專利名稱：引物特異熒光pcr檢測egfr突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及實時熒光PCR檢測試劑盒，特別涉及以引物特異的實時定量熒光PCR技術檢 測表皮生長因子受體(Epithelium Growth Factor Recptor， EGFR)常見突變的試劑盒。
背景技術：
由阿斯利康公司研制的吉非替尼(gefitinib，易瑞沙)EGFR酪氨酸激酶抑制劑 (EGFR-TKI)，是一種新型的腫瘤靶向治療藥物，有效地切斷表皮生長因子受體向細胞內發出 信號，從而阻礙腫瘤的發生發展。美國、日本和中國學者近幾年的研究表明，EGFR的體細胞 突變與NSCLC患者對吉非替尼的敏感性相關。對EGFR突變的腫瘤，Gefitinib的有效率高達 80%-90%，而對沒有EGFR突變的腫瘤Gefitinib絕大部分沒有效果。EGFR蛋白酪氨酸激酶 功能區由EGFR外顯子18-24編碼，迄今為止發現的EGFR突變主要發生在酪氨酸激酶域ATP 結合域附近，約90%的突變為外顯子19的堿基缺失和21外顯子在第858為密碼子的堿基替 換突變。目前國內外主要采用基因測序技術檢測腫瘤組織中EGFR突變，但是測序方法歩驟繁瑣、 周期長、對操作人員要求高，難以在臨床上廣泛開展。更重要的是由于測序方法本身的限制 靈敏度不高，只能檢測出突變基因占總基因15% 20%以上的突變，而腫瘤組織是一個異質 性的組織，EGFR突變又是一種雜合性的突變一即腫瘤細胞的含有EGFR基因的兩條DNA中只 有一條發生突變，如果突變細胞在手術切除的腫瘤組織中的比例小于20%，則普通的測序方 法無法檢出。實時熒光定量PCR技術是上世紀90年代中期基于傳統的PCR技術發展起來的。與傳統 的(終點檢測)PCR技術相比，實時定量檢測方法不僅實現了低拷貝數靶多核苷酸的定量分 析，而且還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及污染的可能性更小等優點。擴增 阻礙突變系統(amplification refractory mutation system, ARMS),是進行根據PCR擴增 引物與模板的匹配程度不同來區分單一位點突變型與野生型序列間差異的一種PCR方法。該 方法設計擴增引物的3'端的最后一個堿基與突變型堿基對應，相應野生型模板就不能有效擴 增。在這種定性的ARMS基礎上，結合TaqMan定量技術，又發展了一種TaqMAMA方法(Taqman mismatch amplification mutation assay),該技術進一步將非特異擴增時引物與模板之間 的引物不匹配程度從3'端的最后一個堿基擴展到了倒數第二個，由此得以成功地辨別單一位 點突變[Warren E. Glaab et al, Mutation Research, 430: 1-12(1999)]。本發明主要就基于以上技術檢測EGFR外顯子中的常見突變。目前文獻中用熒光PCR方法檢測EGFR突變基本上都是采用Taqman-MGB探針技術，MGB 可以提高探針的Tm值，使探針設計更短，具有更好的淬滅效果，可以實現單點突變的檢測。 但是， 一方面Taqman-MGB探針的設計對模板序列要求嚴格，難以保證在所有突變位置有合適 的探針序列；另一方面，利用Taqman探針的特異性來檢測突變需要針對每一個突變類型設計 一對野生型和突變型探針，如EGFR外顯子19的缺失突變據文獻報道就有20種以上，如果要 檢測其中10種突變就需要20個熒光探針，而T叫man-MGB探針價格昂貴，多重探針的使用會 大大增加檢測成本。采用引物特異的熒光PCR方法則可以避免這兩方面的問題，引物的設計 更加簡單，而且合成成本低廉，對同一位置的不同突變類型可以采用多重引物一個探針進行 檢測，既體現了熒光PCR方法簡便，靈敏度高和特異性好的優點，有達到了降低檢測費用的 目的。發明內容本發明的目的在于提供一種檢測EGFR基因突變的實時熒光PCR試劑盒，可用于臨床樣品 中EGFR基因常見突變檢測。為了完成上述任務，本發明的具體技術路線為(1) 針對EGFR19外顯子、21外顯子突變位點設計的分別能夠與野生型和突變型模板的上 游或下游寡核苷酸引物，分別與EGFR 19外顯子、21外顯子野生型和突變型保守序列結合的下 游或上游寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。(2) 配制適宜于PCR擴增的反應體系。核酸擴增反應體系包括19外顯子野生型檢測體系 (A)、 19外顯子突變型檢測體系(B)、 21外顯子突變型檢測體系(C)，每個檢測體系中都包括耐熱DNA聚合酶、dNTP、 UNG酶、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、能 夠與靶多聚核苷酸結合并且兩末端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探 針、含有鎂離子的緩沖液。(3) 從待測樣本中提取DNA，加入前述的三個反應體系中，在熒光定量PCR以上進行PCR檢測。(4) 確定樣本在野生型檢測體系、19外顯子突變型檢測體系、21外顯子突變型檢測體系 的Ct值，分別標記為CtA， CtB和CtC，如果CtB - CtA 〈閾值，則該標本EGFR外顯子19有缺失 突變，如果CtC - CtA <閾值，則該標本EGFR外顯子21有缺失突變，否則為野生型。本發明提供的EGFR基因突變檢測試劑盒包括以下組分(1)野生型PCR反應液、19外顯子 突變PCR反應液、21外顯子突變PCR反應液、酶系、陰性質控品、野生型質控品、19突變型質控品、21突變型質控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中酶系包含耐 熱DNA聚合酶、dNTPs、 UNG酶和純化水。根據本發明一個優選的實施方案，其中試劑盒的野生型PCR反應液由PCR緩沖液、19型 正向引物、19野生型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴 增的19型正向引物、19野生型反向引物和19型熒光探針的序列分別是 19型正向引物(EGFR19-F): 5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3' (SEQ ID N0:1) 19野生型反向引物(EGFR19-W-R): 5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3' (SEQ ID N0:2) 19型熒光探針(EGFR19-P) : 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3， (SEQIDN0:3)， 其中X/Y表示熒光標記檢測體系，分別為熒光發生基團和熒光淬滅基團。根據本發明一個優選的實施方案，其中試劑盒的19外顯子突變型PCR反應液由PCR緩沖 液、19型正向引物、19突變型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，19突變型反向引物 又包括19突變型1反向引物、19突變型2反向引物、19突變型3反向引物、19突變型4反 向引物、19突變型5反向引物、19突變型6反向引物、19突變型7反向引物，其特征在于 用于靶多核苷酸擴增的19型正向引物、19突變型反向引物和19型熒光探針的序列分別是 19型正向引物(EGFR19-F): 5' TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC 3' (SEQ ID N0:1) 19突變型1反向引物(EGFR19-Ml-R): 5'-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT -3' (SEQ ID N0:4)19突變型2反向引物(EGFR19-M2-R) 19突變型3反向引物(EGFR19-M3-R) 19突變型4反向引物(EGFR19-M4-R) 19突變型5反向引物(EGFR19-M5-R) 19突變型6反向引物(EGFR19-M6-R) 19突變型7反向引物(EGFR19-M7-R)5，- TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT -3' (SEQ ID NO:5) 5'- TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT -3' (SEQ ID NO:6) 5' -TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT -3' (SEQ ID NO:7) 5'- CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT -3' (SEQ ID NO:8) 5'- GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT -3' (SEQ ID NO:9) 5'-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3' (SEQ ID NO:10) 19型熒光探針(EGFR19-P): 5， X- TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3' (SEQ ID NO: 3)， 其中X/Y表示熒光標記檢測體系，分別為熒光發生基團和熒光淬滅基團。根據本發明一個優選的實施方案，其中試劑盒的21外顯子突變型PCR反應液由PCR緩沖 液、21型正向引物、21突變型反向引物、21型熒光探針和純化水組成，其特征在于用于靶 多核苷酸擴增的21型正向引物、21突變型反向引物和21型熒光探針的序列分別是 21型正向引物(EGFR2卜F): 5'-GGAGGACCGTCGCTTGG -3' (SEQ ID NO:ll) 21突變型反向引物(EGFR21-M-R): 5' -GCACCCAGCAGTTTGGCTC -3' (SEQ ID NO: 12) 21型熒光探針(EGFR21-P): 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3，(SEQ ID NO: 13)其中x/Y表示熒光標記檢測體系，分別為熒光發生基團和熒光淬滅基te。根據本發明的一個優選實施方案，試劑盒中的陰性質控品為生理鹽水，野生型質控品、 19突變型質控品和21突變型質控品分別為測序檢測結果為EGFR野生型、外顯子19突變型和21 突變型的組織、血液或者細胞系提取的DNA。根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的待檢樣品是從各種途徑獲取的含有腫瘤 DNA的臨床樣品，包括手術切除的癌組織、肺石蠟包埋的腫瘤組織、穿刺組織、血清和胸水等。根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒所檢測的EGFR21外顯子突變指的是在EGFR 酪氨酸激酶區的21外顯子上的L858R點突變，EGFR19外顯子突變指的是在EGFR酪氨酸激酶 區的19外顯子出現的常見缺失突變和復合突變等，如Del E746-A750(1) ， Del E746-A750(2)， Del E746-T751， Del L747-T751insP， Del L747-S752insS， Del L747-S752ins VI， Del L747-S752等。根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒用于判定檢測方法有效性的標準是每次 檢測都使用野生型PCR反應液、突變型PCR反應液分別檢測野生型質控品和突變型質控品， 然后根據兩次熒光PCR所得出的ACt值作為質量控制標準，對于野生型質控品ACt值應大于閾值，對于突變型質控品ACt值應小于閾值。根據本發明的一個優選實施方案，試劑盒按照下述標準判定被檢序列是野生型或者突變 型1)在At大于閾值的情況下，則該樣品即可判定野生型；2)在ACt小于閾值的情況下， 則該樣品即可判定為突變型。根據本發明的一個優選實施方案，試劑盒檢測結果的閾值可以根據不同標本類型或者不 同的靈敏度及特異性要求設為3—9之間的任意值，優選使用5 — 7之間的任意值。根據本發明的一個優選實施方案，可以根據所擴增序列的特殊情況，例如CG堿基含量高 和/或重復序列多等，在試劑盒的PCR緩沖液中加入甜菜堿、甲酰胺和二甲基亞砜等PCR反應 添加劑。本發明所述的EGFR基因突變檢測試劑盒，針對用測序方法步驟繁瑣、操作復雜、靈敏度 低的缺點，采用引物特異的熒光PCR方法，分別針對TK區的每個外顯子的設計野生型與突變型 引物以及公用探針，利用熒光PCR方法靈敏、特異的優點， 一次PCR操作即可檢出多種常見突 變，靈敏度至少可以達到1%。本發明與現有的測序技術相比，具有下列優點(1) 靈敏度更高，可以檢出1%的突變模板，高于測序方法20%的靈敏度。(2) 全封閉反應，提取基因組DNA后，直接用PCR檢測判斷結果，避免了用PCR產物測序 造成的污染；(3) 檢測速度快，整個過程僅需4 5小時；(4) 操作簡單，可控性強，可進行大批量樣品檢測，有利于臨床操作。
圖l顯示試劑盒質控品的擴增曲線，其中圖1A顯示野生型質控品的擴增曲線，圖1B顯示 EGFR19突變型質控品的擴增曲線，圖1C顯示EGFR21突變型質控品的擴增曲線。 圖2顯示試劑盒檢測EGFR 19外顯子突變型的肺癌組織標本的擴增曲線。 圖3顯示試劑盒檢測EGFR 21外顯子突變型的肺癌組織標本的擴增曲線。 圖4顯示DNA提取失敗的肺癌組織標本的擴增曲線，其中圖4A中反應液A、 B均無擴增曲線， 說明DNA提取失敗。圖4B中B管無特異性增長曲線且CtA〉23，說明DNA濃度太低，不能用于PCR 檢測具體實施方式
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。 實施例l: EGFR基因突變檢測試劑盒及其使用(1) 試劑盒的組成PCR反應液A l管(820 ul /管)、PCR反應液B l管(820 ul /管)、PCR反應液C l管 (820 ul /管)、酶系l管(240 yl /管)、野生型質控品l管(30ul/管)、19突變型標準品1 管(30ul/管)、19突變型標準品1管(30ul/管)，陰性對照l管(30, ul/管)。PCR反應液A 包括19型正向引物、19野生型反向引物、19型熒光探針、PCR緩沖液、純化水；PCR反應液B 中包括19型正向引物、19突變型l-7反向引物、19型熒光探針、PCR緩沖液、純化水；PCR反應 液C中包括21型正向引物、21突變型反向引物、21型熒光探針、PCR緩沖液、純化水；Taq酶系 中包括UNG酶、dNTPs、 Taq酶。(2) 核酸提取取10-50mg新鮮組織或石蠟包埋組織樣本或者200-500 n l外周血清，建議使用Qiagen或 者RochDNA提取試劑盒提取基因組DNA，提取過程按照試劑盒說明書進行，最后收集到100ul DNA溶液。(3) PCR檢測按比例取相應量的PCR反應液、Taq酶系(PCR反應液A和PCR反應液B 41W/人份+Taq酶系4rt/人份)，充分混勻后按45W/管分裝至PCR反應管中，備用。向準備好PCR反應液A和B的PCR反應管中，分別加入處理后的同一個樣品的DNA提取液5y 1，并蓋緊管蓋，3000rpm離心2分鐘，8熒光定量PCR上機。PCR循環條件是50°C 3分鐘一94度3分鐘一(預擴增步驟)94度30秒，60 度45秒，10個循環—94度15秒，60度(讀熒光)60秒，進行30個循環；或40。C 30分鐘一94 度30秒，60度(讀熒光)45秒，進行40個循環(參見附圖l)。選擇熒光定量PCR儀上FAM/TAMRA 通道進行熒光信號檢測。(4) 結果分析根據擴增曲線設置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值可以 在1 10、 st叩值可以在5 20、 Value值可以在0.01 0.2范圍選擇)，在Analysis菜單下選 擇Analyze自動分析結果。(5) 結果判定A. 對野生型質控品，A管有特異性增長曲線，B管和C管無特異性增長曲線(圖1A); 對E19突變型質控品，A管和B管有特異性增長曲線，C管無特異性增長曲線(圖1B);對 E21突變型質控品，A管和C管有特異性增長曲線，B管無特異性增長曲線。同時滿足上述 條件本次實驗有效(圖1C)。B. 每個樣品均要同時進行A、 B和C三管的檢測，其Ct值分別記為CtA、 CtB、 Cte。試 劑盒檢測的最適DNA濃度范圍為10ng/反應-500ng/反應，對應的CX值范圍約為12-20 (對 應的循環數為22-30)。C. 對同一樣品，如果B管呈特異性增長曲線，iCtB-CtA〈6 (圖2)，則該標本EGFR 外顯子19有缺失突變，否則為野生型。D. 對同一樣品，如果C管呈特異性增長曲線，且Ctr CtA 〈 6 (圖3)，則該標本EGFR 外顯子21有L858R的點突變，否則為野生型。E. 如果A， B， C管均無特異性增長曲線(參見附圖4A)或者B， C管無特異性增長曲線且CtA > 23(循環數為33)(參見附圖4B)，則該樣本檢測無效，需重新檢測或者提取DNA。<110>中山大學達安基因股份有限公司<120>弓I物特異熒光PCR檢測EGFR突變的試劑盒<140><141><160> 13<210> 1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220><223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400〉 1tcacaattgccagttaacgtcttc<210>2 <211>23 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 2gctttcggagatgttgcttctct<210> 3 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 3tctc3ccttctgggatccagagtccc<210>4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 4tggctttcggagatgttttgat<210> 5 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 5tggctttcggagatgtcttgat<210>6 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 6tgttggctttcggagatttgat<210> 7 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220〉<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 7ttggctttcggaggttcctt<210>8 <211>21 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 8ccttgttggctttcgattcct<210>9 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 9gttggctttcggaaccttgat<210> 10 <211>21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 10cttgttggctttcggttcctt<210> 11 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 11ggaggaccgtcgcttgg<210> 12 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 12gcacccagcagtttggctc<210> 13 <211> 26 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 13tctcaccttctgggatccagagtccc
權利要求
1、一種采用引物特異的實時熒光聚合酶鏈反應技術檢測EGFR突變的試劑盒，該試劑盒包括野生型PCR反應液、19外顯子突變PCR反應液、21外顯子突變PCR反應液、酶系、陰性質控品、野生型質控品、19突變型質控品、21突變型質控品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中19外顯子突變型PCR反應液由PCR緩沖液、19型正向引物、19突變型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，19突變型反向引物又包括19突變型1反向引物、19突變型2反向引物、19突變型3反向引物、19突變型4反向引物、19突變型5反向引物、19突變型6反向引物、19突變型7反向引物，其特征在于用于靶多核苷酸擴增的19型正向引物、19突變型反向引物的序列分別是19型正向引物5′-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3′19突變型1反向引物5′-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT-3′19突變型2反向引物5′-TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT-3′19突變型3反向引物5′-TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT-3′19突變型4反向引物5′-TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT-3′19突變型5反向引物5′-CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT-3′19突變型6反向引物5′-GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT-3′19突變型7反向引物5′-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3′。
2、 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于19外顯子突變型PCR反應液中19型熒光探 針的序列為5，X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC—Y 3，，其中X/Y表示熒光標記 檢測體系，分別為熒光發生基團和熒光淬滅基團。
3、 根據權利要求1的試劑盒，其中21外顯子突變PCR反應液由PCR緩沖液、21型正 向引物、21突變型反向引物、21型熒光探針和純化水組成，其特征還在于用于靶多核苷酸擴 增的21型正向引物、21突變型反向引物的序列分別是 '21型正向引物5'-GGAGGACCGTCGCTTGG-3'21突變型反向引物5'-GCACCCAGCAGTTTGGCTC-3'。
4、 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于21外顯子突變PCR反應液中21型熒光探針 的序列是5'X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3，，其中X/Y表示熒光標記檢 測體系，分別為熒光發生基團和熒光淬滅基團。
5、 根據權利要求1的試劑盒，其中野生型PCR反應液由PCR緩沖液、19型正向引物、 19野生型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，其特征還在于用于靶多核苷酸擴增的19 型正向引物、19野生型反向引物的序列分別是19型正向引物5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3'19野生型反向引物5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3'。
6、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于野生型PCR反應液中19型熒光探針的序列 是5， X- TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC -Y 3'，其中X/Y表示熒光標記檢測體系， 分別為熒光發生基團和熒光淬滅基團。
7、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于酶系中包含Taq酶、dNTP和UNG酶。
8、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于陰性質控品為生理鹽水，野生型質控品、19 突變型質控品和21突變型質控品分別為測序檢測結果為EGFR野生型、外顯子19突變型和21突 變型的組織、血液或者細胞系提取的DNA。
9、 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于每個樣品野生型和突變型體系熒光PCR測得的 ACt值是指同一樣品在突變型PCR體系擴增的Ct值減去其在野生型PCR體系擴增的Ct值的差值。
全文摘要
本發明提供了一種引物特異熒光PCR檢測EGFR突變的試劑盒，特別涉及腫瘤組織以及腫瘤患者外周血清中EGFR基因突變的診斷。本試劑盒針對分子靶向抗癌藥物療效相關的特定突變位點，設計特異性的寡核苷酸引物序列和探針序列，對每一個待測樣品，分別用野生型PCR體系和突變型PCR體系進行熒光PCR檢測，通過兩次反應Ct值差值(ΔCt)的大小，判斷樣品是否存在EGFR19外顯子和21外顯子的突變。本發明可對EGFR的特定位點是否存在突變進行檢測，可用于分子靶向抗腫瘤新藥的療效預測和腫瘤患者臨床個體化用藥方案的指導。
文檔編號C12Q1/68GK101565742SQ20081002767
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者何蘊韶, 荃 吳, 明 李, 鋼 程 申請人:中山大學達安基因股份有限公司