專利名稱：：電化學法測定血液樣品中Xa因子抑制劑的方法和設備的制作方法
技術領域：
：本發明涉及電化學測定血液樣品中Xa因子抑制劑(尤其是肝素和肝素衍生物以及直接的Xa因子抑制劑)的方法。.另外，本發明涉及基于干燥化學的測試元件和測試元件分析系統，其用于電化學測定血液樣品中的Xa因子抑制劑，尤其是肝素和肝素衍生物以及直接的Xa因子抑制劑。
背景技術：
：抗凝血劑(其尤其還包括肝素)經常被用于臨床實踐來預防和治療止血紊亂(凝血系統紊亂)。肝素和肝素衍生物尤其被用于治療和預防血栓栓塞疾病。它們非常有效地預防和治療腿血管血栓、肺部栓塞并用于治療不穩定型心絞痛和急性心肌梗塞。它們也經常在手術期間使用，尤其是用于心臟手術(旁路)和輸血。肝素的作用主要基于其與抗凝血酶III(ATIII)的相互作用，從而使它們改變ATIII的構型。這加速了某些凝血酶(凝血酶(FIIa)、Xa因子(FXa)和因子IXa)的失活，因此延遲了凝血。因此可將肝素歸于Xa因子抑制劑。其它Xa因子抑制劑諸如有某些寡糖(如戊糖磺達肝素(Fondaparmux))或仍在臨床開發中的并可歸于不同物質類型的低分子量的直接的Xa因子抑制劑。除了已經使用了很長時間的未分級(unfraktioniert)的肝素(UFH子量肝素(=LMWH)。分級的肝素現在已經代替^FH用于許多適^應癥了，而且其從未分級的肝素通過化學或酶促解聚作用制備，其中形成只有標準肝素約1/3大小的級分。由此減弱了這些LMWH對凝血酶的效果，而優先使得Xa因子失活。由于它們有更有利的藥物動力學，因此分級的肝素比常規未分級的肝素具有其它優勢。有關這些類型的物質的臨床作用和意義的綜述可在"肝素和低分子量肝素"(MechanismsofAction,Pharmakokinetics,Dosing,Monitoring,Efficacy,andSafety),Hirsh等；Chest2001;119:第64頁-第94頁中找到。由于生物利用度的個體差異、蛋白質結合和30-150分鐘的短半衰期，需要監視給藥未分級的肝素的患者，由此避免可能的劑量過大(t)berdosierung)帶來的出血傾向增力。、或劑量不足(Unterdosierung)帶來的血栓形成風險增加。在常規臨床治療中，經常利用活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT),也通過凝血酶凝固時間(TCT)或活化凝固時間(ACT)來進行以UFH治療的監護。這些化驗就是所謂的全局化驗，因為它們非特異性地反映了凝血酶誘導的纖維蛋白凝塊的形成。主要用于測定內部系統因子活性的aPTT測試，主要對肝素對凝血酶的抑制效應靈敏。aPTT測試對0.1-0.7U/ml的肝素范圍敏感，但aPTT的正常范圍以及其治療范圍非常強地取決于試劑和所使用的分析儀。另一種限制因素是樣品穩定性，其尤其是在血液樣品存放過久之后常常導致錯誤的結果。這類全局凝固化驗的其它缺點還有，通常需要復雜的實驗過程，其需要專門訓練的人員來獲得可重復的結果，并且這些測試需要相對高的試劑消耗。在給藥低分子量肝素時，由于其改善的藥物動力學，對于通常的患者來說，并不絕對需要監視。可是，推薦在治療開始時檢查治療，而且尤其對于由于其腎排泄改變而致腎功能不全的患者來說，它是必須的，并對于是極端體重、新生兒、兒童和孕婦的患者或使用它們幾周內或剛有外傷或手術之后，也推薦使用監視。在常規臨床治療中，尤其使用aPTT以監視LMWH,然而該測試對于該抗凝血劑來說僅具有不足夠的靈敏性，而且其以非常強的程度依賴于所用的纟企測試劑。FXa測試是適于監纟見低分子量肝素效應的檢測測試。迄今的FXa測試通常以生色測試或以凝固測試來進行，其中生色測試測量Xa因子活性，而凝固測試測量凝固。測試原理都遵循相同的測試歷程1.FXa+[肝素/抗凝血酶ni]—[FXa/肝素/ATIII]復合物+剩余的FXa2.a)剩余的FXa從FXa特異性底物上裂解出生色殘基(生色測試)b)剩余的FXa裂解凝血酶原以形成凝血酶(通過凝血酶誘導的纖維蛋白交聯進行的凝固測試)當加入樣品時，測試試劑中以確定量存在的Xa因子與樣品中含有的肝素和抗凝血酶III結合，并與它們形成未活化的復合物。剩余的Xa因子裂解生色底物或與樣品中含有的其它凝血因子形成凝血酶，而且凝血酶裂解纖維蛋白原以形成纖維蛋白(凝塊形成)。裂解的底物的多少取決于Xa因子的活性。Xa因子的活性進而取決于樣品中含有的肝素的量。雖然生色測試對于樣品中FXa活性有特異性，但是凝固測試并不專門測量FXa活性，而通常對于LMWH來說，比對于aPTT更靈敏。若干種生色測試可通過商業途徑獲得，但是僅有少數幾種凝固測試(Sigma公司的Heptest,Pharmanetics公司的ENOX測試)是可通過商業途徑獲得的。這些各類測試僅適度地互相并與aPTT相關聯，因為它們帶有不同的終點。生色測試給出活性而非凝固時間。可是，凝固時間和Xa因子活性之間僅有中度的相關性。此外,這些生色測試需要分離血漿，而且它們不能直接用于全血樣品中。由于復雜的樣品準備和運行步驟以及所需的裝置，這些測定方法是耗時、費力并需要復雜設備的。盡管Heptest輸出凝固時間作為結果，可是在相同肝素濃度時，它可以是非常不同的，這取決于患者不同的肝素靈敏性。此外，需要確定肝素校正曲線，然后由其中讀出測試結果。至今，僅有單一的Xa因子測試可用作為干燥化學測試，并由此還適于現場護理(PointofCare)儀器(Pharmanetics公司的ENOX測試)，其利用BayerAG的快速點分析儀上的測試卡來進行。該測試專門為依諾肝素用于經皮腔內血管成形術而開發，而且僅能區分依諾肝素濃度>1U/ml和<1U/ml的情況，這特別是因為其它分級的肝素和未分級的肝素干擾測試，因而并不適于常規監測低分子量肝素。WO03/050298記載了這一如下的干燥化學Fxa測試的原理要檢查的樣品優選是檸檬酸化的全血，將它與至少含有Xa因子活化劑(優選是魯塞爾蝰蛇毒)和均勻分布的磁性顆粒的干燥化學試劑混合。樣品中含有的X因子通過試劑中含有的Xa因子活化劑被轉化成Xa因子，該Xa因子繼而通過凝血酶原-凝血酶轉化使纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，由此形成凝塊。經光學方法通過觀察由外部振蕩磁場造成的反應批料中磁性顆粒的遷移率(Beweglichkeit),來沖全測該凝塊。因此，該測試原理是以纖維蛋白凝塊形成為基礎的，所述纖維蛋白凝塊形成僅在檢測由Xa因子引發的多級反應級聯中的反應進程期間形成，其中除了Xa因子還包括酶和輔因子。因此，諸如纖維蛋白的聚合和交聯需要存在鉤離子和通過凝血酶依賴性活化而由失活的因子xm形成的活化的因子xnia。因此，通過測定纖維蛋白凝塊的方式來測定Xa因子也依賴于其它要素(essentiellenFaktor)和可能的干擾效應。除了該間接檢測方法，WO03/050298所述的檢測方法需要復雜的;^測和評估系統來進行Xa因子的測定。因此，在一個方面，凝固反應所發生的測試載體必須具有保證試劑和磁性顆粒與樣品優良并均一混合的專門裝置，而在另一方面，用于測定Xa因子活性的評估系統必須具有用于產生振蕩磁場(如借助移動永磁體)的裝置和用于照射并以光度檢測磁性顆粒移動的光學系統。WO01/63271記載了一般的基于干燥化學的電化學傳感器，用于測定血液凝固或各種凝血因子，所述電化學傳感器在惰性載體上具有至少兩個電極以及干燥的試劑，所述干燥的試劑含有由能由血液凝血系統蛋白酶裂解并通過羧基末端與被取代的胺(尤其是與苯二胺殘基)酰胺基(amidisch)連接的肽殘基組成的蛋白酶底物。在蛋白酶誘導的裂解之后，這些被取代的胺用作為第2類電子載體并可被用于電化學測定蛋白酶活性。除了通過蛋白酶凝血酶活性來確定凝固時間的所謂的全局測試(如aPTT、PT或ACT)之夕卜，WO01/63271還記載了可用于測定各個凝血因子或其抑制劑的測試。對于這種情況，WO01/63271教導了使用特別為要測定的凝血因子而定制的底物，其肽部分特異性適配要測定的蛋白酶，由此通過該蛋白酶可特異性裂解它，并且被取代的胺作為可電化學檢測的顆粒特異反映該蛋白酶的活性。當轉用于Xa因子測試時，這意味著使用了由能由Xa因子裂解并通過羧基末端與被取代的胺(尤其是與苯二胺殘基)酰胺基連接的肽殘基組成的蛋白酶底物。其中，該測試原理類似于生色Xa因子測試原理，其中也使用Xa因子特異性底物的酶促裂解產物來測定Xa因子。
發明內容本發明的目的是提供用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法和裝置，其避免了現有技術的缺點。本發明的目的尤其是提供用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法，其可簡便地由未經專門培訓的人員在時間、設備或人力要求低的情況下實施，并在短時間內產生可靠的結果。本發明的目的尤其是提供用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的簡單實施方法，其用盡可能少的方法步驟數和所需的試劑和/或設備來實施，由此能夠快速、分散地(dezentral)在諸如重癥監護病房或醫院病房中直接分析。本發明的目的尤其是提供用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法和裝置，其使得也能直接在全血中進行測定，由此不需要任何復雜的樣品準備步驟。本發明的目的尤其是提供用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法和裝置，其滿足試劑保存性和穩定性的要求，并使得能盡可能準確并特異性地進行測定。本發明的目的尤其是提供用于測定血液樣品中的肝素(尤其是分級的肝素或低分子量肝素)以及直接的Xa因子抑制劑的方法和裝置。本發明的解決方案為了實現所述任務，本發明提供了用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法、電化學測試元件和測試元件分一斤系統以達到本專利獨立權利要求所述的這些目的。優選的具體實施方式在從屬權利要求中被聲明。為了實現這些目的，本發明特別記載了用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法，其特征在于，在第一步中，使要分析的血液樣品與檢測試劑并與已知量的Xa因子接觸，所述檢測試劑含至少一種由能由凝血酶裂解并通過羧基末端與產電物質酰胺基連接的肽殘基組成的凝血酶底物，隨后在第二步中，利用電化學方法測定作為測量信號的通過Xa因子介導的凝血酶活化而從凝血酶底物上裂解的產電物質的量或活性和/或其時程，并最后在第三步中，根據該測量信號確定要分析的血液樣品中Xa因子抑制劑的量或與其相關的測量值(尤其是與其相關的凝固時間)。根據本發明，在該方法的第一步中，已知量的Xa因子不直接作為Xa因子試劑加入，而是通過向樣品加入已知量的X因子試劑和活化試劑而進行，其使得X因子轉化成Xa因子。本發明所迷的方法進一步依照示例性的實施例來闡述測試原理的基礎是通過電化學測量來測定由Xa因子誘導的凝固反應所形成的凝血酶的酶活性，其中至少一種裂解產物在電極上電化學測定。特別可使用三肽底物作為凝血酶特異性底物，所述三肽底物例如是還原的ChromozymTH(甲苯磺酰-甘氨酰-脯氨酰-精氨酸-4-苯基重氮酸乙酸鹽(tosyl-glycy-prolyl-arginine陽4-nitroanilideacetate)),其通過三肽部分的羧基末端與產電物質酰胺基連接。這類產電物質在WO01/63271中有舉例說明，并且其尤其可以是^皮取代的苯胺，特別是硝基苯胺衍生物或苯二胺。才企測反應如下進4亍酶(凝血酶)從底物上裂解出產電物質，在本實施例中，其是苯二胺，其在電極上被氧化成苯二胺。在一個優選的具體實施方式中，在裂解產物被氧化的同時，在電極上發生輔助物質的還原(例如從刃天青到試鹵靈)，可測量由此產生的與裂解產物的量相關的電流強度。因此，在本電化學反應中，刃天青在陰極上作為輔助物質一皮還原，而苯二胺在陽極上被氧化。雙電極系統優選被用于電化學法測量凝血酶活性，其中一方面選擇工作電極上的電勢，使其高到足以氧化從凝血酶釋放出的苯二胺，在另一方面，使其低到不還原三肽的殘基。陰極(工作電極)和陽極(對電極)間的電勢差由恒電位儀控制。在本實施例中，可選擇約550mV的電勢差作為合適的電勢差，由此使得只在電極上發生所希望的反應。對于本發明所述的方法，該電化學測試原理如下運用于Xa因子抑制劑測試中在反應批料中除了檢測試劑，還有通過加入已知量的X因子試劑而形成的已知量的Xa因子和使X因子轉化成Xa因子的活化試劑。要分析的血液樣品含有待測定的Xa因子(FXa)抑制劑，其優選是肝素。該抑制劑與反應批料中以已知量并過量存在的Xa因子和血液樣品中存在的抗凝血酶III形成化學計量的復合物。在該過程中，Xa因子(FXa)的殘存量仍舊是依賴于樣品中Xa因子抑制劑濃度的濃度。現在，這能與血液樣品中存在的凝血酶原(并與其中還存在的Va因子)反應形成凝血酶原復合物并隨后反應形成凝血酶，該凝血酶可如上所述通過凝血酶依賴性酶促裂解產電物質和電化學檢測物質來測定。樣品中存在越多Xa因子抑制劑，與ATIII形成復合物后剩余的Xa因子(FXa)越少，并形成越少的凝血酶。本測量原理在嚴格意義上不檢測凝固時間，即它不是借助纖維蛋白形成的凝固測試，而是借助電化學方法測定凝血酶形成的時程。實施例2和圖1示例性顯示了根據本發明的方法而得的該電化學測定凝血酶的結果。本發明所述的活化的Xa因子與凝血酶檢測試劑的應用，相對于生色Xa因子測試和WO01/63271中所述的方法，給出了更多有關凝血系統生理狀態的信息，因為在該情況下，它不裂解人造的Xa因子特異性底物并用于測量Xa因子活性，而例如在生理凝固過程中才形成凝血酶。根據本發明，利用凝血酶特異性底物能電化學測定該凝血酶的形成，并利用合適的算法來例如轉換成凝固時間。相對于基于測定Xa因子誘導的纖維蛋白凝塊形成的Xa因子抑制劑測試，如Heptest或ENOX測試，本發明具有的優勢有，通過電化學方法的測定簡單得多而且能以較少人力和設備投入來實施。由于用本發明所述的方法測定Xa因子活性是通過測定生理凝固級聯中才天然產生的下游凝血因子(凝血酶)的活性進行的，在一個方面，的生色測試和WO01/63271中所述的方法更接近天然的系統，在另一方面，Xa因子活性的檢測在凝固級聯中較早的時間點上進行，比用基于測定Xa因子誘導的纖維蛋白凝塊形成的測試的情況要早，由此位于凝血酶形成和纖維蛋白凝塊形成之間的下游凝血因子不影響Xa因子活性的測定。這能在生理系統中比用以前已知的測試更準確并更特異性地得到有關Xa因子活性的信息。本發明的解決方案尤其還能在全血中進行Xa因子抑制劑的測定，因為相對于生色測量方法，在所用的電化學方法中，它不需要分離干擾性(尤其是有色)的血液成分。通過相對用于檢測的產電物質匹配控制電極，諸如通過適配所選擇的電極電勢，可能使檢測用于檢測的產電物質基本不受樣品或試劑中存在和潛在的其它干擾性物質影響。為了測定Xa因子抑制劑，根據本發明需要向要檢測的樣品加入至少以下物質或它們必須存在于樣品中已知量的X因子、活化試劑和可從其酶促裂解出產電物質的肽性凝血酶底物作為才企測試劑。可是，用于凝血酶測試中的許多已知的凝血酶底物(包括廣泛使用的ChromozymTH)不具有絕對和排他性的凝血酶特異性，而是也能被其它酶裂解。Xa凝固因子是絲氨酸蛋白酶，其天然識別凝血酶原的氨基酸序列-Ile-Glu-Gly-Arg-,并通過裂解該序列而活化天然的凝血酶原底物以形成凝血酶。除了該生理底物，Xa因子也能酶促裂解其它具有這一或其它裂解序列的肽。因此，肽性凝血酶底物(尤其是廣泛使用的ChromozymTH)也能通過Xa因子來裂解。該Xa因子的低底物特異性會在本發明所迷的方法中帶來問題，尤其是在該也能通過Xa因子裂解的凝血酶底物被用作檢測試劑并已經在加入樣品前就與Xa因子進行接觸而由此被轉化的情況下，帶來問題。因此，已經能夠轉化凝血酶底物部分，使得其不再可供凝血酶介導的檢測反應所使用，因此會因影響測量結果。該不希望的副反應尤其在Xa因子和凝血酶底物長時間接觸的時候發生，例如，如果這些兩種物質被同時導入液體檢測試劑中，會是這種情況。對于前述示例性的測量系統，這意味著，如果在開始檢測反應前，Xa因子和用作凝血酶底物的還原的ChromozymTH已經能互相長時間反應，凝血酶底物部分已經被裂解，由此試劑中存在顯著不確定量的裂解的產電物質。這種情況尤其會發生在這兩種物質一起存在于液體試劑中的時候，或對于千燥化學測試的情況，在它們產生時以液體形式進行接觸的時候。因此，普通的2h總保留時間已經足以僅由Xa因子作用而裂解約25%的還原的ChromozymTH。對于本發明所述的電化學方法，該Xa因子誘導的過早產生的底物降解的結果尤其會使測量信號在開始凝血酶引起裂解還原的ChromozymTH前，偏移至較高的電流強度而且在最小值時也已經具有高的電流強度，因為在樣品中已經由于Xa因子的酶促作用而釋放出苯二胺作為產電物質存在。根據本發明，通過如下方式至少部分解決了過早產生的Xa因子引起底物降解的問題在反應批料中已知量的Xa因子通過如下方式獲得向樣品加入已知量的X因子試劑和將無蛋白水解活性的X因子轉變成為蛋白水解活性的Xa因子的活化試劑。令人驚訝的是，本發明所述的該方法顯示，通過該試劑組合能獲得特別簡單并穩定的測試元件構造。在加入或活化活化試劑前，在試劑中不存在活化的Xa因子而是存在無活性的X因子的事實，使得能夠在測定反應開始前已經將檢測試劑與X因子接觸，而不產生過早產生的Xa因子引發的底物降解并由此干"t尤測定。在尤其優選的具體實施方式中，血漿凝固外部途徑的活化劑或參與復合物被用作活化試劑。尤其是天然產生的活化劑或凝血因子(如組織因子和/或VIIa因子)可被用作活化試劑，而且除了這些天然產生的活化劑或凝血因子，它也可能使用其它活化劑，如合成制備的活化劑。在進一步優選的具體實施方式中，血漿凝固內部途徑的活化劑或參與復合物被用作活化試劑。尤其是天然產生的活化劑或凝血因子，如XIIa因子或使X因子轉換成Xa因子的物質(如魯塞爾蝰蛇毒(RVV-X))可被用作活化試劑，而且除了這些天然產生的活化劑，也可使用其它活化劑，如合成制備的活化劑。在該情況下，在測量過程前或之中，活化試劑可作為外部試劑而被加入至樣品或其它試劑中，或者它可以已經存在于血液樣品中。這也可類似地適用于其它Xa因子活化或檢測反應過程所需的物質上。因此，尤其可通過要分析的血液樣品來提供進一步所需的凝血因子，如V因子或抗凝血酶。在該變體的尤其優選的具體實施方式中，與將活化試劑加入樣品在空間或時間上分開地將X因子試劑加入樣品。X因子試劑和活化試劑的分離避免了不希望的過早產生的X因子向Xa因子的轉化。基礎是在測量開始時盡可能準確已知的Xa因子量，這進而對于測定Xa因子抑制劑有著決定性影響。在這種情況下，與將活化試劑加入樣品在空間和/或時間上分開地向樣品加入X因子試劑。干燥化學試劑通常通過將它們作為溶液以線形方式施加到測試元件上并去除溶劑，由此來施加到測試元件上，由此使它們以干燥化學形式在那兒存在。這是尤其有益的，因為干燥化學形式的試劑通常能比濕化學試劑滿足顯著更高的保存性和穩定性要求。通過提供液體重新溶解干燥化學試劑并優選直接在要分析的血液樣品中溶解它們，在給定的時間內能轉化成更有活性但更不穩定的溶解形式。在測試元件上不同分隔室中安排不同試劑能在開始Xa因子抑制劑測定前，基本防止這些試劑的接觸。這也能使這些試劑的不希望的副反應大大受抑制。優選存在于各個分隔室中的試劑僅能通過樣品液體互相接觸。在濕化學方法中這例如能以如下方式實現，試劑溶液存在于不同的液體空間中，并直到開始Xa因子抑制劑測定才與樣品進行接觸，其中例如通過泵的方式將它們從這些空間加入到樣品中，或讓樣品先后流經不同的液體空間。能導致與將活化試劑和X因子試劑加入樣品的在空間和/或時間上分開的優選方法和裝置，尤其可被設定成分開的試劑線的形式。為了根據本發明測定Xa因子抑制劑，除了X因子試劑和活化試劑，還必須存在檢測試劑。這些試劑可以在開始測定前位于至少部分在空間上分開的分隔室中。由于根據本發明，在開始檢測反應前盡可能不存在Xa因子，因此在優選的具體實施方式中，也可能使X因子試劑或活化試劑與檢測試劑一起存在。對于濕化學方法，這也可相似地適用于試劑的匯合和混合。因此，對于這種情況，X因子試劑或活化試劑能在試劑溶液中與檢測試劑在一起存在。直到缺少的試劑成分(X因子試劑或活化試劑)被加入到該試劑混合物中，才形成Xa因子。這些試劑混合物使得以較少的方法步驟或試劑分隔室就能運行并由此更容易和更成本有利地生產并更容易處理的測定方法和裝置稱為可能。在尤其優選的具體實施方式中，X因子試劑是^r測試劑的組分，其中與將活化試劑加入樣品在空間或時間上分開地向樣品加入^r測試劑/X因子試劑的組合。可以與前述的在空間上或時間上分開地(尤其是以分開的試劑線的形式)將活化試劑和X因子試劑加入樣品的方法和裝置相似，設計出在空間上或時間上分開地將活化試劑和檢測試劑/X因子試劑的組合加入樣品的優選方法和裝置。尤其是，檢測試劑/X因子試劑的組合可在加入活化試劑之后被加入。在優選的具體實施方式中，通過在樣品流動方向先后設置試劑線(Reagenzstriche)來在空間上分開試劑，由此使它們的試劑由樣品先后活化，這對應于時間上錯開地加入到樣品。在這種情況下，試劑線可以彼此分開地存在或者也可以相互接觸(例如相鄰存在)或者完全或部分錯開地彼此疊置施加。在尤其優選的具體實施方式中，活化試劑的試劑線至少部分在樣品流動方向上排列在檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線的上游，優選以部分重疊或彼此疊置的試劑線形式，其中對于后者的情況，活化試劑的試劑線施加在^r測試劑/X因子試劑組合的試劑線之上。實施例3和圖2顯示了在測試元件上用活化試劑和檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線的不同安排方式來進行電化學測定凝血酶的例子。在該變化方案的優選的具體實施方式中，在與將活化試劑加入樣品相同的步驟中將X因子試劑加入樣品中。例如對于濕化學反應，這可以通過諸如泵或吸液管，將兩種試劑一起從其各自儲存的分隔室(儲存容器)中加入樣品來進行。可是，也可能首先使X因子試劑和活化試劑合并，然后向樣品加入這種其中形成Xa因子的試劑混合物。在尤其優選的具體實施方式中，X因子試劑和活化試劑都以干燥狀態存在，而且X因子直到與樣品接觸才轉變成Xa因子。干燥化學試劑的應用使它們能以未活化的形式儲存在一起，而不在試劑之間發生化學反應。直至干燥化學試劑被潤濕，試劑才轉變成它們能互相反應的狀態。在優選的具體實施方式中，該干燥化學試劑的"活化"通過液體血液樣品本身引起。在尤其優選的具體實施方式中，X因子試劑、活化試劑和檢測試劑作為干燥化學試劑一起存在并直到與樣品接觸X因子才轉化成Xa因子。由于千燥化學試劑的應用使它們能以未活化的形式儲存在一起，而不在試劑之間發生化學反應，這些本發明所述的方法和裝置能使所有測定Xa因子抑制劑中所需的試劑儲存在共同的分隔室中而不產生過早產生的Xa因子引起的凝血酶底物降解。僅當加入液體樣品的時候，X因子才以基本確定的起始點和時程轉化成Xa因子，由此最終使已知量的Xa因子存在于樣品中，這構成了根據本發明的原理測定Xa因子抑制劑的基礎。由此原則上能利用所屬領域技術人員已知的方法，使所有測定Xa因子抑制劑所需的試劑合并為單一的干燥化學試劑線或點，這使得能簡便并成本有利地生產，而且能簡便并更不容易出錯地操作。本發明所述的用于測定Xa因子抑制劑的方法和裝置尤其可有益地被用于測定肝素(尤其是分級的或低分子量肝素)。其它能利用本發明所述的方法和裝置有益地測定的Xa因子抑制劑尤其可以是間接選擇性或直接的Xa因子抑制劑。Xa因子抑制劑在本發明的范圍中可被理解為所有直接或間接影響Xa因子活性(尤其是降低活性)的物質，因而能影響(尤其是延遲)血液凝固級聯過程。直接的Xa因子抑制劑對于Xa因子有直接的影響，因此影響其活性，而間接的Xa因子抑制劑不直接與Xa因子相互作用，而影響其數量和形成或需要使其活化的輔因子。例如，它們可以是抗凝血劑，其在Xa因子前作用于凝固級聯中存在的凝血因子，并參與其形成和/或調節。間接選擇性Xa因子抑制劑的例子有某些與抗凝血酶III聯合作用的戊糖，如石黃達肝素(Fondaparinux)和依達肝素(Idraparinux)，與肝素不同，它們對Xa因子有選擇性。直接的Xa因子抑制劑的例子是奧米沙班(Otamixaban)或雷扎沙班(Razaxaban)。本發明的另一方面涉及帶有基于干燥化學的電化學傳感器的測試元件，其用于測定Xa因子抑制劑，尤其是未分級的肝素、分級的或低分子量肝素、間接選擇性Xa因子抑制劑或直接的Xa因子抑制劑，其在惰性載體上具有至少兩個電極和含有由能由凝血酶裂解并通過羧基末端與產電物質以酰胺基連接的肽殘基組成的凝血酶底物的4企測試劑，以及至少一定量的X因子試劑和活化試劑。本發明所述的測試元件尤其適于實施前述本發明所述的用于測定血液樣品中Xa因子抑制劑的方法。本發明所述的測試元件尤其是基于干燥化學的電化學測試元件。這類測試元件含至少兩個電極，其中至少一個電極是所謂的工作電極。它們不必含典型的參比電極，如Ag/AgCl參比電極，而僅僅需要至少一個工作電極和對電極。電極可由所有常見電極材料構建，如金屬、貴金屬、合金或石墨，優選由諸如金或鈀的貴金屬、或石墨構建。測試元件的不同電極可由相同或不同材料組成。在尤其優選的具體實施方式中，測試元件含有都由金組成的工作電極和對電極。這類電化學測試元件的具體實施方式，尤其是對于材料的選擇、電才及和試劑的安置以及測試元件的生產，在諸如US5762770、US6270637或WO01/63271的現有技術中有記載，對于所屬領域技術人員來說是已知的。在優選的具體實施方式中，試劑以一種或多種試劑線的方式^皮施加到電極上。這些能以相互分開或者部分或完全重疊的方式提供。此外，根據本發明，可能不直接在電極上施加并千燥試劑，而是在緊接著電極(諸如在電極附近的平坦基材上)施加并干燥試劑。在這種情況下，測量時，試劑與樣品被轉移至電極處。備選地，為此可以將試劑施加到多孔材料(如非織造物(Vlies)、紙、膜等)中，例如以可分離的方式浸漬。在這種情況下，在與電極接觸前，樣品必須流過這些材料，由此試劑能釋放到樣品中。也可能將試劑的各個成分施加到測試元件的不同分隔室中，例如將檢測試劑施加到電極之上或與電極緊鄰，但是X因子試劑和活化試劑在空間上與其分開(如進一步遠離(entfemt)該電極)或浸漬在不同的層(如膜或羊毛)中。根據本發明，測試元件含有X因子試劑和將X因子轉化成Xa因子的活化試劑，其中與X因子試劑至少部分在空間上分開地(尤其是在樣品流動方向上至少部分安置在X因子試劑之前)使活化試劑存在于測試元件上。例如在優選的具體實施方式中可以由此實現將X因子試劑和活化試劑以分離的試劑線安置在測試元件上。這些可以以相互分開或相互接觸的方式存在。尤其優選的排列方式是其中活化試劑的試劑線在樣品流動方向上至少部分排列在X因子試劑的試劑線的上游，而且至少部分與該試劑線接觸，尤其是至少部分重疊該試劑線。在該具體實施方式中，檢測試劑存在于另一分隔室中，并尤其是以另一試劑線中，可是，其至少能部分與活化試劑和X因子試劑的試劑線接觸。在尤其優選的具體實施方式中，檢測試劑與活化試劑或X因子試劑一起存在于測試元件上。由于活化試劑或X因子試劑都不能單獨產生或形成活化Xa因子，檢測試劑可與這些試劑之一混合而不使檢測試劑發生過早產生的Xa因子引起的降解，由此不產生不希望的對Xa因子抑制劑測定的干擾。將檢測試劑加入這兩種其它試劑之一中能省略掉一個試劑分隔室，則能使用更簡單的和更成本有利地生產的測試元件結構。例如在尤其優選的具體實施方式中，這能通過這樣排列來實現，在所述排列中，活化試劑的試劑線在樣品流動方向上至少部分排列在X因子試劑的試劑線之前，而且至少部分與該試劑線接觸，尤其是至少部分重疊該試劑線，而且檢測試劑與X因子試劑一起存在于一個試劑線中。在另一具體實施方式中，測試元件包含干燥化學形式的X因子試劑和能使X因子轉化成Xa因子的活化試劑，其中活化試劑與X因子試劑一起并任選還與檢測試劑一起存在于測試元件上，而且其中直到與樣品接觸才發生X因子向Xa因子的轉化。由于X因子試劑和活化試劑以干燥化學形式存在于測試元件上，因此它們以它們不能相互反應的形式存在。所以，X因子試劑和活化試劑能一起被儲存于一個分隔室中而不形成Xa因子。直至加入液體，尤其是直至接觸樣品液體時，這兩種試劑才能相互反應，然后X因子才能被轉化為Xa因子。例如在優選的具體實施方式中，這通過將X因子試劑和活化試劑一起以共同的試劑線設置在測試元件上實現。在該具體實施方式中，檢測試劑可存在于另外的分隔室中，尤其是另外的試劑線中，可是它能至少部分與組合的活化劑/X因子試劑的試劑線接觸。在尤其優選的具體實施方式中，也可將檢測試劑加入至X因子試劑和活化試劑中，從而使所有測定Xa因子抑制劑需要的試劑存在于測試元件上單一的分隔室中，尤其是單一的試劑線中。如已經敘述的，干燥化學試劑的應用能使X因子試劑和活化試劑一起共同施加在一個分隔室中而不形成Xa因子。由此也能將檢測試劑加入至該試劑組合中，因為沒有活化的Xa因子，也就不會發生過早產生的Xa因子引起的檢測試劑降解。尤其是，本發明的解決方案能使所有用于測定Xa因子抑制劑需要的試劑施加于單一分隔室中，這使得能產生更簡單的和更成本地生產的測試元件結構。本發明的另一方面涉及電化學測試元件分析系統，其含有至少一種本專利權利要求書所述的測試元件和電流或電壓測量儀器。這類儀器的應用能通過電極上產生的電流來檢測在Xa因子抑制劑測定進程中形成的產電凝血酶底物裂解產物，尤其是苯二胺。在尤其優選的具體實施方式中，測量電流時程。優選以準恒電位的方式來實施電化學法測定，更優選利用雙電極系統，其中連接一個電極同時用作參比和對電極，而連接另一電極作為工作電極。在這雙電極系統上施加恒壓，并隨時間測量電流。該方法也被稱為安培計測量法。在該過程中，測量電流的時程并在開始測定反應一段時間后測得的電流超過預先確定的閾值時，進行測定。該時間段是在凝固反應進程中Xa因子引起的凝血酶底物轉化的量度，其進而依賴于樣品中存在的Xa因子抑制劑的量。除了所述的安培計測量法，也可能使用伏特計測量法。在這種情況下，并不在電極之間控制恒壓，而是電壓從起始值向終值線性地變化，隨后再次回歸到起始值。該過程在完整的測量持續時間中可被重復若干次。對于伏特計測量法，進行電流相對于電壓作圖并且可得到對應于重復的彼此連接的電流-電壓曲線(循環伏安曲線)。使用合適的電壓范圍，電子載體的氧化峰和還原峰被顯示于這些曲線中。如果沒有其它氧化-還原活性物質在所覆蓋的電勢范圍內被氧化或還原，從而不額外地影響電流，則這些峰的高度直接與電子載體的濃度成正比。當測量濃度變化時，可以視需要不考慮該干擾。如果現在能畫出峰極大點的電流值或各個電流-電壓循環(Strom-Spannungsschleife)隨時間的曲線所包圍面積(對應于電荷轉移(Ladungsumsatz)),也能得到電子載體濃度在測量持續時間以由循環周期給出的時間光柵(Zeitraster)形式的變化圖。然后能像安培計測量法那樣使用該信息來測定Xa因子抑制劑。這類方法在諸如WO01/63271中有記載。尤其可用根據本發明的方法和裝置來測定血液樣品中的Xa因子抑制劑。在本發明的意義上，術語血液樣品不但包括未處理的血液(全血)而且包括可隨后通過物理和/或化學和/或生物化學進一步處理從天然血液樣品中得到的血液衍生物或血液制品。在對本申請意義中，尤其可將血清或血漿視作為血液衍生物。在對本申請意義中，測定Xa因子抑制劑可以是任何定性、定量或半定量測定Xa因子抑制劑。具體實施方案本發明進一步通過以下示例性的實施例和附圖來闡述。圖1示例性顯示了符合本發明所述的方法的電化學測定Xa因子抑制劑的初步測量結果。圖2顯示了測試元件上以活化試劑和檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線的不同排列方式電化學凝血酶測定的結果。實施例1:本發明所述的測試元件的示例性構造本發明所述的測試元件的可能構造及其制備如下示例性描述。例如，惰性載體材料可由聚酯薄膜(如Melinex薄膜)構成。利用各種方法，如用金蒸鍍載體薄膜，然后激光熔蝕所希望的電極結構，可以將電極結構施加在該薄膜上，而其它生產這些電極結構的方法也是所屬領域技術人員所熟悉的，如蝕刻法或印刷法。任選隨后能以絕緣層來提供電極結構的某些部分。現在將測定所需的試劑施加于帶有其電極結構的載體材料上。對此，可設想所屬領域技術人員已知的各種方法，尤其是印刷或刮涂法，其中將溶解形式的試劑以試劑線的形式施加到測試元件上，然后至少部分去除溶劑，從而在測試元件上提供干燥化學形式(即未活化形式)的試劑。這類方法在諸如WO01/63271中有記載。在這類涂覆方法中，試劑通常被溶解于基礎批料中，該基礎批料包含能盡可能優化試劑溶液的處理的物質。該基礎批料的示例性組成如下(其溶解于雙蒸水中):<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>現在將每種特定試劑成分(如凝血酶底物、X因子、活化試劑；各自或以組合形式)混入到該基礎批料中并以空間確定的方式(如作為試劑線或試劑點)施加于測試元件上。去除溶劑后，現在在測試元件上存在有確定并穩定的試劑線或試劑點，其中試劑可以穩定形式長期儲存而不喪失活性。在優選的具體實施方式中，還在測試載體上另外施加橫向隔板和覆蓋薄膜，來區隔出可吸收基本確定體積的樣品并將其傳送到試劑分隔室和電極上的毛細管通道。實施例2:對應于本發明所述的方法和裝置來電化學測定Xa因子抑制劑的示例性的過程為了進4亍Xa因子抑制劑測定，將足夠量(如1-1000優選約10pl)的要分析的血液施加于本發明所述的測試元件上，施加方式能使其與位于測試元件上的試劑分隔室和電極接觸，例如，所述測試元件可以優選根據實施例1來制備。這優選通過在測試元件上提供毛細管通道并在測試元件上的毛細管通道內適當地配置試劑分隔室和電極實現。在優選的具體實施方式中，樣品液體、測試元件和/或Xa因子抑制劑測定所需的其它裝置可被恒定在某個溫度，尤其是約37。C的溫度。將測試元件連接在合適的測量裝置上，用以檢測電化學檢測反應，例如連接于尤其能測量并儲存電流時程的電流測量系統上。劑的時程(zeitlichenVerlauf)。在該情況下，使用符合實施例1的測試元件。該曲線顯示了測量得到的電流強度的時程，所述電流強度是其從凝血酶底物上經凝血酶誘導裂解后通過氧化苯二胺而形成的。在x軸上對上樣血液樣品后的以秒計的時間t,并在y軸上對各個時間點上測得的以毫微安培(nanoamper)計的電流強度I作圖。曲線首先經過最低點，然后隨著苯二胺氧化的增加而提高，最后達到最高點，然后由于底物消耗而持續下降。例如使用閾值算法，來進行對這種電流時程的評估以確定反映檢測反應進程的時間測量值。該算法將閾值(如60nA)加到計算出的最小值上，且該算法對所有測量保留。可以將達到的最小值的時間確定作為凝血酶轉化的時間測量值，直到其達到該閾值。由于以這種方式確定的凝血酶轉化的時間測量值依賴于活化的Xa因子的活性/濃度，而且這進而依賴于存在的Xa因子抑制劑的數量或濃度，因此以這種方式確定的時間值能被用于推導出Xa因子抑制劑的存在，超過或低于某濃度或Xa因子抑制劑的數量或濃度。為了實現該目的，例如可能利用已知Xa因子抑制劑濃度的樣品來產生曲線，其使這些濃度與根據本發明確定的其時間參數相關聯。而且利用合適的算法，這些確定了的時間參數還可被用于確定其它的相關參數和與可能存在的Xa因子抑制劑的量相關的測量值，尤其是凝固時間。實施例3:試劑線的排列方式對含有X因子試劑和活化試劑的測試元件的影響圖2顯示了以測試元件上活化試劑和檢測試劑/X因子試劑組合以不同排列方式的試劑線進行電化學凝血酶測定的結果。對于每種情況，都顯示了測得的電流強度的時程，其中在x軸上對施加血液樣品后的以秒計的時間t,并在y軸上對各個時間點上測得的以毫微安培計的電流強度I作圖。在本實施例中，檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線上包含0.8ml還原的ChromozymTH和38.1plX因子(americandiagnostica7A司的X因子；對應于2U/mlXa因子)，活化試劑的試劑線上含有80pl魯塞爾蝰蛇毒(PentapharmUd.的魯塞爾蝰蛇毒(RVV-X))和0.04%磷脂(PHL)。以以下變化形式來施加試劑線曲線A:首先施加^r測試劑/X因子試劑組合的試劑線，然后在該線上施加活化J式劑的試劑線。曲線B:首先施加^^測試劑/X因子試劑組合的試劑線，然后在該線上施加活化試劑的試劑線，其中錯開地施加活化試劑的試劑線，從而使其至少部分在樣品流動方向上位于檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線之前，并至少部分與該線重疊。圖2中的兩條曲線據顯示，最小值相對于較高的電流值和低的初始電流都沒有位移。這表明，用根據本發明的這些優選的方法和裝置，通過至少部分在空間上將試劑分開在兩個分隔室中(尤其是試劑線)，能大大抑制過早產生的底物降解。相對于直接在檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線上施加活化試劑的試劑線(曲線A)，在樣品流動方向上于檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線之前錯開地施加活化試劑的試劑線(曲線B)顯示出較低的電流極大值和延遲的反應動力學。直接在檢測試劑/X因子試劑組合的試劑線上施加活化試劑的試劑線，主要由于具有更快的反應動力學，因而對于本發明測定Xa因子抑制劑(尤其對于診斷應用)來說尤其具有優勢。權利要求1.用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑的方法，其特征在于，a)使要分析的血液樣品與檢測試劑并與已知量的X因子試劑和誘導X因子轉化成Xa因子的活化試劑接觸，所述檢測試劑含至少一種由能由凝血酶裂解并通過羧基末端與產電物質酰胺基連接的肽殘基組成的凝血酶底物，b)利用電化學方法測定作為測量信號的通過Xa因子介導的凝血酶活化而從凝血酶底物上裂解出的產電物質的量或活性和/或其時程，和c)根據該測量信號確定要分析的血液樣品中Xa因子抑制劑的量或與其相關的測量值，尤其是與其相關的凝固時間。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，血漿凝固外部途徑的活化劑或參與復合物，尤其是組織因子和/或Vila因子，或血漿凝固內部途徑的活化劑或參與復合物，尤其是XIIa因子或誘導X因子轉化成Xa因子的物質，被用作活化試劑。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，與將活化試劑加入樣品在空間上或時間上分開地將X因子試劑加入樣品。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于X因子試劑是^r測試劑的組分，而且與將活化試劑加入樣品在空間上或時間上分開地，尤其是在將活化試劑加入樣品之后，將該檢測試劑/X因子試劑的組合加入樣品中。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，在將活化劑加入樣品的同一步驟中將X因子加入樣品中。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，X因子試劑和活化試劑一起以干燥狀態存在而且直到與樣品接觸x因子才轉化成Xa因子。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，X因子試劑、活化試劑和檢測試劑一起以干燥狀態存在而且直到與樣品接觸X因子才轉化成Xa因子。8.根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，Xa因子抑制劑是肝素，尤其是分級的或低分子量肝素，間接選擇性或復接的Xa因子抑制劑。9.帶有基于千燥化學的電化學傳感器的測試元件，用于測定Xa因子抑制劑，尤其是未分級的肝素和分級的或低分子量肝素、間接選擇性Xa因子抑制劑和直接的Xa因子抑制劑，所述測試元件在惰性載體上具有至少兩個電極和含有檢測試劑以及至少一定量的X因子試劑和活化試劑，所述^r測試劑含至少一種由能由凝血酶裂解并通過羧基末端與產電物質酰胺基連接的肽殘基組成的凝血酶底物。10.根據權利要求9所述的測試元件，其特征在于，所述活化試劑以與X因子試劑至少部分在空間上分開地存在于測試元件上，尤其是至少部分設置在樣品流動方向上X因子試劑的上游。11.根據權利要求IO所述的測試元件，其特征在于，所述檢測試劑與所述活化試劑或X因子試劑一起存在于測試元件上。12.根據權利要求9所述的測試元件，其特征在于，它含有X因子試劑和誘導X因子轉化成Xa因子的活化試劑作為干燥的化學試劑，而且活化試劑與X因子試劑一起并任選還與檢測試劑一起存在于該測試元件上，從而直到與樣品接觸才使X因子轉化為Xa因子。13.電化學測試元件分析系統，其包括至少一種電流或電壓測量裝置和根據權利要求9至12之一所述的測試元件。全文摘要本發明涉及用于測定血液樣品中的Xa因子抑制劑(尤其是肝素和分級的或低分子量肝素以及直接的Xa因子抑制劑)的方法和裝置，其特征在于，在第一步中將血液樣品與檢測試劑并與已知量的X因子試劑和誘導X因子轉化成Xa因子的活化試劑接觸，所述檢測試劑含有至少一種由能由凝血酶裂解并通過羧基末端與產電物質酰胺基連接的肽殘基組成的凝血酶底物，隨后在第二步中，利用電化學方法測定作為測量信號的通過Xa因子介導的凝血酶活化而從凝血酶底物上裂解出的產電物質的量或活性和/或其時程，并最后在第三步中，根據該測量信號確定要分析的血液樣品中Xa因子抑制劑的量或與其相關的測量值(尤其是與其相關的凝固時間)。文檔編號C12Q1/56GK101535498SQ200780040819公開日2009年9月16日申請日期2007年10月27日優先權日2006年10月31日發明者C·霍恩,L·多爾格,M·克爾齊休克申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司