專利名稱：東北野生大豆s-腺苷甲硫氨酸合成酶sams基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及現代分子生物學與基因工程技術，具體說就是一種東 北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因。
背景技術：
隨著DNA的內部結構和遺傳機制的秘密一點一點呈現在人們 眼前，特別是當人們了解到遺傳密碼是由RNA轉錄表達的以后，生 物學家不再僅僅滿足于探索生物遺傳的秘密，而是開始躍躍欲試，設 想在分子的水平上去干預生物的遺傳特性。如果將一種生物的DNA 中的某個遺傳密碼片斷連接到另外一種生物的DNA鏈上去，將DNA 重新組織一下，就可以按照人類的愿望，設計出新的遺傳物質并創造 出新的生物類型，這與過去培育生物繁殖后代的傳統做法完全不同。隨著工業現代化、灌溉地和塑料大棚面積的擴大，土壤次生鹽漬 化也日趨嚴重，以鹽堿為例，全國有鹽堿地近15億畝，僅黑龍江省 鹽堿地就高達9000余萬畝，全國有2000多萬公頃鹽堿荒地等待開墾 利用。因此如何通過提高作物抗滲透脅迫能力來充分利用鹽堿地資源 增加耕地面積，增加糧食產量和節約水資源，已成為挖掘逆境農業生 態區的生產潛力、保持我國農業持續高效發展、解決糧食安全亟待解 決的重大問題。近年來現代分子生物學與基因工程技術發展迅猛，為 通過轉基因技術培育耐鹽堿轉基因作物，改良鹽堿地展示了美好的發 展空間，克隆具有自主知識產權的新基因是其重要前提。發明內容本發明的目的是公開一種從抗逆性極強的東北野生大豆中克隆 出來的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,簡 稱SAMS)基因，具有較強耐鹽堿、低溫、抗干旱的功能，是培育耐 鹽堿、低溫、干旱轉基因植物的重要功能基因。本發明的目的是這樣 實現的1. 東北野生大豆EST的篩選東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆是通過篩選東 北野生大豆鹽脅迫cDNA文庫及EST庫，經過cDNA序列與NCBI 等網上數據庫進行同源性比對，篩選滲透脅迫相關基因。2. 東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆采用RT-PCR的方法，獲得到1178bp的片段。通過分析其氨基 酸序列，編碼392個氨基酸，ORF査找具有完整的開放閱讀框。初 步確定已經克隆得到了東北野生大豆的《X4MS基因，命名為G^X4MS， 將其DNA序列提交GenBank，登錄號為EU145721 。3. C^&4MS基因的功能分析構建Gs&^必基因植物表達載體，對模式植物煙草進行轉化， 獲得整合Gs&^必基因的煙草植株，進行了分子生物學檢測，包括 PCR檢測、Southern-blot檢測和RT-PCR檢測；對轉基因煙草進行了 抗逆性分析，包括與耐鹽堿、低溫及干旱能力相關的生理指標(不同 條件處理下葉綠素含量、丙二醛含量、電導率、脯氨酸含量、超氧化 物歧化酶活性)測定。結果表明轉G^5^W5"基因煙草植株在不同的 脅迫處理條件下的各項生理指標不同程度的優于未轉基因煙草對照， 并表現明顯的抗性。證明GW^l必具有提高植物耐鹽堿、低溫及干旱 的功能。本發明所述的東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基 因，該基因包括1178bp的開放讀碼框，編碼392個氨基酸，有ATG 起始密碼子和TAA終止密碼子。本發明所述的東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基 因，其核苷酸序列及氨基酸序列見序列表l。來源于東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS，簡稱 6^54^5)基因是一種具有抗滲透脅迫功能的基因，尤其對鹽脅迫的抗 性較為明顯。因此為植物抗滲透脅迫基因工程提供了新的基因資源。 通過對轉基因煙草的抗逆性檢測，證明C^&4MS基因具有顯著的耐鹽 堿能力，對低溫和干旱也表現出較強的抗性。是培育抗滲透脅迫轉基 因作物的較理想基因。
圖1為轉G^S^WS基因煙草PCR檢測結果；圖2為轉GsSAMS基因煙草Southern檢測結果；圖3為轉GsSAMS基因煙草RT-PCR檢測結果； 圖4為野生大豆C^S^MS基因PCFl擴增結果；具體實施方式
下面結合附圖對本發明作進一步說明1. 東北野生大豆ESTs篩選根據東北野生大豆鹽脅迫cDNA文庫及EST數據庫，篩選EST得 到與滲透脅迫直接相關的cDNA序列，將cDNA序列與NCBI等網上數 據庫進行同源性比對，從中篩選滲透脅迫相關基因。2. 東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆采用RT-PCR的方法，獲得到U78bp的片段。圖4是SAMS基 因PCR擴增的電泳結果，其中M: DL2000 marker 1、 2、 3、 4:退 火溫度分別為52°C、 54°C、 56°C、 58°C。PCR擴增的引物序列為GsSAMS UP: 5'- AgA Tgg CAg AgA CAT TCC T -3'GsSAMS5'- TgC ACC TTT CAA TAC CTA TAA -3' DOWN:根據測序及序列分析，得到了具有完整的開放閱讀框的基因命名 為G^SL4il必；基因的全長DNA序列及氨基酸序列見序列表2。序列表l:1ATGGCAGAGACATTCCTATTTACCTCAGAGTCGGTGAACGAGGGACACC CTGACAAGCTC1 MAETFLFTSESVNEG H P D K LCAGACAGCAAA21 CDQISDAVLDACLEQ D P D S K121GTTGCCTGCGAAACATGCACCAAAACCAACTTGGTCATGGTCTTCGGAG AAATCACGACC41 VACETCTKTNLVMVF G E 工T T181AAGGCCAACGTTGACTACGAGAAGATAGTGCGTGACACCTGCAGGAACA TCGGCTTCGTC61 KANVDYEKIVRDTCR N I G F V241TTGAGCAGCAG 81 S NN 工 E Q QDVGLDAGNCKVLV301AAGAAATTGGT 101 S PP E E I GDAQGVHGHLTKK361GCTGGTGACCAGGGTCACATGTTTGGCTATGCCACTGATGAAACCCCTG AATTGATGCCA121 AGD(2GHMFGYATDET P E L M P421GCAAGAACGGT141 LSHVLATKLGARLTE V R K N G481ATTACAATGAC161 TCPWLRPDGKTQVTV E Y Y N D541AACACGACGAG181 NGARVP工RVHTVLIS T <2 H D E601AGCCTGTGATC201 TVTNDEIAADLKEHV I K P V I661GCCGTTTTGTC221 PEKYEDEKTIFHLNP S G R F VTCGATACTTAT241 工GGPHGDAGLTGRKI 工ID T Y781CCAAGGTTGAT261 GGWGAHGGGAFSGKD P T K V D841AGGAGTGGTGCTTACATTGTGAGACAGGCTGCTAAGAGCATTGTGGCAA GTGGACTTGCC281 RSGAYIVRQAAKSIV A S G L A901AGAAGGTGCATTGTGCAAGTGTCTTATGCCATTGGTGTGCCTGAGCCTT TGTCTGTGTTT301 RRCIVQVSYAIGVPE P L S V F961GTTGACACCTATGGCACTGGGAAGATCCATGATAAGGAGATTCTCAACA TTGTGAAGGAA321 VDTYGTGKIHDKEIL N I V K E1021GGGGTGGAAAT341 NFDFRPGMISINLDL K R G G N1081CTGACTTCACA361 NRFLKTAAYGHFGRE D P D F T1141 TGGGAAGTGGTCAAACCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTAA 381 WEVVKPLKWEKP序列表2:1ATGGCAGAGACATTCCTATTTACCTCAGAGTCGGTGAACGAGGGACACC CTGACAAGCTC1 MAETFLFTSESVNEG H P D K L61CAGACAGCAAA21 CDQISDAVLDACLEQ D P D S K121AAATCACGACC41 VACETCTKTNLVMVF G EIT T181AAGGCCAACGTTGACTACGAGAAGATAGTGCGTGACACCTGCAGGAACA TCGGCTTCGTC61 KANVDYEK工VRDTCR N I G F V241TTGAGCAGCAG81 S N D VN工E Q QGLDAGNCKVLV301AAGAAATTGGT101 SP DP E EI GAQGVHGHLTKK361GCTGGTGACCAGGGTCACATGTTTGGCTATGCCACTGATGAAACCCCTG AATTGATGCCA121 AGDQGHMFGYATDET P E L M P421GCAAGAACGGT 141 L SV R K N GHVLATKLGARLTE481ATTACAATGAC 161 T CE Y Y N DPWLRPDGKT(2VTV541AATGGTGCCAGGGTTCCTATTCGTGTACACACCGTGCTAATCTCCACCC AACACGACGAG181 NGARVPIRVHTVLIS T <2 H D E601AGCCTGTGATC201 TVTNDEIAADLKEHV I K P V I661GCCGTTTTGTC221 PEKYLDEKTIFHLNP S G R F V721TCGATACTTAT241 IGGPHGDAGLTGRK工 II D T Y781GGAGGATGGGGTGCTCATGGTGGTGGTGCTTTCTCCGGGAAGGACCCTA CCAAGGTTGAT261 GGWGAHGGGAFSGKD P T K V D281 RSGAYIVRQAAKS IVA SG L A901TGTCTGTGTTT 301 R R CP L S V F961GTTGACACCTATGGCACTGGGAAGATCCATGATAAGGAGATTCTCAACA TTGTGAAGGAA321 VDTYGTGKIHDKEIL N I V K EV <2 V S Y AG V P E1021GGGGTGGAAAT341 NFDFRPGMISINLDL K R G G N1081AACAGGT T T T TGAAGACT GC T GCC TAT GGACAC T T T GGAAGAGAAGAC C CTGACTTCACA361 NRFLKTAAYGHFGRE D P D F T1141 TGGGAAGTGGTCAAACCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTAA 381 WEVVKPLKWEKP
權利要求
1.一種東北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS基因，其特征在于該基因包括1178bp的開放讀碼框，編碼392個氨基酸，有ATG起始密碼子和TAA終止密碼子。
全文摘要
本發明公開一種從東北野生大豆中克隆的S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS基因，該基因包括1178bp完整的開放讀碼框，編碼392個氨基酸，有ATG起始密碼子和TAA終止密碼子。其耐鹽堿、低溫和干旱的功能驗證是通過轉基因煙草進行，系統地測定了與鹽堿、低溫和干旱相關的生理指標，證明該基因具有提高植物耐鹽堿、低溫和干旱的功能。是一種具有抗滲透脅迫功能的基因，尤其對鹽脅迫的抗性較為明顯。為植物抗滲透脅迫基因工程提供新的基因資源。
文檔編號C12N9/00GK101333534SQ200810064150
公開日2008年12月31日 申請日期2008年3月21日 優先權日2008年3月21日
發明者華 才, 朱延明, 勇 李, 錫 柏, 樊金萍, 巍 紀 申請人:東北農業大學