專利名稱：以大蒜為原料生產大蒜多糖和蒜氨酸酶的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于天然產物的提取、分離和純化領域，特別涉及到一種以鮮大蒜 為原料聯合制備蒜氮酸酶與大蒜多糖的方法。
背景技術：
大蒜(j〃/ w ^///vwm L.)多糖占大蒜干物質的70%-80%，是大蒜含量 最高的成分，屬于果聚多糖。CN1239719A報道大蒜多糖的分子量為3500，含 量為80%的雜果聚糖，有希望代替珍貴的牛膝多糖用于醫藥。現已研究證實 了果聚多糖具有控制血脂、降低血糖、促進礦物質吸收、增殖腸道雙歧桿菌、 防便秘及治療肥胖癥等多種生理功能。最近還研究證實大蒜多糖具有保肝護肝 作用，對實驗性小鼠病毒心肌炎有治療作用。因此，為發揮大蒜多糖的保健、 藥用價值，有必要對其工業化生產進行研究。CN1555728、 CN1556102報道 了聯產大蒜精油和大蒜多糖、聯產蒜氨酸和大蒜多糖方面的專利，但在這些生 產技術中均未提到如何利用其中的重要生物活性物質蒜氨酸酶，在這些生產技 術中，均將其作為雜質或廢棄物丟掉了。蒜氨酸酶是一種糖蛋白，有二聚體，三聚體，四聚體等形式。它能催化大 蒜的蒜氨酸生成具有多種藥用和保健作用的大蒜素(烯丙基二硫亞砜)。研究 表明蒜氨酸酶對A549人肺腺癌和P388小鼠白血病有體外抗腫瘤活性，有 抗血小板凝聚作用。鑒于蒜氨酸酶的重要作用，可以利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生 產治療腫瘤的復合膠囊或注射針劑;也可以利用蒜氨酸酶生產能夠檢測大蒜及 其制品中的蒜氨酸含量的新一代生物傳感器；以色列魏茨曼研究所科學家利用 蒜氨酸酶和蒜氨酸治療癌癥；蒜氨酸酶又稱C-S鍵裂解酶，有多種底物如S-甲基、S-乙基、S-丙基、S-丁基和S-烯丙基半胱氨酸亞砜都可作該酶的底物，S-烯丙基半胱氨酸亞砜即蒜氨酸酶是天然底物之一。由于蒜氨酸酶對C-S鍵裂 解的高度專一型和高活力，有望在相關的化學反應或生化反應中發揮巨大的作 用。雖然蒜氨酸酶具有很大的現實和潛在的利用價值，但是目前還沒有工業化 生產蒜氨酸酶方面的報道。發明內容本發明旨在提供一種生產工藝，用同一批原料，同時生產蒜氨酸酶和大蒜 多糖兩種產品，以充分利用大蒜資源，盡可能多的提取大蒜中具有生物活性或 保健作用的天然產物，以滿足醫藥和保健品行業對蒜氨酸酶和大蒜多糖需求， 提高大蒜原料的利用率。為達上述目的，本發明的以大蒜為原料生產大蒜多糖和蒜氨酸酶的生產工 藝，包括如下步驟A、 預處理將大蒜用水浸泡，洗去雜質，除去蒜皮；用打漿機將去皮大 蒜破碎得蒜漿液，過濾除去雜質，濾渣用水洗滌，合并濾液得大蒜汁液；B、 分離蒜氨酸酶向上述大蒜汁液中加入酸溶液，并攪拌，使其pH降 至3 5，離心，得到的沉淀即為蒜氨酸酶粗品；將蒜氨酸酶粗品用磷酸鹽緩 沖溶液溶解，采用截留分子量為3 6萬道爾頓的超濾設備超濾，除去小分子 雜質，將截留液冷凍干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產品；C、 制取大蒜多糖提取液將步驟B中離心后的上清液分別通過陽離子交 換樹脂柱和陰離子交換樹脂柱，或者直接將陰、陽離子交換樹脂分別加入到大 蒜粗提液中，分離出陰、陽離子交換樹脂后得大蒜多糖提取液，調節所得大蒜 多糖提取液的pH至中性，經活性炭吸附后得到精制的大蒜多糖提取液；D、 大蒜多糖產品的獲得在溫度為60 80"C的真空條件下，將大蒜多糖 精制液濃縮、干燥，得到白色的大蒜多糖產品。所述步驟A中，用打漿機將所述去皮大蒜破碎成粒度60 300目的蒜漿液。所述步驟B中，所述的酸為食用酸，以逐滴加入的形式加入到所述大蒜 粗提液中。所述酸優選食用級鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸或乳酸等。所述步驟B中，磷酸鹽緩沖溶液是pH為6.0 8.0的磷酸鹽緩沖溶液。 所述步驟C中，當將所述上清液過陽離子交換樹脂柱，控制流速為0.5 10mL/min*100克樹脂，樣品上樣后立即收取流出液，然后再將收取的流出 液通過陰離子交換樹脂柱脫色，控制流速為0.5 10mL/min 100克樹脂，再用去離子水洗脫2 3個色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，調節其pH至中 性，再通過活性炭吸附柱，或者用0.1 0.2%活性炭吸附20 24小時后，得 到精制的大蒜多糖溶液。所述步驟C中，當直接將陰、陽離子交換樹脂先后加入到大蒜粗提液中 時，每公斤上清液先后分別添加100 600克陽離子交換樹脂和100 600克陰 離子交換樹脂，并分別在25 200 rpm的轉速下吸附0.5 5小時。所述步驟D中，采用噴霧干燥或烘房干燥得到大蒜多糖產品。采用本發明的生產工藝所得產品性質的測定一、 大蒜多糖的提取率測定 參考專利文獻CN1555728二、 蒜氨酸酶活性測定 酶活性測定采用測丙酮酸法取蒜氨酸溶液lml，加入lml酶液，在25ml具塞試管中反應3min后 立即加入2 ml 10%三氯乙酸終止反應，加入1 ml 2，4-二硝基苯肼，25 °C保 溫5 min，然后加入5 ml 2.5 mol/LNaOH，反應10 min后于520 nm比色(以鈍化酶、底物、2，4-二硝基苯肼、NaOH反應體系為參比液)。酶活性定義以在25"C條件下，每分鐘產生1 li mol丙酮酸為1個活力單位(U)。定義為一個酶活單位)經測定，采用本發明的生產工藝所獲得蒜氨酸酶的比活為72U/mg;活力回收62%。本發明最大優點之一是利用同一批原料生產蒜氨酸酶和大蒜多糖兩種有 價值的產品，目前未見有這兩種物質綜合提取的研究報道，與過去利用大蒜原 料只生產大蒜精油(如CN1049272A)或只生產大蒜多糖(CN1239719A， JP10158306A)相比，充分地利用了大蒜資源；這在一定程度上降低了生產成 本，減輕了生產單一產品時造成的環境污染，可使生產企業比單獨生產大蒜多 糖的效益翻番。同聯合制備大蒜精油與大蒜多糖的方法(CN1555728)和聯合制 備蒜氨酸與大蒜多糖的方法(CN1556102)等已有的關于大蒜聯合提取有效成 分方面的專利相比，本技術路線首次提出了聯合提取蒜氨酸酶和大蒜多糖的方 法，因此，本發明具有極高的生產應用價值，填補了蒜氨酸酶工業化提取上的空白。其次，本發明的蒜氨酸酶的提取方法，只是通過改變pH值和離心的方法 便可以得到蒜氨酸酶的粗成品，方法簡單，酶活力回收高，回收率達到62%， 可應用于工業化生產。
圖l是本發明的工藝流程圖。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但發明的實施方式 不限于此。實施例1:以新鮮大蒜為原料，聯合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步驟進行第一步進行預處理將鮮蒜瓣置于質量約為其6倍的飲用水中，浸泡2 小時，流動水洗滌去皮，控干明水，置于打獎機中破碎成粒度200目的蒜槳。 蒜漿用板式過濾機擠壓過濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。第二步分離蒜氨酸酶向所得蒜提取液中逐滴加入食用級鹽酸，并快速攪 拌，使提取液的pH降為3.0，離心，得到的沉淀用pH為6的磷酸鹽緩沖溶 液溶解，采用截留分子量為3 6萬道爾頓的各種超濾膜超濾，將截留液冷凍 干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產品。第三步大蒜多糖粗提液的精制:將第二步中離心后的上清液過732型陽離 子交換樹脂；控制流速為lml/min *100克樹脂，樣品上樣后立即收取流出液， 然后將其快速通過陰離子交換樹脂，控制流速為lml/min 100克樹脂，再用 無離子水洗脫2 3個色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，混合，加入適量的 NaHC03溶液，調節其pH為中性，再用0.1 0.2%活性炭吸附20 24小時后， 得到精制的大蒜多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產品在真空條件(溫度60°C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在35%，再進行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。采用的噴霧壓力為0.25MPa，進入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 9tTC，所得干粉即為大蒜多糖。實施例2:以新鮮大蒜為原料，聯合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步 驟進行第一步進行預處理將鮮蒜瓣置于質量約為其4倍的飲用水中，浸泡2 小時，流動水洗滌去皮，控干明水，置于打漿機上破碎成粒度300目的蒜漿。 蒜漿用板式過濾機擠壓過濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。第二步分離蒜氨酸酶向所得蒜提取液中逐滴加入磷酸，并快速攪拌，使 提取液的pH降為5.0，離心，得到的沉淀用pH為6的磷酸鹽緩沖溶液溶解， 采用截留分子量為3 6萬道爾頓的各種超濾膜超濾，將截留液冷凍干燥后， 即得到精制的蒜氨酸酶產品。第三步大蒜多糖粗提液的精制:將第二步中離心后的上清液過732型陽離 子交換樹脂；控制流速為5ml/min *100克樹脂，樣品上樣后立即收取流出液, 然后將其快速通過陰離子交換樹脂脫色，控制流速為5ml/min 100克樹脂， 再用無離子水洗脫2 3個色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，加入適量的 NaHC03溶液，調節其pH為中性，再通過活性炭吸附柱后，得到精制的大蒜 多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產品在真空條件(溫度70°C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在50%，再進行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。 采用的噴霧壓力為0.25MPa，進入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 卯"C，所得干粉即為大蒜多糖。實施例3:以新鮮大蒜為原料，聯合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步 驟進行第一步進行預處理將鮮蒜瓣置于質量約為其3倍的飲用水中，浸泡2小時，流動水洗滌去皮，控干明水，置于打漿機上破碎成粒度300目的蒜漿。 蒜漿用板式過濾機擠壓過濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。8第二步分離蒜氨酸酶向蒜提取液中逐滴加入檸檬酸或乳酸，并快速攪拌， 使提取液的pH降為4，離心，得到的沉淀用pH為7的磷酸鹽緩沖溶液溶解，采用截留分子量為3 6萬道爾頓的各種超濾膜超濾，將截留液冷凍干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產品。第三步大蒜多糖粗提液的精制將第二步中離心后的上清液過732型陽離 子交換樹脂；控制流速為H)ml/min 100克樹脂，樣品上樣后立即收取流出 液，然后將其快速通過陰離子交換樹脂脫色，控制流速為10ml/min 100克樹 脂，再用無離子水洗脫2 3個色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，加入適量 的NaOH溶液，調節其pH為中性，再通過活性炭吸附柱，或者用0.1 0.2 %活性炭吸附20 24小時后，得到精制的大蒜多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產品在真空條件(溫度60°C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在75%，再進行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。 采用的噴霧壓力為0.25MPa，進入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 90°C，所得干粉即為大蒜多糖。實施例4:以新鮮大蒜為原料，聯合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步 驟進行第一步進行預處理將鮮蒜瓣置于質量約為其4倍的飲用水中，浸泡2 小時，流動水洗滌去皮，控干明水，置于打漿機上破碎成粒度300目的蒜漿。 蒜漿用板式過濾機擠壓過濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。第二步分離蒜氨酸酶向所得蒜提取液中逐滴加入磷酸或醋酸，并快速攪 拌，使提取液的pH降為5.0,離心，得到的沉淀用pH為6的磷酸鹽緩沖溶 液溶解，采用截留分子量為3 6萬道爾頓的超濾膜超濾，將截留液冷凍干燥 后，即得到精制的蒜氨酸酶產品。第三步大蒜多糖粗提液的精制以陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、上 清液的體積比為1:1:8的比例，將陽離子交換樹脂加入到第二步離心后的上清 液中；在100rpm的轉速下吸附2.5小時，分離出陽離子交換樹脂后，再將陰離 子交換樹脂加入到提取液中，在100rpm的轉速下吸附2.5小時，分離出陰離 子交換樹脂后，調節提取液pH為中性，再通過活性炭吸附柱，或者用0.1 0.2%活性炭吸附20 24小時后，得到精制的大蒜多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產品在真空條件(溫度70。C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在50%，再進行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。 采用的噴霧壓力為0.25MPa，進入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 90°C，所得干粉即為大蒜多糖。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1、一種以大蒜為原料生產大蒜多糖和蒜氨酸酶的生產工藝，其特征在于包括如下步驟A、預處理將大蒜用水浸泡，洗去雜質，除去蒜皮；用打漿機將去皮大蒜破碎得蒜漿液，過濾除去雜質，濾渣用水洗滌，合并濾液得大蒜汁液；B、分離蒜氨酸酶向上述大蒜汁液中加入酸溶液，并攪拌，使其pH降至3～5，離心，得到的沉淀即為蒜氨酸酶粗品；將蒜氨酸酶粗品用磷酸鹽緩沖溶液溶解，采用截留分子量為3～6萬道爾頓的超濾設備超濾，除去小分子雜質，將截留液冷凍干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產品；C、制取大蒜多糖提取液將步驟B中離心后的上清液分別通過陽離子交換樹脂柱和陰離子交換樹脂柱，或者直接將陰、陽離子交換樹脂先后加入到大蒜粗提液中，分離出陰、陽離子交換樹脂后得大蒜多糖提取液，調節所得大蒜多糖提取液的pH至中性，經活性炭吸附后得到精制的大蒜多糖提取液；D、大蒜多糖產品的獲得在溫度為60～80℃的真空條件下，將大蒜多糖精制液濃縮、干燥，得到白色的大蒜多糖產品。
2、 根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于所述步驟A中，用打漿 機將所述去皮大蒜破碎成粒度60 300目的蒜漿液。
3、 根據權利要求l所述的生產工藝，其特征在于步驟B中，所述的酸為食用酸，以逐滴加入的形式加入到所述大蒜粗提液中。
4、 根據權利要求3所述的生產工藝，其特征在于所述酸是指食用級鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸或乳酸。
5、 根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于步驟B中，所述磷酸鹽緩沖溶液是pH為6.0 8.0的磷酸鹽緩沖溶液。
6、 根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于所述步驟C中，將所述 上清液過陽離子交換樹脂柱，控制流速為0.5 10mL/min.l00克樹脂，樣品上 樣后立即收取流出液，然后再將收取的流出液通過陰離子交換樹脂柱脫色，控 制流速為0.5 10mL/min 100克樹脂，再用去離子水洗脫2 3個色譜柱體積， 收集流出液和洗脫液，調節其pH至中性，再通過活性炭吸附柱，或者用(U 0.2%活性炭吸附20 24小時后，得到精制的大蒜多糖溶液。
7、 根據權利要求l所述的生產工藝，其特征在于所述步驟C中，直接將陰、陽離子交換樹脂先后加入到大蒜粗提液中時，每公斤上清液先后分別添加100 600克陽離子交換樹脂和100 600克陰離子交換樹脂，并分別在25 200 rpm的轉速下吸附0.5 5小時。
8、根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于所述步驟D中，采用噴 霧干燥或烘房干燥得到大蒜多糖產品。
全文摘要
本發明以新鮮大蒜為原料，通過洗滌、去雜、破碎取汁、過濾、調節汁液pH值，離心得到粗蒜氨酸酶，再經溶解、超濾、冷凍干燥獲得高純度的蒜氨酸酶產品；離心后的上清液過陽離子交換樹脂柱和陰離子交換樹脂柱得大蒜多糖精制液，再經過濃縮、氣流干燥等工序得到高純度的大蒜多糖產品。本發明利用同一批原料生產蒜氨酸酶、大蒜多糖兩種有價值的活性物質，大大提高了大蒜資源的利用率，減輕了生產單一產品時造成的環境污染，降低了制造成本，可使采用本發明技術的生產企業比單獨生產大蒜多糖或蒜氨酸酶的效益成倍增長。
文檔編號C12N9/88GK101255200SQ200810027309
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月9日 優先權日2008年4月9日
發明者孔祥智, 黃雪松 申請人:暨南大學