專利名稱：：一種動物疫苗免疫增強劑及其生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物疫苗免疫增強劑，具體地說是一種小分子肽，其對部分病毒和細菌疫苗具有顯著的免疫增強效果。本發明還涉及制備該小分子肽的方法。
背景技術：
：目前我國動物疾病比較復雜，原有的疾病還未得到有效的控制，新的疫情又接踵而至，令人防不勝防，給養殖業帶來了巨大的經濟損失。免疫增強劑能顯著提高機體免疫系統功能，增強疫苗的免疫效果，減少疾病發生，因而成為近年來研究的熱點課題。免疫增強劑按其來源大體可分為以下幾類①微生物類，如乳酸菌、小棒狀桿菌、酵母細胞壁、靈芝菌絲體以及真菌中的一些菇類等，這類免疫增強劑主要作用于體液和網狀內皮系統；②生物因子類，如胸腺因子、植物多糖、轉移因子、等，這類免疫增強劑主要刺激T、B細胞分化和發育，快速誘導抗原在淋巴母細胞表面上的表達；③人工合成類，如左旋咪唑、脂質體、佐劑等，它們可使受抑制的吞噬細胞和淋巴細胞恢復功能或增強巨噬細胞的吞噬功能。左旋咪唑的一個重要特點是在機體免疫力正常時沒有作用，而在免疫力低下時，尤其是細胞免疫功能低下或缺損時有恢復和增強其免疫功能的作用；④天然類，如蜂膠、中草藥等，這類制劑可增加巨嗜細胞的吞噬功能而達到增強免疫功能的作用；⑤微量因子類，如硒、維生素E、維生素A等，它們通過抗氧化作用改變機體免疫細胞的相對數量來改善機體的免疫功能。目前已知的各種免疫增強劑(如左旋咪唑、脂多糖、脂質體、法氏囊素及一些細胞因子等)均因成本太高或者效果不穩定等原因而沒有得到廣泛應用。
發明內容本發明的目的在于針對上述不足提供一種廉價高效安全的動物疫苗免疫增強劑。本發明研究發現一種小分子肽能夠增強動物疫苗免疫效果，該小分子肽序列為COOH-Gly-His-Lys-NH2或其串聯重復序列，該小分子肽結構與雞法氏囊素的分子結果相似，單分子排列順序恰好相反，因而將其命名為類囊素(sBursin)。以一定濃度的類囊素加入到滅活好的ND(或禽流感H5、H9)抗原中，制成ND疫苗類囊素疫苗(或禽流感H5類囊素疫苗、H9類囊素疫苗)，免疫雛雞后，不同日齡釆集分離血清，用血凝抑制試驗(HI)測定血清效價。試驗同時設定不含類囊素的陰性對照，以及未用疫苗免疫的空白對照，結果含類囊素的疫苗(無論是ND，還是AIH5或AIH9)比不含類囊素的疫苗平均效價高1.2滴度，免疫增強效果顯著。本發明的另一個目的在于提供制備所述類囊素的方法，包括重組質粒的構建、基因工程菌的構建、類囊素的誘導表達以及分離純化參照大腸桿菌某些核糖體蛋白質中密碼子使用頻率，選擇Gly、His和Lys最常用的密碼子GGT、CAC和AAA,按照氨基酸從N端到C端的合成規律，以5'-GGTCACAAA-3'作為類囊素基因。根據人工堿基合成的效率，本發明設計了9個類囊素的串連基因如序列表SEQIDNo.l所示，以下用(GGTCACAAA)9表示。根據載體的酶切位點，在(GGTCACAAA)9序列的上下游分別引入酶切位點，并在兩側各補加幾個保護性堿基。本發明以pET32a為表達載體，在(GGTCACAAA)9序列的上下游分別引入45coRl(GAATTC)和5WI(GTCGAC)的酶切位點，同時兩側各補加4個保護性堿基，所合成的基因序列如下F:5，-TCAGGAATTC(GGTCACAAA)9GTCGACCCAC-3，為了使合成的寡核苷酸能變成雙鏈，同時合成了相應的互補序列R:5，-GGTGGTCGAC(TTTGTGACC)9GAATTCCTGA-3，。將以上寡核苷酸等量混合后，在沸水中孵育10min后，立即用冰水冷卻，然后轉移到4'C水洛，再用Klenow酶處理未匹配的末端，得到9個類囊素的串聯核苷酸雙鏈。。將雙鏈化的串連類囊素基因用五coJU和5WI雙酶切后，與同酶處理的載體pET32a相連接。連接產物按常規方法轉化BL21(DE3)宿主菌。挑取轉化菌落，擴大培養后提取質粒，酶切初步鑒定后送交測序，獲得的重組質粒即為pET32a-sBursin。將在LB培養液中隔夜培養的重組菌按1%體積接種到2YT培養基中繼續培養4h，用IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導4h后收獲細菌。用超聲波或液氮凍融將細菌破碎后，收集裂解，初步純化的裂解物經定量后即為本增強劑產品。應當理解，考慮到密碼子的簡并性，本領域技術人員可以依據轉化宿主密碼子的偏愛性，在不改變表達類囊素氨基酸序列的條件下，對類囊素編碼基因進行修改，并將所得基因通過適當的方法制備重組表達載體，并轉化宿主得到基因工程菌。然而這些并沒有改變本發明的實質，均應落入本發明的保護范圍。本發明所獲得的重組類囊素對體外多種動物的淋巴細胞具有明顯的刺激活性，對雞新城疫(ND)疫苗、禽流感H5、禽流感H9疫苗具有明顯的免疫增強活性。按照本發明所提供的方法，能夠獲得低廉高效安全的生物免疫增強劑，為類囊素的產業化提供可能。圖1為重組質粒pET32a-sBursin經EcoiI和Sa/1單酶切和雙酶切的電泳結果，其中l是sBursin(9重復串連)克隆前片斷(含酶切位點和保護性堿基共約100bp);2是MarkerDL2000;3是pET32a-sBursin經五coRI和Sa/I雙酶切；4是pET32a-sBursin經」EcoRI酶切；5是pET32a-sBursin經5bt/1酶切；6是pET32a-sBursin經五coRI和fe/I雙酶切；圖2是類囊素對家兔脾細胞的刺激活性曲線；圖3是類囊素對小鼠脾細胞的刺激活性曲線；圖4是類囊素對雞法氏囊細胞的刺激活性曲線；圖5是普通雞5曰齡免疫ND活苗免疫對比結果；圖6是普通雞12曰齡免疫ND活苗免疫對比結果；圖7是普通雞ND滅活苗免疫對比結果；圖8是普通雞H9滅活苗免疫對比結果；圖9是普通雞H5滅活苗免疫對比結果；圖IO是SPF雞ND滅活苗免疫對比結果；圖11是SPF雞H5滅活苗免疫對比結果；圖12是SPF雞H9滅活苗免疫對比結果；圖13是SPF雞ND活苗免疫對比結果。圖14是表達蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖，其中泳道1為蛋白分子量標準，泳道2、3是空載體表達產物，泳道4、5是重組載體表達產物(即類囊素)。具體實施方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不能限制本發明的保護范圍。依據大腸桿菌對不同Gly、His、Lys的偏愛性，設計能表達該三肽的基因5，-GGTCACAAA-3，，并將9個同樣的該基因串連。串連后的基因通過限制性內切酶(五coRl和)克隆進pET32a載體質粒中,轉化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌，并通過序列測定篩選陽性克隆。獲得的重組菌命名為E.coliBL21/pET32a-sBursin。(該菌株已于2007年9月26日送交中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCCNo.2188)。該菌株在適宜的培養基上傳100代后，遺傳性狀仍很穩定。動物試驗表明重組菌裂解物的提取物對動物疫苗具有明顯的免疫增強作用。具體方法如下1重組菌的構建1.1類囊素(COOH-Gly-His-Lys-NH2)基因序列的確定根據大腸桿菌對密碼子的偏嗜性，設計5，-GGTCACAAA-3'作為類囊素的編碼基因，大腸桿菌對該基因具有良好的表達效率。1.2類囊素基因串連序列的合成1.2.1設計串連基因序列根據人工堿基合成的效率，本發明設計了9個類囊素的串連基因，如序列表SEQIDNo.l所示。1.2.2設計合成帶有酶切位點的串連基因序列參照pET32a載體的酶切位點，在(GGTCACAAA)9基因序列的上、下游分別加入五coRl(GAATTC)和5WI(GTCGAC)的酶切位點，同時兩側各補加3個保護性堿基，所合成的基因序列如下F:5，-TCAGGAATTC(GGTCACAAA)9GTCGACCCAC-3，。為了使合成的寡核苷酸能變成雙鏈，同時合成了相應的互補鏈，序列如下R:5，—GGTGGTCGAC(TTTGTGACC)9GAATTCCTGA1.2.3單鏈寡核苷酸的雙鏈化由于基因的克隆和表達需要雙鏈，為了獲得雙鏈的串連類囊素基因，將F和R單鏈在Klenow酶的作用下，連接過夜。1.3串連類囊素基因的克隆將雙鏈化的串連類囊素基因用&oRl和^/I雙酶切后，與同酶處理的載體pET32a相連接。連接產物按常規方法轉化BL21宿主菌。1.4篩選隨機挑取4生長出的菌落，擴大培養后提取質粒，用酶切初步鑒定為陽性的質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，結果篩選到2株陽性菌株，命名為E.coliBL21/pET32a-sBursin。2重組菌的特性檢查2.1形態和生化特性檢查革蘭氏染色為陰性，呈典型的大腸桿菌形態。2.2培養特性檢查在pH6.47.4的LB瓊脂或其他適宜培養基上生長良好。2.3基因特性檢查目的基因的分子檢測或鑒定可通過PCR、酶切或序列測定完成，具體方案如下2.3.1PCR鑒定2.3.1.1引物由于克隆片斷較小，因此在用PCR鑒定時，本項目設計引物針對了pET32a載體多克隆位點上、下游的部分核酸進行，具體引物序列設計如下上游引物F:5'—TTCGAACGCCAGCACATG—3'下游引物R:5'-TTGTTAGCAGCCGGATCTC—3'用TE緩沖液配制成40(miol/L儲存濃度。2.3.1.2PCR反應體系dNTP(25mmol/Leach)4pL10xBuffer(含Mg2+)5pLF引物l|iLR引物lpL模板lpLTaq酶(5U/pL)0.5jaL38.5pL模板的制備從在固體培養基平板上挑取單菌落，加100mL滅菌雙蒸水，在沸水洛中加熱5分鐘后，取lpL作為模板。2.3丄3PCR反應程序95。C5min94°C30s72°C30s72°ClOminPCR反應結束后，取10MLPCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。2.3丄4結果判斷預期的PCR產物為223bp,如果電泳條帶與預期吻合，可初步判為陽性，反之為陰性。2.3.2.酶切鑒定2.3.2.1試驗材料質粒提取試劑盒(博大泰克生物基因技術有限公司)，五coRI和&/I限制性內切酶，DNAMarkerDL2000(寶生物工程有限公司)，瓊脂糖(上海生工生物工程技術有限公司)，水浴鍋、核酸電泳儀等。2.3.2.2試驗方法菌種繁殖及質粒提取接種單個重組菌于5ml含100嗎/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培養基中，37i:振蕩培養過夜，次日按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒，簡略步驟如下收集1.5ml菌液的沉淀與1.5mlEppendorf離心管中，加入100pl溶液I,振蕩至徹底懸浮，加入15(Hil溶液n,立即輕柔顛倒離心管數次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管放置冰上2分鐘，加入150^il溶液m,立即溫和顛倒離心管數次，置室溫放置5分鐘。12000rpm離心12分鐘，轉移上清到轉移的離心吸附柱后，分別用420pil結合緩沖液盒75(Hil漂洗液洗滌離心吸附柱，用5(^l洗脫液洗出質粒。質粒的酶切和電泳鑒定質粒提取完畢后，分別按下列體現進行酶切消化體系I:重組質粒6nl10xBufferH2|il五coRI酶0.5jli1M酶0,5nlH20體系n:重組質粒6|il10xBufferH2pl￡coRI酶0.5plH2011，體系III:重組質粒6pl10xBufferH2^il5WI酶0.5jalH2011.5pl同時取未重組的pET32a載體用￡coRI和Sa/I雙酶切作陰性對照，反應體系如下:pET32a質粒6^110xBufferH2pl五coRI酶0，S"/1酶0.5^1H20lljil將以上各體系分別混勻后，于37t:水洛消化1小時后，用1.2%瓊脂糖凝膠100V進行電泳，1小時后取出觀察結果。2.3.2.3結果判定酶切電泳的結果如圖1所示。相對于載體而言，用EcoRI和S"/1雙酶切的目的片斷在紫外光下條帶非常弱，因此酶切需要用0.5)ig以上的質粒，同時觀察結果時需要仔細分辨。電泳時間超過l小時，有利于區分重組質粒和非重組的載體大小。酶切電泳結果符合圖1結果的，判為陽性，否則為陰性。2.3.3.測序鑒定一種簡單而方便的鑒定方法就是通過序列測定進行鑒定，方法如下-.2.3.3.1細菌培養挑取單個重組克隆，接種到5ml含10(Hig/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培養基中，37"C振蕩培養過夜。2.3.3.2測序測定取0.5ml菌液無菌分裝到1.5ml的Eppendorf管中，送交測序(上海生工)。2.3.3.3序列分析將測序結果與預期序列進行比對，序列測定結果與預期一致，表明篩選得到的基因工程菌為陽性克隆。3表達產物的分離純化ii3.1菌液的制備將工程菌種劃線接種于含氨節青霉素的SOB平板培養基，37°C過夜，選取光滑圓潤的單個菌落，接種于4個含氨節青霉素的25毫升SOB液體培養基內，3(TC條件下在搖床搖動過夜，然后將其轉移至4個含氨節青霉素的250亳升SOB液體培養基內，37"C條件下在搖床搖動2.5小時，然后將上述1升培養物接種于含氨節青霉素的9升SOB液體培養基內，在15升發酵罐中37'C培養至細菌進入平臺期。3.2包涵體蛋白的提取,純化和鑒定(1)將100ml誘導后的重組菌，分裝于50ml的離心管中，4000rpm/min離心30min，棄掉上清。(2)每管加入細胞裂解液10ml，充分混勾后，將兩管的菌液合并到一個100ml。的小燒杯中。加入0.1g/ml的溶菌酶20|il、O.lmmol/Lol/L的PMSF和5pl的Aprotinin(胰蛋白酶抑制劑)，室溫置磁力攪拌器上攪拌30min。(3)將小燒杯放在冰水混合物中進行超聲裂解，超聲功率為200W,工作10s,間歇10s,共進行20個循環；如果菌液粘稠，那么繼續超聲幾次，直到菌液變清亮為止。(4)將超聲后的菌液分裝于離心管中，4°C,8000rpm離心10min,保留上清和沉淀，取200nl的上清，加入50(il的蛋白上樣緩沖液，即為超聲裂解上清的樣品。(5)用20ml冰冷的溶液2(洗滌液)將超聲后的沉淀重懸，混勻，室溫下緩慢搖動，作用10min后，4°C，8000rpm離心10min。共進行三次，最后一次洗滌離心后，倒掉上清，保留沉淀。(6)用20ml的溶液3(洗滌液)將沉淀重懸，混勻。進行與(5)相同的操作，沉淀即為SDS-PAGE提取的包涵體。(7)用20ml溶液4(包涵體溶解液)溶解沉淀，取200(11的溶解液，加入50pl的上樣緩沖液，即為包涵體的樣品。各取上述的菌液上清樣品，超聲波裂解的上清樣品和包涵體樣品各取IOjliI，用12。/。的SDS-PAGE電泳檢測結果，電泳完成后，用考馬斯亮蘭染色液染色，脫色后，用凝膠成像系統拍照。結果如圖14所示，表達產物大小與預期相一致。4重組菌裂解物(類囊素)對淋巴細胞的作用4.1實驗方法4丄1淋巴細胞的制備無菌操作，分別取家兔、小鼠的脾臟，取SPF雞的法氏囊，用平頭鑷子擠壓出組織細胞并用PH7.2-7.6Hanks液稀釋數倍，用200目銅網過濾上述脾細胞懸液，過濾液分成兩份，其中一份用45倍體積的紅細胞裂解液處理片刻，然后加入5倍體積無Ca++、Mg++Hanks液，混勻1,500r/min離心10min，吸棄上清，重復洗滌2次，臺盼藍拒染法計數，用10。/o小牛血清RPMI1640培養液(含雙抗)調整細胞濃度分別為2xl(^細胞/mL和lxl(^細胞/mL，同上分裝96孔細胞培養板。另一份用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，同上細胞記數并分裝細胞培養板。向上述細胞培養板孔中加入10嗎類囊素，每一濃度設三個復孔，并用三個不同個體進行重復實驗，37。C或41°C，5。/。C02中培養64~66h。4丄23H-TdR摻入和刺激指數統計分析細胞培養終止前16小時，每孔加入0.5pCi3H-TdR。培養結東后，用多頭細胞收集器將細胞收集于玻璃纖維濾紙上，依次用PBS、5%三氯醋酸和無水乙醇洗滌細胞各三次。P-液閃儀測定每孔細胞的每分閃爍次數(cpm值)，并計算刺激指數(SI)。SI=(測定孔的cpm值一機器本底cpm值)/(陰性對照孔cpm值一機器本底cpm值)。由于三個不同個體進行的重復實驗基本吻合，SI最終值選取三個不同個體中的一個個體的三次重復實驗的SI平均值表示。4.2實驗結果4.2.1對家兔脾細胞的刺激用MTT法測定類囊素對家兔脾細胞的免疫刺激活性，結果加類囊素的試驗組顯著高于不加類囊素的對照組(圖2)。4.2.2對小鼠脾細胞的刺激用MTT法測定類囊素對昆明系小鼠脾細胞的免疫刺激活性，結果加類囊素的試驗組顯著高于不加類囊素的對照組(圖3)。4.2.3對SPF雞法氏囊的刺激活性用MTT法測定類囊素對SPF雞法氏囊細胞的免疫刺激活性，結果加類囊素的試驗組顯著高于不加類囊素的對照組(圖4)。5重組菌裂解物(類囊素)對疫苗的免疫增強作用一、材料1、1曰齡黃雞350只2、海蘭胚80枚，SPF雞胚70胚、1日齡SPF雞150只3、免疫增效劑—pET32a-sBursin—，為方便起見，將其命名為XIO。4、其它一次性耗材注射器、離心管、抗原、一次性血凝板。二、方法二1、ND(LaSota株)抗原的制備及EID50的測定。2、將免疫增效劑以生理鹽水稀釋成2ml，類囊素蛋白濃度約為500ug/ml，約1500羽份。將類囊素添加到ND活疫苗的稀釋液中，或者將其添加到ND滅活疫苗的水相中，按照ND活疫苗和滅活疫苗的常規免疫方法進行點眼滴鼻或肌肉注射。3、分組情況3.1普通雞分組情況(注每組免疫30只，其它疫苗不免疫)表l普通雞的免疫組別免疫種類免疫天齡(天)免疫劑量(ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1MPF雞分組情況(每組"只)表2SPF雞的免疫<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>各組于免疫后7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日分別釆血測H5、H9、ND的抗體效價。以后視情況每1530曰采血一次。三、結果及分析1、普通雞結果表3普通雞免疫結果.<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注活表示為活疫苗免疫，滅表示為滅活苗免疫，-表示未測。用SPSS軟件進行分析結果(參見圖59)表明(l)用ND活苗免疫與ND+X10活苗免疫組間抗體滴度無差異，與空白對照組有顯著差異。(2)H5滅活苗與H5+X10滅活苗免疫組間抗體滴度有顯著差異，H5+X10組顯著高于H5滅活苗組。(3)H9滅活苗與H9+X10滅活苗免疫組間抗體滴度有顯著差異，H9+X10組顯著高于H9滅活苗組。(4)ND滅活苗與ND+X10滅活苗免疫組間抗體滴度有顯著差異，ND+X10組顯著高于ND滅活苗組。2、SPF雞結果表4SPF雞的免疫結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>空白(H5結果)0.671.170.671.00(H9結果)1.331.831.67U72(ND+X10滅)0.807.738.4710.133(ND滅)0.477.139.679.804(H5滅)1.737.339.3311.605(H5+X10滅)1.007.738.8711.406(H9+X10滅)1.937.008.8011.217(H9滅)2.077.3310.3611.938(ND+X10活)4.306.806.009(ND活)4.806.606.70用SPSS軟件進行分析結果(參見圖10~13)表明(1)用ND活苗免疫與ND+X10活苗免疫組間抗體滴度無差異，與空白對照組有顯著差異。(2)H5滅活苗與H5+X10滅活苗免疫組間抗體滴度無差異。(3)H9滅活苗與H9+X10滅活苗免疫組間抗體滴度基本無差異，僅在免疫后21天時，H9滅活苗比H9+X10滅活苗高，差異顯著。(4)ND滅活苗與ND+X10滅活苗免疫組間抗體滴度基本無差異，僅在免疫后21天時，ND滅活苗比ND+X10滅活苗高，差異顯著。上述結果表明本發明類囊素具有顯著的免疫增強作用。17序列表〈110〉廣東大華農動物保健品有限公司<120>—種動物疫苗免疫增強劑及其生產方法<130〉<160〉1<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉81<212>醒〈213>人工序列<400〉1ggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcac肌aggtcacaaaggtcac60aaaggtcacaeiaggtcacaaa8權利要求1.一種小分子肽，其為具有氨基酸序列COOH-Gly-His-Lys-NH2的單體或者多個該序列首尾相連的串聯體。2、如權利要求1所述的小分子肽，其為9個COOH-Gly-His-Lys-NH2首尾相連的串聯體。3、編碼權利要求1或2所述小分子肽的基因。4、如權利要求3所述的基因，其具有序列表SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。5、含有權利要求3或4所述基因的表達載體。6、如權利要求5所述的表達載體，其衍生于pET32a。7、含有權利要求5或6所述表達載體的宿主。8、大腸埃希氏菌(Esc/zen'c/w'acoli)BL21(pET-sBur)CGMCCNo.2188，其含有權利要求5所述的表達載體。9、一種制備權利要求l或2所述小分子肽的方法，其特征在于培養權利要求7所述的宿主，并誘導表達。10、含有權利要求1或2所述小分子肽的免疫增強劑。全文摘要本發明提供了一種免疫增強劑—類囊素，其是一種小分子肽，該小分子肽為具有氨基酸序列COOH-Gly-His-Lys-NH<sub>2</sub>的單體或者多個該序列首尾相連的串聯體。本發明免疫增強劑對體外多種動物的淋巴細胞具有明顯的刺激活性，對雞新城疫(ND)疫苗、禽流感H5、禽流感H9疫苗具有明顯的免疫增強活性。文檔編號C12N15/11GK101255189SQ20081009042公開日2008年9月3日申請日期2008年4月7日優先權日2008年4月7日發明者丁家波申請人:廣東大華農動物保健品有限公司