專利名稱：一種重組桿狀病毒快速篩選方法
技術領域：
本發明屬于生物基因克隆表達技術領域，涉及一種重組桿狀病毒快速篩選 方法，特別是對現有的利用桿狀病毒表達系統篩選重組病毒步驟的改進。
技術背景桿狀病毒以NPV為主，病毒粒子呈桿狀，外被有囊膜和核衣殼。病毒囊膜 內包被一個或多個病毒粒子，成病毒束。核衣殼內包含著單分子環狀雙鏈DNA 分子，當囊膜病毒進入到中腸細胞后，在中腸堿性條件下，釋放出病毒粒子， 使病毒在細胞內增殖并傳播。桿狀病毒囊膜表面蛋白主要包括gp64、 p74、 gp41、 p25等，這些蛋白在囊膜病毒進入宿主細胞的過程中起著非常重要的作用，當病毒在細胞內復制、重 新包裝時，這些蛋白被表達于病毒囊膜的表面。因此，有人利用桿狀病毒囊膜蛋白的特點，建立了桿狀病毒表面展示系統。 桿狀病毒表面展示系統以桿狀病毒為載體，外源基因片段插入到病毒衣殼蛋白 的信號肽與成熟蛋白之間，與衣殼蛋白融合表達或與特異性的錨定部位結合， 加工后信號肽被切除形成的N端融合蛋白或多肽借助桿狀病毒穩定地表達并展 示于感染細胞或病毒粒子的表面，篩選得到表達有特異肽或蛋白的桿狀病毒粒 子。桿狀病毒表面展示系統主要是通過在病毒衣殼蛋白gp64插入外源肽，二者 融合表達或與特異性的錨定部位結合，在病毒表面進行融合表達而篩選出目的 活性肽或蛋白的高等真核生物展示系統。可以用來展示需糖基化、二硫鍵異構化等翻譯后修飾才表現功能活性的復雜真核蛋白及構建多肽文庫、抗體庫等。桿狀病毒表面展示系統的基礎是gp64蛋白。gp64蛋白是出芽型病毒特有的 結構蛋白，以同源二聚體、三聚體或四聚體的方式存在于囊膜內、被感染細胞 或病毒粒子的表面，介導病毒和細胞的融合及侵染過程。gp64蛋白能夠在病毒 感染的早期和晚期表達。在出芽病毒吸附內吞入細胞的過程中，作為pH依賴型 的膜融合蛋白，gp64與胞飲體膜融合而把病毒核衣殼釋放到細胞質中。桿狀病毒表達載體系統(baculovirus expression vector system, BEVS) 是一個以桿狀病毒為外源基因載體，以和細胞為宿主的表達系統。桿狀病毒的 桿狀衣殼與較大的基因組可以容納相對較大片段的DNA插入物，可表達來自病 毒、細菌、真菌、植物和動物幾乎所有的蛋白；而且細胞作為真核細胞能完成 外源基因轉譯后一系列加工修飾，其轉譯后的加工修飾是賦予外源基因產物生 物活性所必需的，而這些加工修飾在大腸桿菌等原核生物表達系統內往往無法 完成，所以利用桿狀病毒表達載體表達出來的蛋白更近似于天然物質。由于以 上優點，桿狀病毒表達載體系統已經成為當今基因工程領域四大表達系統之一， 在研究基因表達調控、蛋白質結構和功能分析及各種生物活性物質的制備等方 面發揮著越來越重要的作用。目前，用BEVS表達的外源基因己達500種以上， 并在基因工程生產蛋白質的研究方面存在巨大潛力。由于桿狀病毒基因組太大，很難對它直接進行操作。通常BEVS由轉移載體、 親本病毒和重組介質三部分組成，其技術路線分以下幾步先將外源片段克隆 到載體質粒中，置于桿狀病毒啟動子控制之下，上下游各有一段與親本病毒DNA 相匹配的側翼序列，通常是多角體蛋白基因(PH)或者是p10基因的側翼非必 須序列，轉移載體帶有能在大腸桿菌中繁殖的復制起點卻不能在細胞中復制。 構建完成轉移載體，然后把轉移載體和野生型病毒共轉染入細胞，通過同源重組將外源片段插入到病毒基因組而產生重組病毒。由于外源目的基因替換多角 體蛋白基因，重組病毒不能形成多角體，從而易與野生型病毒區分開來，可以 通過空斑分析來鑒定和純化重組病毒。傳統的空斑純化重組病毒的技術是將共轉染后的含有重組病毒和野生型病 毒的溶液作梯度稀釋后，用不同濃度的病毒感染單層培養細胞，溫育lh后用低熔點瓊脂糖凝膠覆蓋，27'C培養4 6天后進行空斑鑒定。重組病毒產生的空斑 借助光學顯微鏡檢査加以篩選，并用消毒玻璃毛細管挑取吸出。吸出的含有重 組病毒的瓊脂塊置于少量細胞培養液溶解稀釋并用于下次空斑篩選。如此反復 篩選，才能得到純化的重組病毒。從共轉染樣本中分離重組病毒也可以在96孔 塑料板上進行，但是無論哪種方法，由于重組病毒產生的比例很低(通常只有 0. 1% 1%)，往往是重組病毒和野生型病毒混合在一起，區分野生型有包涵體表 型和重組病毒無包涵體表型非常困難，需要訓練有素的觀察能力和實際經驗， 即使技術熟練也需要數個月才能完成。由于空斑篩選的方法效率很低，費時費力，所以重組桿狀病毒的篩選成為 制約桿狀病毒表達載體系統應用的技術瓶頸。近年來，在空斑分析技術的基礎 上發展了一些新技術，大大簡化了重組病毒構建和篩選的過程。其中包括在空 斑測定基礎上發展的藍白斑篩選技術、野生型病毒線性化技術、大腸桿菌_細胞 穿梭載體(Bac—to一Bac系統)技術、酵母—細胞穿梭載體等。但是，這些新技術、 新方法只是針對AcNPV表達系統而言的。對于新開發的其他桿狀病毒表達系統， 由于受到敏感細胞株、野生型病毒基礎理論研究的限制，很難在較短的時間內 開發這些新技術、新方法，使這些表達系統的應用受到限制和影響。 發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種重組桿狀病毒快速篩選方法，達到快速篩選重組桿狀病毒，提高重組桿狀病毒的篩選效率。 本發明的技術方案如下桿狀病毒囊膜表面蛋白基因與標簽蛋白基因進行融合，構建帶有桿狀病毒 囊膜表面蛋白基因和標簽蛋白基因的轉移載體；轉移載體與野生型病毒DNA共 轉染細胞，待細胞發病后收集病毒液，將得到的病毒液通過能與標簽蛋白親和 的凝膠進行親和層析，利用展示在病毒囊膜表面的標簽蛋白分離、純化重組桿 狀病毒。用收集的重組桿狀病毒侵染細胞，即可觀察紅色熒光蛋白的表達。其中所述的桿狀病毒囊膜表面蛋白基因是存在于桿狀病毒基因組上的核苷 酸序列，包括gp64、 p74、 gp41、 p25等表達于桿狀病毒囊膜表面的蛋白。其中所述的標簽蛋白基因是精氨酸標簽(Arg-tag)、谷胱甘肽S-巰基轉移酶、 麥芽糖結合蛋白和硫氧還蛋白等基因，主要用于分離、純化與之共同表達的融 合蛋白。本發明的效果和益處是與常規的空斑篩選方法相比，重組桿狀病毒的篩選 效率大大提高，可以廣泛的應用到利用桿狀病毒表達載體進行外源基因表達及 其相關內容的研究工作中。
圖1為構建轉移載體gst-gp64-rfp-pAp748的質粒示意圖。圖2為構建gst-gp64-pAp748載體的電泳圖。圖3為構建gst-gp64-rfp-pAp748載體的電泳圖。圖4為篩選得到的重組病毒感染樗蠶蛹精巢細胞，紅色熒光蛋白表達圖。 圖中M1:DL2000 DNA Mark; M2: A-HindIII DNA Mark;l:gst-gp64-pAp748質粒； 2:gst-gp64-pAp748-1-Not I /EcoR I ; 3:gst-gp64-pAp748-2-Not I /EcoR I ; 4:pAp748—Not I /EcoR I對照； 5:rfp-T-EcoR I ; 6:rfp-gst-gp64-pAp748-EcoR I ; 7: gp64-pAp748-EcoR I 。
具體實施方式
以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發明的具體實施例。實施例分別克隆gst-gp64基因和cmv-rfp-polyA序列。將這兩段基因分別依次 克隆到已有的pAp748質粒中，得到轉移載體gst-gp64-rfp-pAp748。轉移載體 與野生型病毒DNA共轉染樗蠶蛹精巢細胞。待細胞發病后收集病毒液，將病毒 液經過GST吸附柱，洗脫吸附的病毒，得到重組病毒。用收集的病毒侵染樗蠶 蛹精巢細胞，觀察紅色熒光蛋白的表達。下面是詳細的步驟第一步構建轉移載體gst-gp64-rfp-pAp7481.提取柞蠶桿狀病毒DNA:收取患核多角體病的柞蠶血，低速離心沉淀多角 體，以蒸餾水多次洗滌后，加入0.訓a2C03-0. 15MNaCl溶液，室溫放置1-1. 5 小時，偶爾搖動。冰醋酸調pH到7.5。加入蛋白酶K至終濃度30ug/ml， 50°C 消化2小時；加入SDS至終濃度P/。， 5(TC消化2小時。酚、酚/氯仿/異戊醇、 氯仿/異戊醇依次抽提一次，取上清。2倍體積冷無水乙醇沉淀DNA, 70%乙醇洗 滌，溶于無菌水中。2.以柞蠶桿狀病毒DNA為模板，擴增gp64基因 使用引物Gp64 F:5'-TCTGGAAGTTCTGTTCCAGGCCGAGCATTGCAACGC-3，Gp64 R:5' -GMTTCTAGAAAGGGCCATTAATTTGACTGGCGCCGCCT-3'，其中粗 體字為EcoRI酶切位點。以已有的pGEX6p-l質粒為模板，擴增gst基因。 使用引物GST F: 5， -AGATCT^ r6"C7AU^ 7TJ 70CA4 7T6T6"67^7T6^C(^6^a ftT ATGCTTGGGCATGTCCCCTATACTAGGTTA-3' GST R:5'-AGCGTTGCAATGCTCGGCCTGGAACAGAACTTCCAG-3'，其中粗體 字為BglII酶切位點，斜體字為信號肽序列。以擴增出的gp64片段和gst片段共同作為模板，使用GST F和Gp64 R作 為引物，擴增出gst-gp64片段，連接T載體，測序。3.以pDsRed-Express Nl質粒為模板，克隆CMV-rfp-polyA片段 使用引物RED F: 5' -CGAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGG-3，RED R:5' -CGMTTCCTTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC-3， 其中粗體字為EcoRl酶切位點。片段連接T載體。將gst-gp64片段克隆到已有的pAp748載體中。Bgl II ， EcoR I ， Pvu I三 酶切gst-gp64-T質粒，回收2900bp片段。BamH I ， EcoR I雙酶切pAp748質粒， 回收載體片段。連接gst-gp64和pAp748。得到gst-gp64-pAp748質粒。 (附圖2) 將CMV-rfp-polyA片段克隆到gst-gp64-pAp748載體中。EcoR I分 別酶切CMV-rfp-polyA-T質粒和gst-gp64-pAp748質粒，回收1500bp片段和載 體片段。載體5'端去磷酸化后，連接CMV-rfp-polyA和gst-gp64-pAp748，得 到轉移載體gst-gp64-rfp-pAp748，見附圖3。第二步共轉染樗蠶蛹精巢細胞TC100+20。/。胎牛血清，26。C靜止培養樗蠶蛹精巢細胞至對數生長期，以1X106 個/ml接種12孔細胞培養板，待完全貼壁后進行轉染。5u g gst-gp64-rfp-pAp748質粒DNA， 10u g野生型柞蠶桿狀病毒DNA與 90ii 1無血清培養基混合，3u 1 Cellfection與97 u 1無血清培養基混合。將 上述兩種溶液混合，置室溫20min。將培養板中的培養液吸出，加入上述混好的 轉染混合液，放置27'C培養箱作用5h。棄去轉染混合液，加入正常細胞培養液， 27"C靜置培養，觀察細胞變化。第三步經親和層析篩選純化的重組病毒待細胞發病，收集培養基上清液。使用Amersham Biosciences GST Gene Fusion System中的谷胱苷肽瓊脂糖4B介質，參考Amersham Biosciences GST Gene Fusion System Handbook,從病毒提取液純化表面展示了 GST標簽的重組 病毒，收集病毒。第四步篩選的重組病毒感染樗蠶蛹精巢細胞，觀察紅色熒光蛋白的表達 TC100+20y。胎牛血清，26。C靜止培養樗蠶蛹精巢細胞至對數生長期，以1X106個/ml接種12孔細胞培養板，待完全貼壁后進行感染。取收集的病毒液，加入上述準備好的細胞中，放置27。C培養箱置培養，觀察細胞變化及紅色熒光；見附圖4，圖中的白點為紅色熒光。
權利要求
1. 一種重組桿狀病毒快速篩選方法，其特征在于桿狀病毒囊膜表面蛋白基因與標簽蛋白基因進行融合，構建帶有桿狀病毒囊膜表面蛋白基因和標簽蛋白基因的轉移載體；轉移載體與野生型病毒DNA共轉染病毒敏感細胞，等細胞發病后將得到的病毒液通過能與標簽蛋白親和的凝膠進行親和層析，利用展示在病毒囊膜表面的標簽蛋白分離、純化重組桿狀病毒。
2. 根據權利要求1所述的一種重組桿狀病毒快速篩選方法，其特征在于昆蟲 桿狀病毒囊膜表面蛋白基因是存在于桿狀病毒基因組上的核苷酸序列，包括 gp64、 p74、 gp41或p25。
3. 根據權利要求1所述的一種重組桿狀病毒快速篩選方法，其特征在于其中 所述的標簽蛋白基因是精氨酸標簽(Arg-tag)、谷胱甘肽S-巰基轉移酶、麥芽 糖結合蛋白或硫氧還蛋白。
4. 根據權利要求1所述的一種重組桿狀病毒快速篩選方法，其特征在于克 隆gst-gp64基因和cmv-rfp-polyA序列，將兩段基因分別依次克隆到已有的 pAp748質粒中，得到轉移載體gst-gp64-rfp-pAp748;轉移載體與柞蠶野生型 桿狀病毒DNA共轉染樗蠶蛹精巢細胞；待細胞發病后收集病毒液，將病毒液經 過GST吸附柱，洗脫吸附的病毒，得到重組桿狀病毒；用收集的重組桿狀病毒 侵染樗蠶蛹精巢細胞，觀察紅色熒光蛋白的表達。
全文摘要
本發明公開了一種快速篩選重組桿狀病毒的方法，屬于生物基因克隆表達技術領域。其特征是桿狀病毒囊膜表面蛋白基因與標簽蛋白基因進行融合，構建帶有桿狀病毒囊膜表面蛋白基因和標簽蛋白基因的轉移載體，轉移載體與野生型病毒DNA共轉染病毒敏感細胞，待細胞發病后將得到的病毒液通過能與標簽蛋白親和的凝膠進行親和層析，利用展示在病毒囊膜表面的標簽蛋白分離、純化重組桿狀病毒。本發明的效果和益處是與常規的空斑篩選方法相比，重組桿狀病毒的篩選效率大大提高，可以廣泛的應用到利用桿狀病毒表達載體進行外源基因表達及其相關內容的研究工作中。
文檔編號C12N15/85GK101275122SQ20081001135
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月7日 優先權日2008年5月7日
發明者李文利, 邵純君 申請人:大連理工大學