專利名稱：一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑盒，特別是涉及使用DNA 反向斑點雜交技術，快速準確地區分臨床血液樣品中野生型和(或)核苷類似物耐藥相關突 變型乙型肝炎病毒的檢測試劑盒。
背景技術：
乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原體。由HBV所引起的乙型肝炎是 一種危害嚴重的傳染性疾病。目前，全世界慢性HBV感染者至少有3.5億，而中國作為乙型 肝炎的高發流行區，約占總人口9%左右的人群(約1.2億)為慢性HBV感染者。持續慢性 HBV感染在臨床上可表現為各種不同類型的疾病，包括無癥狀攜帶狀態、急或慢性肝炎、肝 硬化等，嚴重的可能發展為原發性肝癌(HCC)。目前全世界每年有120萬人死于HBV感染 引起的疾病。。
研究證明，持續高載量HBV是慢性乙肝病情進展和發展為肝硬化和肝細胞癌(HCC) 的主要病因，因此慢性乙肝的治療應著手于長期抑制或清除病毒。目前用于抗HBV治療的藥 物有干擾素和核苷類似物兩大類，核苷類似物則是近年發展最快的抗病毒藥物。截至目前， 美國FDA批準可用于治療乙肝的核苷類似物藥物主要有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替 比夫定和依曲西他平，克拉夫定仍處于試驗階段，臨床一線藥物以拉米夫定、阿德福韋和恩 替卡韋為主。
據研究，大部分乙型肝炎病毒中耐藥突變主要集中在病毒DNA聚合酶序列，其中在不 同藥物的選擇壓力下產生的耐藥突變不盡相同，簡述如下
拉米夫定(LAM)耐藥突變主要集中在病毒DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序，表現為編碼甲硫氨酸的核苷酸發生堿基替代(ATG—ATT/GTG)， 從而使其編碼的氨基酸發生相應的變化(M—I/V, rtM204I/V)。阿德福韋(ADV)耐藥集中在 HBV多聚酶D區N236T和B區A181V等位點，rtV173L位點變異也對阿德福韋耐藥產生一 定的協同作用；同時，據報道發現一例rtA181S變異與阿德福韋耐藥相關，rtA181S+N236T 聯合變異對拉米夫定與阿德福韋聯合治療敏感性較差。根據目前的資料證明，在YMDD突變 基礎上，加上以下耐藥突變位點T184G、 S202I、 M250V之一，即可發生恩替卡韋(ETV) 耐藥。因此，ETV的耐藥突變只發生在LAM耐藥的患者中，提示ETV治LAM耐藥的患者，有可能發生ETV耐藥突變。替比夫定(LdT)在治療過程中，亦可出現YMDD突變耐藥， 治療52周后，出現突變耐藥率為2/44 (4.5%)，主要突變表型為M204I和L180M+M204V， 與LAM有交叉耐藥。據報道依曲西他平(FTC)治療48周后，YMDD突變耐藥率達12.6%， 與LAM交叉耐藥。
目前國內外的乙型肝炎病毒耐藥基因突變檢測試劑盒檢測的變異位點一般為rtL180M、 rtA181V、 rtM204V和rtN236T等與拉米夫定及阿德福韋耐藥相關位點，雖然也能覆蓋部分乙 肝耐藥患者群，但存在一定的漏檢率，并且不能檢測恩替卡韋耐藥突變位點。本發明擬檢測 rtV173L、 rtL180M、 rtA181V 、 rtA181S 、 rtT184G、 rtS2021、 rtM204V/1、 rtl233V、 rtN236T 和rtM250V等幾乎涵蓋目前已知所有能引起核苷類似物藥物耐受性核苷酸變異位點，并且能 較準確的檢測出野生型和耐藥突變型混合感染，劣勢型在混合群體中占10%即可檢出；設計 出一種能在短時間內系統、全面的檢測和分析乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試 劑盒。
目前耐藥突變的檢測方法主要有以下幾種質譜分析，熒光偏振，PCR-肽核酸，限制性 片段長度多態方法RFLP，線性探針分析法，熒光定量PCR熔解曲線分析法和基因芯片技術。 然而，這些方法大多成本昂貴，操作繁瑣，不利于廣大基層醫院開展。因此，本發明人在前 期的研究成果的基礎上(CN200410052531.1)，結合半自動的結果判讀系統，建立一種能夠在 短時間內檢測和分析乙型肝炎病毒多種核苷類似物藥物耐受突變基因型的試劑盒。
發明內容
本發明的目的是提供一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑盒，特別是涉 及使用DNA反向斑點雜交技術，快速準確地區分臨床血液樣品中野生型和(或)核苷類似物耐 藥相關突變型乙型肝炎病毒的檢測試劑盒。
試劑盒的檢測步驟如下(1)提供待檢標本并從中提取DNA; (2)使用合成的特定寡核 苷酸引物，利用聚合酶鏈反應技術擴增包含目的基序的一段耙DNA序列；(3)使被標記的靶 DNA序列與特異性寡核苷酸探針雜交；(4)雜交膜條經顯色后，掃描結果并用軟件分析并判 斷乙型肝炎病毒耐藥突變的存在及其相對量。
為了達到上述檢測步驟，本發明提供的乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑 盒的組分，包括(1)提取樣本核酸的核酸抽提試劑；(2)聚合酶鏈反應試劑，陰、陽質控 品；(3)用于核酸雜交反應的核酸雜交試劑、雜交膜條，其中聚合酶鏈反應試劑由正向引物、 生物素標記的反向引物、脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、 耐熱Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)組成，其特征在于正向引物和生物素標記的反向引物的序列分別是
(1) 5'-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3， (SEQIDNO: 1)
(2) 5'-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3' (SEQIDNO: 2)
(3) 生物素-5，-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3， (SEQIDNO: 3)
(4) 5'-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA陽3， (SEQIDNO: 4)。 根據本發明的一個優選實施方案，所述引物為SEQIDNO: 1 4中15 28bp堿基范圍內所
有可能的堿基長度和位置組合。
根據本發明的一個優選實施方案，雜交膜條中用于核酸雜交的5'端氨基標記的寡核苷酸 探針的序列分別是
(5 )麗2-5 ，-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3 ，(SEQ ID NO: 5)
(6) NH2-5，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3，(SEQIDNO: 6)
(7) NH2-5，-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3，(SEQIDNO: 7) (8 ) NH2-5 ，隱TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3 ， (SEQ ID NO: 8) (9 ) NH2-5 ， -GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3 ， (SEQ ID NO: 9)
(10)NH2-5，.-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:10)
(11)NH2-5,-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3，(SEQ ID NO:11)
(12)NH2-5，.陽TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG陽3，(SEQ ID NO::12)
(13)NH2-5，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3' (SEQ ID NO:13)
(14)NH2-5，-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:14)
(15)NH2-5，-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT-3， (SEQ ID NO:15)
(16)NH2-5，隱GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY隱3， (SEQ ID NO:16)
(17)NH2-5，-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:17)
(18)NH2-5，-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY-3' (SEQ ID NO:18)
(19)NH2-5'-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO::19)
(20)NH2-5'-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO:20)
(21)NH2-5，-CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:21)
(22)NH2-5，-CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3' (SEQ ID NO:22)
(23)NH2-5，-CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3' (SE(J ID NO:23)
(24)NH2-5，-GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3，(SEQ ID NO:24)
(25)NH2-5，-ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3， (SEQ ID NO:25)
以及5'端生物素標記和3'端氨基標記的用于監測雜交過程的顯色對照寡核苷酸探針是:
6(26)生物素-5'- GCCGTAACCGTCACAATCCGT -3'-NH2 (SEQ ID NO:26)。 根據本發明的一個優選實施方案，所述探針為SEQIDNO: 5-26中15 26bp堿基范圍內
所有可能的堿基長度和位置組合。
根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的待測樣本指的是血清，血漿，腹水及肝
組織中乙型肝炎病毒的任何一種已知變異體或者野生型和變異型的組合，或者是多種變異型
的組合。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的提取樣本核酸試劑是用3% 8%的聚乙二 醇和lmol/L的氯化鈉配制而成的濃縮液和常規DNA提取液組成。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸雜交試劑由雜交液I (2X SSC-0.1%SDS)和II (0.5XSSC-0.1%SDS)、溶液I (250u/ml偶聯辣根過氧化物酶的鏈酶親 和素溶液)、II (0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液)、III (2mg/ml的四甲基聯苯胺溶液)和IV (3%的 過氧化氫溶液)組成。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的雜交膜條上所固定的探針能夠檢測乙型肝 炎病毒基因組逆轉錄酶基因野生型的位點包括rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl81A 、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233L、 rt236N和rt250M;突變型位點包括rtl73L、 rtl80M、 rtl81V 、 rtl81S 、 rtl84G、 rt2021、 rt204V/1、 rt233V、 rt236T和rt250V。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的雜交膜條為尼龍膜或硝酸纖維素膜，雜交 是在恒溫水浴裝置中進行雜交反應，檢測裝置包括恒溫水浴搖床或自動、半自動雜交儀。
由于本發明中增加了很多近期新發現的核苷類似物耐藥相關突變位點，而且使這些位點 同時分布在一張檢測膜條上，因此本發明的試劑盒不僅能用于檢測單一乙型肝炎病毒感染， 更具有檢測乙型肝炎病毒混合感染或多種聯合突變的能力。另一方面，由于本發明的試劑盒 使用水浴搖床進行檢測，其操作簡單、通量大、價格低廉，半自動雜交裝置方便快捷、效率 高、節省人力物力，兩者均具有良好的應用前景和可推廣性。特別是由于使用了設計嚴謹的 核酸探針，使得核苷類似物耐藥的乙型肝炎病毒檢測具有更好的靈敏度和特異性。
為了實現本發明，詳細步驟分述如下 l.引物的設計和合成
為了特異、高效地擴增待檢核酸樣品中的目的基因，我們從GeneBank中調A H型乙型肝 炎病毒全基因組DNA序列，針對乙型肝炎病毒逆轉錄酶基因在核苷酸類似物藥物選擇壓力下易 于變異的位點，按照引物設計的一般性原則，采用primer premier5. 0和oligo6. 0軟件分別設 計合成了巢式PCR所用的正向和反向引物，其中反向引物的5'端使用生物素標記。 (1) 5'-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3， (SEQIDNO: 1)(2) 5，-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3， (SEQIDNO: 2)
(3) 生物素-5,-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3， (SEQIDNO: 3)
(4) 5，-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3， (SEQIDNO: 4)。
2.探針的合成和標記
針對乙型肝炎病毒逆轉錄酶基因在核苷酸類似物藥物選擇壓力下易于變異的位點，設計 并合成了21條探針和一條用于控制顯色反應的顯色探針(探針22， SEQID: 24)，以其作為對 照借以控制顯色反應。為了保證各探針均能在同一溫度下與特定的靶DNA成功地雜交，本發明 設計了多條簡并探針并且使探針的Tm值和GC含量嚴格控制在特定范圍內。合成的探針經20% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并純化后，用于后面的雜交反應。雜交反應中使用的寡核苷酸探針 分別是
(5) NH2-5,-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3，(SEQIDNO: 5) (6 ) NH2-5 ，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT國3 ， (SEQ ID NO: 6)
(7 ) NH2-5 ，-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO: 7) (8 ) NH2-5 ，-TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3' (SEQ ID NO: 8) (9 ) NH2-5，-GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3 ， (SEQ ID NO: 9)
(10)NH2-5，-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3， (SEQ ID NO:10)
(11)NH2-5，-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3，(SEQ ID NO:11)
(12)NH2-5，.-TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG-3，(SEQ ID NO::12)
(13)NH2-5，.-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3， (SEQ ID NO:13)
(14)NH2-5，.-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:14)
(15)NH2-5，.-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT-3, (SEQ ID NO:15)
(16)NH2-5，-GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY-3' (SEQ ID NO:16)
(17)NH2-5，.-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:17)
(18)NH2-5，'-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY-3' (SEQ ID NO:18)
(19)NH2-5，-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO::19)
(20)NH2-5,-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO:20)
(21)NH2-5，-CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:21)
(22)NH2-5，-CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3' (SEQ ID NO:22)
(23)NH2-5，-CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3' (SEQ ID NO:23)
(24)NH2-5，隱GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3,(SEQ ID NO:24)
(25)NH2-5，-ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3, (SEQ ID NO:25)以及5'端生物素標記和3'端氨基標記的用于監測雜交過程的顯色對照寡核苷酸探針是
(26)生物素-5'- GCCGTAACCGTCACAATCCGT -3'-NH2 (SEQ ID NO:26)。
3. 雜交載體的制備
作為雜交載體的膜可以是由硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素等材料制成的膜，大小約為 3.2cmX2.5cm，并用打印機打成3行x8列的格式。膜條使用前用1(Fq的EDC (N-乙基-N， -[二甲 基氨丙基]-碳二亞胺)溶液充分浸泡活化處理。新合成的探針(100pmol/iU)經稀釋后，按 每孔l. l在膜條的適當位置上以固定格式點樣。點樣后用NaOH溶液處理膜條并充分洗滌， 然后保存于-2(TC備用。
4. 核酸的提取
無菌采集待檢乙型肝炎病人的靜脈血約lml，分別于室溫和4'C靜置一段時間后，離心分 離并收集血清標本。然后從中取適量血清樣品，向其中加入等量DNA提取液，充分混勻并在 沸水浴中放置10分鐘，離心并收集上清液用于進一步PCR反應。
5. 核酸擴增體系的優化
為了進一步提高試劑盒的靈敏度、特異性和重復性，我們對聚合酶鏈反應所用引物進行 了反復設計和優選，對聚合酶鏈反應的體系進行了摸索與優化使之達到最佳的特異性與最高 的擴增效率。結果發現，該方法可以使低拷貝數的樣品DNA得到有效的擴增，其檢測下限達到 lxl03 5xl03IU/ml。同時，為了盡可能地減少污染，我們使用dUTP-UNG酶處理待檢核酸。特 別是，我們調整了PCR擴增中使用的引物和其濃度，并調整和優化了Mg2+和模板等其他反應物 的濃度，也有利于防止和減少污染。
6. 核酸雜交體系的優化
核酸雜交的操作過程包括首先將如前制備的膜條放入編號好的15mlEP管中，然后對應 地加入PCR產物與雜交液I的混合物在一定溫度下進行雜交。通過對雜交體系、雜交液的摸索， 使雜交反應達到最優化和最好的雜交效率。雜交完成后，經洗滌和顯色步驟以顯示雜交斑點 的存在，并根據所顯色斑點所在位置探針的不同來判斷樣本的基因突變。實驗證明本發明中 的檢測試劑能檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關突變位點(rtl73、 rtl80和rt204)、阿德福 韋耐藥相關突變位點(rtl81A、 rt233和rt236N)和恩替卡韋耐藥相關突變位點(rtl84、 rt202 和rt250M)。同時，本發明也可檢測出生物樣本中是否存在乙型肝炎病毒。另外，在發明實施 過程中，通過摸索不同的雜交溫度和探針濃度使檢測的結果更準確可靠，并使之具有更好的 重復性。
綜上所述，本發明的試劑盒主要用于檢測和鑒別野生型和耐核苷類似物突變型乙型肝炎
病毒，借以判斷乙型肝炎病毒對藥物的耐受情況。整個檢測過程包括提取血清樣品中的HBVDNA、 PCR擴增包含HBVDNA聚合酶rtl73 rt250區域序列的耙DNA片斷，以及PCR擴增產 物的雜交等主要步驟。為了完成這些步驟，本發明的試劑盒又可分為PCR反應試劑盒和反向 斑點雜交試劑盒兩個部分。其中，前者包括核酸抽提試劑、聚合酶鏈反應試劑，陰、陽質控 品(野生型和耐核苷類似物突變型HBVDNA質粒)。后者包括核酸雜交試劑以及雜交膜。雜 交試劑主要為常規的20xSSC、十二烷基磺酸鈉(SDS)、鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化酶結 合物(POD)、四甲基聯苯胺(TMB)，試劑盒組成包括雜交液I (2xSSC-0.1%SDS)、雜交 液II (0.5xSSC-0.1% SDS)、溶液I (250u/mlPOD)、溶液II (O.lmol/L擰檬酸鈉)、溶液III (2mg/mlTMB)、溶液IV (3%H202)，以及用作雜交反應載體的膜條。
圖l顯示所使用的探針在膜條上的排列圖。rtl73V號探針具有SEQIDNO:5所示的序列， rtl80L號探針具有SEQIDNO: 6所示的序列，rtl81A號探針具有SEQ ID NO:7所示的序列， rtl84T號探針具有SEQ ID NO:8所示的序列，rt202S號探針具有SEQ ID NO:9所示的序列， rt204M號探針具有SEQ ID NO:10所示的序列，rt233I號探針具有SEQ ID NO:ll所示的序列， rtl73L號探針具有SEQ IDNO:12所示的序列，rtl80M號探針具有SEQ ID NO:13所示的序列， rtl81T號探針具有SEQ ID NO:14所示的序列，rtl84G號探針具有SEQ ID NO:15所示的序列， rt202I號探針具有SEQ ID NO:16所示的序列，rt204I號探針具有SEQ ID NO:17所示的序列， rt233V號探針具有SEQ ID NO:18所示的序列，rt236N號探針具有SEQ ID NO:19所示的序列， rt236T號探針具有SEQ ID NO:20所示的序列，rtl81S號探針具有SEQ ID NO:21所示的序列， rt250M號探針具有SEQIDNO:22所示的序列，rt250V號探針具有SEQ ID NO:23所示的序列， rt204V號探針具有SEQIDNO:24所示的序列，陽性控制探針(P.C)具有SEQ ID NO:25所示的 序列，顯色對照探針(C.C)具有SEQ IDNO:26所示的序列。
圖2顯示靶DNA擴增片段經2。/。的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中第l-6泳道為從乙型肝炎病毒 臨床樣本中擴增出的特異性靶DNA片段；第7為陰性對照。
圖3顯示六種不同的HBV基因型血清樣品反向斑點雜交檢測結果。其中A:野生型；B:
rt204 I突變；C: rt204V突變；D: rtl81T和rt236T突變；E: rt236T突變；F: rtl80M、 rt202 I 和rt204V突變。
圖4為乙型肝炎病毒野生型和耐藥突變型混合感染模擬實驗及其靈敏度的確定。
具體實施例方式
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。實施例l:血清DNA的提取
無菌采集待檢乙型肝炎病人的靜脈血約1 ml，分別于室溫和4。C靜置2小時和1小時后， 離心(8,000 rpm， 5分鐘)分離并收集血清標本200 pl。然后從中取血清樣品40 pl，向其中 加入等量DNA提取液，充分混勻并在沸水浴中放置10分鐘。為了保證血清內所含的病毒顆 粒能夠被充分裂解，進一步將此混合物于4'C下繼續靜置10小時。然后離心(10,000rpm， 5 分鐘)并收集上清液2pl并將其用于進一步PCR反應。
實施例2:包含HBV DNA聚合酶rtl73 rt250區域序列的靶DNA片斷的巢式PCR擴增。
取單管單人份PCR反應液若干管，每管直接加入2 pl模板(或陰陽性標準品)，充分混勻 后瞬時(3秒)離心。然后將各反應管放入PCR儀，5(TC預處理3分鐘，按下列條件擴增93°C 5分鐘，然后按93。C 30秒，68°C l分鐘，共25個循環，然后按93。C 30秒，55。C30秒，72°C 45 秒，共30個循環，最后72'C延伸7分鐘。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(參見附圖2)。 所使用的PCR擴增體系包括lx定性PCR緩沖液、0.2mMdNTPs、 6UTaq酶、0.1 pmol引物l、 引物4(SEQIDNO:1,4)禾口0.3 pmol引物2、引物3(SEQ ID NO:2，3)。
實施例3:采用水浴雜交法對三種基因型的樣品進行反向斑點雜交檢測
雜交前，將水浴搖床(或水浴鍋)溫度調到雜交溫度，取雜交液I (2xSSC-0.1%SDS) 與雜交液II預熱至40 5(TC備用。根據待檢樣品的數目取若干個15ml離心管，各管分別加入 8-10ml雜交液I并預加熱至40 50。C。然后取1000 pl雜交液I +2 pl溶液I (1000: 2)混合溶 液作為結合液4"保存備用，并取溶液II:溶液III:溶液IV (1900: 200: 1)的混合物(1.9 ml 溶液II +0.2 ml溶液III+l pl溶液IV )作為顯色液避光保存備用。
首先將預熱的雜交液I加入管中直至沒過膜條，按膜條對應編號加入PCR產物，蓋緊后 放入水浴搖床上用中等轉速雜交40 50min;接著用鑷子取出膜條放入50ml洗滌管中，用預 熱的雜交液II洗3次，每次3 5分鐘，40 50。C在水浴搖床內進行洗脫；然后加入結合液在 常溫(20 30°C)下使用生化搖擺儀進行結合操作；結合過后，用常溫(20 30°C)雜交液 I生化搖擺儀上洗脫3次，每次1 3分鐘；洗脫完成后控干殘余液體加溶液II在生化搖擺儀 上預顯色2min;最后加入顯色液顯色5 8分鐘，顯色完成后倒掉顯色液并加一定量溶液II 終止5min，再用純水30ml洗兩次即完成了雜交全過程。雜交結果采用掃描儀掃描后以JPEG 格式保存。
實施例4:本發明試劑盒的結果判定
結果的判定原則是，用于監測雜交過程的顯色對照探針(SEQIDNO:26)應在所有的檢測
中都顯色。如rt204M位點(SEQ ID NO:IO)、 rt204 I位點(SEQ ID NO:17)、 rt204V位點(SEQ
IDNO:24)出現單一顯色，則分別表示樣品中有YMDD野生型、YIDD突變型、YVDD單一突變型HBV DNA的存在；如果rt204M位點(SEQ ID NO:IO)和rt204 I位點(SEQ ID NO:17) 探針同時顯色，則表明樣品中存在YMDD野生型和YIDD突變型混合感染；如rt204M位點 (SEQ ID NO:IO)和rt204V位點(SEQ ID NO:24)探針同時顯色，則表明樣品中存在YMDD 野生型和YVDD突變型混合感染；如rt204 I位點(SEQ ID N0:17)和rt204V位點(SEQ ID NO:24)探針同時顯色，則表明樣品中存在YVDD和YIDD兩種突變型HBV的混合感染； 如rt204M位點(SEQ ID NO:IO)、rt204 I位點(SEQ ID N0:17)和rt204V位點(SEQ ID NO:24) 三種探針同時顯色，即表明樣品中同時存在YMDD野生型、YIDD和YVDD突變型HBV的 混合感染。
本試劑盒的發明可為臨床核苷類似物用藥方案的制定提供科學的、個體化的分子生物學 實驗數據，為乙肝病人的治療提供可靠的分子病毒學證據。如果病人血清中出現某種耐藥突 變型病毒，則要立即減少該種核苷類似物的用量甚至停藥，改用其他藥物治療，避免浪費人 力物力，也避免延誤病情和治療而產生不必要的后果。本發明的結果判讀部分情況如下
1、 陽性控制探針、顯色對照探針(SEQIDNO:25、 26)和探針rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 19、 22)顯色判定為HBV野生型感染；
2、 陽性控制探針、顯色對照探針(SEQIDNO:25、 26)和探針rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt2041、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SE(^IDNO:5、 6、 7、 8、 9、 11、 17、 19、 22)顯色判定為rt204 I突變，對拉米夫定耐藥；
3、 陽性控制探針、顯色對照探針(SEQIDNO:25、 26)和探針rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204V、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 7、 8、 9、 17、 19、 22、 24)顯色判定為rt204V突變，對拉米夫定耐藥；
4、 陽性控制探針、顯色對照探針(SEQIDNO:25、 26)和探針rtl73V、 rtl80L、 rtl81T、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 8、 9、 10、 11、 20、 22)顯色判定為rtl81T和rt236T突變，對阿德福韋耐藥；
5、 陽性控制探針、顯色對照探針(SEQIDNO:25、 26)和探針rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 20、 22)顯色判定為rt236T突變，對阿德福韋耐藥；
6、 陽性控制探針、顯色對照探針(SEQIDNO:25、 26)和探針rtl73V、 rtl80M、 rtl81A、 rtl84T、 rt2021、 rt2041、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SEQIDNO:5、 7、 8、 11、 13、 16、 17、 19、 22)顯色判定為rtl80M、 rt202 I和rt204V突變，對拉米夫定或恩替卡韋耐藥；(參見表l 和附圖3)表l HBV不同型別感染及對應的耐藥情況
樣品號探針組合病毒感染情況
1rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rt184T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236N、 rt250M 、陽性控制探針、顯色對照探針YMDD感染 (野生型)
2rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt2041、 rt233 I、 rt236N、 rt250M 、陽性控制探針、顯色對照探針YIDD感染 (LAM耐藥)
3rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204V、 rt233 1、 rt236N、 rt250M、陽性控制探針、顯色對照探針YVDD感染 (LAM耐藥)
4rtl73V、 rtl80L、 rtl81T、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M、陽性控制探針、顯色對照探針ADV耐藥相關突變 (rtl81T+rt236T)
5rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M、陽性控制探針、顯色對照探針ADV耐藥相關突變 (rt236T)
6rtl73V、 rtl80M、 rtl81A、 rtl84T、 rt202 I、 rt204 I、 rt233 I、 rt236N、 rt250M、陽性控制探針、顯色對照探針ETV耐藥相關突變 (rtl80M+rt202 I+rt204 I)
實施例5:乙型肝炎病毒野生型和耐藥突變型混合感染模擬實驗及其靈敏度的確定。
乙型肝炎病毒的耐藥性是在藥物和人體免疫選擇壓力的持續作用下逐漸產生并逐步發展 變化的， 一般有從少到多，從劣勢變為優勢的逐步轉化過程，因此，對乙型肝炎病毒基因組 的檢測與監控就需要對病毒野生型和耐藥突變型混合感染有較好的檢測與分辨能力，才能動 態的反映病毒耐藥的發生、發展以及病情歸轉過程，為臨床進一步了解與研究病毒耐藥產生、 發展和及時控制患者病情發展產生積極影響，同時對臨床準確有效用藥有重要指導意義。
選取YMDD、 YIDD和YVDD型別血清樣本(已稀釋至Ul()4copy/ml)各一管，YMDD與YIDD 為A組，YMDD與YVDD為B組，分別按照l: 9， 2: 8， 3: 7， 4: 6， 5: 5， 6: 4， 7: 3， 8:
2， 9: l的比例混合，然后抽提DNA、 PCR以及RDB。實驗證明，本發明的野生型和突變型混 合感染檢測下限均為10% (見附圖4)。
實施例6:雜交探針序列的確定，本發明中探針的序列為15 26堿基左右，其長度與雜交信號 的強度相關，其Tm值和雜交溫度相關。在所列21條探針中(SEQIDNO:5 26)的序列范圍 內，所選取的不同長度探針序列的組合均能產生較好的雜交信號和區分鑒別能力。如在發明 實施過程中，三條探針(SEQIDNO: 10,17,24)的序列為如下序列時，雜交反應在55度時能 產生很好的信號和區分能力。
NH2-5，-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3， (SEQ ID NO: 10) NH2-5 ， -GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO: 17) 麗2-5，-GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3，(SEQ ID NO: 24)
13在5'端去掉5個堿基，在3'端去掉5個堿基或者在5'端去掉兩個堿基，3'端去掉3個堿基；這三 種序列的探針在42度雜交時均能產生很好的信號和野生及突變的鑒別能力。序列表
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<120> —種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑盒
<140> <141> <160> 26
<210> 1 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 1
tagactcgtggtggacttctctcarttt
<210>2 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 2
tggatgtrtctgcggcgttt
<210>3 <211> 18 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 3
gccttrtaagttggcgag
<210>4 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 4
cgacgtgcagaggtgaagcgaagtgca<210>5 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 5
twcctatgggagtgggcctcagyccg
<210>6 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 6
gyccgtttctcytggctcagtttact
<210>7 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 7
cgtttctchtggctcagtttactwgy
<210>8 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 8
tggctcagtttactwgygcmatttgt
<210>9 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 9
gyytggctttyagttatatkgatgay<210> 10 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 10
gctttyagytatatggatgatstggt
<210> 11 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 11
trtctbtgggyatmcatttraaymcy
<210> 12 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 12
twcctatgggattgggcctcagyccg
<210> 13 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 13
gyccgtttctcytggctcagtttact
<210> 14 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 14
cgtttctchtgactcagtttactwgy <210> 15<211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 15
tggctcagtttggtwgygcmatttgt
<210> ]6 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 16
gyytggctttyatttatatkgatgay
<210> 17 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 17
gctttyagytatathgatgatstggt
<210> 18 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 18
trtctbtgggygtgcatttraaymcy
<210> 19 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 19
tctbtgggyaaycatttraaycctma
<210> 20 <211>26<212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 20
tctbtgggyacmcatttraaycctma
<210>21 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 21
cgtttctchtgattcagtttactwgy
<210>22 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 22
cccttaayttyatggghtayrtnaty
<210> 23 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 23
cccttaayttygtggghtayrtnaty
<210> 24 <211>26 <22>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 24
gctttyagytatgtggatgatstggt
<210>25 <211>26 <212>DNA<213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 25
attgttcagtggttcgtagggctttc
<210>26 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作雜交探針。 <400> 26
gccgtaaccgtcacaatccgt
權利要求
1、一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑盒，該試劑盒包括提取樣本核酸的核酸抽提試劑，聚合酶鏈反應試劑，陰、陽質控品，用于核酸雜交反應的核酸雜交試劑、雜交膜條，其中聚合酶鏈反應試劑由正向引物、生物素標記的反向引物、含脫氧尿嘧啶核苷三磷酸的脫氧核糖核苷三磷酸、耐熱Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶組成，其特征在于正向引物和生物素標記的反向引物的序列分別是1)5’-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3’2)5’-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3’3)生物素-5’-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3’4)5’-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3’引物序列為15～28bp堿基范圍內所有可能的堿基長度和位置組合。
2、根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于雜交膜條中用于核酸雜交的5'端氨基標記的 寡核苷酸探針的序列分別是5) NH2-5' -TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3'6) NH2-5' -GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3，7) NH2-5， -CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3，8) NH2-5，—-TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3'9) NH2-5，--GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3'10)NH2-5，-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT--3，11)NH2-5，-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY--3，12)NH2-5，-TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG--3，13)NH2-5'-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT--3，14)NH2-5，-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY--3，15)NH2-5，-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT--3，16)NH2-5，-GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY--3，17)NH2-5'-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT--3'18)NH廠5，-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY--3'19)NH2-5，-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA--3，20)NH2-5，-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA--3，21) NH2-5， -CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3'22) NH2-5， -CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3，23) NH廠5， -CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3，24) NH2-5， -GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3'25) NH2-5， -ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3，以及5'端生物素標記和3'端氨基標記的用于監測雜交過程的顯色對照寡核苷酸探針的序 列是生物素_5'- GCCGTAACCGTCACAATCCGT -3'-NH2 ，探針為15 26bp堿基范圍內所有可能 的堿基長度和位置組合。
3、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于核酸提取試劑是由用3% 8%的聚乙二醇和 lmol/L的氯化鈉配制而成的濃縮液和常規DNA提取液組成。
4、 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于核酸雜交試劑中雜交液I為2XSSC-0. 1%SDS， 雜交液II為0. 5XSSC-0. 1%SDS、溶液I為250u/ml偶聯辣根過氧化物酶的鏈酶親和素溶液、 溶液II為0. lmol/L的檸檬酸鈉溶液、溶液III為2mg/ml的四甲基聯苯胺溶液、溶液IV為3% 的過氧化氫溶液。
5、 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于雜交膜為尼龍膜或硝酸纖維素膜。
6、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于野生型乙型肝炎病毒檢測位點包括rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233L、 rt236N和rt250M。
7、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于耐藥突變型乙型肝炎病毒檢測位點包括 rtV173L、 rtL180M、 rtA181V、 rtA181S、 rtT184G、 rtS2021、 rtM204V/1、 rtl233V、 rtN238T 和rtM250V單個氨基酸變異中的一種或幾種。
全文摘要
本發明涉及一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥相關突變檢測試劑盒，特別是涉及使用DNA反向斑點雜交技術，快速準確地區分臨床血液樣品中野生型和(或)核苷類似物耐藥相關突變型乙型肝炎病毒的檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/70GK101565756SQ20081002765
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者何蘊韶, 周新宇, 張太松, 明 李, 董瑞華, 娟 陳 申請人:中山大學達安基因股份有限公司