經突變的)MLO蛋白質相比，那些MLO突變體與生理和/或病原性結合伙伴蛋白的減少的結合效率優選在超過1%至卯％的范圍內，更優選超過1%至70%，尤其優選超過1%至50%，特別優選超過1%至30%，以及最優選超過1%至10%的范圍內。盡管非功能性MLO突變體顯示了一個或多個點突變、缺失和/或插入，術語"非功能性"MLO(也稱為失活MLO)不包含這樣的蛋白質，所述蛋白質與如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的功能性MLO蛋白質沒有關鍵的序列同源性。優選地，非功能性MLO的至少一處點突變、缺失和/或插入阻止了MLO的細胞功能，尤其抑制了MLO與其病原或生理性結合伙伴蛋白(尤其是與ROR2和/或鈣調蛋白)的相互作用。根據本發明在轉基因植物中表達或過量表達的非功能性MLO突變體不必需是與宿主細胞內源MLO相同的MLO，還可以來自其它生物/物種。非功能性MLO突變體的重要特征是它們與內源MLO的活性竟爭。當然，這兩種蛋白質之間的高度序列同源性將有利于非功能性MLO的高竟爭性活性。根據本發明優選的實施方案，非功能性MLO是顯性失活MLO。"顯性失活方法，，可以包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，_與其有效連接的編碼至少一種內源Mlo的顯性失活突變體的DNA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。本領域的技術人員可以通過常規方法鑒定顯性失活突變體。他可以例如向野生型MLO序列中引入突變，以及實施所獲得的突變體與結合伙伴蛋白例如ROR2或鈣調蛋白的體外結合測定。以相同的方式，技術人員可以測試MLO非功能性突變體是否與其野生型相似物在與已知結合伙伴蛋白的相互作用的方面竟爭。在本發明的范圍內，"顯性失活突變體"是能夠抑制MLO與其病原或生理性結合伙伴蛋白如ROR2和/或鉀調蛋白的相互作用的每種突變體(插入、缺失、點突變)。可以通過下述方法產生具有增加的抗大豆銹病抗性的轉基因植物或植物細胞，所述方法的特征在于通it^達至少一種重組抗體來減少至少一種內源MIo的含量和/或活性，所述重組抗體對于至少一種內源Mlo來說是特異性的，并且其阻止Mlo的細胞功能，并且尤其抑制Mlo與其病原或生理性結合伙伴蛋白，尤其是與Ror2和/或鈣調蛋白的相互作用。技術人員從文獻中已知如何產生、分離和鑒定那些抗體，所述抗體例如對于某一MLO結構域來說是特異性的。根據本發明，術語"重組抗體"包含抗體的全部不同的形式和類型，例如在SkerraA.(CurrOpinImmunol.19934月；5(2):256-62)中所描述的。實例是Fab片段、Fv片段、scFv抗體、scFv同型二聚體、VH鏈等。ConradU.和FiedlerU.提供了綜述(PlantMolBiol.19989月；38(1-2):101-9)。用于產生單克隆、多克隆或重組抗體的標準方案可以在下列中找到"GuidetoProteinPurification",Meth.Enzymol.182，第663-679頁(19卯),M.P.Deutscher，編輯。抗體的表達也描述在Fiedler等人，(1997)Immunotechnology3，205-216和Maynard和Georgiou(2000)Anrni.Rev.Biomed.Eng.2，339-76中。本發明中優選的是scFv抗體，其由輕鏈的可變區和重鏈的可變區組成，通過柔性接頭肽彼此融合(見，例如Breitling等人(1999)Recombinant54Antibodies,JohnWiley&Sons,NewYork)。ScFv抗體與"正常"抗體具有相同的抗原特異性和活性，但是不需要從單鏈裝配。通常，重組抗體的產生用表達單克隆抗體的雜交瘤細胞系起始。分離編碼輕鏈和重鏈的cDNA，并且在下一步中，輕鏈和重鏈的可變區的編碼區域被融合為一個分子。獲得重組抗體的另一方法是基于重組抗體文庫(被稱為嚏菌體展示文庫)的篩選(見Hoogenboom等人(2000)ImmunologyToday21，371-378;Winter等人(l994)A隨.Rev.Immunol.12,433-455;DeWildt等人(2000)Nat.Biotechnol.18，989-994)。這一方法允許富集、選擇和分離所需的抗MLO蛋白質的抗體。表達抗-MLO抗體的一種方法可以包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼重組抗體的DNA序列，所述重組抗體對于至少一種內源Mlo來說是特異性的并且其阻止Mlo的細胞功能，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的栽體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。也可以通過下述方法產生具有增加的抗大豆銹病抗性的轉基因植物或植物細胞，所述方法的特征在于通it^達至少一種MLO抑制劑來減少至少一種內源MLO的含量和/或活性，所述MLO抑制劑阻止了至少一種MLO的細胞功能，并且其尤其抑制了MLO與其病原或生理性結合伙伴蛋白(尤其是與ROR2和/或4丐調蛋白)的相互作用。這些抑制劑可以是例如這樣的肽，所述肽在用于與生理性結合成分或因子相互作用的MLO蛋白質的各個結合袋中結合。這一方法類似于抗體策略，因為在植物中表達或過量表達的MLO蛋白質的抑制劑將通過與MLO結合而阻斷MLO的活性(例如空間的)。表達MLO抑制劑的一種方法可以包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，55-與其有效連接的編碼MLO抑制劑的DNA序列，所述MLO抑制劑阻止了MLO的細胞功能，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。除了核酸分子的轉移外，還有其它方法可以用于在轉基因植物或植物細胞中增加抗大豆銹病的抗性，所述植物或植物細胞具有至少一種內源MLO的減少的含量和/或活性。例如，MLO含量和/或活性可以通過誘變減少，優選通過化學誘變或者輻射誘導誘變。誘變可以例如是通過乙基甲磺酸(EMS)、y照射和/或快中子照射來實施的。經誘導的突變也可以通過其它化學物來引起，所述化學物例如亞硝基胍(NTG)，堿基類似物(例如BrdU)，簡單的化學物(例如酸)、烷化劑(例如N-乙基-N-亞硝基脲，ENU)，甲基化劑(EMS)，多環烴類(例如苯丙芘)，I)NA嵌入劑(例如溴化乙錠)，DNA交聯劑(例如鉑)，氧自由基，或者通過UV照射(非電離)或電離輻射。烷化劑可以突變復制的和非復制的DNA。相反，威基類似物僅在該類似物被摻入復制DNA中時突變DNA。每種這些類型的化學^"變劑具有某些效果，其然后導致轉換、顛換或缺失。UV照射將電子激發到更高的能量水平。DNA吸收一種形式，紫外光。在DNA中的兩種核苷酸堿基——胞嘧啶和胸腺嘧啶是最易受到激發的，所述激發能夠改變堿基配對性質。UV光可以誘導DNA鏈中鄰近的胸腺嘧咬堿基彼此配對，例如大量的二聚體。發明人發現大麥中的mlo敲除賦予了增加的抗大豆銹病抗性。但是，可以理解通過MLO也發生了正的抗性效果。這意味著MLO過量表達(MLO來自例如大麥或擬南芥)也可以導致增加的抗性，尤其是大豆的增加的抗性。存在這樣的蛋白質實例，其在非宿主相互作用(如在存在的情形中大麥-大豆銹菌)中賦予抗性，而在宿主相互作用的情形中(大豆-大豆銹菌)，這些蛋白質賦予易感性。例如，在易感性相互作用中，大多數真菌Avr蛋白質是致病性因子，而在宿主抗性植物中，Avr蛋白質為植物R-蛋白質所識別。這意味著Avr蛋白質在抗性和相容的相互作用中具有不同的"功能"。因此，MLO過量表達也可以在大豆中賦予抗性。因此，本發明的另一方面涉及在轉基因植物和/或植物細胞中增加抗大豆銹病抗性的方法，其特征在于與野生型相比，至少一種MLO的含量和/或活性纟皮增加。增加優選是至少10%或20%，也優選至少30%或40%，更優選至少50%或60%，還更優選至少70%或80%，尤其優選至少90%、95%或100%，特別優選至少2倍或5倍，還特別優選至少10倍或50倍，以及最優選至少IOO或1000倍。在本發明優選的實施方案中，與野生型相比至少一種MLO含量和/或活性的增加是通過向植物或植物細胞轉移至少一種核酸分子來實施的，所述核酸分子編碼至少一種MLO和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物。原則上，核酸分子可以編碼來自任何生物的任何已知的MLO(以及其功能等價的片段和/或衍生物)。在mlo序列是真核細胞的基因組來源的并且包含內含子的情形中，以及在宿主植物或植物細胞不能剪接那些內含子或者不能被賦予剪接那些內含子的能力的情形中，優選使用相應的cDNA序列。術語"功能等價的片段，，和"功能等價的衍生物，，的下列定義涉及與野生型相比，增加至少一種MLO含量和/或活性的方法。因此，片段和突變體必需是功能性的，這與減少至少一種MLO含量和/或活性的方法(其中MLO片段或突變體也可以是非功能性的)相反。在本發明的上下文中，編碼MLO的"功能等價的片段"的核酸分子是這樣的核酸分子的片段或部分，所述核酸編碼具有例如如SEQIDNO:2、4、7、9、U、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列的MLO蛋白質。由這一核酸編碼的MLO片段與任何下述MLO蛋白質具有相同的細胞功能、相同的結合性質和/或相同的結構性質(見上"功能等價"的定義)，所述MLO蛋白57質具有如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的^tj^酸序列。通常，該片段缺乏N-末端和/或C-末端的氨基酸。優選地，片段具有"完整"MLO蛋白質的至少40%或50%，優選至少55%或60%，更優選至少65%或70%,尤其優選至少75%或80%、特別優選至少85%或卯％,以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的長度。在本發明的上下文中，編碼MLO蛋白質的"功能等價的衍生物"的核酸分子是下述核酸的衍生物或"同源物"或"突變體"，所述核酸編碼MLO蛋白質，其中所述MLO蛋白質具有例如如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的^&酸序列。由這一核酸編碼的MLO衍生物具有與下述任意MLO蛋白質相同的細胞功能、相同的結合性質和/或相同的結構性質，所述MLO蛋白質具有如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列。通常，衍生物具有一處或多處氨基酸改變、插入或缺失，其不導致改變的細胞功能、結合性質和/或結構性質。優選地，衍生物與"完整，，ML()蛋白質具有至少40%或50%,優選至少55%或60%，更優選至少65%或70%，尤其優選至少75%或80%、特別優選至少85%或卯％，以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相似。在本發明優選的實施方案中，編碼至少一種MLO蛋白質和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物的核酸序列被轉移到植物或植物細胞中。該轉移導致與野生型相比MLO的表達或活性的增加，以及因此導致轉基因細胞中抗大豆銹病抗性的增加。本領域技術人員熟知包含這些核酸序列以及啟動子和任選地終止序列的栽體的應用。此類方法通常包括下列步驟a)構建載體，其以5，_3，方向包含下列核酸序列-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼至少一種MLO和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物的DNA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。技術人員已知如何將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞中以及載體需要哪些特征來被整合到植物基因組中。如果轉基因植物或植物細胞中MLO的含量通過轉移編碼來自不同生物的Mlo的核酸分子而被增加，那么優選的將氨基酸序列根據遺傳密碼再翻譯成這樣的核酸序列，所述核酸序列主要包含由于宿主生物的"密碼子選擇"而被其優選使用的密碼子。密分析來確定。至少一種內源Mlo的含量和/或活性的增加也可以通過影響內源MIo的轉錄、翻譯和/或翻譯后修飾來實施。這意味著例如增加內源Mlo的基因表達或者關閉轉錄、翻譯或蛋白質(例如翻譯后修飾)水平上的抑制型調節機制。根據本發明，基因表達的增加可以例如通過影響內源Mlo基因的啟動子序列來實現。此類修飾優選導致內源Mlo表達的增強，可以通過缺失或插入DINA序列來實現。啟動子序列的修飾通常導致表達的Mlo的量的改變，以及因此導致MLO活性的改變，所述活性可以在植物細胞中被確定。此外，當在經轉化的細胞或植物中不存在的調節蛋白質與內源Mlo基因的啟動子相互作用時，實現了至少一種內源Mlo基因的被改變或被增加的表達。此類調節子可以是嵌合蛋白質，其包含DNA結合結構域和轉錄激活域，例如WO96/06166所述。增加內源Mlo的含量和/或活性的另一種可能性是基于轉錄因子的上調，所述轉錄因子參與內源MIo基因的轉錄，所述上調例如是通過過量表達所述轉錄因子。上調轉錄因子的方法是技術人員已知的。內源MLO的增加也可以在影響Mlo的轉錄后修飾時實現。例如，可以通過例如過量表達或"基因沉默，，的方法來調節參與該過程的酶例如激酶或磷酸酶的活性。最后，可以通it^達與Mlo的啟動子序列特異性結合的適配體來調節內源MIo的表達。根據適配體結合來刺激還是阻遏啟動子區域，增加內源Mlo的含量以及因此也增加其活性。在本發明優選的實施方案中，被轉移到植物或植物細胞中的栽體除了啟動子序列和任選的終止序列外，還包含其它的調節和/或功能序列。更優選地，那些調節和/或功能序列是允許載體在細菌中增殖，和/或允許在植物細胞中瞬時和/或持久復制，和/或選自增強子、復制信號和選擇標記的序列。根據本發明的載體還可以包括其它例如增強子元件作為調節元件。此外，它們可以包含抗性基因、復制信號和其它允許栽體在細菌例如大腸桿菌(Em//)中增殖的DNA區域。調節元件還可以包括在宿主細胞中引起載體穩定的序列。特別地，這些調節元件包括允許載體穩定整合到植物宿主基因組或者允許載體在植物細胞中自主復制的序列。本領域的技術人員熟知這一類型的調節元件。所謂的終止序列意思是這樣的序列，其確保適當終止轉錄或翻譯。如果轉移的核酸是要被翻譯，那么它們通常是終止密碼子和相應的調節序列；如果轉移的核酸僅是要被轉錄，那么它們通常是聚-A序列。優選地，載體選自質粒、黏粒、(重組)病毒以及其它基因
技術領域：
已知的現有栽體，使用所述載體可以將核酸分子轉移到植物或植物細胞中。術語"栽體"還包含所謂的微型染色體，其是線性或環狀DNA片段，所述片段除了轉基因外還包含各個植物的著絲粒序列。微型染色體在核中是穩定的并且在細胞分裂過程中被傳遞到子細胞中。它們是通過轉化的標準方法被轉移的。更優選地，載體選自pBR322、pUC載體、M13mp載體或來源于農桿菌的Ti質粒或Ri質粒的載體。為了準備將外來基因引入高等植物或其細胞，大量的克隆栽體是可用的，所述載體包含用于大腸桿菌的復制信號和用于選擇轉化的細菌細胞的60標記基因。此類載體的實例是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。可以在適當的限制性位點將所需序列引入栽體。獲得的質粒用于轉化大腸桿菌細胞。將經轉化的大腸桿菌細胞培養在適當的培養基上，并且最終收獲和裂解。回收質粒。作為表征獲得的質粒DNA的分析方法，通常使用的方法例如限制性分析、凝膠電泳和其它生物化學/分子生物學方法。在每個操作后，切割質粒DNA，并且將獲得的DNA片段與其它DNA序列組合。可以將每種質粒DNA序列克隆到相同或另外的質粒中。標準克隆方法見Sambrook等人,2001(Molecularcloning:Alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress)待轉移的核酸序列優選受到在植物中有功能的啟動子的控制。在本發明優選的實施方案中，啟動子序列選自組成型啟動子，優選35S啟動子、肌動蛋白啟動子或泛素啟動子；組織特異性啟動子，優選磷酸烯醇丙酮酸啟動子或果糖-l,6-二磷酸酶啟動子、葉特異性啟動子、表皮特異性啟動子、發育特異性啟動子、光特異性啟動子、損傷特異性啟動子或病原體誘導的啟動子，尤其是真菌誘導的啟動子。啟動子可以是組成型的、可誘導的、組織或發育特異性的啟動子。此外，它們還可以是病原體特異性啟動子。這樣，例如可以產生轉基因植物，所述轉基因植物在正常環境下，表達MLO蛋白質，但是如果受到病原體攻擊，將由首先受到影響的細胞中的病原體特異性啟動子沉默MLO蛋白質的基因。通常，組成型35S啟動子用作為載體的啟動子。此外，當然可以使用其它啟動子，所述啟動子獲得自不同的來源(例如植物或植物病毒或真菌)并且適合于在植物中表達基因。啟動子和其它調節序列的選擇決定了局部和時間表達圖式，以及還有轉基因植物中MLO蛋白質的沉默。除了其它組成型啟動子例如肌動蛋白啟動子(McElroy等人，19卯，PlantCell，2:163)和泛素啟動子(Binet等人，1991，PlantScience,79:87)外，也可以考慮決定葉特異性表達的，來自玉米的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的組織特異性啟動子(Hudspeth等人，1989，PlantMol.Biol.，12:579)或者來自馬鈴薯的果糖1，6-二磷酸酶的組織特異性啟動子(W098/18940)。也可以使用損傷誘導的、光誘導的或病原體誘導的(尤其是真菌誘導的)啟動子、葉特異性、表皮特異性和發育依賴性啟動子或控制序列(Xii等人，1993，PlantMol.Biol.22:573;Logemann等人，1989，PlantCell,1:151;Stockhaus等人，1989，PlantCell,1:805;Puente等人，1996，EMBOJ"15:3732;Gough等人，1995，Mol.Gen.Genet.，247:323)。可用的控制序列的概括也可以在Zuo等人，2000，Curr.Opin.Biotech.,11:146中找到。如ST-LSl啟動子(Stockhaus等人(1987)Pro"Natl.Acad.Sci.USA84:7943-7947;Stockhaus等人(1989)EMBOJ.8:2445-2451)。也可以使用這樣的啟動子，其在植物轉化、植物再生或這些過程的特定階段有活性，例如細胞分裂-特異性啟動子如HistonH3啟動子(Kapros等人(1993)InVitroCellCev.Biol.Plant29:27-32)或者可化學誘導的Tet-阻遏物系統(Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237)。其它適當的啟動子可以從文獻例如Ward(1993，PlantMol.Biol.22:361-366)中獲得。對于可誘導和細胞或組織特異性啟動子，情況也是如此，所述啟動子例如分生組織特異性啟動子，所述啟動子已經在文獻中描述并且在本發明的構架中合適。其它可誘導啟動子包括病原體誘導型啟動子例如ACMV病毒粒體正義啟動子(Hong等人，1996，Virology,220:119-227)，其是由基因產物AC2所誘導的。真菌誘導型啟動子也尤其適用于本發明。此外，在病原體侵染的組織中被誘導的此類蛋白質(例如苯丙氨酸銨裂合酶、查耳酮合酶、富羥脯氨酸糖蛋白、伸展蛋白、致病相關蛋白(例如PR-la)和創傷可誘導的蛋白酶抑制劑(US6，013，864))的所有啟動子也是適合的。此外，葉特異性啟動子例如來自光合組織的啟動子(例如CAP啟動子、RBCS啟動子、GAPA啟動子、GAPB啟動子、ST-LSl啟動子等)尤其適用于本發明。此外，本領域的普通技術人員能夠通過常規方法分離另外的適當的啟動子。本領域的技術人員借助于所建立的分子生物學方法(例如雜交實驗62或DNA-蛋白質結合研究)可以由此鑒定葉特異性調節核酸元件。這樣做，例如在第一步中，將整個的聚(A)+-RNA從所需生物的葉組織中分離出來(其中從所述生物中分離出調節序列)，并且產生cDNA文庫。在第二步中，借助于基于來自非葉組織的聚(入)+-1^^\分子的cDNA克隆，通過雜交從第一文庫中鑒定出這樣的克隆，其相應的聚(A廣RNA分子僅在葉組織中聚集。最終，借助于以這種方式鑒定的這些cDNA，分離了用葉特異性調節元件裝備的啟動子。本領域技術人員可用基于PCR的其它方法來分離適當的葉特異性啟動子。另一實施方案使用來自馬鈴薯的I類patatin基因B33的啟動子。其它有利的啟動子是在果實中特別有活性的那些。這些包括例如多聚半乳糖醛酸酶基因的啟動子(例如來自番茄，其介導番茄果實成熟過程中的表達)(Nicholass等人，(1995)PlantMol.Biol.28:423-435，本領域描述了啟動子/GUS融合構建體的分析)；ACC氧化酶的啟動子(例如來自蘋果，其介導了轉基因馬鈴薯的成熟和果實特異性)(Atkinson等人(1"8)PlantMol.Biol.38:449-460;本領域也公開了啟動子/GUS表達分析)，或者來自番茄的2A11啟動子(vanHaaren等人(1991)PlantMol.Biol.17:615-630，也描述了啟動子/GUS融合)同樣在果實特異性啟動子的情形中，本領域的技術人員可以采用來自文獻的其它適當的啟動子，或者類似于如上所述的葉特異性啟動子，通過常規方法分離它們。物細胞，其僅瞬時表達以及因此僅瞬時沉默根據本發明的序列。此類瞬時表達允許產生僅表現出瞬時病原體抗性的植物。例如如果有病原體污染的風險并且該植物因此需要僅在特定長度的時間內對病原體有抗性，那么則需要此類瞬時抗性。本領域技術人員已知需要瞬時抗性的其它情況。本領域技術人員還已知通過使用在植物細胞中不穩定復制并且攜帶用于沉默MLO蛋白質的分別的序列的載體，其可以實現瞬時表達以及因此也實現瞬時沉默和瞬時抗性。63對于將DNA引入植物宿主細胞，有許多已知的技術可用，借此本領域的技術人員可以毫無問題地確定在每種情形中適當的方法。這些技術包括通過使用才艮癌農桿菌(J^y^fl"en'w附似附e/"c/e附)或發根農桿菌(Jgw6fl"e/77/附W/^^wim)作為轉4匕劑用T-DNA進4亍的植物細胞的轉化、原生質體的融合、經分離的DNA直接基因轉移進原生質體、DNA的電穿孔、通過生物射彈方法引入DNA，以及其它可能。這樣做，可以產生穩定和瞬時的轉化體。關于DNA向植物細胞中的注射和電穿孔，實質上對于所用的質粒沒有特定的要求。對于直接的基因轉移，情況亦是如此。可以使用筒單的質粒例如pUC衍生物。但是，如果要從此類經轉化的細胞中再生出完整的植物，則需要存在可選擇的標記基因。本領域的技術人員熟知現有的選擇標記，他將毫無問題地選擇適當的標記。標準選擇標記是介導經轉化的植物細胞對殺生物劑或抗生素(卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、鏈霉素、磺酰脲、慶大霉素或膦絲菌素等)有抗性的那些。根據將所需基因引入植物細胞的方法，需要其它DNA序列。例如，如果Ti或Ri質粒用于轉化植物細胞，則至少包含在Ti或Ti質粒中的T-I)NA的右側翼區域(但是通常T-DNA的右和左側翼區域)必需作為側翼區域與待引入的基因相連。如果農桿菌用于轉化，則必需將待引入的DNA克隆到特定的質粒中(中間載體或二元載體中)。基于與T-DNA中的序列同源的序列，可以通過同源重組將中間載體整合進農桿菌的Ti或Ri質粒中。這一質粒還包含用于轉移T-DNA所需的vir區域。中間載體不能在農桿菌中復制。通過輔助質粒，可以將中間載體轉移到根癌農桿菌中(綴合)。可以在大腸桿菌以及農桿菌中復制二元載體。它們包含由右和左T-DNA邊界區域加框的選擇標記基因和接頭或多聚接頭。它們可以被直接轉化到農桿菌中(Holsters等人(1978)，MolecularandGeneralGenetics163，181-187)。作用為宿主細胞的農桿菌應當包含攜帶vir區域的質粒。Vir區域對于將T-I)NA轉移到植物細胞中是必需的。也可以存在T-DNA。這一類型的經轉化的農桿菌被用于轉化植物細胞。已經深入研究并且在EP120515中充分描述了T-DNA用于轉化植物細月包的用途。為了將DNA轉移到植物細胞中，可以特別為此目的栽培具有根癌農桿菌或發根農桿菌的植物外植體。從經感染的植物材料(例如、葉片、莖細裂片(segment)、根、但是還有原生質體或懸浮培養的植物細胞)中，可以在適當的培養基中再生完整植物，所述培養基可以包含用于選擇經轉化的細胞的抗生素或殺生物劑。根據標準再生方法，〗吏用常規的營養^X生植物的再生。可以就被引入的DNA的存在檢查以這種方式獲得的植物和才直物細月包。本領域的技術人員熟知其它可能性，用于使用生物射彈方法或通過原生質體轉化引入外來DNA(見L.Willmitzer(1993)TransgenicPlants在Biotechnology,AMulti-VolumeComprehensiveTreatise中(出版商H丄Rehm等人)，第2巻，627-659，VCHWeinheim，德國)。盡管借助于^f艮癌農桿菌通過Ti質粒載體系統轉化雙子葉植物或其細胞已經良好建立，新的工作表明這樣的事實，即單子葉植物或其細胞也非常容易用基于農桿菌的載體轉化(見，例如Chan等人(1993)，PlantMol.Biol.22，491-506)。用于轉化單子葉植物或其細胞的備選系統是通過生物射彈方法轉化(Wan和Lemaux(1994)PlantPhysiol.104，37-48;Vasil等人(1993)Bio/Technology11，1553-1558;Ritala等人(1994)PlantMol.Bio.24，317-325;Spencer等人(19卯)，Theor.Appl.Genet.79，625-631)、原生質體轉化、部分可透化細胞的電穿孔、以及通過玻璃樣組織(glasstissue)引入l)NA。PlantCellReports5，81-84)。可以以正常方式培養獲得的植物，并將其與具有相同的轉化的遺傳素質(disposition)或其他遺傳素質的植物雜交。獲得的雜種個體具有各自的表型性質。65可以培養兩代或多代以確保表型特征保持穩定并且被遺傳。應當收獲種子并且確保保留各自的表型或其它特征。類似地，通過使用標準方法，可以確定對于新的核酸分子純合的轉基因品系，并且研究了它們在存在的或不存在的病原體應答性方面的表型特征，以及將所"型特征與來自半合子品系的那些進行了比較。當然，可以另外培養包含根據本發明的核酸分子的植物細胞以及植物細胞(包括原生質體、愈傷組織、懸浮培養物等)。可以以多種方式將上述載體轉移到植物細胞中。載體是線性還是環狀形式取決于想要的應用。本領域的技術人員已知他可以使用各自的線性化的載體還是不可以，以及何時使用各個線性化載體。例如，本領域的技術人員已知為了通過同源重組產生MLO蛋白質的基因的特異性敲除，線性化相應的栽體并且將它們注射到植物或植物細胞中就足夠了。此外，本發明還涉及轉基因植物或植物細胞，其具有增加的抗大豆銹病的抗性，特征在于與野生型植物或植物細胞相比，分別改變了至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性。這一植物可以例如通過上述任一方法產生。"轉基因植物"和轉基因植物細胞可以表示任何單子葉或雙子葉植物或植物細胞，優選農業植物或來自農業植物的細胞。本發明還涉及該植物的轉基因部分例如葉和花，轉基因繁殖材料例如原生質體、愈傷組織、果實、種子、塊莖、根狀莖、胚原基、花粉、插條，以及植物的轉基因后代。根據一個優選的實施方案，與野生型植物或植物細胞相比，至少一種ML()蛋白質的含量和/或活性減少。根據另一優選的實施方案，與野生型植物或植物細胞相比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性增加。本發明的另一主題涉及植物細胞和植物，在所述植物細胞和植物中，MLO蛋白質的內源基因具有突變，即取代、插入和/或缺失，所述突變導致這樣的事實，即表達的內源MLO蛋白質不再能夠，或者僅在某些環境下能夠，與其內源細胞或病原性結合伙伴蛋白相互作用。包含顯示出突變的MLO蛋白質的這些內源基因拷貝的植物或植物細胞可以由增加的瞬時或持久的抗大豆銹病的抗性來區分開。此類植物和植物細胞，不同于上述指出的植物和植物細胞，是非轉基因的，可以通過常規誘變來產生。內源植物MLO蛋白質的表達的調節可以例如意思是，通過在MLO蛋白質基因的調節DNA元件(例如啟動子、增強子或通常所稱的"上游激活序列，，)中的突變，下調內源MLO蛋白質的表達。在本發明的構架中，MLO蛋白質的結合特征的調節意思是上述指定的突變類型導致內源MLO蛋白質與其內源細胞或病原性結合伙伴蛋白的結合特征的改變。MLO蛋白質的表達和結合特征的調節的組合也有可能。例如，植物或植物細胞可以在MLO蛋白質的基因序列中具有突變，所述突變導致這些蛋白質表達的減少。其它植物或植物細胞具有導致上述顯性失活突變體的突變。在兩種情形中，獲得了具有增加的抗大豆銹病抗性的植物。本領域的技術人員已知例如也可以通過誘變產生植物和植物細胞，所述植物和植物細胞由于在植物MLO蛋白質基因的增強子和/或啟動子序列中的突變，顯示出這些蛋白質表達的減少，并且同時顯示出編碼MLO蛋白質的基因的編碼區中的突變，所迷突變引起這樣的事實，即剩下的表達的MLO蛋白質將不再，或者僅以有限的程度，與真菌和/或其它細胞結合伙伴蛋白相互作用。另一方面，在增強子和/或啟動子序列以及在編碼序列中的各個突變可以具有這樣的效果，即如上所述的植物MLO蛋白質的顯性失活突變體過量表達，從而發生了上述竟爭性反應，所述顯性失活突變體不再能夠，或者僅以非常有限的程度來與真菌和/或正常細胞相互作用伙伴蛋白相互作用。優選地，通過所謂的"TILLING"方法(TargetingInducedLocalLesioninGenomes)產生根據本發明的非轉基因植物和植物細胞，其是通過內源MLO蛋白質的表達和/或結合特征的調節來區別的，并且具有持久或瞬時的抗大豆銹病的抗性。這一方法已經詳細描迷在Colbert等人(20(H，PlantPhysiology,126，480-484)、McCallum等人(2000,Nat.Biotechnol"18，455一457)和McCallum等人(2000，PlantPhysiology,123，439—442)中。上述指明的參考文獻作為"TILLING"方法的明確公開內fI入本文。67TILLING方法是所謂的反求遺傳學策略，其將在誘變的植物標本收藏中產生高頻率點突變(例如通過用乙基甲磺酸(EMS)的化學誘變)與乾序列中突變的快速系統辨別組合起來。首先，通過PCR，在誘變的M2群體的DNA庫中擴增乾序列。異等位PCR產物的變性和退火反應允許形成異源雙鏈體，其中一條DNA鏈來源于突變的并且另一條來源于"野生型"PCR產物。然后在點突變的位點發生所謂的錯配，這可以通過變性HPLC(DHPLC，McCallum等人，2000，PlantPhysiol"123，439—442)或用CWI錯配檢測系統(Oleykowsky等人，1998，Nucl.AcidsRes.26，4597-4602)來鑒定。CWI是內切核酸酶，其識別異源雙鏈體DNA中的錯配并且特異性地在這些位點處切割DNA。然后可以將切割產物分離并且通過自動測序凝膠電泳來檢測(Colbert等人，2001，見上)。在庫中鑒定了靶基因特異性突變后，于是分析了單個的DNA樣品，以分離具有突變的植物。這樣，可以在通過使用靶向MLO蛋白質的引物序列產生誘變的植物群體后，用根據本發明的植物和植物細胞鑒定誘變的植物細胞或植物。TILLING方法通常適用于全部植物，并且因此上迷指明的栽培的和農業植物適合于根據本發明的方法。因此，本發明還涉及大豆銹病抗性植物或植物細胞，其特征在于其是通過TILLING方法產生的并且其在至少一種編碼MLO蛋白質的基因的編碼和/或調節序列中包含突變，所述突變使得與野生型植物或植物細動目比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性改變。本發明還涉及至少一種核酸分子用于在轉基因植物和/或植物細胞中增加抗大豆銹病的抗性的用途，所述核酸分子包含a)至少一種與編碼內源Mlo或其片段的序列同一、同源或互補的序列，b)至少一種編碼非功能性Mlo或其片段的序列，所述非功能性Mlo或其片段具有至少一種點突變、缺失和/或插入，c)至少一種編碼重組抗體的序列，所述重組抗體對于內源Mlo是特異性的并且其阻止Mlo的細胞功能，68劑的序列，所述Mlo抑制劑阻止Mlo的細胞功能，和/或e)至少一種編碼Mlo和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物的序列。本發明還涉;M^達載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列a)在植物中有功能性活性的啟動子序列，b)與其有效連接的下述序列-所述序列與編碼內源Mlo或其片段的序列同一、同源或互補，-所述序列編碼非功能性Mlo或其片段，所述非功能性Mlo或其片段具有至少一種點突變、缺失和/或插入，-所述序列編碼重組抗體，所述重組抗體對于內源Mlo是特異性的并且其阻止Mlo的細胞功能，-所述序列編碼Mlo抑制劑，所述Mlo抑制劑阻止Mlo的細胞功能，和/或-所述序列編碼Mlo和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物，c)任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列。最后，本發明還涉及分離的核酸分子，其包含至少一種核酸序列，所述核酸序列選自a)根據SEQIDNO:3、5、6、8或10的核苷絲列或其片段，b)編碼具有才艮據SEQIDNO:4、7、9或11任一項的M酸序列的多肽的核苷^f列或其片段，c)與a)或b)的任一核苷酸序列基本同源的核苷酸序列，d)在嚴格條件下與a)、b)或c)的任一核苷酸序列雜交的核苷餅列，其中所述核^^列編碼MLO蛋白質。本領域的技術人員已知這樣的事實，即條目a)的術語"核苷酸序列"優選是指SEQIDNO:3、5、6、8或10的編碼部分，即編碼MLO蛋白質69的部分，而不是通常位于編碼區上游和下游的調節部分。但是，SEQIDNO:3、5、6、8或10的5，和3，未翻譯區也可以包括在核酸分子中。"分離的核酸分子"意思是與存在于核酸的天然來源的其它核酸分子分開的分子。優選地，經分離的核酸分子不包含這樣的序列，所述序列天然位于該分子所來源的生物的基因組DNA的側翼。在一些實施方案中，經分離的核酸分子可以包括例如少于大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，所述核酸序列天然位于該分子所來源的細胞的基因組l)NA的側翼。"MLO蛋白質"具有生物學活性，植物或植物細胞中其含量和/或活性的改變導致植物或植物細胞抗大豆銹病的增加的抗性。生物學活性(或"細胞功能，，)尤其意思是MLO蛋白質與其病原或生理性結合伙伴蛋白的相互作用，即優選其與鈣調蛋白和/或ROR2的相互作用。因此，作為上述經分離的核酸分子的部分的核苷酸序列的"片段"限于編碼具有這一生物學活性的MLO蛋白質的那些片段。通常，所述片段缺乏5，端或3，端的核苷酸。優選地，片段具有至少40%或50%,優選至少55%或60%，更優選至少65%或70%，尤其優選至少75%或80%、特別優選至少85%或90。/。，以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的"完整"MLO編碼序列的長度。與另一核苷^列"基本同源"的核苷^列在本發明的范圍內意思是該序列與另一序列或片段有至少40%或50%，優選至少55%或60%，更優選至少65%或70%,尤其優選至少75%或80%、特別優選至少85%或90%，以及最優選至少92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相似。優選地，這一同源性是在核苷酸序列的完整序列長度上確定的。當然，"基本同源，，或者可以"在嚴格條件下雜交"的核苷,列(見條目c)和d))也需要編碼根據本發明的功能性MLO蛋白質，即，具有上述生物學活性的MLO蛋白質。實施例在本發明中使用大麥mlo突變mlo5。Mlo5是完全的無效突變體，是通過將Met-l(ATG)改變為Ile來得到的。野生型MLO蛋白質的序列描述在SEQIDNO:2中。使用大麥栽培種"Ingrid"野生型和mlo5突變體。通過BASFAG的APR/HS部門(Agrarzentrum，Limburgerhof)提供種子。在氣候暴露測試箱中在受控的條件下(即22。C的溫度和12小時的晝/夜節律)進行培育7天。在播種后7天用豆薯層銹菌接種植物。大豆銹菌是來自巴西的野生分離群。為了獲得用于接種的適當的孢子材料，在接種前2-3天取15-20天以前被大豆銹菌感染的大豆葉，并將其轉入瓊脂平板中(H20中1%瓊脂)。將葉放置在瓊脂上(上側向上(withtheirupperside))，這使得真菌能夠通過生長通過組織并且產生非常年輕的孢子。對于接種溶液，將孢子從葉上敲除并且添加到Tween-H20溶液中。在光學顯孩i鏡下通過托馬計數室進行孢子的計數。為了接種植物，將孢子懸浮液添加到空氣壓縮的可操作噴霧瓶中并且均勻應用到植物或葉上，直到葉表面被良好潤濕。為進行顯微鏡術，使用10xl0S個孢子/ml的密度。將接種的植物在溫室中放置24小時，所述溫室為平均22°。且>卯％的空氣濕度。將接種的葉在相同條件下在封閉的培養皿中在0.5%植物瓊脂上孵育。在平均25。C和70%空氣濕度的室中進行下列培養。為了評估病原體發育，將大麥"Ingrid"野生型和大麥"Ingrid"mlo5的接種的葉用苯胺藍染色。同樣的方案也用于大豆。苯胺藍染色用于檢測熒光物質。在宿主相互作用和非宿主相互作用的防御反應中，物質例如酚、愈創葡聚糖、或木素聚集或者產生，并且在細胞壁被局部摻入乳突中或者摻入在整個細胞中(過敏反應，HR)。形成與苯胺藍聯合的復合物，這例如在愈創葡萄糖的情形中，導致黃色熒光。將葉材料轉移到包含脫色液II(乙醇/乙酸6/1)的falcon管或平皿中，并且在水浴中在90。C溫育10-15分鐘。然后將脫色液II立即移除，用水將葉子洗滌2次。為了染色，將葉子在染色液11(0.05%苯胺藍=曱基藍、0.067M磷酸氫二鉀)中溫育1.5-2小時，并且在之后立即通過顯微術對其加以分析。通過顯^t術評估(計數)了不同的相互作用類型。使用OlympusUV顯微鏡BX61(入射光)和UVLongpath濾器(激發375/15，電子(射)束分裂器405LP)。在苯胺藍染色后，孢子在UV光下顯現出藍色。通過綠/黃染色，可以在真菌附著器下識別乳突。過敏反應(HR)的特征在于整個細胞熒光。結果顯示在表3和圖1中。可以區別出抗真菌生長的植物抗性的兩個主要階段。1.在附著器下細胞壁內側上作為機械屏障的乳突的形成防止了細胞感染和真菌的進一步生長。2.受感染的細胞死亡(被稱作過敏反應(HR))是抗真菌抗性的另一種方式。圖l顯示了與野生型相比，在大麥"Ingrid"mlo5中乳突形成率的顯著增加。表3:用大豆銹菌感染的大麥品系<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>乳突形成百分比的標準誤差在wt大麥中是0.02592647，在mlo5大麥中是0.04322237。T檢驗的值是0.001735842。附圖描述圖1:在用大豆銹菌感染后大麥"Ingrid"野生型和大麥"Ingrid"ml05突變體的乳突形成率(％)。圖2aGmMlol—大豆(全長)核酸序列(SEQIDNO:3)GmMlol—大豆(全長)氨基酸序列(SEQIDNO:4)圖2bGmMlo2(基因組)—大豆部分核酸序列(SEQIDNO:5)GmMlo2(EST)—大豆部分核餅列(SEQIDNO:6)GmMlo2(EST)—大豆部分絲紗列(SEQIDNO:7)圖2cGmMlo3.1—大豆(全長)核酸序列(SEQIDNO:8)GmMlo3.1-大豆(全長)氨基酸序列(SEQIDNO:9)圖2dGmMlo3.2(EST)—大豆核斷列(SEQIDNO:10)GmMlo3.2-大豆理論氨基,列(SEQIDNO:11)7權利要求1.在轉基因植物和/或植物細胞中增加抗大豆銹病抗性的方法，其特征在于與野生型植物或植物細胞相比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性分別被改變。2.根據權利要求l的方法，其特征在于與野生型相比，至少一種內源MLO的含量和/或活性減少。3.根據權利要求2的方法，其特征在于通過向植物細胞轉移至少一種核酸分子來減少至少一種內源MLO的含量和/或活性，所述核酸分子包含至少一種序列，所述序列與編碼內源MLO或其片段的序列同一、同源或互補。4.根據權利要求3的方法，其特征在于與編碼內源MLO或其片段的序列同一、同源或互補的經轉移的核酸分子的部分包含20至1000個核苷酸，優選20至750個核苷酸、更優選20至500個核苷酸、尤其優選20至250個核普酸、特別優選20至150個核苷酸，也特別優選20至100個核普酸，以及最優選大約20至50個核苷酸。5.根據權利要求3或4的方法，其特征在于經轉移的核酸分子的一部分與編碼內源MLO或其片段的序列至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、尤其優選至少80%、特別優選至少90%、以及最優選至少95%同源。6.根據權利要求3或4的方法，其特征在于經轉移的核酸分子的一部分與編碼內源MLO或其片段的序列有至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、尤其優選至少80%、特別優選至少卯％，以及最優選至少95%互補。7.根據權利要求3至6中任一項的方法，其特征在于至少一種內源MLO的含量和/或活性的減少是通過RNA干擾(RNAi)、反義構建體、共-阻抑構建體、轉錄后基因沉默(PTGS)、核糖核酸酶P構建體、同源重組、核酶構建體或病毒誘導性基因沉默(VIGS)實現的。8.根據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的與編碼至少一種MLO或其片段的序列互補的反義序列，或這一反義序列的同源物，其中所述序列在其3，端具有可為剪接體所識別的3，外顯子序列，_與其有效連接的內含子，-與其有效連接的正義序列，所述正義序列與編碼至少一種MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列在其5，端具有可為剪接體所識別的5，外顯子序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的所述載體轉移到植物細胞中，以及任選地整合進植物基因組。9.根據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建雙鏈RNA分子，其具有15至100個核苷酸，優選20至75個核苷酸，更優選20至50個核苷酸，尤其優選20至40個核苷酸，特別優選20至30個核苷酸以及最優選20至25個或者21、22或23個核苷酸的長度，包含具有正義鏈的核,列，所述正義鏈與編碼至少一種內源MLO的序列的片段同一或同源，b)將來自步驟a)的分子轉移到植物細胞中。10.根據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，所述載體以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的與編碼至少一種內源MLO或其片段的序列互補的反義序列，或這一反義序列的同源物，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的所述載體轉移到植物細胞中，以及任選地整合進植物基因組。11.根據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，所述栽體以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的正義序列，所述正義序列與編碼至少一種內源MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列具有自身-互補的區域，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的栽體轉移到植物細胞中并且任選地整合進植物基因組中。12.4艮據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的與編碼至少一種MLO或其片段的mRNA的序列互補的DNA序列，-與其有效連接的編碼核糖核酸酶P的序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。13.根據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建栽體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-與編碼至少一種內源MLO的5'端的序列同一或同源的DNA序列，-在植物中有功能性活性的啟動子序列，_與其有效連接的編碼抗性基因或報道基因的DNA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，-與編碼至少一種內源MLO的3'端的序列同一或同源的DNA序列，b)將來自步驟a)的栽體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。14.根據權利要求3至7中任一項的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼特異性識別至少一種內源MLO的mRNA的核酶的DNA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。15.根據權利要求2的方法，其特征在于通#達至少一種非功能性MLO或其片段來減少至少一種內源MLO的含量和/或活性，所述非功能性MLO或其片段具有至少一處點突變、缺失和/或插入。16.根據權利要求15的方法，其特征在于非功能性MLO的至少一處點突變、缺失和/或插入阻止了MLO的細胞功能，尤其抑制了MLO與其病原或生理性結合伙伴蛋白，尤其是與Ror2和Z或鈣調蛋白的相互作用。17.根據權利要求15或16的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼至少一種內源MLO的顯性失活突變體的DINA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。18.根據權利要求2的方法，其特征在于通it^達至少一種重組抗體來減少至少一種內源MLO的含量和/或活性，所述重組抗體對于至少一種內源MLO來說是特異性的，并且其阻止MLO的細胞功能，并且其尤其抑制MLO與其病原或生理性結合伙伴蛋白，尤其是與Ror2和/或釣調蛋白的相互作用。19.根據權利要求18的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼重組抗體的DNA序列，所述重組抗體對于至少一種內源MLO來說是特異性的并且其阻止MLO的細胞功能，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的栽體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。20.根據權利要求2的方法，其特征在于通過表達至少一種MLO抑制劑來減少至少一種內源MLO的含量和/或活性，所述MLO抑制劑阻止了至少一種MLO的細胞功能，并且其尤其抑制了MLO與其病原或生理性結合伙伴蛋白，尤其是與Ror2和/或鈣調蛋白的相互作用。21.根據權利要求20的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建載體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼MLO抑制劑的DNA序列，所述MLO抑制劑阻止了MLO的細胞功能，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。22.根據權利要求1的方法，其特征在于與野生型相比至少一種MLO的含量和/或活性#皮增加。23.根據權利要求22的方法，其特征在于通過向植物或植物細胞轉移至少一種核酸分子來增加至少一種MLO的含量和/或活性，所述核酸分子編碼至少一種MLO和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物。24.根據權利要求22或23的方法，其特征在于其包括下列步驟a)構建栽體，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件-在植物中有功能性活性的啟動子序列，-與其有效連接的編碼至少一種MLO和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物的DNA序列，-任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞并且任選地整合進植物基因組。25.根據權利要求22至24中任一項的方法，其特征在于通過影響內源MLO的轉錄、翻譯和/或翻譯后修飾來增加至少一種內源MLO的含量和/或活性。26.根據前述權利要求任一項的方法，其特征在于MLO是植物MLO,優選選自下述的植物MLO:大麥(//w^m附vw/g"fr)MLO、稻(6^yw""/wi)MLO、鼠耳芥(麵/"w")MLO，優選A麵ol、AtMIo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlolO、AtMloll、AtMlol2、AtMlol3、AtMlol4或AtMlol5，亞麻(""m附仏s/tori&w附M附)MLO、普通'J、麥(7V/ricw附"e^/vw附)('J、麥)MLO、大豆)Mlo，優選GmMIol、GmMIo2、GmMIo3.1或GmMlo3.2，或與任一所述MLO蛋白質基本功能等價的MLO。27.根據前述權利要求任一項的方法，其特征在于MLO選自具有如SEQII)NO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的^J^^^列的MLO，或者具有與在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等價的M酸序列的MLO。28.根據權利要求8、10至14、17、19、21以及24至27中任一項的方法，其特征在于所述栽體除了啟動子序列和任選的終止序列外，還包含其它的調節和/或功能序列。29.才艮據權利要求28的方法，其特征在于所述調節和/或功能序列是允許載體在細菌中增殖，和/或允許在植物細胞中瞬時和/或持久復制，和/或選自增強子、復制信號和選擇標記的序列。30.根據權利要求8、10至14、17、19、21以及24至29中任一項的方法，其特征在于所述栽體選自質粒、教粒、重組病毒和微型染色體。31.才艮據斥又利要求30的方法，其特征在于所述載體選自pBR322、pUC載體、M13mp載體或來源于農桿菌的Ti質粒或Ri質粒的載體。32.根據權利要求8、10至14、17、19、21、24至31中任一項的方法，其特征在于啟動子序列選自組成型啟動子，優選35S啟動子、肌動蛋白啟動子或泛素啟動子；組織特異性啟動子，優選磷酸烯醇丙酮酸啟動子或果糖-l，6-二磷酸酶啟動子、葉特異性啟動子、表皮特異性啟動子、發育特異性啟動子、光特異性啟動子、損傷特異性啟動子或病原體誘導的啟動子，優選真菌誘導的啟動子。33.根據權利要求8、10至14、17、19、21以及24至32中任一項的方法，其特征在于通過轉化、轉染、注射、生物射彈方法和/或電穿孔將栽體轉移至植物或植物細胞。34.根據前述權利要求任一項的方法，其特征在于植物是雙子葉植物例如大豆、棉花、油菜、番茄、糖蘿卜、馬鈴薯、向日葵、豌豆、觀賞植物、煙草、三葉草(車軸草屬物種(Trifoliumspec.))、野葛(Puerarialobata)、樹和豆科植物如苜蓿，并且尤其是大豆。35.根據權利要求1至33中任一項的方法，其特征在于植物是單子葉才直物例如大麥屬(/"n/e"附)(大麥)、燕麥屬(爿ve/ifl)(燕麥)、小麥屬(7W"c"附)(小麥)、黑麥屬(&c"/e)(黑麥)、稻屬(6^yzfl)(稻)、高粱屬(SwgA"附)(黍)、玉蜀黍屬(Ze")(玉米)、稷屬(尸""/c"附)、狼尾草屬(/^ww/se似附)、狗尾草屬(&似n'fl)等。36.至少一種核酸分子用于在轉基因植物和/或植物細胞中增加抗大豆銹病的抗性的用途，所述核酸分子包含a)至少一種與編碼內源MLO或其片段的序列同一、同源或互補的序列，b)至少一種編碼非功能性MLO或其片段的序列，所述非功能性MLO或其片段具有至少一種點突變、缺失和/或插入，c)至少一種編碼重組抗體的序列，所述重組抗體對于內源MLO是特異性的并且其阻止MLO的細胞功能，d)至少一種編碼MLO抑制劑的序列，所述MLO抑制劑阻止MLO的細胞功能，和/或e)至少一種編碼MLO和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的衍生物的序列。37.根據權利要求36的用途，其特征在于MLO蛋白質是植物MLO，優選選自下述的植物MLO:大麥MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO,優選AtMlol、AtMlo2、AtMlo3、A翻o4、AtMlo5、AtMlo6、A鍾o7、A麵o8、A翻o9、A翻o10、A鍾oll、A舗o12、AtMlol3、AtMlol4或AtMlol5，亞麻MLO、普通小麥(小麥)MLO、大豆Mlo，優選GmMlol、GmMIo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或與任一所述MLO蛋白質基本功能等價的ML()。38.根據權利要求36或37的用途，其特征在于MLO選自具有如SEQIDNO:2，4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的^J^酸序列的MLO，或者具有與在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等價的M酸序列的MLO。39.根據權利要求36至38中任一項的用途，其特征在于所述植物是雙子葉植物例如大豆、棉花、油菜、番茄、糖蘿卜、馬鈴薯、向日葵、豌豆、觀賞植物、煙草、三葉草(車軸草屬物種)、野葛(Puerarialobata)、樹和豆科植物如苜蓿，并且尤其是大豆。40.根據權利要求36至38中任一項的用途，其特征在于所述植物是單子葉植物例如大麥屬(大麥)、燕麥屬(燕麥)、小麥屬(小麥)、黑麥屬(黑麥)、稻屬(稻)、高粱屬(黍)、玉蜀黍屬(玉米)、稷屬、狼尾草屬、狗尾草屬等。41.具有增加的抗大豆銹病抗性的轉基因植物或植物細胞，以及植物的轉基因部分例如葉和花，轉基因繁殖材料例如原生質體、愈傷組織、果實、種子、塊莖、根狀莖、胚原基、花粉、插條，以及植物的轉基因后代，別改變了至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性。42.根據權利要求41的轉基因植物或植物細胞，其特征在于與野生型植物或植物細胞相比，分別減少了至少一種內源MLO蛋白質的含量和/或活性。43.根據權利要求42的轉基因植物或植物細胞，其特征在于與野生型植物或植物細胞相比，分別增加了至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性。44.根據權利要求41至43中任一項的轉基因植物或植物細胞，其特征在于所述MLO蛋白質為植物MLO，優選選自下述的植物MLO:大麥MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO，優選AtMlol、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、A舗o5、AtMlo6、AtMlo7、A麵o8、A翻o9、A翻olO、A纖oll、A鍾o12、A薩o13、AtMIo"或AtMIol5，亞麻MLO、普通小麥(小麥)MLO、大豆Mlo，優選GmMlol、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMk)3.2，或與任一所述MLO蛋白質基本功能等價的MLO。45.根據權利要求41至44中任一項的轉基因植物或植物細胞，其特征在于MLO選自具有如SEQIDNO:2、4、7、9、U、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO,或者具有與在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等價的M酸序列的MLO。46.具有增加的抗大豆銹病抗性的轉基因植物或植物細胞，以及植物的轉基因部分例如葉和花，轉基因繁殖材料例如原生質體、愈傷組織、果實、種子、塊莖、根狀莖、胚原基、花粉、插條，以及植物的轉基因后代，所述轉基因植物或植物細胞的特征在于其是通過根據權利要求1至35中任一項的方法所產生的。47.根據權利要求41至46中任一項的轉基因植物或植物細胞，其特征在于所述植物是雙子葉植物例如大豆、棉花、油菜、番茄、糖蘿卜、馬鈴薯、向日葵、豌豆、觀賞植物、煙草、三葉草(車軸草屬物種)、野葛(Puerarialobata)、樹和豆科植物如苜蓿，并且尤其是大豆。48.根據權利要求41至46中任一項的轉基因植物或植物細胞，其特征在于所述植物是單子葉植物例如大麥屬(大麥)、燕麥屬(燕麥)、小麥屬(小麥)、黑麥屬(黑麥)、稻屬(稻)、高粱屬(黍)、玉蜀黍屬(玉米)、稷屬、狼尾草屬、狗尾草屬等。49.表達載體，其特征在于其包含a)在植物中有功能性活性的啟動子序列，b)與其有效連接的下述序列-所述序列與編碼內源MLO或其片段的序列同一、同源或互補，-所述序列編碼非功能性MLO或其片段，所述非功能性MLO或其片段具有至少一種點突變、缺失和/或插入，-所述序列編碼重組抗體，所述重組抗體對于內源MLO是特異性的并且其阻止MLO的細胞功能，-所述序列編碼MLO抑制劑，所述MLO抑制劑阻止MLO的細胞功能，和/或-所述序列編碼MLO和/或其功能等價的片段和/或其功能等價的4汙生物，c)任選地，與其有效連接的在植物中有功能性活性的終止序列。50.根據權利要求50的表達載體，其特征在于MLO蛋白質是植物MLO，優選選自下述的植物MLO:大麥MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO，優選AtMlol、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlolO、AtMloll、AtMlol2、AtMlol3、A薩o14或AtMlol5，亞麻MLO、普通小麥(小麥)MLO、大豆Mlo,優選GmMlol、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMio3.2，或與任一所述MLO蛋白質基本功能等<介的MLO。51.根據權利要求50或51的表達載體，其特征在于MLO選自具有如SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有與在SEQIDNO:2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等價的M酸序列的MLO。52.大豆銹病抗性植物或植物細胞，其特征在于其是通過TILLING方法產生的并且其在至少一種編碼MLO蛋白質的基因的編碼和/或調節序列中包含突變，所述突變使得與野生型植物或植物細胞相比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性改變。53.分離的核酸分子，其包含至少一種核酸序列，所述核酸序列選自a)根據SEQIDNO:3、5、6、8或10的核苷酸序列或其片段，b)編碼具有根據SEQIDNO:4、7、9或11任一項的氨基酸序列的多肽的核苷*列或其片段，c)與a)或b)的任一核苷酸序列基本同源的核苷酸序列，d)在嚴格條件下與a)、b)或c)的任一核苷酸序列雜交的核苷餅列，其中所述核酸序列編碼MLO蛋白質。全文摘要本發明涉及在轉基因植物和/或植物細胞中增加對大豆銹病的抗性的方法，以及涉及核酸分子用于產生這些植物和/或植物細胞的用途。在這些植物中，與野生型相比，至少一種MLO蛋白質的含量和/或活性改變。此外，本發明涉及具有增加的抗大豆銹病抗性的轉基因植物和/或植物細胞，以及包含下述序列的表達載體，所述序列與編碼功能性或非功能性MLO或其片段的序列同一、同源或互補。文檔編號C12N15/82GK101511865SQ200780033105公開日2009年8月19日申請日期2007年8月9日優先權日2006年8月10日發明者C·赫費爾,H·舒爾塞斯,M·弗蘭克申請人:巴斯福植物科學有限公司