專利名稱：用甲基營養酵母生產重組人表皮生長因子受體2胞內區的方法
用甲基營養酵母生產重組人表皮生長因子受體2胞內區的方法 發明領域
本發明涉及蛋白質的生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德畢赤酵 母中表達重組人表皮生長因子受體2胞內區(rhHER2/neu ICD)，以及優化的大 規模工業化發酵生產重組人HER2/neu ICD的方法。
背景技術：
VeriZ/7e"基因編碼分子量為185kDa的跨膜糖蛋白(P185)， P185是由1255 個氨基酸組成的受體酪氨酸激酶，包括信號肽、胞外區、跨膜區和胞內區四個部 分，信號肽位于氨基端，由21個氨基酸組成；胞外區是由632個氨基酸組成的 富含半胱氨酸的配體結合功能區，它又由四個區域構成，包括采用e螺旋結構的 Ll、 L2區和由富含L一半胱氨酸的EGF樣折疊模式的S1、 S2區，這些外功能區 調節著HER2/neu與自身和EGF家族其他成員之間的二聚體化，啟動HER2/neu信 號轉導和腫瘤發展；跨膜區是由22個氨基酸組成的強疏水區，使其能作為膜錨 定區而使整個蛋白分子定位在胞膜上，胞內區為580個氨基酸組成的具有內在酪 氨酸激酶活性的功能區，另外P185蛋白在羧基端還具有自身酪氨酸磷酸化位點。
HER2/neu在人體多種組織和器官有表達(Natali PG， et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer, 1990， 45(3) :457-61.)，在接受生長因子的刺激后，HER2/廳介 導細胞增殖的信號傳導。許多種類人類腫瘤細胞表達高水平的HER2/neu (Slamon DJ， et al. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. 1989， 244(4905) :707-12.)在大約20_30%的乳腺癌病人的 乳腺癌細胞有HER2/neu的過度表達。在一些乳腺癌病人的血漿中可檢出分泌型 HER2/neu細胞外段(secretive HER2， sHER2)。乳腺癌細胞中的HER2/neu的過 度表達和血漿中sHER2的檢出均與乳腺癌的不良預后密切相關。這些乳腺癌病人 有較短的無病生存期和存活期。研究發現，乳腺癌細胞中HER2/neu過度表達和腫瘤的惡性度正相關。過度表達HER2/neu的乳腺癌細胞可以獲得不依賴于附著 物的生長性質，這種性質使腫瘤細胞易發生轉移。在動物模型中，過表達HER2/neu 腫瘤細胞增強了致瘤性和轉移的潛力，轉染力e/么/;7et/基因小鼠能發生自發乳腺 癌且形成的乳腺癌容易發生轉移。
HER2/neu蛋白是腫瘤主動免疫治療的理想靶點，因為HER2/neu蛋白與細胞 惡性轉化有關，是腫瘤病因學中一種生物相關蛋白。某些腫瘤病人存在服R2/neu 特異性抗體或CTL，表明HER2/neu疫苗能誘導免疫反應。Manjili等人(Manjili MH， et al. Development of a recombinant HSPllO-HER-2/neu vaccine using the chaperoning pr叩erties of HSP110. Cancer Res. 2002 ， 62 (6) : 1737-1742.) 己經利用熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)的分子佐劑性質發展了一個 重組的HSPllO-HER2疫苗。從腫瘤組織中純化的HSPs有結合腫瘤特異性肽的優 點，HSP能作為有效的疫苗來殺滅同一來源的腫瘤。這種疫苗的臨床應用需要足 夠量的臨床手術標本來純化HSPs，因此限制了這種方法的應用。使用重組的HSP 通過熱休克和重組的腫瘤蛋白抗原結合制備類似腫瘤來源的HSPs可以克服這種 缺陷。HSPllO能有效地和大分子量蛋白結合，例如HER2通過熱休克方法形成天 然的HSPllO和HER2胞內段的復合體。應用HSPllO-ICD復合體免疫能激發ICD 特異性的CD8+和CD4+T細胞反應。和單獨應用ICD相比，HSP110-ICD顯著地增 強了 ICD特異性的抗體反應，而且沒有檢測到抗HSPllO的CD8+T細胞或抗體。 使用HSPllO制備大分子量蛋白的分子伴侶復合體的設計是以蛋白為靶點的腫瘤 疫苗的新進展。
我們設計的腫瘤疫苗目的是通過特異性細胞毒效應(CTL)來治療乳腺腫瘤。 這種免疫治療制劑是將人HSP110與HER2/neu ICD非共價偶聯在一起，HER2/neu 胞內區蛋白的相對分子量大，所含的抗原表位多，比抗原肽分子的免疫原性明顯 增強。因此HER2/neu胞內區蛋白經過抗原遞呈細胞(APC)加工后，會提供更多 的T細胞作用靶點，是一種有潛力的腫瘤蛋白疫苗。
雖然有人曾利用大腸桿菌系統成功地表達了 HER2/neu ICD,但由于表達產 物通常在宿主細胞內形成包涵體，所以致使產物的收率很低，或者純化困難，易 于污染內毒素，往往難于適應研究的需要。因此，有必要建立和發展重組表達和 純化HER2/neu ICD的方法，以便滿足實驗室研究的需求，并為腫瘤的治療與預
4防大量提供這類免疫治療制劑。
甲基營養酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是己被深入研究的真核表達系統，并 己被用于表達許多有用的蛋白質。例如，美國專利5,324,639公開了在甲基營養 酵母特別是巴斯德畢赤酵母細胞中生產胰島素樣生長因子1的方法；美國專利 5,330,901公開了使用巴斯德畢赤酵母系統表達人血清白蛋白的方法；美國專利 5，965,389提供了在甲基營養酵母中表達L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構建 體以及由之制備純的GAD65的方法；美國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達血 小板衍生的細胞因子(PDGF)的方法；美國專利6，780，615描述了使用重組巴斯 德畢赤酵母生產應樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關于使用巴斯德畢赤酵 母生產人HER2/neu ICD的報道。
發明目的
本發明的一個目的是提供一種使用甲基營養酵母生產重組人HER2/neu ICD 多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母， 其中所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構建體轉化 的(l)甲基可誘導的轉錄啟動子；(2)編碼her2/neu ICD的DNA片段；(3)轉 錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少100mg/L培養基的濃度生產HER2/neu ICD多肽。
本發明的另一個目的是提供用于表達重組人HER2/neu ICD的甲基營養酵 母，該酵母能夠依靠甲醇作為碳源和能源生長，并且是被包括甲基可誘導的轉錄 啟動子、編碼HER2/neu ICD的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志的DNA構建 體轉化的。
本發明的再一個目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人HER2/neu ICD多肽的DNA構建體，該構建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導的轉錄 啟動子、編碼her2/neu ICD的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志。
本發明的再一個目的是提供使用巴斯德畢赤酵母大規模生產重組人 HER2/neu ICD多肽的優化的發酵培養條件，特征在于其中發酵溫度維持在28°C 30°C、所使用的pH值為4.4、發酵液的DO值(溶解氧)保持在25% 30%、并且 培養基中添加有0.5% (W/V)的蛋白胨。
圖1以質粒PCMV (該質粒為包含人HER2/neu全長cDNA的真核表達質粒)為模板，PCR克隆人力er^/77e" /O 基因，產物經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中泳道1、 2為力er^/z7ei/ /6 PCR擴增產物，泳道3為DNA分子量標志物。
圖2顯示重組質粒pPICZ a /力e7^/77ei/ /G9轉化酵母菌的PCR鑒定電泳圖譜。其中泳道1是DNA分子量標志物；泳道2是空質粒載體轉化的酵母菌基因組DNA的PCR產物；泳道3 8是不同酵母菌轉化子基因組DNA的PCR擴增產物。
圖3顯示純化的rhHER2/neu ICD的Western印跡分析結果。其中泳道1、2是本發明制備并純化的rhHER2/neu ICD樣品。
圖4顯示在不同pH值的培養基中誘導表達外源蛋白時的電泳圖。泳道1、 2、3、 4分別為pH4.0、 pH4.4、 pH4. 8、 pH5.2時的表達上清。
圖5顯示純化的rhHER2/neu ICD蛋白質的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。其中泳道1為純化的rhHER2/neu ICD蛋白，泳道2為分子量為66KDa的蛋白標志物。
發明內容
本發明涉及蛋白質生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達HER2/neu ICD的方法。
畢赤酵母表達宿主菌，于20世紀80年代初開發獲得，大多數應用宿主菌是通過對野生型石油酵母Y_11430進行突變改造而來，也就是在組氨酸脫氫酶基因處有一突變，用于轉化后的篩選。 一般用于外源基因表達的巴斯德畢赤酵母菌株包括Y-11430、 M-6100-3 、 GS115、 KM71、 SMD1168 、 X-33等。畢赤酵母中有兩個基因編碼乙醇氧化酶，即A0X1和A0X2。細胞中大多數的乙醇氧化酶是由A0X1編碼的。甲醇高度調控和誘導A0X1基因的表達，在甲醇培養的細胞中，A0X1表達產物占可溶性蛋白總量的30%。而A0X2基因盡管與AOX 1基因同源性達97%，但表達量遠低于A0X1基因。當A0X1基因缺失只存在A0X2基因時，大部分的乙醇氧化酶無法表達，細胞在甲醇培養基上生長緩慢，這種菌株表型為Muts(Methanol utilization slow);相反地A0X1基因存在時，細胞利用甲醇能力強，
6在甲醇培養基上生長快，表型為"1^+ (Methanol utilization plus)。本發明優選的是巴斯德畢赤酵母X-33菌株。X-33表達宿主菌由一個外源基因表達框和AOXl啟動子、多克隆位點(MCS )和一個從A0X1基因上拷貝下來的終止序列(TT)組成。另外，本宿主菌還含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色體的A0X1部位的AOXl 3'非編碼區序列。
用于本發明的巴斯德畢赤酵母X-33菌株含有典型高等真核生物的許多翻譯后修飾功能。這些功能包括信號肽的加工、蛋白質折疊、二硫鍵的形成、0-及N-型糖基化和乙酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白質的糖基化鏈參與細胞識別、激素受體結合、蛋白質定位及宿主與微生物間相互作用。糖基化過程是經一系列剪接并產生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)組成的寡核糖的反應。巴斯德畢赤酵母能夠將碳水化合物連接到分泌表達的外源蛋白質上。巴斯德畢赤酵母修飾糖鏈的平均長度為8 14個甘露糖，而且外鏈不含a-l，3甘露糖，所以其表達的糖蛋白特別適于治療應用。
由于巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白非常少，并且培養基中不含其他的蛋白質，這樣分泌的外源蛋白占了培養液中總蛋白的絕大部分，因此十分有利于外源蛋白的分離和純化。因此分泌表達外源蛋白是一種理想的方式。為了達到此目的，本發明優選的信號肽是a因子信號肽。a因子信號序列由87個氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S.cerevsia)的a性成熟因子前導序列，并且已將這段序列編碼的信號肽插入到巴斯德畢赤酵母的表達載體中。
巴斯德畢赤酵母表達載體可以是胞內表達的，也可以是分泌表達的。這些載體都包括一個由0. 9 kb的5' A0X1序列片段和約0. 3 kb的轉錄終止基因的3'序列組成的表達盒。分泌型表達載體可以是pPIC9、 pPIC9k、 pHIL-Sl、 pPICZci、pYAM75P6E6等；胞內表達的載體可以是pHIL-D2、 pA0815、 pPIC3K、 pPICZ、pHW010E121、 pGAPZ、 pGAPZa等。因此我們所以本發明優先選擇分泌型、高拷貝標記和易操作的穿梭載體，特別是pPICZ a作為HER2/neu ICD多肽的表達載體。本發明所使用的載體是由啟動子、終止子、選擇標記、報告基因、復制起點等元件構成。
表達載體均不含酵母復制原點，導入酵母內的重組表達載體只有和酵母染色體上的同源區發生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩定存在。本發明中，為了穩定地表達目的基因，可以在His或5'A0Xl的單酶切位點將質粒載體線性化(Sacl)，使之通過單交換整合到酵母細胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲醇利用能力的轉化子。另外由于在His位點整合時，染色體突變的His位點可與表達盒的HIS4基因位點之間發生基因交換會導致表達盒的丟失，故一般優先選擇A0X1位點。
得到攜帶力e2么/y7e〃 JO 基因的重組表達載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質球法和電穿孔法等方法轉化巴斯德畢赤酵母宿主細胞。其中，本發明優選的轉化方法是電轉移法(參見Sambrook， ed. Molecular Cloning: A LaboratoryManul (2nd. ed.), Vols. 1-3， Cold Spring Harbor Laboratory (1998))，因為其相對于其他轉化方法最為方便、快捷，需要幾個微克的質粒即可。
由于本發明中充分優化了溶解氧水平、通氣量、發酵pH值、攪拌速率、營養補給等培養條件，所以可使酵母菌高密度生長，從而導致產物的高效表達。例如，在發酵罐培養條件下，本發明的重組HER2/neu ICD蛋白表達產量可達到500mg/L。
絕大多數情況下，巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)中整合多拷貝外源基因會提高重組蛋白表達產量，所以本發明優先選擇分泌型、高拷貝標記和易操作的穿梭載體，特別是pPICZa作為HER2/nen ICD蛋白的表達載體。
另外，由于在His位點整合時，染色體突變的His位點可與表達盒的HIS4基因位點之間發生基因交換會導致表達盒的丟失，故一般優先選擇A0X1位點。
本發明中，發酵培養所使用的培養基可以是BMGY/B羅Y、 BMG/B薩、MGY/MMY等培養基，但優選的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培養基。
作為唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般為培養體積的0. 5-1. 0%(V /V)。
發酵培養過程中，可使用已知的方法檢測由被轉化細胞分離物所產生的HER2/neu ICD多肽含量，并從中選擇有高產率的細胞分離物，用于放大生產。
本發明首次在酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達了HER2/neu ICD，建立了穩定的rhHER2/neu ICD畢赤酵母高效表達體系。與在大腸桿菌中的表達相比，本發明的方法具有如下特點①表達體系穩定，含目的基因的表達盒通過同源重組整合進入酵母的染色體中，菌種穩定，不存在質粒丟失的問題；②有效的分泌表達，目的蛋白質的表達受醇氧化酶啟動子的嚴格控制，可在甲醇誘導下啟動表達并將表達產物分泌到培養基中，而且畢赤酵母本身的蛋白很少分泌到培養基中，使目的蛋白更易于純化；③表達產量高，rh服R2/neuICD在畢赤酵母中的搖瓶規模表達量可高達100mg/L，在發酵罐中大規模高密度發酵培養時可達到500mg/L;④不存在內毒素污染問題；⑤大規模發酵生產成本低。
在HER2/neu ICD純化方面，目前大多采用DEAE陰離子交換層析或者親和層析。眾所周知，內毒素是由脂蛋白和多糖組成的，通常帶有負電荷，而核酸也帶負電荷，因此使用陰離子交換層析方法容易造成內毒素和核酸等雜質的污染。因為HER2/neu ICD的等電點約為5. 3，所以本發明采用pH3. 8條件下進行陽離子交換層析可很好的避免核酸和內毒素的污染。
本發明建立了在酵母中高效分泌表達rhHER2/neu ICD的方法，同時建立了陽離子交換層析技術純化rhHER2/neu ICD產物的方法。使用SDS-PAGE、 Western印跡分析證實按照本發明方法生產的rhHER2/neu ICD與天然HER2/neu ICD具有相同的理化性質，從而為進一步檢測其體內外生物學活性提供了必要條件。
在以上研究的基礎上，本發明進一步探討了畢赤酵母工程菌大規模發酵(80L發酵罐)方法，優化了利用酵母菌大規模發酵產生rhHER2/neu ICD的條件，以及適合大規模生產的產物純化方法。其中所使用的優化條件包括發酵溫度維持在28"C 3(TC、所使用的pH值為4.4、發酵液的DO值(溶解氧)保持在25% 30%、并且培養基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。
結果顯示，本發明建立的畢赤酵母工程菌大規模發酵生產rhHER2/neu ICD的表達率約為500mg/L發酵液、產物回收率約為75%、產物的純度達約85%。本發明的這些研究結果無疑將為重組人HER2/neu ICD的工業化生產和臨床應用提供必要的基礎。
具體實施例方式
以下借助實施例描述本發明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。實施例1: rhHER2/neu ICD畢赤酵母分泌型表達載體pPICZ a // eri//7ew /G9的構建和宿主細胞轉化
以質粒PCMV (包含人HER2/neu全長cDNA的真核表達質粒)為模板，采用PCR法克隆her2/neu ICD。上游引物5， 一TTACTCGAGAAGAGAAAGCGACGGCAGCAG -3， (SEQIDN0: 1)引入酵母a因子信號肽的部分序列和XhoI位點，并利用下游 引物5， — CTATCTAGATCACACTGGCACGTCCAGACC -3， (SEQ ID NO: 2)引入XbaI 位點。PCR條件為94。C變性4min; 94。C變性30s、 58。C退火30s、 72。C延伸 2.5min30個循環；72"C再延伸10min。對擴增產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分 析，觀察片段大小，確定是否得到正確目的基因。PCR引入上述序列和酶切位點 后，回收目的片段。用相應酶切后，連入用同樣酶切后的質粒pPICZa，構建畢 赤酵母表達載體pPICZ a /力er^/77e〃 然后轉化大腸桿菌，提取質粒并進行
酶切鑒定和DNA序列測定分析。核酸測序結果顯示her2/neu ICD的第1483個 堿基由g突變為c，氨基酸由丙氨酸Ala (gcc)突變為脯氨酸Pro (ccc)。
設計一對引物(SEQ ID NO: 3)CACTCTGGAAAGGGCCAAGACTCTCTCCCC， (SEQ ID NO: 4) GGGGAGAGAGTCTTGGCCCTTTCCAGAGTG將突變位點設計在引物上，按照兩步PCR 體外定點突變重疊延伸法進行.設計攜帶突變堿基的中間引物(NO: 3， NO: 4) 分別與端引物(NO: 1， NO: 2)進行擴增第一步.取第一步擴增產物I， II做瓊 脂糖凝膠電泳分別進行回收，各取2 UL互相作為模板，用端引物(NO: 1， NO: 2)在相同條件下再次進行PCR擴增。擴增片段上含有所需要的突變位點，最后 經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收的PCR產物與質粒pPICZ a分別經Xhol和Xbal酶消 化，pPICZd的酶消化產物去磷酸化并經0.8y。瓊脂糖凝膠電泳回收特異片段，用 T4DNA連接酶連接。
取測序正確的培養菌液，按質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA并用瓊脂糖 凝膠電泳法進行定量分析。取20 25 ii g pPICZ a /^ri//7e" /C"重組質粒經Sacl 酶消化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質粒用10ul超 純水溶解后置冰上備用。
從畢赤酵母X-33的YPD陰性培養板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取 單個菌落，接種于5mlYPD培養基中，250r/min， 30。C震蕩培養8小時，以常規 制備酵母感受態細胞。
然后取80 y 1上述感受態菌，與20 25 u g線性化的重組表達質粒混合，移 入0.2cm電轉化杯內進行電轉化。取50 100u 1轉化后的菌液涂布于含Zeocin (100ug/ml)的YPD平板上，3(TC培養箱培養2 3天，觀察轉化子的生長狀況。
10然后用PCR方法(所使用引物和反應條件同上)篩選轉化酵母菌。離心回收菌 體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進行PCR鑒定，鑒定結果如附圖2所示。
實施例2: HER2/neu ICD蛋白的表達
取上述鑒定結果陽性的克隆接種于10ml BMGY(pH6.0)培養基中，30。C震蕩 培養24小時，至OD,達到2. 0 6. 0時收集細胞。用等體積(10ml) BMMY(p朋.0) 重懸細胞沉淀，3(TC震蕩培養，誘導表達。誘導過程中，每24小時補充一次甲 醇至終濃度0.5%，同時補充滅菌超純水，使發酵液總體積保持不變。在培養的 第0、 24、 48、 72、 96和120小時等時間點各取0.5ml發酵液，離心取上清用于 蛋白質分析(SDS-PAGE， Western Blot分析等)。
實施例3: HER2/neu ICD蛋白的理化性質鑒定
(1) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
用SDS-PAGE法進行蛋白質分子量測定和初步定量分析。方法如下 配制10%分離膠5%濃縮膠。分別取第48小時培養物上清按4:1比例加入5 XSDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸3 5分鐘。取上述樣品，冷卻至室溫后，離 心(10000r/min) 30秒，取上清每孔加樣20ul。 40V電泳至濃縮膠與分離膠交 界處，調整電壓到IOOV，繼續恒壓電泳分離。考馬斯亮藍染色并脫色后，觀察 分析結果。
(2) 表達產物的Western印跡分析 按照常規方法將發酵液上清經SDS-PAGE后，轉印到硝酸纖維素(NC)膜上，
室溫干燥30 60分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0.2%牛 血清白蛋白(BSA)的TTBS (lOOmMTris 0. 9%Nacl 0. l%Tween20))，室溫輕輕 振蕩2 3小時或4'C封閉過夜。封閉結束后，將NC膜放入雜交袋中按O. lml抗 體溶液/cm2膜加入兔抗人HER2/neu ICD抗體，室溫振蕩1 4小時。膜用TTBS 漂洗3 5次后，用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體至1:200 1:1000，加入雜交袋中，與NC膜一起室溫振蕩2 4小時。加入lml 0. 3% (W/V) NiCl或CoCl2及10ul 30%&02溶液。洗膜后，將膜移入顯色液中，室溫下輕輕 搖動并觀察顯色反應。結果如附圖3所示。
11實施例4: HER2/neu ICD的大規模發酵制備及純化 (1)最佳pH值的確定
選取表達量較高的rhHER2/neu ICD畢赤酵母工程菌，在10ml YPD培養基中 30°C、 250r/min震蕩培養約24 36小時。分別取上述未加緩沖液的BMGY 8ml， 按下示的量加入lmol/L Na2HP0jB 0. 5mol/L檸檬酸，以配制成不同pH值的BMGY。 混勻后各加入lml畢赤酵母工程菌，30°C、 250r/min震蕩培養約30小時，使其
0D600"5。
pH值 lmol'L—1 Na2HP04 (u 1) 0. 5mol.L—1檸檬酸(u 1)
2.2 20 980
2.4 62 938
2.6 109 891
2.8 158.5 841.5
3.0 205.5 794.5
3.2 247 753
3.4 285 715
3.6 322 678
3.8 355 645
4.0 385.5 614.5
4.2 414 586
4.4 441 559
4.6 467.5 532.5
4.8 493 507
5.0 515 485
5.2 536 464
室溫離心(3000r/min) 5分鐘，棄去上清，并在菌體沉淀物中加入不含緩 沖液的B應Y 8ml。然后按如上所示的量加入lmol/LNa2HP04和0. 5mol/L檸檬酸， 以配制成不同pH值的BMMY， 30°C、 250r/min震蕩培養。誘導表達過程中，每 24小時補充一次甲醇至終濃度0.5%，同時補充滅菌去離子水，使發酵液總體積 保持不變。在培養的第0、 24、 48、 72、 96和120小時等時間點各取0. 5ml發 酵液，離心收集上清進行蛋白質定量分析(SDS-PAGE法)，結果如附圖4所示。(2)其他發酵條件的優化
1)將凍存的工程菌在YPD瓊脂(含Zeocinl00yg/ral)板上30。C劃線培養。至 菌落直徑達到2mra左右，挑取單克隆菌落加入到10ml YPD培養液(種子培養基) 中，30°C、 250r/min震蕩培養16 24小時。然后將上述培養物加入到YPD培養 液(2L)中，30°C、 250r/min震蕩培養約24小時，0D,達到10左右。
2) 生物量的積累
配制30L FM21培養基，加入80L發酵罐中，高壓滅菌(12rC， 30分鐘)。 待發酵罐內培養基冷卻到室溫時，用氨水調節FM21培養基的pH至所需數值，而 后加入36. 75ml PTM1微量元素混合物和13. 5ml生物素貯備液。在發酵罐中加入 2升上述培養的菌液，開始進行第一階段發酵罐培養(即甘油培養擴增菌體階段)。 此階段培養溫度為3(TC、攪拌速度500r/min，罐內壓力10psi， DO值(溶解氧) 維持在20%以上，必要時通入純氧。在此階段，每天至少取樣2次，測006。。和細 胞濕重，分析酵母菌生長狀態，肉眼和鏡下觀察菌液。排除雜菌污染，并留取上 清用于蛋白分析。約24小時后DO值上升至接近100%，表明培養基中甘油已消 耗殆盡。此時即轉入補充甘油階段，以進一步增加菌體密度。按照每升12ml PTM1 微量元素的比例在高壓滅菌后的50%甘油中加入PTM1微量元素。混勻后，將此 混合物以18. 2ml/h/L初始發酵液(即546ml/h)的速率加入到發酵罐中，至菌 體濕重達到180 220g/L。 DO值上升至接近100%后，繼續維持"甘油饑餓"狀 態30分鐘，然后進入甲醇誘導表達階段。
3) 甲醇誘導rhHER2/neu ICD的合成
按照12ml/L的比例，在甲醇中加入PTM1微量元素，混勻后，以3.6ml/h/L 初始發酵液(即108ml/小時)的速率加入到發酵罐中誘導表達。維持此低速率2 3小時，以使酵母逐漸適應以甲醇為唯一碳源的成長環境。DO值由波動較大變為 相對穩定后，繼續維持此低速率并補加甲醇l小時。
然后加大補充甲醇的速率(7. 2ml/h/L)，并將此速率維持2小時后將速率繼 續增加至10. 9ral/h/L。同時，監測DO值和發酵液溫度并判斷甲醇是否過量。若 停止補充甲醇后的DO值在l分鐘內上升幅度大于10y。，說明碳源受限，反之說 明甲醇過量。在碳源受限的情況下，須加快補充甲醇的速率；如果甲醇過量則應 調慢補甲醇的速率。開始誘導表達后，每隔6小時取樣，檢測0De。。和細胞濕重，借以分析酵母菌 的生長狀態。此期間留取培養物上清，用于蛋白定量分析。連續誘導發酵72小 時后，結束發酵。
(3) rhHER2/neu ICD的純化
70 L發酵液離心取上清，用冰醋酸調pH至3. 8，添加NaAc-HAc緩沖液(終 濃度為20 mmol/L)和去離子水稀釋后，通過預先用緩沖液A(20 mmol/L NaAc-HAc， pH 3.8)平衡過的S印harose SP陽離子交換柱。然后連續加樣，加樣后用3倍 于柱體積的緩沖液A洗柱。用緩沖液B (20 mmol/L NaAc-HAc加0. 5 mol/L NaCl， pH3.8)洗脫。洗脫液用3000 (3K)中空纖維柱除鹽和濃縮。
SDS-PAGE分析結果顯示，如此純化的rhher2/neu ICD至少達到電泳純，且 產物的的收率和純度分別達到約75%和85% (參見附圖5)。
(4) 實驗結果
1) 發酵液pH值對rhHER2/neu ICD發酵產量的影響
觀察了在大規模條件下pH值對rhHER2/neu ICD產率的影響，發現在pH值 4.4條件下，發酵的第54小時表達量即達到最高峰。繼續延長發酵時間，目的 蛋白的表達量逐漸減少，雜蛋白條帶增加。
2) 溶解氧對rhHER2/neu ICD發酵表達產量的影響
在發酵過程中，發酵液的DO值(溶解氧)應保持在25% 30%之間。溶解氧 過高對rhHER2/neu ICD的表達沒有任何有利的影響，反而會增加生產成本。
3) 溫度對rhHER2/neu ICD發酵表達產量的影響
畢赤酵母的最佳生長溫度為3CTC，溫度升高達到32'C對畢赤酵母是致命的。 有時降低發酵溫度可增加目的蛋白的產量。有報道稱在甲醇誘導階段，溫度從 30°C降至25°C ，可使克隆到巴氏畢赤酵母中的半乳糖氧化酶的產量增加4倍。 對于rhHER2/neu ICD，在28°C的溫度下發酵取得了很好的效果。
4) 甲醇流加速度對rhHER2/neu ICD發酵表達的影響
雖然畢赤酵母可以以甲醇為唯一碳源生長增殖，但甲醇對畢赤酵母菌而言仍 是一種有毒物質，因此其在培養基中的濃度一般不得高于2%。本研究發現，在 流加甲醇進行誘導時，盡管在一定范圍內目的蛋白質的表達量與甲醇消耗量呈正 相關，但是甲醇的流加速度并非越快越好。就發酵表達rhHER2/neu ICD而言，
14以甲醇的最終流加速度為10.9ml/h/L初始發酵液體積為宜，甲醇流加速度過低 會延長誘導時間，增加雜蛋白的污染；甲醇流加速度過高也會導致表達量下降和 雜蛋白增加。
15序歹"表
〈110〉吉林圣元科技有限責任公司
〈120〉用甲基營養酵母生產重組人表皮生長因子受體2胞內區的方法
<140> 〈141〉 <160>4 <210> 1 〈211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223〉根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。 <400〉 1
TTACTCGAGA AGAGMAGCG ACGGCAGCAG
〈210〉 2 <211> 30 〈212>腿 〈213〉人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PC財廣增引物。 <400〉 2
CTATCTAGAT CACACTGGCA CGTCCAGACC
<210〉 3 〈211> 30 〈212〉腿 <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作定點突變的PC財廣增引物。 <400> 3
CACTCTGGAA AGGGCCAAGA CTCTCTCCCC
<210> 4
<211> 30 <212>醒 <213>人工序列 <220>
<223>根據特定核苷酸序列設計的用作定點突變的PCR擴增引物。 <400> 4
GGGGAGAGAG TCTTGGCCCT TTCCAGAGTG
1權利要求
1、一種使用甲基營養酵母生產重組人her2/neu ICD蛋白的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導的轉錄啟動子；(2)編碼人her2/neu ICD的DNA片段；(3)轉錄終止子和(4)可選擇標志，從而以至少100mg/L培養基的濃度得到重組人her2/neu ICD蛋白。
2、 根據權利要求l的方法，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。
3、 用于表達重組人her2/neuICD的甲基營養酵母培養物，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且該酵母是被包括甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼人her2/neu ICD的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志的DNA構建體轉化的。
4、 用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人her2/neu ICD蛋白的DNA構建體，該構建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導的轉錄啟動子、編碼人her2/neuICD的DNA片段、轉錄終止子和可選擇標志。
5、 根據權利要求4的構建體，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。
6、 使用巴斯德畢赤酵母大規模生產重組人her2/neu ICD蛋白的優化的發酵培養條件，特征在于其中發酵溫度維持在28'C 3(TC、所使用的pH值為4.4、發酵液的DO值(溶解氧)保持在25% 30%、并且培養基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。
7、 純化her2/neuICD的方法，特征在于使用陽離子交換層析技術分離。
全文摘要
本發明涉及蛋白質的生產、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人her2/neu ICD，以及優化的大規模工業化發酵生產和純化重組人her2/neu ICD的方法。
文檔編號C12N15/12GK101492675SQ20081005027
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月21日 優先權日2008年1月21日
發明者煌 徐, 冬 韓, 顏煒群 申請人:吉林圣元科技有限責任公司