專利名稱：一種高純度低聚果糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種高純度低聚果糖的生產方法，尤其涉及一種利用固定化酶 生產高純度低聚果糖的方法。
背景技術：
低聚果糖(Fructooligosaccharide, FOS),又稱蔗果低聚糖或果寡糖，是 由1 - 3個果糖基通過P(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結合生成的蔗果三糖、 蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。其中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖是非消 化性糖，具有雙歧桿菌增殖功能，是功能性低聚糖的有效成分。迄今為止，市 場上的低聚果糖產品分為兩種 一種是低聚糖含量50%左右的低聚果糖(以下 稱為FOS50)，其中低聚糖(三糖+四糖+五糖)含量在50°/。左右，其余為葡 萄糖和蔗糖，糖尿病人和肥胖者不能接受；另一種是高純度低聚果糖，即低聚 糖含量達75 %或更高的低聚果糖，是較理想的低聚果糖產品。
工業化生產高純度低聚果糖的方法，國內外至今一直采用兩步法，即在微 生物(酶)法獲得FOS5o基礎上，再釆用層析分離法或者納濾膜分離法將葡萄 糖和蔗糖分離出去，得到高純度低聚果糖產品。其中國外多用葡聚糖凝膠 SephadexG-10樹脂來分離，其分離效果很好，但是這種樹脂價格十分昂貴(約 1200美元/公斤)，使得設備投資成本太高，企業難以實現。國內生產高純度低 聚果糖的企業大多采用截留分子量為300Da的膜組件進行納濾分離，由于 300Da的膜組件除了濾掉葡萄糖和蔗糖以外，還要把近一半數量的蔗果三糖也 濾掉，其結果是低聚果糖的回收率和產品得率都很低，大約需要消耗3 4噸
FOS5o才能獲得1噸低聚糖含量95%左右的高純度低聚果糖產品(FOS95), 因FOSso的市場價為每噸8000元，光原料成本就高達2.4-3萬元/噸，再加 上設備運行時間長，能耗過高，使生產成本居高不下。
中國發明專利ZL 00130200.0采用截留分子量為200Da的膜組件進行納 濾分離，雖然可以避免蔗果三糖的損失，但是該膜組件只能濾掉單糖，大部分 蔗糖被截留，因此需要增加一次酶反應來轉化蔗糖，而且同時需要增加一次脫
鹽、脫色工藝，然后進行第二次納濾，才能獲得FOSg5產品，其工藝太復雜，
相當于兩次生產低純度低聚果糖產品的成本加上兩次納濾的成本，其總成本與 300Da膜組件納濾法幾乎一樣高。
除了層析法和納濾分離法外，國內外也有過雙酶法或混合酶法生產高純度 低聚果糖的探索性研究報導。Yun J .W等于1993、 1994年報導，用果糖基轉 移酶加葡萄糖氧化酶的雙酶系，獲得90.05%以上的FOS產品；但這些試驗由 于需用過氧化氫酶配套，過氧化氫酶的成本太高，又不能回收，沒有工業化應 用價值。國內也有人嘗試過雙酶法；江南大學江波等1997年報導在采用黑曲 霉單酶法將蔗糖轉化為56.64% FOS的基礎上，第二步用葡萄糖氧化酶加過氧 化氬酶協同作用，將葡萄糖轉化為葡萄糖酸，然后用離子交換法去掉葡萄糖酸， 可獲得87%的FOS。這種雙酶法的弱點是工業化生產難以實現，原因是葡萄 糖氧化酶沒有重復利用，過氧化氫酶的價格太昂貴。據Sigma公司2008年的 報價，貨號為C3515的過氧化氫酶售價為785.07元/10mg。
鑒于現有技術的上述缺陷，現有必要提供一種能明顯降低成本的工業化生 產高純度低聚果糖的方法。
發明內容
本發明提供一種能明顯降低成本的工業化生產高純度低聚果糖的方法。本
發明是利用可重復使用的固定化酶來生產高純度低聚果糖。
本發明的高純度低聚果糖的制備方法包括以下兩個步驟
(1) 制備固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫
模擬酶；
(2) 利用步驟(1)制備的酶用間歇式或連續式的生產方法生產高純度低 聚果糖。
其中，固定化果糖基轉移酶的制備
選擇具有能分泌果糖基轉移酶的優良菌抹，在合適的培養基中培養，然后將 培養得到的大量菌絲體進行破壁，用離心法將酶分離，用固定化試劑將酶固定下 來。
上面所述的具有能分泌果糖基轉移酶的優良菌抹經本發明人進行實驗和篩 選，有以下幾種可達到要求，它們是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉 (Asperg川us niger)和棲土曲霉(Aspergillus terricola)。
上面所述的合適的培養基包括以下幾種物質1-10%蔗糖，1-5%豆粕粉， 0.1-1%玉米粉，其培養方法是在25-35。C，通風比1:0.1-1:1，攪拌速度100-300rpm 條件下，經過15-45小時，獲得大量菌絲體。
上面得到的菌絲體必須先進行破壁，收集這些菌體細胞的胞內酶，才獲得較 好的果糖基轉移酶，所述的菌體破壁可用已知的方法如機械破壁法、凍融法、超 聲波破碎法、溶菌酶法等獲得果糖基轉移酶的混合液，再用離心法將含酶的溶液 分離。
上面所述的用試劑將酶固定化的方法，采用化學偶聯法，固定化試劑包括載 體和交聯劑，用來固定酶的載體是大孔樹脂，所用的交聯劑為戊二醛。利用偶聯 反應可使吸附在載體上的果糖基轉移酶之間以化學鍵連接起來，達到固定化的目 的。所用戊二醛濃度在0.1-0.9%,過低或過高都影響固定化的效果。
固定化過程中，酶和載體的比例范圍是每克載體需酶15-95u,當酶的用量< 15u/g載體時，固定化酶的酶活太低，酶促作用很難發揮出來，但當酶活〉95u/g 載體時，酶的固定化效率太低，部分呈游離酶狀態，使用一次后就流失掉。
固定化的條件是pH4-8，溫度0-10。C,攪拌速度15-60rpm。固定化操作 果糖基轉移酶經分離后，用高效液相色諳法(HPLC)測定其酶活力，按一定的酶/ 載體比例加入載體，混合吸附5 24h后，加入一定濃度的戊二醛溶液，在上迷條 件下，交聯反應10-24h,充分洗滌、離心甩干，可得到固定化果糖基轉移酶，于 0-10'C保存。
在本發明的另外的實施例中，固定化果糖基轉移酶的制備方法，可按照 ZL01128345.9中公開的方法制備，此處不再贅述。 本發明中固定化葡萄糖氧化酶的制備
將游離葡萄糖氧化酶用化學偶聯法與載體交聯，所用的載體是大孔樹脂、 瓊脂糖凝膠、烯丙基葡聚糖凝膠或殼聚糖凝膠等，所用交聯劑為戊二醛。
固定化的條件是酶和載體的配比是每克載體需酶100 ~ 300 U,在p H 5.0 — 7.0、溫度10~ 5CTC、 4覺4半速度10— 100r/min、戊二醛的鄉冬濃度為0.05 ~ 0.3%的條件下反應3~ 10h。
所用的游離葡萄糖氧化酶可以是商業酶，也可以用自行篩選和誘變的黑曲霉 菌抹(Asperg川us carbonarius OLG2)，經過種子培養和發酵培養獲得菌體后， 再經過破壁、離心分離而提取的葡萄糖氧化酶。該菌林的發酵培養基組成是(以 g/L計)飾30- 50，瓊月旨10-20, NaN03 、 MgS04 7H20 、 KCI 、 FeS04 4H2O和K2HPO4各0.01 ~ 3.0，調節pH為5.5 ~ 7.5。
固定化葡萄糖氧化酶的制備也可采用殼聚糖和海藻酸鹽的界面凝固-交聯
耦合固定化法。先將含有發泡劑的海藻酸鈉溶液滴入氯化鉤溶液，形成一種具 有很多微孔的海藻酸鈣凝膠珠；多孔海藻酸鈣凝膠珠再和殼聚糖反應形成多孔 微球。由于殼聚糖分子鏈上有大量的伯氨基，而海藻酸鹽的分子鏈上有大量的 羧基，所以殼聚糖和海藻酸鈉可以通過正、負電荷的吸引形成聚電解質膜，這 樣制備的微膠嚢其球性度和光潔度很好，而且具有很多微孔，其比表面較大， 很適合于作為葡萄糖氧化酶的固定化載體，這樣首先解決了固定化栽體選擇和 成型問題。其次，由于這種多孔微球中每個微孔的表面是一層殼聚糖凝膠，再
利用帶有兩個醛基的雙功能交聯劑戊二醛與殼聚糖和葡萄糖氧化酶通過Schiff 反應而將酶固定在微膠嚢的各個微孔上。這樣酶與載體的結合十分牢固，不易 流失，而且只分布在多孔微球中微孔的表面，空間屏障和酶促反應的傳質阻力 都很小，提高了固定化酶的活性。 固定化的條件是
將含有0.01~0.20%NaHCO3 (質量分數)的1.0-2.0% (質量分數)海藻酸 鈉溶液在蠕動泵加壓下通過ct) 1 ~ 2mm針頭滴入1.0 ~ 2.0% (質量分數)的 CaCl2溶液，室溫放置2-4h,得到白色的海藻酸鉤多孔微球。用5%醋酸溶液 配制0.1~0.5%(質量分數)的殼聚糖溶液，按2份溶液1份微球(質量比)投 入海藻酸鈣多孔微球，在30-40。C、 200rpm的恒溫搖床中搖動20~40min, 用0.5~ 1.0%(質量分數)的CaCl2溶液洗滌，獲得海藻酸鈣-殼聚糖多孔微球。 取海藻酸鈣-殼聚糖多孔微球100g,加5L 5%戊二醛溶液，在25~35°C、 200rpm的恒溫搖床中搖動4~6h,蒸餾水反復洗滌以除去殘存的戊二醛。按 每克海藻酸鈣-殼聚糖多孔微球栽體需葡萄糖氧化酶200~ 500 U,在25~ 35°C、 200rpm的恒溫搖床中搖動2~4h，放入冰箱中于4°C下靜置過夜，離心、 沉淀，用蒸餾水反復沖洗，過濾即得固定化葡萄糖氧化酶。
本發明中固定化過氧化氫模擬酶的制備 將金屬卟啉化合物氯化血紅素或血紅蛋白用化學偶聯法與載體交聯，所用 的載體為瓊脂糖凝膠、烯丙基葡聚糖凝膠或殼聚糖凝膠等；所用交聯劑為戊二
醛。固定化的條件是'pH 8.0-12.0,溫度10-5CTC,攪拌速度10-100r/min,
金屬卟啉化合物和載體的質量比是每克載體需金屬卟啉化合物0.1 ~ 0.3克，交 聯劑戊二醛的終濃度為0.05-0.3%,反應時間3-10h。反應結束后，用水洗 滌，并測定其過氧化氫酶活性。
過氧化氫酶的活性中心是鐵(in)卟啉。用具有鐵卟啉環的天然提取物氯化 血紅素(卟啉鐵)或血紅蛋白作為過氧化氫酶模擬酶，其優點是1、與過氧 化氫酶結構相似，模擬酶的性能好；2、屬于天然產物，安全無毒，特別適于 食品工業的使用；3、材料來源于動物血，資源豐富，提取工藝簡便，價格不 高。
用間歇式或連續式的生產方法生產高純度低聚果糖，其中間歇式的分批法生 產高純度低聚果糖的方法是
在反應罐中，加入20~55% (質量百分數)的蔗糖溶液，按每Kg蔗糖(干) 同時加入1000 ~ 4000U固定化果糖基轉移酶、1000 ~ 4000U固定化葡萄糖氧化酶 和1000-4000U固定化過氧化氫模擬酶的酶量，以1.0-3.0 L/min的流速通入空 氣，用CaC03粉末控制反應液的pH值，使其維持在4.0-7.0之間，溫度在10-50 。C和攪拌速度為50 ~ 200r/min的條件下反應10- 50h,以HPLC檢測低聚果糖含 量達標后，用篩網過濾反應液，分離回收固定化酶(固定化果糖基轉移酶、固定 化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模擬酶)，并用水充分洗滌后作下一批原料的 生產之用。濾液經過精濾、離子交換和噴霧干燥成為高純度低聚果糖產品。
連續式的柱式反應法(即一步法)生產高純度低聚果糖的方法是
將固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模擬酶按酶 活比1.0-4.0: 1.0-3.0: 1.0~4.0混合，再和2~8% (質量百分數)的碳酸4丐
顆粒混勻，裝入柱式反應器中，以10~60% (質量百分數)的蔗糖溶液在pH4.0 ~7.0，溫度10 5(TC下反復通過此柱，以HPLC檢測低聚果糖含量達標后過濾， 經離子交換和噴霧千燥成為高純度低聚果糖產品。
與現有的高純度低聚果糖的制備方法相比較，本發明的果糖基轉移酶、葡 萄糖氧化酶和過氧化氫模擬酶都經過固定化處理，提高了酶的穩定性，并可以 重復使用，提高了酶的利用效率。另外，用廉價的金屬卟啉化合物作為過氧化 氫模擬酶代替昂貴的過氧化氫酶，其成本約只有過氧化氫酶的十分之一，這樣 能大幅度降低制備高純度低聚果糖的生產成本。再者，與國外現行的兩步法的 高純度低聚果糖制備方法比較，本發明的制備方法可以用 一 步法從蔗糖直接生 產高純度的低聚果糖。本發明的工藝流程簡短、技術成熟、可搡作性強，而且 生產成本大大降低，適于工業化生產。
說明(1 )本發明所稱的糖含量均為質量百分數，低聚糖含量指三糖+四 糖+五糖的總和，各組分糖的含量由高效液相色譜(HPLC)的歸一化法計算 而得。
(2) 本發明所稱的"低純度低聚果糖"是指低聚糖含量在50%左右，所 稱的"高純度低聚果糖"是指低聚糖含量在75%以上(含)。
(3) 本發明所接觸三種酶的酶活性定義分別如下
果糖基轉移酶(fructosytransferase,縮寫FTS，酶分類號EG2.4 1.9):測 定方法按國家輕工行業標準QB 2583-2003的附錄A，酶活力定義是根據酶供應者 標識的最佳酶化反應的條件下，將蔗糖轉化為低聚果糖每分鐘產生1 nmol蔗果三 糖所需酶量為一個酶活力單位(U)。
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,縮寫GOD，酶分類號EC1.1 3.4):酶活 力測定方法按滴定法(見鄔顯章著《酶的工業生產技術》，吉林科學技術出版社， 1988年49-53頁)，酶活力定義是在35。C的反應溫度和所規定的條件下每分鐘生產1 ij mol葡萄糖酸所需酶量為一個酶活力單位(U)。
過氧化氫模擬酶酶活力測定方法按滴定法(見B.施特爾馬赫著，錢嘉淵譯 《酶的測定方法》，中國輕工業出版社，1992年第一版)，酶活力定義是在35。C的 反應溫度和所規定的條件下每分鐘分解1 y mol過氧化氳所需酶量為一個酶活力 單位(U )。
下面將結合實施例詳細介紹本發明的高純度低聚果糖的制備方法。以下的 實施例僅用來解釋本發明，而不應以此來限定本發明的保護范圍，根據本發明 的本質所做的等同變化仍屬于本發明的保護范圍。
具體實施方式
實施例一
(一) 固定化果糖基轉移酶的制備
選取棲土曲霉(Asperg川us terricola)菌種接入含5。/o蔗糖、3%豆粕粉、0.3% 玉米粉培養基的200升發酵罐中，于33。C發酵24小時，得種子培養液。在5000升 發酵罐中，加入培養基溶液，其中含蔗糖5%、豆粕粉3%、玉米粉0.3%。于121 。C滅菌40min，加入種子培養液150升，在33。C、 220rpm的條件下，培養24h， 得到含有菌絲體的發酵液，經離心機離心，分離收集菌絲體，洗滌、破壁、離心 取酶液，經HPLC測定酶活力后，按每40u酶液加入1g載體的比例，在2000升反 應罐中加入酶液和大孔樹脂，攪拌均勻，冷卻至8。C,吸附12h。加入戊二醛，使 其最終濃度為0.2%,在8。C下反應16小時，過濾取固態物，充分洗滌，離心甩干 水分，即得固定化果糖基轉移酶制劑。
(二) 固定化葡萄糖氧化酶的制備
談變黑曲霉(Asperg川us carbonarius OU32 )菌種接入含2 ~ 3。/。蔗糖，1~ 2%瓊月旨，1-2。/o酵母提取物和NaN03 、 MgS04 ■ 7H20 、 KCI 、 FeS04 4H20
和K2HPO4各0.001 ~ 0.3%培養基的100升種子發酵罐中，調節pH為5.5-7.0,于 33。C培養16 h，得種子培養液。在3000升發酵罐中，加入培養基溶液，其中含3~ 5%蔗糖，1 ~2%瓊月旨，NaN03 、 MgS04 7H20 、 KCI 、 FeS04 4H2C^K2HP04 各0.001~0.3%,于120 。C滅菌30 min, 加入種子培養液80升，在33 。C , 200r/min的條件下培養30 h，得含菌絲體的發酵液，離心分離收集菌絲體，洗滌、 破壁、離心取酶液，超濾濃縮得到萄萄糖氧化酶的粗酶液，用滴定法測定其酶活 力。
在100升反應罐中，30-40。C下，按每克栽體(濕)力。入100~ 300 U酶液 的比例，加入10Kg的殼聚糖凝膠(濕)和100~ 300萬U的酶液，攪拌混勻后 加入戊二醛，使其終濃度為0.05~0.2%,在pH 5.0-7.0， 30-40。C下反應4 6h ，過濾取固態物，用去離子水充分洗滌，離心甩干、成型，即得固定化萄糖 氧酶制劑。
(三) 固定化過氧化氫模擬酶的制備
在100升反應罐中，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液50L, 30 40。C下加入卟啉 鐵2.5Kg攪拌至完全溶解。按卟啉鐵殼聚糖凝膠=1.0 ~ 3.0: 10.0的質量比，加 入10-25Kg的殼聚糖凝膠(濕)，攪拌混勻后加入戊二醛，使其終濃度為0.05 0,2%%,在pH 9.0-12.0, 30 4(TC下反應4 8 h ,過濾取固態物，用去離子 水充分洗滌，離心甩千、成型，即得固定化過氧化氫模擬酶。用滴定法測定其酶 活力。
(四) 固定化酶法生產高純度低聚果糖
在2.2M3的反應罐中，加入50~55% (質量百分數)蔗糖溶液2000 Kg，加 入固定化果糖基轉移酶制劑125 ~ 380萬U、固定化萄糖氧酶制劑100 ~ 300萬U和 固定化過氧化氫模擬酶150-400萬U,以1.0-3.0 L/min的流速通入空氣，用 CaC03粉末控制反應液的pH值，使其維持在5.0-7.0之間，在30-45'C和攪拌速
度為50~ 200r/min的條件下反應12 ~ 30h,以HPLC檢測低聚果糖含量達標后， 用篩網過濾反應液，分離回收固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定 化過氧化氫模擬酶，并用水充分洗滌后作下一批原料的生產之用。濾液經過精 濾、離子交換和噴霧干燥成為高純度低聚果糖產品。
實施例二
(一) 固定化果糖基轉移酶的制備
選取棲土曲霉(Aspergillus terricola)菌種接入含5。/。蔗糖、3%豆粕粉、0.3% 玉米粉培養基的200升發酵罐中，于33。C發酵24小時，得種子培養液。在5000升 發酵罐中，加入培養基溶液，其中含蔗糖5%、豆粕粉3%、玉米粉0.3%。于121 。C滅菌40min,加入種子培養液150升，在33。C、 220rpm的條件下，培養24h，
得到含有菌絲體的發酵液，經離心機離心，分離收集菌絲體，洗滌，破壁，離心 取酶液，經HPLC測定酶活力后，按每40u酶液加入1g載體的比例，在2000升反 應罐中加入酶液和大孔樹脂，攪拌均勻，冷卻至8。C,吸附12h。加入戊二醛，使 其最終濃度為0.2%，在8。C下反應16小時，過濾取固態物，充分洗滌，離心甩干 水分，即得固定化果糖基轉移酶制劑。
(二) 固定化葡萄糖氧化酶的制備
誘變黑曲霉(Asperg川us carbonarius 0LG2 )菌種接入含2~3%蔗糖，1 ~2%瓊月旨，1 ~2%酵母提取物和NaN03 、 MgS04-7H20 、 KCI 、 FeS04-4H20 和K2HP04各0.001 ~ 0.3°/。培養基的100升種子發酵罐中，調節pH為5.5-7.0，于33。C培養16 h,得種子培養液。在3000升發酵罐中，加入培養基溶液， 其中含3~5%蔗糖，1 ~2%瓊月旨，NaN03 、 MgS04 7H20 、 KCI 、 FeS04.4H20 和K2HP04各0.001 ~ 0.3%,于120 。C滅菌30 min， 加入種子培養液80升， 在33。C， 200r/min的條件下培養30 h，得含菌絲體的發酵液，離心分離收集 菌絲體，洗滌、破壁、離心取酶液，超濾濃縮得到萄糖氧化酶的粗酶液，用滴
定法測定其酶活力。
將含有0.01 0.20。/oNaHC03(質量分數)的1.0 ~ 2.0% (質量分數)海藻酸鈉 溶氣在蠕動泵加壓下通過cM -2mm針頭滴入1.0-2.0% (質量分數)的CaCI2 溶液，室溫放置2 4h,得到白色的海藻酸鈣多孔微球。用5%醋酸溶液配制 0.1~0.5%(質量分數)的殼聚糖溶液，按2份溶液1份微球(質量比)投入海 藻酸4丐多孔微球，在30-4(TC、 200rpm的恒溫搖床中搖動20-40min，用0.5 ~1.0%(質量分數)的CaCl2溶液洗滌，獲得海藻酸鈣-殼聚糖多孔微球。取該 微球100g，力。5L5。/。戊二醛溶液，在25-35。C、 200rpm的恒溫搖床中搖動4 ~6h,蒸餾水反復洗滌，以除去殘存的戊二醛。
在100升反應罐中，30-4(TC下，按每克多孔微球載體(濕)加入200~ 500 U酶液的比例，加入10Kg的多孔微球載體(濕)和200~ 500萬U的酶液，在 25~35°C、 200rpm的恒溫搖床中搖動2-4h，放入冰拒中于4。C下靜置過夜，離 心，沉淀用去離子水反復沖洗，離心甩干，即得固定化葡萄糖氧化酶制劑。
(三) 固定化過氧化氬模擬酶的制備
在100升反應罐中，加入去離子水50L, 30-40。C下加入血紅蛋白3Kg攪拌至 完全溶解。按血紅蛋白殼聚糖凝膠=2.0-3.0: 10.0的質量比，加入10 15Kg 的殼聚糖凝膠(濕X攪拌混勻后加入戊二醛，使其終濃度為0.05~0.2%%,在pH 5.0-7.0， 30-40。C下反應4-8 h ,過濾取固態物，用去離子水充分洗滌，離心 甩干、成型，即得固定化過氧化氫模擬酶。用滴定法測定其酶活力。
(四) 固定化酶法生產高純度低聚果糖
在3.5M3的反應罐中，加入50~55% (質量百分數)蔗糖溶液3000 Kg，加 入固定化果糖基轉移酶制劑200 ~ 550萬U、固定化萄糖氧酶制劑150 ~ 450萬U和 固定化過氧化氫模擬酶220- 560萬U,以1.0-2.0 L/min的流速通入空氣，用 CaC03粉末控制反應液的pH值維持在4.5 ~ 7.0之間，在30 ~ 45。C和攪拌速度為
100 200r/min的條件下反應12 28h,以HPLC檢測低聚果糖含量達標后，用篩 網過濾反應液，分離回收固定化酶一固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶 和固定化過氧化氫模擬酶，并用水洗滌后作下一批原料的生產之用。濾液經過精 濾、離子交換和噴霧干燥成為高純度低聚果糖產品。 實施例三
(一) 固定化果糖基轉移酶的制備，按ZL 01128345.9的實施例一操作。
(二) 固定化葡萄糖氧化酶的制備
固定化載體按實施例二方法制備，取市售商業萄糖氧化酶的粗酶液，經滴定 法測定酶活力后，在100升反應罐中，30 40'C下，按每Kg多孔微球載體(濕) 加入20萬~ 50萬U酶液的比例，加入20 Kg的多孔微球載體(濕)和40萬~ 100 萬U的酶液，在25 35。C、 200rpm的恒溫搖床中搖動2-4h,放入冰拒中于4 。C下靜置過夜，離心、沉淀，用去離子水反復沖洗，離心甩干，即得固定化葡萄 糖氧化酶制劑。
(三) 固定化過氧化氫模擬酶的制備
在200升反應罐中，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液100L， 30 40。C下力。入吟 啉鐵5Kg攪拌至完全溶解。按卟啉鐵殼聚糖凝膠=1.0 ~ 3.0: 10.0的質量比， 加入20~ 50Kg的殼聚糖凝膠(濕)，攪拌混勻后加入戊二醛，使其終濃度為0.05 ~0.2%%,在pH 9.0-12.0， 30~ 4(TC下反應4-8 h ,過濾取固態物，用去離 子水充分洗滌，離心甩干、成型，即得固定化過氧化氫模擬酶。用滴定法測定其 酶活力。
(四) 固定化酶法生產高純度低聚果糖
將固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氬模擬酶的酶 活比按1.2-3.8: 1.0-3.0: 1.5~4.0混合，再和2~8% (質量百分數)的碳 酸釣顆粒混勻，裝入柱式反應器中，以10 50。/。(質量百分數)的蔗糖溶液在pH4.8
~7.0,溫度30-5CrC下反復通過此柱，以HPLC檢測低聚果糖含量達標后，過濾 回收固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模擬酶，濾液 經離子交換和噴霧干燥成為高純度低聚果糖產品。
權利要求
1.一種高純度低聚果糖的生產方法，其包括以下步驟(1)制備固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模擬酶；(2)利用步驟(1)制備的酶用間歇式或連續式的生產方法生產高純度低聚果糖。
2、 如權利要求1所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述 制備固定化果糖基轉移酶的方法為選擇具有能分泌果糖基轉移酶的優良菌 林，在合適的培養基和培養條件中培養，然后將培養得到的菌絲體進行破壁， 用離心法將酶分離，用固定化試劑將酶固定下來，其中，所迷的優良菌林為米 曲霉、黑曲霉或棲土曲霉。
3、 如權利要求2所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述的合 適的培養基包括以下幾種物質1 ~ 10% (質量分數)蔗糖，1~5% (質量分數) 豆粕粉，0.1 ~ 1%(質量分數)玉米粉，所述的培養條件包括培養溫度25-35。C, 通風比為1:0.1 ~ 1:1,攪4半速度100 — 300rpm。
4、 如權利要求2所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述 的用固定化試劑將酶固定下來，所用的固定化方法為化學偶聯法，所述的固定 化試劑包括載體和交聯劑，其中所述載體為大孔樹脂，所述交聯劑為戊二醛。
5、 如權利要求4所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，固定化過 程中酶和載體的比例范圍是每克載體對應15- 95u的酶，固定化條件是pH4 8， 溫度0-10。C，攪拌速度15-60rpm,其中固定化包括以下操作步驟果糖基轉 移酶經分離后，測定其酶活力，按上述的酶/載體比例加入載體，混合吸附5-24h 后，加入0.1 ~ 0.9。/。濃度的戊二醛溶液，在上述條件下，交聯反應10-24h，洗 滌、離心甩千，可得到固定化果糖基轉移酶，于o icrc保存。
6、 如權利要求1所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，固定化葡萄糖氧化酶是將游離的葡萄糖氧化酶用化學偶聯法與載體交聯，所用的栽體是天 然的或合成的高聚物，所用交聯劑為戊二醛。
7、 如權利要求6所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述載體為交聯瓊脂糖凝膠、交聯烯丙基葡聚糖凝膠或者交聯殼聚糖凝膠。
8、 如權利要求6或7所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于， 固定化過程中酶和載體的配比是每克栽體對應100-300 U的葡萄糖氧化酶， 固定化是在pH 5.0-7.0、溫度10-5(TC、攪拌速度10-100r/min、戊二醛的 終濃度為0.05~0.3%和反應3~ 10h的條件下進行的。
9、 如權利要求1所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，固定化葡 萄糖氧化酶的制備方法為殼聚糖和海藻酸鹽的界面凝固一交聯耦合固定化法。
10、 如權利要求9所迷的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述的 殼聚糖和海藻酸鹽的界面凝固一交聯耦合固定化法是先將含有發泡劑的海藻酸 鈉溶液滴入氯化鈣溶液，形成一種具有很多微孔的海藻酸鈣凝膠珠；多孔海藻酸 4丐凝膠珠再和殼聚糖反應形成具有很多微孔的微球；再用交聯劑戊二醛與殼聚糖 和葡萄糖氧化酶通過Schiff反應而將酶固定在微球的微孔上。
11、 如權利要求10所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述的 殼聚糖和海藻酸鹽的界面凝固 一 交聯耦合固定化法詳細過程為將含有 0.01~0.20%NaHCO3 (質量分數)的1.0 ~ 2.0% (質量分數)海藻酸鈉溶液在蠕動泵 加壓下滴入1.0 2.0% (質量分數)的CaCl2溶液，室溫放置2 4h,得到白色的海 藻酸釣多孔微球；用5%醋酸溶液配制0.1~0.5%(質量分數)的殼聚糖溶液，按2份 溶液1份微球(質量比)投入海藻酸鈣多孔微球，在30 4(TC、 200rpm的恒溫 搖床中搖動20 40min,用0.5 ~ 1.0。/。(質量分數)的CaCl2溶液洗滌，獲得海藻酸 鈣-殼聚糖多孔微球；取海藻酸鈣-殼聚糖多孔微球100g,加5L 5% (質量分數) 戊二醛溶液，在25- 35。C、 200rpm的恒溫搖床中搖動4-6h,蒸餾水洗滌除去殘 存的戊二趁；按每克海藻酸鈣-殼聚糖多孔微球栽體需葡萄糖氧化酶200 500 U 的量加入葡萄糖氧化酶，在25- 35。C、 200rpm的恒溫搖床中搖動2-4h，放入冰 箱中于4。C下靜置過夜，離心，沉淀用蒸餾水沖洗，過濾即得固定化葡萄糖氧化 酶。
12、 如權利要求1所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，固定化 過氧化氫模擬酶的制備方法為金屬卟啉化合物用化學偶聯法與載體交聯，其中 所用的載體是天然或合成高聚物，所用交聯劑為戊二醛。
13、 如權利要求12所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，所述載 體為交聯瓊脂糖凝膠、交聯烯丙基葡聚糖凝膠或者交聯殼聚糖凝膠，所述金屬卟 啉化合物為氯化血紅素或者血紅蛋白。
14、 如權利要求12所述的高純度低聚果糖的生產方法，其特征在于，固定化 過氧化氫模擬酶的制備是在pH 8.0-12.0，溫度10 50。C，攪拌速度10-100r/min條件下進行，其中，金屬卟啉化合物和載體的質量比是每克載體需金屬 吟啉化合物0.1 ~ 0.3克，交聯劑戊二醛的終濃度為0.05-0.3%反應時間3 10h, 反應結束后，洗滌，測酶活性。
15、 如權利要求1所述的高純度低聚果糖的制備方法，其特征在于，所述 的間歇式生產方法是在反應罐中，加入蔗糖溶液，同時加入固定化果糖基轉 移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模擬酶，通入空氣，控制反應液 的pH值，在一定溫度和攪拌速度下反應10~50h,監測反應液中低聚果糖的 含量，果糖含量達標后，過濾反應液，分離回收固定化酶，然后濾液進一步精濾、離子交換和噴霧干燥成為高純度低聚果糖產品。
16、 如權利要求15所述的高純度低聚果糖的制備方法，其特征在于，往 反應罐中加入的蔗糖和固定化酶的含量為每Kg蔗糖加入1000-4000U固定 化果糖基轉移酶、1000~4000U固定化葡萄糖氧化酶和1000-4000U固定化過氧化氫模擬酶。
17、 如權利要求16所述的高純度低聚果糖的制備方法，其特征在于，所 述通入空氣的量為1.0-3.0 L/min。
18、 如權利要求15所述的高純度低聚果糖的制備方法，其特征在于，是 用CaC03來控制反應液的pH值在4.0~ 7.0之間。
19、 如權利要求1所述的高純度低聚果糖的制備方法，其特征在于，所述 的連續式反應法是將固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過 氧化氫模擬酶按比例混合，再和碳酸鈣顆粒混勻，裝入柱式反應器中，以10 ~30% (質量百分數)的蔗糖溶液在pH4.0~7.0、溫度10 4(TC下反復通過 此柱，監測低聚果糖的含量，低聚果糖含量達標后，過濾反應液，經離子交換 和噴霧干燥成為高純度低聚果糖產品。
20、 如權利要求19所述的高純度低聚果糖的制備方法，其特征在于，柱 式反應器中，固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模 擬酶的比例是1.0-4.0: 1.0-3.0: 1.0-4.0;所述碳酸鈣的質量百分數是2 ~ 8 % 。
全文摘要
本發明涉及一種高純度低聚果糖的制備方法，尤其涉及一種用固定化酶來制備高純度低聚果糖的方法。本發明的制備方法先制備固定化果糖基轉移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化過氧化氫模擬酶；然后利用上述制備的酶用間歇式或連續式的生產方法制備高純度低聚果糖。本發明的制備方法中使用廉價的金屬卟啉化合物作為過氧化氫模擬酶代替昂貴的過氧化氫酶；果糖基轉移酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫模擬酶都經過固定化處理，可以回收再利用，提高了酶的穩定性和利用效率，大大降低了制備高純度低聚果糖的生產成本。本發明的制備方法可以用一步法從蔗糖直接生產高純度低聚果糖。
文檔編號C12N11/04GK101368195SQ20081003033
公開日2009年2月18日 申請日期2008年8月22日 優先權日2008年8月22日
發明者姚評佳, 曾憲綱, 曾憲經, 曾昭政, 梁錦添, 謝慶武, 謝擁葵, 陳子健, 陳振鵬, 魏遠安 申請人:江門量子高科生物工程有限公司