牛sry基因和酪蛋白檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：牛sry基因和酪蛋白檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因分析檢測產品，更具體的說是適用于檢測牛SRY基因和酪蛋白基因的 試劑盒。
背景技術：
牛胚胎的性別選擇對于養牛業和牛奶生產意義重大。研究表明，SRY基因為母牛特有基 因，而酪蛋白基因則是公、母牛均攜帶的基因。
基因芯片是近幾年在高科技領域內出現的最具時代特征的重大科技進展之一。它是將能 反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產物等)，有序固定 在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團修飾的載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖 維素膜)上形成陣列，通過與實際樣本(或擴增產物)進行雜交反應，只需一次實驗，就可高通 量獲得所有待檢基因的信息。這種平行檢測、高信息通量的特點使其在基因表達、基因多態 性檢測等方面的應用受到廣泛重視。
利用芯片技術高通量地檢測牛SRY基因，將酪蛋白基因作為對照基因同時檢測，可以為 畜牧業育種提供一種準確、價廉的方法。

發明內容
技術問題
本發明的目的在于提供一種用于高通量檢測牛SRY基因和酪蛋白基因的檢測試劑盒。 技術方案
為了實現本發明的目的，本發明提供了一種高通量檢測牛的SRY基因和酪蛋白基因的試 劑盒，試劑盒包含24種擴增管，不少于l張基因芯片，雜交液A和B。還可選擇性的包含陽 性對照和陰性對照，Taq酶以及雜交顯色試劑。
其中，所述的24種擴增管分為兩組，每組12管； 一組擴增管中每管包含以下系列上游 引物(SP1-SP12)之一和公用下游引物(QP):
SP1: 5 ， tgctgctagcatgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ，
SP2: 5， tgcagcatgctagccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3，
SP3: 5， tgcagcaacgttgccgagct cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3 ，
SP4: 5， tgcagctagcatcgcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3，
SP5: 5 ， tgcagctgacatgccgaggt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ，
SP6: 5， tgcagctagcagtccgacct cat ctg taa gcc ttt tec tct ca 3，
SP7: 5， tgcagctggcataccgacga cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3，
SP8: 5， tgcagccagcatgtcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3'
SP9: 5， tcgagctagactgccgacgt eat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3'SP10 SP11 SP12 QP:
5， tgcagcctgattgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' 5' tgcagctagccgtacgacgt cat ctg taa gcc加tec act ca 3， 55 tgcagctacggtaccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 35 ;，aga cca gcc agg ace acg 3，
另一組擴增管中每管包含以下系列上游引物(CP1-CP12)之一和公用下游引物(WP):
CP1
CP2
CP3
CP4
CP5
CP6
CP7
CP8
CP9
CP10
CPU
CP12
WP:
5， tgctgctagcatgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5' tgcagcatgctagccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5， tgcagcaacgttgccgagct ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3 5' tgcagctagcatcgcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3' 5， tgcagctgacatgccgaggt ttt ctt tgt get tag gag cga ta 3' 5， tgcagctagcagtccgacct世ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5， tgcagctggcataccgacga ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5' tgcagccagcatgtcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3' 5' tcgagctagactgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5， tgcagcctgattgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3 ， 5' tgcagctagccgtacgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3' 5' tgcagctacggtaccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5，cac ccc ttt gcc cag aca 3'
上述兩組擴增管中系列上游引物(SP1-SP12和CP1-CP12)均由5'端20nt的編碼序列和 3'端23nt的特異序列組成。
所述的基因芯片是將5'端帶氨基修飾和16聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分AB 二個 區域順序固定于醛基修飾的載玻片上制成的。P1-P12的序列如下
PI: 5 ，NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgctgctagcatgccgacgt 3'
P2: 5 ， NH3 _TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagcatgctagccgacgt 3'
P3: 5' NH3 .tttTTTTTTTTTTTTT tgcagcaacgttgecgagct 3'
P4: 5' NH3 _TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagcatcgcgacgt 3'
P5: 5 ， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctgacatgccgaggt 3'
P6: 5 ， NH3 _TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagcagtccgacct 3'
P7: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctggcataccgacga 3'
P8: 5, NH3畫ttttTTTTTTTTTTTT tgcagccagcatgtcgacgt 3 ，
P9: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tcgagctagactgccgacgt 3'
P10: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagcctgattgccgacgt 3'
Pl 1: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagccgtacgacgt 3'
P12: 5，鵬-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctacggtaccgacgt 3，
以上捕獲探針的序列與相應的上游引物的編碼序列一致。
所述的雜交液A和B中分別含有5'端帶有生物素或熒光基團標記X的識別探針A和B，識別探針A和B的序列如下-
識別探針A: 5，X- agttc gee acc ttt cgt ctt cgt 3， 識別探針B: 5'X- attct gga ggg atg ttt tgt ggg 3，
本發明還提供了一種試劑盒的使用方法，包括以下步驟
(1) 制備多個牛的染色體DNA;
(2) 在試劑盒中每對擴增管中各加入一個牛的染色體DNA作為擴增模板，用聚合酶鏈反 應(PCR)方法擴增牛的SRY基因和酪蛋白基因的基因片段；
(3) 將所得兩組擴增管的擴增產物變性后，分別取一定體積加入雜交液A和B中混勻；
(4) 將上述雜交液A和B分別與基因芯片的捕獲探針A和B陣列雜交；
(5) 檢測基因芯片A和B陣列的雜交信號。
制備用于PCR擴增的染色體DNA的方法有很多，可以從全血中制備、也可以從組織樣 本中制備。具體方法可參閱文獻(丁振諾，蘇明權主編.《臨床PCR基因診斷技術》，世界圖書 出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法擴增染色體基因特定片段的方法己經是本領域公知技術。其中本發明涉及的 擴增體系和擴增程序可根據有關文獻(KB穆里斯，F.費里，R.吉布斯等主編《PCR聚合酶鏈 式反應》，科學出版社)方法由使用者獨立完成。
識別探針A和B在合成時，其5'端帶標記基團，所述標記基團包括伹不限于地高辛分 子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、 Cy5 等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。這些標記及其標記方法以及各標記物的檢 測方法都已是本領域眾所周知的常規技術，也可以參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射 性操作手冊》；J.薩姆布魯克，E.R弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主編，《分子克隆實驗指南》，科學出 版社，1995年；馬立人，蔣中華主編，《生物芯片》，北京化學工業出版社，2000， 1-130。
擴增產物的變性可采用常規變性方法如加熱至94 98。C，并保溫2 10min，然后迅速置 冰上。
雜交液與基因芯片雜交時，可以先將基因芯片與預雜交緩沖液進行預雜交。
本發明擴增產物與基因芯片之間的固相雜交按照本領域的經典方法進行，本領域一般人 員依據經驗容易確定有關緩沖液、探針和樣品濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最 適條件。或者也可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.薩姆布魯克，E.F. 弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主編，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，1995年。
然后根據標記信號在基因芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。本發明所述檢測基 因芯片雜交信號的方法是基于與抗生物素抗體或親合素或鏈親合素復合在一起的堿性磷酸酶 或辣根過氧化物酶催化的四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)或四 甲基聯苯胺(TMB)的顯色反應。具體方法可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作 手冊》。若擴增產物用熒光基團標記，也可以直接用熒光檢測設備(如激光共聚焦掃描儀 Scanarray3000等)獲取待測信息。
有益效果本發明提供的試劑盒，可用于檢測牛SRY基因和酪蛋白基因，這可用于牛胚胎早期性別 的高通量檢測，為畜牧生產中種牛的篩選提供必要信息。


本發明的上述以及其他的特征、本質和優勢將通過下面結合附圖對實施例的說明而 變得更加明顯，在附圖中相同的附圖標記表示相同的特征，其中 圖1:本發明試劑盒的檢測原理示意圖2:用本發明試劑盒檢測12只牛SRY基因和酪蛋白基因所得結果。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例進一步描述本發明的技術方案。
圖1示出了本試劑盒采用的工作原理含編碼序列的上游引物與公用下游引物對模板 DNA進行特異擴增后產生的擴增產物M，其3'端的編碼序列C與固定在芯片L上的特異性 捕獲探針P互補(每一樣品對應不同的捕獲探針，用于區別不同樣品的擴增產物)，其擴增片 段的檢測位點序列與識別探針A或B (帶Biotin標記，用于SRY基因鑒定)互補。
將各樣品擴增產物混合后變性(平行做兩管)，然后分別加入含Biotin標記識別探針A 和B的雜交液中混勻，在同一張芯片上A、 B兩個不同的反應區(兩個反應區的陣列及各信 號點分別對應的探針一致)中進行雜交反應。每個樣品對應的擴增產物，其3'端會與芯片上 的捕獲探針雜交，若該擴增片段中含有與雜交液A或B中帶Biotin標記的識別探針A或B 互補的序列，則與該Biotin標記的識別探針A或B雜交，使擴增產物帶上Biotin標記。將 Biotin標記進行顯色處理，即可檢測到信號。否則檢測不到信號。根據芯片上同一樣品對應 的A和B兩個陣列上檢測位點的信號強度來判斷每一樣品的基因。
圖2是按照以下具體方法實施獲得的檢測結果。
1. 取待檢12頭牛基因組DNA;
2. PCR擴增用水溶解引物并稀釋至10umol/L的使用液濃度。將購置的Taq酶、IOX緩 沖液(Tiangen)， dNTP (上海生工生物工程技術服務有限公司)，純水以及綿羊基因組DNA 按以下配方配制PCR擴增體系10 XBuffer 2.5 nl; 25mM dNTP 0.2 pi; 25mM MgCl2 1.5|xl; DMSO 1.5pl; 200mg/ml BSA0.1pl; DDW 13.2 pi; Primers lpl; Taq酶l|nl; Temp 3|al。用PCR 擴增儀(Tc-25/HPCR擴增儀，杭州大和熱磁電子有限公司)按以下程序擴增94°C， 5 min; 然后按94。C25sec, 53。C25sec， 72。C25sec做40個循環，最后72。C5min。
3. 雜交方法采用上海百傲科技有限公司的雜交試劑盒(產品編號BST05010，包含預 雜交液，雜交緩沖液，洗液l，反應艙)進行雜交。取各管PCR擴增產物各4^1，分別加至兩 個0.2ml的薄壁管中，98。C熱變性5分鐘，取出后迅速放入冰盒，-20°C放置。取出基因芯片， 做好樣品編號，在A、 B雜交艙中各加滿預雜交溶液(約11(^1)，于46'C靜置5分鐘，將反 應艙中的溶液吸除干凈；從雜交緩沖液A、 B瓶中各吸出70fil雜交緩沖液(檢測探針的濃度 為100pM)，分別加到己變性的PCR擴增混合物中，混勻，將液體對應加滿到A、 B雜交艙
7(約llOpl)中(加液時應注意無氣泡產生)；將基因芯片迅速放入46'C恒溫箱中，保溫30min。 同時取1.5ml離心管，從洗液1瓶中吸出700nl洗液1，于46。C恒溫箱中預熱；從恒溫箱中 取出基因芯片，吸除A、 B雜交艙中溶液；在A、 B雜交艙中加入ll(^l已預熱的洗液l， 46 'C保溫5min，然后吸除。再重復此步驟兩次。
4. 顯色方法采用上海百傲科技有限公司的顯色試劑盒(產品編號BST06010，包含
抗體液，洗液2，洗液3，顯色液)進行顯色。在A、 B雜交艙中加入洗液2溶液110^1，室溫 放置2min;吸除a、 B雜交艙中溶液，向雜交艙中加入抗體液溶液IIOjjI,室溫放置20min; 吸除A、 B雜交艙中溶液，向雜交艙中加入洗液2溶液llOpl，室溫靜置2min。再重復此步 驟一次；吸除A、 B雜交艙中溶液，向雜交艙中加入洗液3溶液110nl，室溫放置lmin;吸 除A、 B雜交艙中溶液，向雜交艙中加入顯色液溶液110nl， 46'C避光放置40min。
5. 檢測方法吸除A、 B雜交艙中溶液，小心揭除雜交艙，將顯色載玻片顯色區小心用 蒸餾水沖洗一下，置46'C烘干；將顯色載玻片面朝下扣在BaiO BE-2.0生物芯片識讀儀(Ca估 BSE 01011 )的片槽上檢領3，具體操作見儀器使用說明。檢測圖像經Array Doctor 2.0軟件分析 可自動輸出檢測結果
1號，2號，5號，6號，9號，10號樣本為公牛； 3號，4號，7號，8號，11號，12號樣本為母牛；
上述實施例是提供給熟悉本領域內的人員來實現或使用本發明的，熟悉本領域的人員可 在不脫離本發明的發明思想的情況下，對上述實施例做出種種修改或變化，因而本發明的保 護范圍并不被上述實施例所限，而應該是符合權利要求書提到的創新性特征的最大范圍。
權利要求
1. 一種檢測牛的SRY基因和酪蛋白基因的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含24種擴增管，不少于1張基因芯片，雜交液A和B。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含陽性對照和陰性對照。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含Taq酶。
4. 根據權利要求l所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含雜交顯色試劑。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于將所述的24種擴增管分為兩組，每組12 管； 一組擴增管中每管包含以下系列上游引物(SP1-SP12)之一和公用下游引物(QP):SP1: 5, tgctgctagcatgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ， SP2: 5， tgcagcatgctagccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 31 SP3: 5' tgcagcaacgttgccgagct cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' SP4: 5， tgcagctagcatcgcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， SP5: 5， tgcagctgacatgccgaggt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， SP6: 5， tgcagctagcagtccgacct cat ctg taa gcc ttt tec tct ca 3， SP7: 5 ， tgcagctggcataccgacga cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ， SP8: 5， tgcagccagcatgtcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， SP9: 5' tcgagctagactgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' SP10: 5' tgcagcctgattgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' SP11: 5' tgcagctagccgtacgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3' SP12: 5， tgcagctacggtaccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， QP: 5，aga cca gcc agg acc acg 3'另一組擴增管中每管包含以下系列上游引物(CP1-CP12)之一和公用下游引物(WP)-CP 1: 5' tgctgctagcatgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP2: 5， tgcagcatgctagccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，CP3: 5， tgcagcaacgttgccgagct ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3CP4: 5， tgcagctagcatcgcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，CP5: 5， tgcagctgacatgccgaggt ttt ctt tgt get tag gag cga ta 3'CP6: 5， tgcagctagcagtccgacct ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP7: 5， tgcagctggcataccgacga ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP8: 5， tgcagccagcatgtcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP9: 5' tcgagctagactgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP10: 5， tgcagcctgattgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，CP 11: 5 ， tgcagctagccgtacgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3 ，CP 12: 5， tgcagctacggtaccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，WP: 5，cac ccc ttt gcc cag aca 3'上述兩組擴增管中系列上游引物(SP1-SP12)均由5'端20nt的編碼序列和3'端21nt的 特異序列組成。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的基因芯片是將5'端帶氨基修飾和16 聚脫氧胸苷酸的捕獲探針P1-P12分AB 二個區域順序固定于醛基修飾的載玻片上制成的。 P1-P12的序列如下PI: 5 'Nro-TTTTTTTTTTTTTTTT tgctgctagcatgccgacgt 3 ， P2: 5 ， NH3-TmTTTTTTTTmT tgcagcatgctagccgacgt 3 ，P4: 5， NH3-TmTTTTTTTTTTTT tgcagctagcatcgcgacgt 3，P5: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctgacatgccgaggt 3'P6: 5'NH3-T^TTTTTTTTTTTTTtgcagctagcagtccgacct3,P7: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctggcataccgacga 3 ，P8: 5， MD-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagccagcatgtcgacgt 3，P9: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tcgagctagactgccgacgt 3'Pll: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagccgtacgacgt 3' P12: 5'NH3-TmTTTTTmTTTT tgcagctacggtaccgacgt 3'以上捕獲探針的序列與相應的上游引物的編碼序列一致。
7. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的雜交液A和B中分別含有5'端帶 有生物素或熒光基團標記X的識別探針A和B,識別探針A和B的序列如下識別探針A: 5'X匿agttc gcc acc ttt cgt ctt cgt 3' 識別探針B: 5'X-attctggagggatgttttgtggg3，。
8. —種試劑盒的使用方法，包括以下步驟(1) 制備多個牛的染色體DNA;(2) 在試劑盒中每對擴增管中各加入一個牛的染色體DNA作為擴增模板，用聚合酶鏈反 應(PCR)方法擴增牛的SRY基因和酪蛋白基因的基因片段；(3) 將所得兩組擴增管的擴增產物變性后，分別取一定體積加入雜交液A和B中混勻；(4) 將上述雜交液A和B分別與基因芯片的捕獲探針A和B陣列雜交；(5) 檢測基因芯片A和B陣列的雜交信號。
全文摘要
本發明提供了一種高通量檢測牛的SRY基因和酪蛋白基因的試劑盒。該試劑盒包含24種擴增管，不少于1張基因芯片，雜交液A和B。本發明的產品可用于牛胚胎早期性別的高通量檢測，為畜牧生產中種牛的篩選提供必要信息。
文檔編號C12Q1/68GK101463386SQ20081009131
公開日2009年6月24日 申請日期2008年4月2日 優先權日2008年4月2日
發明者劉守仁, 劉福元, 濱 朱, 華 楊, 敏 沈, 王新華, 鐘發剛 申請人:新疆農墾科學院;上海百傲科技有限公司