纖維素酶以及纖維低聚糖的制造方法

專利名稱：纖維素酶以及纖維低聚糖的制造方法
技術領域：
本發明關于選擇性、高產率制造纖維低聚糖的方法，是纖維素酶活性高、且纖維低 聚糖選擇率高的酶溶液的制造方法，以及使用了該酶溶液的纖維低聚糖的制造方法。
背景技術：
纖維低聚糖是纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖、纖維六糖的總稱，是1 6個吡喃葡萄糖單位以日-1，4鍵合的各種糖類。近年來，與其他的低聚糖相同，纖維低聚糖 的生理機能日益明確，可望作為功能性食品的新素材(參照非專利文獻1)。一般，作為得到 纖維二糖的方法，所知的有(1)使用了以蔗糖為原料的酶合成反應的方法和(2)使用了以 纖維素為原料的酶的分解反應的方法。作為上述(1)的酶合成反應，所知的有，在磷酸存在下，以蔗糖為原料，依次作用 蔗糖磷酸化酶、葡萄糖異構酶以及纖維二糖磷酸化酶，得到纖維二糖的方法(參照專利文 獻1)。但是，該方法中，為了得到纖維二糖，使用了 3種昂貴的酶，且在3個階段各自必須反 應，考慮工業生產的話，酶的成本較高，且生產效率低。另一方面，作為上述(2)的酶分解反應，所知的有，將纖維素系材料通過纖維素酶 進行分解的方法。關于此種酶解反應，關鍵在于如何提高從纖維素生產纖維低聚糖時含有 纖維素酶的酶溶液的纖維低聚糖的生產效率，如何防止生成的纖維二糖向葡萄糖分解(參 照非專利文獻2)。圍繞上述課題，一直以來，進行了許多以提高纖維素酶解時的纖維低聚糖得率的
嘗試o作為使用纖維素酶、通過酶解纖維素選擇性得到纖維低聚糖的方法，例舉如下。專利文獻2提出，使用含有許多非結晶性纖維素的纖維素原料，在木質素存在下 進行纖維素酶的水解反應，同時，通過隨時從反應液中至少采取水解反應所生成的纖維低 聚糖中的纖維二糖的纖維低聚糖制造方法，專利文獻3提出，蒸解含有天然木質纖維素的 原料，將蒸解后未經過干燥而得到的濕漿(wet pulp)通過纖維素酶部分水解，至少采取纖 維低聚糖中的纖維二糖的纖維低聚糖制造方法。這些制造方法，是將纖維素酶所含的纖維低聚糖分解酶——3 -葡萄糖苷酶吸附 在木質素上，通過抑制葡萄糖苷酶的作用，抑制纖維低聚糖向葡萄糖的分解，提高纖維 低聚糖的反應選擇率。但是，這些制造方法中，由于所得到的糖化液含有大量的木質素，結 果會降低纖維低聚糖的產收量。此外，為了得到高純度的纖維低聚糖，必須進行從糖化液的 脫除木質素的處理，因此存在精制工序變得復雜的問題。專利文獻4提出，通過使含有1 20質量％的木質素的木質纖維素與纖維素酶以 及白色腐朽菌等木質素降解菌共同反應，制造纖維低聚糖的1種——纖維二糖的方法。該 制造方法中，不經過纖維素的脫除木質素處理，可以提高對于纖維素酶的基質的作用，但由 于其分解生成物中混入了纖維二糖以外的木質素降解物，因此與上述相同，纖維低聚糖的 產收量下降。此外，為了得到高純度的纖維二糖，必須有木質素降解物的除去工序，因此存
3在精制工序變得復雜的問題。此外，通過使用特定的纖維素酶、纖維素的酶解，來提高纖維低聚糖得率的方法可 例舉如下。專利文獻5提出，通過屬于纖維弧菌屬的微生物所生產的纖維素酶的作用，在水 性反應液中從纖維素系物質制造纖維低聚糖的方法中，通過超濾反應器的組合，可解除生 成物阻礙，生成積蓄纖維低聚糖的纖維低聚糖的制造方法。通過該方法，作為纖維素系物質 的酶解的分解生成物，可以得到僅由纖維二糖、纖維三糖構成的纖維低聚糖。但是，屬于纖 維弧菌屬的微生物所生產的酶難以對結晶性的纖維素起作用，為了縮短反應時間、提高得 率，必須有作為基質的非晶質纖維素，存在工序變復雜的問題。專利文獻6提出，用纖維素酶分解纖維素、生成纖維低聚糖的方法中，事先令纖維 素酶與平衡為PH3. 5 5. 0的弱酸性陽離子交換樹脂接觸，從而選擇性除去纖維素酶中的 3 -葡萄糖苷酶，令相關的除去了 0 “葡萄糖苷酶的纖維素酶與纖維素接觸，從而得到纖維 低聚糖的制造方法。根據該制造方法，通過纖維素的酶解，可以減少葡萄糖，得到纖維低聚 糖60%以上的分解生成物。但是，該制造方法中，必須有除去纖維素中的葡萄糖苷酶的 工序，存在纖維低聚糖制造工序變復雜的問題。此外，該纖維素酶精制工序中，對于未處理 纖維素酶，必須用75 1000倍的陽離子交換樹脂，因此纖維素酶處理量受限制，纖維低聚 糖的生產效率不充分，存在纖維素酶精制成本、陽離子交換樹脂的分離精制劑成本增加的 問題。專利文獻7提出，令纖維素酯或纖維素醚酯的任一個或兩者與纖維素酶溶解，保 溫一定時間后，變化PH，通過使不溶的固體部分與溶液分離，而選擇性除去纖維素酶中含有 的葡萄糖苷酶的纖維素酶精制方法，此外，將該除去了 葡萄糖苷酶的纖維素酶與纖 維素添加在水性介質中變為懸濁液，對該懸濁液進行一定時間的保溫，令該懸濁液中生成 纖維二糖，采取該纖維二糖的纖維二糖的制造方法。專利文獻8提出，在調整pH后可溶解殼聚糖的水性介質中，溶解上述殼聚糖和纖 維素酶，保溫一定時間后，變化PH，通過使不溶的固體部分與溶液分離，而選擇性除去纖維 素酶中含有的葡萄糖苷酶的纖維素酶精制方法，此外，將該除去了 葡萄糖苷酶的纖 維素酶與纖維素添加在水性介質中變為懸濁液，對該懸濁液進行一定時間的保溫，令該懸 濁液中生成纖維二糖，采取該纖維二糖的纖維二糖的制造方法。通過這些制造方法，使用纖維素衍生物或殼聚糖對纖維素酶進行吸附分離處理， 使其在吸附于纖維素衍生物或殼聚糖的狀態下與纖維素接觸，從而提高纖維二糖的得率。 但是，該制造方法中，必須進行纖維素酶的精制處理，因此存在制造工序變得復雜，使用于 纖維素酶精制的纖維素衍生物、殼聚糖昂貴、成本上升的問題。此外，由于同時將纖維素酶 與纖維素衍生物或殼聚糖用于纖維素酶解，因此存在必須從分解反應液中將其除去的工序 的問題。專利文獻9提出，將不溶性纖維素或含有纖維素的物質與來自Trichoderma的纖 維素酶在水性介質中保溫后，分離固體部分，在該固體部分中加入水溶性溶液，得到纖維二 糖的方法。通過該制造方法，可以減少在纖維二糖制造工序中混入的葡萄糖苷酶，可選 擇性得到纖維二糖。但是，由于必須對固體部分進行纖維素酶吸附工序以及固體部分分離 工序，因此存在工序非常復雜的問題。
非專利文獻1 :Cellulose Communications, 5, No2,91-97 (1998)非專利文獻2 《七 >，一七》講談社寸^ ^ > r ^ 7 ^ ^發行，97-104 (1987)專利文獻1 日本專利特開平03-130086號公報專利文獻2 日本專利特開平05-317073號公報專利文獻3 日本專利特開平07-184678號公報專利文獻4 日本專利特開平08-089274號公報專利文獻5 日本專利特開平01-256394號公報專利文獻6 日本專利特開平05-115293號公報專利文獻7 日本專利特開平05-227957號公報專利文獻8 日本專利特開平05-227958號公報專利文獻9 日本專利特開昭63-226294號公報

發明內容
本發明的目的是提供以纖維素系物質為原料、在纖維素酶存在下酶解而有選擇 生產纖維二糖時，無須經過繁雜的工序，纖維素酶活性高、且可確保大量的纖維低聚糖高選 擇率培養上清酶溶液的酶溶液制造方法；以及使用了該酶溶液的纖維低聚糖的制造方法。本發明人們發現，在含有0. 1 10質量％棉籽粕的培養基中，培養屬于 Trichoderma屬的微生物，可以得到纖維素酶活性高的培養液。此外，在除棉籽粕外還含有 硫酸銨0. 01 %以上的培養基中接種屬于Trichoderma屬的微生物，通過在適當的條件下培 養，成功地降低了 葡萄糖苷酶的活性。8口，本發明如下。(1) 一種含有纖維素酶的酶溶液的制造方法，包括在含有來自屬于錦葵科的植物 種子的成分的液體培養基中，培養屬于Trichoderma屬的微生物。(2)如(1)所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，屬于錦葵科的植物種子為棉 籽。(3)如(2)所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，在含有0. 1 10質量％的作為 來自棉籽成分的棉籽粕的液體培養基中，培養屬于Trichoderma屬的微生物。(4)如⑴ (3)任意一項所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，液體培養基含 有選自硫酸根離子、硫酸氫根離子以及銨離子中的至少一個。(5)如⑴ ⑷任意一項所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，微生物為屬于 Trichodermareesei 的菌株。(6)如(5)所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，屬于Trichoderma reesei的 菌株，是Trichoderma reesei GL_1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物保藏 中心、受托編號FERM BP-10323)、和/或Trichoderma reesei AKC-015株(獨立行政法人 產業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、受托編號FERM BP-10839)、和/或以GL-1株或 AKC-015株為親株得到的變異株。(7) —種含有纖維素酶的酶溶液的制造方法，包含培養Trichoderma reesei AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、受托編號FERM BP-10839)。
(8) 一種纖維低聚糖的制造方法，包含使用(1) (7)任意一項所述的制造方法所 制造的酶溶液對纖維素系物質進行酶解。通過本發明，可以制造纖維素酶活性高、且纖維低聚糖選擇率高的酶溶液，通過將 該酶溶液用于纖維低聚糖的制造，可無須經過繁雜的工序而高產地制造纖維低聚糖。


[圖1]圖1為棉籽粕與其它的本培養用培養基成分的CMCase活性(相對比)的 比較。棉籽粕培養的培養液，較之于其它培養基成分系，在相同培養條件下顯示出較高的 CMCase活性(相對比)。
具體實施例方式本發明中的纖維素酶指的是分解纖維素的酶的總稱，只要具有纖維素的分解活 性，即包含在本發明所稱的纖維素酶中。此外，本發明中的纖維素酶活性，可用分解羧甲基 纖維素(CMC)的酶活性(CMC-ase)和分解結晶纖維素(MCC)的酶活性(MCC-ase)表示，可 使用下述方法測定。這些纖維素酶活性越高，纖維素的分解速度、分解率提升，因此較為理
術g
；ο(1) CMC-ase 活性準備480 μ 1的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5)中溶解有1 %羧甲基纖維素鈉鹽 溶液的溶液。在其中加入經過適當稀釋的酶溶液20μ 1，進行40°C、30分鐘的反應。95°C 加熱15分鐘，停止反應，然后通過3，5_ 二硝基水楊酸法進行還原糖比色定量。用纖維二糖 標準液制作標準曲線，通過纖維二糖換算，將1分鐘內游離Ιμπιο 的還原糖的酶量定義為 1個酶單位(IU)。(2) MCC-ase 活性在50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5)中懸濁有1. 25質量％結晶性纖維素(旭化成 夕笑力 > 文制造，商品名七才，^ PH-101，水分60%，使用三英制作所制造、商品名萬能 攪拌混合機的鉤型U”、攪拌葉，進行90分鐘、126rpm混煉攪拌得到)的基質液0.4ml 中，加入經過適當稀釋的酶溶液0. 1ml，進行40°C、30分鐘的反應后，加熱95°C、15分鐘，停 止反應，然后通過3，5- 二硝基水楊酸法進行還原糖比色定量。用纖維二糖標準液制作標準 曲線，通過纖維二糖換算，將1分鐘內游離1 μ mol的還原糖的酶量定義為1個酶單位(IU)。此外，本發明中的葡萄糖苷酶指的是分解纖維低聚糖、生成葡萄糖的酶，以 β-葡萄糖苷酶活性定量。通過纖維素的酶解得到葡萄糖的情況下，酶溶液的葡萄糖 苷酶活性越高，由于葡萄糖的生成速度以及分解率越高，因此有效。反之，為了高產地得到 纖維低聚糖，有效的是使用上述纖維素酶活性高、且葡萄糖苷酶活性低的酶溶液。該 β-葡萄糖苷酶活性可通過以下方法測定。(3) β -葡萄糖苷酶活性在200mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5)中溶解有2. 0質量％纖維二糖(Aldrich制 造特級級別)的基質液0. 3ml中，加入酶溶液0. 3ml，進行40°C、30分鐘的反應后，95°C加 熱15分鐘，停止反應，然后使用變旋酶和葡萄糖氧化酶組合的酶法試劑——葡萄糖定量試 劑盒(葡萄糖Cll-test wako，和光純藥工業公司制造)，定量反應液中的葡萄糖濃度。將1分鐘內游離ι μ mol的葡萄糖的酶量定義為1個酶單位(IU)。本發明使用的纖維素酶生產菌為屬于Tricoderma屬的微生物。通過接種屬于 Tricoderma屬的微生物、培養，可以制造本發明的纖維素酶活性高的酶。將本發明的酶溶液用于制造纖維低聚糖時，必須要得到纖維素酶活性高、且 纖維低聚糖選擇率高的酶溶液，在上述屬于Tricoderma屬的微生物中，優選使用屬于 Trichodermareesei的菌株，特別優選使用Trichoderma reesei GL-1株(獨立行政法人產 業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、受托編號FERM BP-10323)或Trichoderma reesei AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、受托編號FERM BP-10839)。上述方法中，為了進一步高產制造纖維低聚糖，優選使用以上述Trichoderma reesei GL-I株或AKC-015株為親株、經已知的變異處理得到的變異株，以得到高產且高選 擇率的纖維低聚糖。此外，GL-I株于2005年4月15日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利 生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6 (郵編305-8566))、受托編 號FERM BP-10323，AKC-015株于2007年6月13日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究 所、專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6 (郵編305-8566))、 受托編號FERM BP-10839。此外，GL-I株于2005年10月7日保藏于中華民國(臺灣)食 品工業發展研究所(FIRDI)，受托編號BCRC930082。此處的已知的變異處理指的是，對于具有纖維素酶生產能的微生物，根據需要 使用諸如紫外線照射或亞硝基胍等誘變劑，進行誘變處理，從這些菌株中選擇處理纖維 低聚糖生產效率高的菌株。作為誘變處理所使用的微生物，親株優選使用Trichoderma reesei GL-1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、受托編號FERM BP-10323)、或Trichoderma reesei AKC-015株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利 生物保藏中心、受托編號FERM BP-10839)。作為變異處理的一例，例如可舉出如下方法。將Trichoderma reesei GL-1株或AKC-015株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養 基上，進行28°C、3 10天的培養。將生成的孢子懸濁在生理鹽水，成為100，000 100，000，000 個/ml，用 EMS (ethyl methane sulfonate)實施變異處理(100 500 μ g/ml、 pH7. 0、28°C、5 24小時)。分泌纖維低聚糖生產性高的纖維素酶的菌株的選擇，可通過從 該誘變處理孢子的懸濁液中離心分離收集孢子、充分洗凈、將葡萄糖等作為碳源培養、用已 知的方法測定培養物的酶活性來達成。例如，可通過使用各變異處理菌株的培養物，將纖維 二糖或結晶纖維素作為基質進行酶解，既可以對生成的還原糖進行定量，也可以使用已知 的發色基質令培養物和酶反應，定性選擇目標菌株。本發明的酶溶液的制造方法所使用的本培養用培養基，必須含有來自屬于錦葵科 的植物種子的成分。作為屬于錦葵科的植物種子可舉出有棉花、黃秋葵、朱槿、木槿、芙蓉、 蜀葵等的種子，優選使用棉籽等。作為來自屬于錦葵科的植物種子的成分，可使用例如棉籽 粕。此處的棉籽指的是，屬于錦葵科棉花屬的植物的種子、及其外皮，棉籽粕指的是，從棉籽 榨取棉籽油后剩下的物質。本發明的棉籽粕，除了上述的棉籽，也可包括種子、棉籽殼、棉籽 絨、棉花、花瓣等。用于培養屬于Tricoderma屬的微生物的培養基中棉籽的添加量，與酶溶 液的纖維素酶活性密切相關，為了得到高效價的纖維素酶，培養基中棉籽粕的添加量必須為0. 1 10質量％。培養基中棉籽粕的更優選添加量為0. 2 7質量％，進一步優選2
5質量％。為了得到本發明的選擇性制造纖維低聚糖的β -葡萄糖苷酶活性下降的酶溶液， 除了來自屬于錦葵科的植物種子的成分，還優選在液體培養基中添加選自硫酸根離子、硫 酸氫根離子以及銨離子中的至少一種，特別優選在液體培養基中添加硫酸銨。作為培養基 中硫酸銨的添加量，為了降低β -葡萄糖苷酶活性，優選0. 01 10質量％，更優選0. 02 2質量％。特別優選的范圍是0. 1 0.5質量％。在本培養所使用的培養基中，除了上述記載的，作為碳源可舉出有，纖維素粉末、 纖維二糖、濾紙、一般紙類、木屑、米糠、稻殼、蔗渣、大豆粕、咖啡粕、淀粉、乳糖、葡萄糖、甘 油、乙醇、有機酸等。此外，作為氮源，可添加硝酸銨等無機銨鹽、尿素、氨基酸、肉提取物、酵 母提取物、聚蛋白胨、蛋白分解物等有機含氮物。作為無機鹽類，可使用KH2P04、MgS04 ·7Η20、 CaCl2 · 2H20、FeCl3 · 6H20、MnCl3 · 4H20、ZnSO4 · 7Η20等。如有需要可使用含有有機微量營 養物的培養基。培養中可使用通常的通氣攪拌培養裝置或固體培養裝置，使用上述培養基，以溫 度20 40°C、優選26 30°C、培養pH2 8、優選2. 5 5. 5培養的話，3 10天纖維素 酶活性達到最高。接著，通過對培養液進行離心分離、過濾等已知的方法除去菌體，得到上 清液。該上清液可直接作為粗酶液使用。以下說明纖維低聚糖的制造方法。酶解方法只要使用已知的方法即可，并無特別限制，舉一例，作為基質，將纖維素 系物質在水性介質中懸濁，添加本發明的纖維素酶，一邊攪拌或振蕩，一邊加溫進行糖化反 應的方法。上述方法中，懸濁方法、攪拌方法、纖維素酶 基質的添加方法 添加順序、它們的 濃度等反應條件，可為了得到更高產的纖維低聚糖而進行適當調整。此時的反應液的PH以 及溫度，只要在酶不失活的范圍內即可，一般，在常壓下反應時，溫度在5 95°C、pH在1 11的范圍即可。此外，該壓力、溫度、PH也可與上述相同，可為了得到更高產的纖維低聚糖 而進行適當調整。使用將上述的Trichoderma reesei GL-I株和/或AKC-015株、或它們 的變異株作為纖維素酶生產菌所得到的纖維素酶時，纖維素的酶解優選在常壓、醋酸或磷 酸緩沖液中、溫度50 60°C、pH3. 0 5. 5的范圍內進行。本發明使用的纖維素系物質，優選為含有纖維素的水不溶性纖維質物質。它既可 以來自植物性，也可以是動物性，作為產生其的動植物，可舉出例如，木材、竹、麥蒿、稻蒿、 玉米癤(二 ^)、棉花、苧麻、蔗渣、紅麻、甜菜、海鞘、細菌纖維素等。此外，本發明中，除了上 述動植物產生的天然纖維素系物質，也可以使用將天然纖維素系物質暫且進行化學·物理 溶解、或膨潤后，再生得到的再生纖維素系物質、以及將纖維素系原料進行了化學修飾的纖 維素衍生物系物質。這些纖維素系物質在工業上可任意為漿、纖維素粉末、結晶纖維素等的 天然纖維素系原料、人造絲等的再生纖維素、堿性纖維素、磷酸膨潤纖維素等各種再生纖維 素系原料、羧甲基纖維素鈉等各種纖維素衍生物系原料。但是，將得到的纖維低聚糖用于醫 藥品、食品、化妝品時，更優選使用天然纖維素系原料。作為原料，既可以使用其中的1種纖 維素系物質，也可以使用2種以上的混合。該酶反應既可以批量式進行，也可以連續式進行。酶分解反應中，為了回避纖維二糖引起的生成物障礙，將反應系統內的纖維二糖濃度保持在特定范圍，這對提高纖維低 聚糖的生產效率是很重要的。作為保持反應系統內纖維二糖濃度在特定范圍的方法，可以 是通過超濾、反滲過濾等的膜過濾取出反應系統生成的纖維二糖的方法；可以是將活性炭、 竹、木材等干燥植物粉等有機多孔質基材、二氧化硅等無機多孔質基材導入反應系統，令纖 維二糖吸附在它們上的方法；可以是將纖維素基質固定在色譜柱上、令包含纖維素酶的反 應液流通的方法；也可以是通過高分子等固定纖維素酶、令包含纖維素酶的反應液流通的 方法。主成分為通過上述酶解得到的纖維低聚糖的水溶液，也可以根據需要實施脫色、 脫鹽、除酶等精制處理。精制方法只要是已知的方法，則無特別限制，例如可使用活性炭處 理、離子交換樹脂處理、色譜處理、精密過濾、超濾、反滲過濾等過濾處理、晶析處理等，這些 可單獨使用，也可2種以上組合。主成分為上述方法精制的纖維低聚糖的水溶液，既可以直接使用，也可根據需要 通過干燥進行固化。干燥方法只要是已知的方法，則無特別限制，例如可使用噴霧干燥、冷 凍干燥、滾筒干燥、薄膜干燥、棚段干燥、氣流干燥、真空干燥等，這些可單獨使用，也可2種 以上組合。作為上述精制、干燥處理時的纖維低聚糖的介質，除了水以外，也可以根據需要使 用有機溶劑等。這里所使用的有機溶劑也沒有特別限制，但優選例如制造醫藥品、食品及它 們的添加劑工序中所使用的有機溶劑，可舉出《醫藥品添加物事典》(藥事日報社株式會社 發行)、《日本藥局方》、《食品添加物公定書》(均為廣川書店發行)中分類為溶劑的物質。 水、有機溶劑可自由地單獨使用，也可以2種以上并用，可以將1種介質暫且分散后除去該 介質、分散在不同介質。經過了上述工序的纖維低聚糖的形態并沒有特別限制，例如可在常溫下以固體、 懸濁液、乳液、漿、溶液狀的形態使用。作為固體狀纖維低聚糖的一例，可舉出粉末、顆粒、 粒、成形體、積層體、固體分散體等。通過本發明得到的纖維低聚糖的用途并沒有特別限制，例如可用作食品、化妝品、 醫藥品、一般工業制品等領域中的食品成分、化妝品成分、色素成分、香料成分、醫藥品藥效 成分、農藥成分、飼料成分、肥料成分、培養基成分、分析用試劑成分、以及添加劑、中間原 料、發酵原料等。通過本發明得到的纖維低聚糖，在食品中可用于例如，果凍、布丁、酸奶等的凝膠; 蛋黃醬、調味汁、沙司類、醬類、湯、蔬菜加工品等的調味品；咖喱、肉丁洋蔥、肉醬、燉、湯等 的方便食品、冰鮮食品；漢堡、培根、香腸、臘香腸、火腿類等的畜產加工品；魚糕、圓筒狀魚 糕、魚肉火腿·香腸、油炸魚糕等的水練制品；面包、生面、干面、通心粉、意大利面、包子皮、 蛋糕預混物、奶糊預混物、白醬、餃子·春卷等的皮類等小麥加工食品；咖喱、醬、湯、關東 煮、果醬等罐頭、瓶裝罐頭類；糖果、止咳糖、點心片、巧克力、餅干、曲奇、烤米粉片、日式歐 式糕點、歐式帶餡糕點、小吃點心、砂糖點心、布丁等糕點類、油炸類；肉餅、餃子、包子等調 理加工品；蔬菜糊、肉末、水果糊、魚類貝類的糊等糊類等。此外，也可用于冰淇淋、冰牛奶、 乳冰、冰淇淋乳、煉乳、黃油、酸奶、奶酪、白醬等乳制品；人造黃油、油脂餅(fat spread)、使 面點酥松的油脂等油脂加工品等。還可用于可樂等碳酸飲料、含碳酸、含酒精、乳制品的混 合水果軟飲料、果汁或含果汁飲料、乳類飲料等的飲料；咖啡、牛奶、豆奶、可可牛奶、水果牛奶、酸奶等乳酸/乳類飲料等；煎茶、烏龍茶、抹茶、紅茶等茶飲料等。本發明得到的纖維低聚糖，可期待具有乳酸菌、乳酸桿菌等的活性化等腸內有益 菌賦活、降低血糖濃度、血中胰島素濃度，降低血中膽固醇、降低身體脂肪率、促進脂·糖代 謝、改善通便·便臭、抗觸性等各種生理活性，因此，除了上述通常的食品用途，也可作為生 理活性物質用于功能性食品、健康食品、減肥食品等用途。此外，通過本發明得到的纖維低聚糖，由于是高純度，因此也可用作各種纖維低聚 糖衍生物的化學變換原料。
實施例基于實施例等對本發明進行更具體的說明，但本發明并不局限于這些實施例等。[實施例1]將Trichoderma reesei GL-I株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生 物保藏中心、保藏編號FERM BP-10323)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，進行28°C、7 天的培養，充分形成孢子。將1白金環的棉籽粕(培養基、卜 > 夕‘一 7公司制造)0. 15g、 KH2PO4 0. 06g、(NH4)2SO4 :0· 045g、MgSO4 · 7Η20 :0· 009g、CaCl2 · 2Η20 :0· 009g、了 r 力乂一 ^ (注冊商標)LG109 0. 03mL、微量元素液(H3B036mg (NH4) 6Μο7024 · 4H20 26mg FeCl3 · 6H20 IOOmgCuSO4 · 5H20 40mg MnSO4 · 5H20 8mg ZnSO4 · 7H20 200mg 溶解在 100ml 水并懸濁的溶 液)0. 03ml溶解在水30ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注30ml在150ml容量的三角燒瓶，添 加結晶纖維素(旭化成* $力X制造，商品名PH-101)0.3g后，接種到經過高壓滅菌器滅 菌的預培養用培養基，進行28°C、3天的預培養。接著，將該培養液在棉籽粕2g、KH2PO40. 2g、MgSO4 · 7Η20 :0· 03g、CaCl2 · 2H20 0. 03g、7〒力7—義(注冊商標)LG109 :0. 1ml、微量元素液:0· Iml溶解在水:100ml并懸 濁，調整為PH4. 0，分注IOOml在500ml容量的三角燒瓶，添加結晶纖維素(旭化成”力化 乂制造，商品名PH-101) 2g后，接種到經過高壓滅菌器滅菌的本培養用培養基，進行28°C、6 天的培養。在第6天將培養液進行離心分離，測定其ImL上清液的纖維素酶活性(CMCase)。 將其結果作為藥物培養基(，r—^^r^ 7 -)2%，如圖1所示。[實施例2]將Trichoderma reesei GL-I株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，進行28°C、7 天的培養，充分形成孢子。將1白金環與棉籽粕(培養基、卜 > 夕‘一 7公司制造)0. 15g、 KH2PO4 0. 06g、(NH4)2SO4 :0· 045g、MgSO4 · 7Η20 :0· 009g、CaCl2 · 2Η20 :0· 009g、了 r 力乂一 A (注冊商標)LG109 0. 03mL、微量元素液(H3B036mg(NH4)6Μο7024 ·4Η20 26mgFeCl3 ·6Η20 IOOmg CuSO4 · 5Η20 40mg MnSO4 · 5Η20 8mg ZnSO4 · 7Η20 200mg 溶解在 IOOml 水并懸濁的溶液) 0. 03ml溶解在水30ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注30ml在150ml容量的三角燒瓶，添加結 晶纖維素(旭化成* $力X制造，商品名PH-101)0.3g后，接種到經過高壓滅菌器滅菌的 預培養用培養基，進行28°C、3天的預培養。接著，將該培養液在棉籽粕lg、KH2PO40. 2g、MgSO4 · 7Η20 :0· 03g、CaCl2 · 2H20 0. 03g、7〒力7—義(注冊商標)LG109 :0. 1ml、微量元素液:0· Iml溶解在水:100ml并懸 濁，調整為PH4. 0，分注IOOml在500ml容量的三角燒瓶，添加結晶纖維素(旭化成”力化 ^制造，商品名PH-101) 2g后，接種到經過高壓滅菌器滅菌的本培養用培養基，進行28°C、6
10天的培養。在第6天將培養液進行離心分離，測定其上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)。 將其結果作為藥物培養基(，r—^^r^ 7 -)2%，如圖1所示。[比較例1]在與實施例1、或2相同的方法中，除了使用含有小麥米糠(日本制粉)2g或Ig(小 麥米糠各自為2 %、1 % )、玉米漿(和光純藥制造)2g或Ig (玉米漿各自為2 %、1 % )的本 培養用培養基代替本培養用培養基的棉籽粕(實施例1為lg、實施例2為2g)外，與實施例 1相同的方法對Triehoderma reesei GL-I株進行6天的培養。在第6天將培養液進行離 心分離后，測定其上液ImL的纖維素酶活性(CMCase)，各自的結果如圖1所示。[實施例3]將Trichoderma reesei GL-I株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，進行28°C、7 天的培養，充分形成孢子。將其1白金環與棉籽粕(培養基、卜 > 夕‘一 7公司制造)0.15g、 KH2PO4 0. 06g、(NH4)2SO4 :0· 045g、MgSO4 · 7Η20 :0· 009g、CaCl2 · 2Η20 :0· 009g、了 r 力乂一 A (注冊商標)LG109 0. 03mL、微量元素液(H3B036mg(NH4)6Μο7024 ·4Η20 26mgFeCl3 ·6Η20 IOOmg CuSO4 · 5Η20 40mg MnSO4 · 5Η20 8mg ZnSO4 · 7Η20 200mg 溶解在 IOOml 水并懸濁的溶液) 0. 03ml溶解在水30ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注30ml在150ml容量的三角燒瓶，添加結 晶纖維素(旭化成* $力X制造，商品名PH-101)0.3g后，接種到經過高壓滅菌器滅菌的 預培養用培養基，進行28°C、3天的預培養。接著，將該培養液在棉籽粕2g、(NH4)2SO40. 15g、KH2PO4 0. 2g、MgSO4 · 7H20 0. 03g、CaCl2 ·2Η20 :0· 03g、了 r 力乂 一 A (注冊商標)LG109 0. 1ml、微量元素液0. Iml 溶 解在水100ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注IOOml在500ml容量的三角燒瓶，添加結晶纖維 素(旭化成* $力 > <制造，商品名PH_101)2g后，接種到經過高壓滅菌器滅菌的本培養用 培養基，進行28°C、6天的培養。在第6天將培養液進行離心分離后，測定其上清液ImL的 纖維素酶活性(CMCase)、纖維素酶活性(MCCase)以及β _葡萄糖苷酶活性，各自的結果如 表1、2及表3所示。[實施例4]將Trichoderma reesei GL-I株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，進行28°C、7 天的培養，充分形成孢子。將其1白金環與棉籽粕(培養基、卜 > 夕‘一 7公司制造)0.15g、 KH2PO4 0. 06g、(NH4)2SO4 :0· 045g、MgSO4 · 7Η20 :0· 009g、CaCl2 · 2Η20 :0· 009g、了 r 力乂一 ^ (注冊商標)LG109 0. 03mL、微量元素液(H3B036mg(NH4)6Μο7024 · 4H20 26mgFeCl3 · 6H20 IOOmg CuSO4 · 5H20 40mg MnSO4 · 5H20 8mg ZnSO4 · 7H20 200mg 溶解在 100ml 水并懸濁的溶 液)0. 03ml溶解在水30ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注30ml在150ml容量的三角燒瓶，添 加結晶纖維素(旭化成* $力X制造，商品名PH-101)0.3g后，接種到經過高壓滅菌器滅 菌的預培養用培養基，進行28°C、3天的預培養。接著，將該培養液與棉籽粕lg、(NH4)2SO40. 15g、KH2PO4 :0· 2g、MgSO4 · 7Η20 0. 03g、CaCl2 ·2Η20 :0· 03g、了 r 力乂 一 A (注冊商標)LG109 0. 1ml、微量元素液0. Iml 溶 解在水100ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注IOOml在500ml容量的三角燒瓶，添加結晶纖維 素(旭化成* $力 > <制造，商品名PH_101)2g后，接種到經過高壓滅菌器滅菌的本培養用 培養基，進行28°C、6天的培養。在第6天將培養液進行離心分離后，測定其上清液ImL的 纖維素酶活性(CMCase)、纖維素酶活性(MCCase)以及β _葡萄糖苷酶活性，各自的結果如表1、2及表3所示。[實施例5]測定與實施例1相同培養得到的培養液的上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)、 纖維素酶活性(MCCase)以及β _葡萄糖苷酶活性，各自的結果如表1、2及表3所示。[實施例6]測定與實施例2相同培養得到的培養液的上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)、 纖維素酶活性(MCCase)以及β _葡萄糖苷酶活性，各自的結果如表1、2及表3所示。[表1]表1.纖維素酶活性(CMCase) 表1為作為本培養用培養基的成分，比較每個棉籽粕(表中記載為(7 7· — 7 乂 rM τ -))以及硫酸銨(表中記載為硫酸銨)的添加量的培養液的CMCase活性(相對值， 單位U)。可知，在培養基中添加硫酸銨的話，即使棉籽粕添加量少，也可以提高CMCase。[表 2]表2.纖維素酶活性(MCCase) 表2為作為本培養用培養基的成分，比較每個棉籽粕(表中記載為(7 7· — 7 乂 rM τ -))以及硫酸銨(表中記載為硫酸銨)的添加量的培養液的MCCase活性(相對值， 單位U)。可知，在培養基中添加硫酸銨的話，即使棉籽粕添加量少，也可以提高MCCase。[表 3]表3. β-葡萄糖苷酶 表3為作為本培養用培養基的成分，比較每個棉籽粕(表中記載為(7 7· — 7 ^ rM T -))以及硫酸銨(表中記載為硫酸銨)的添加量的培養液的葡萄糖苷酶活性(相對值，單位U)。可知，在培養基中添加硫酸銨的話，表1及表2所示的纖維素酶活性 (CMCase、MCCase)提升，且β-葡萄糖苷酶活性下降。因此，由于在培養基中添加棉籽粕、硫酸銨可以提高纖維素酶活性、降低β _葡萄 糖苷酶活性，因此在纖維素系物質的酶解中，使用本發明的酶溶液的話，可期待高產地得到 纖維低聚糖。[實施例7]除了在本培養用培養基IOOml中加入棉籽粕5g以外，與實施例4相同地培養， 在第7天將培養液離心分離后，上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)以及纖維素酶活性 (MCCase)為 58. 4 禾口 19. 4。[實施例8]除了在本培養用培養基IOOml中加入棉籽粕7g以外，與實施例4相同地培養， 在第7天將培養液離心分離后，上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)以及纖維素酶活性 (MCCase)為 17. 9 和 8. 0。[實施例9]將Trichoderma reesei GL-I株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，進行28°C、7 天的培養，充分形成孢子。將其1白金環與棉籽粕(培養基、卜 > 夕‘一 7公司制造)0.15g、 KH2PO4 0. 06g、(NH4)2SO4 :0· 045g、MgSO4 · 7Η20 :0· 009g、CaCl2 · 2Η20 :0· 009g、了 r 力乂一 ^ (注冊商標)LG109 0. 03mL、微量元素液(H3B036mg(NH4)6Μο7024 · 4H20 26mgFeCl3 · 6H20 IOOmg CuSO4 · 5H20 40mg MnSO4 · 5H20 8mg ZnSO4 · 7H20 200mg 溶解在 100ml 水并懸濁的溶 液)0. 03ml溶解在水30ml并懸濁，調整為pH4. 0，分注30ml在150ml容量的三角燒瓶，添 加結晶纖維素(旭化成* $力^ <制造，商品名PH-10D0. 15g后，接種到經過高壓滅菌器 滅菌的預培養用培養基，進行28°C、6天的預培養。在培養第6天將GL-I株培養液進行離 心分離后，測定其上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)以及β -葡萄糖苷酶活性，CMCase 為29. 4U、β -葡萄糖苷酶活性為0. 145U.在與上述相同的操作中，使用的菌株由GL-I株變為AKC-015株，進行培養，對培養 液進行離心分離后，測定其上清液ImL的纖維素酶活性(CMCase)以及β _葡萄糖苷酶活 性，CMCase為37. 0U、β -葡萄糖苷酶活性為0. 046U。工業可利用性通過本發明的制造方法得到的纖維低聚糖，除了通常的食品素材，還適宜用作功 能性食品素材、醫藥品以及其它化學品的中間體合成材料等的化學變換原料、發酵原料，適 用于食品、醫藥品、一般工業制品領域。
權利要求
一種含有纖維素酶的酶溶液的制造方法，包括在含有來自屬于錦葵科的植物種子的成分的液體培養基中，培養屬于Trichoderma屬的微生物。
2.如權利要求1所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，屬于錦葵科的植物種子為棉籽。
3.如權利要求2所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，在含有0.1 10質量％的作 為來自棉籽成分的棉籽粕的液體培養基中，培養屬于Trichoderma屬的微生物。
4.如權利要求1 3任意一項所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，液體培養基含有 選自硫酸根離子、硫酸氫根離子以及銨離子中的至少一個。
5.如權利要求1 4任意一項所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，微生物為屬于 Trichoderma reesei 的菌株。
6.如權利要求5所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，屬于Trichodermareesei的 菌株是Trichoderma reesei GL_1株(獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物保藏 中心、保藏編號FERM BP-10323)、和/或Trichoderma reesei AKC-015株(獨立行政法人 產業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、保藏編號FERM BP-10839)、和/或以GL-1株或 AKC-015株為親株得到的變異株。
7.一種含有纖維素酶的酶溶液的制造方法，包含培養Trichoderma reesei AKC-015株 (獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物保藏中心、保藏編號FERM BP-10839)。
8.—種纖維低聚糖的制造方法，包含使用權利要求1 7任意一項所述的制造方法所 制造的酶溶液對纖維素系物質進行酶解。
全文摘要
本發明的目的是提供一種酶溶液的制造方法該方法以纖維素系物質為原料、在纖維素酶存在下通過酶解而有選擇、高產地生產纖維二糖時，纖維素酶活性高、且可確保大量的纖維低聚糖高選擇率的培養上清酶溶液；以及使用了該酶溶液的纖維低聚糖的制造方法。根據本發明，可提供包含纖維素酶的酶溶液的制造方法，該方法包含在含有來自屬于錦葵科的植物種子的成分的液體培養基中，培養屬于Trichoderma屬的微生物。
文檔編號C12N9/42GK101883847SQ20078010034
公開日2010年11月10日 申請日期2007年8月15日 優先權日2007年8月15日
發明者井阪光二, 小西一誠, 山崎有亮 申請人:旭化成化學株式會社