堿性磷酸酶標記試劑盒、免疫測定試劑盒及免疫測定方法

專利名稱：：堿性磷酸酶標記試劑盒、免疫測定試劑盒及免疫測定方法
技術領域：
：本發明涉及一種堿性磷酸酶(ALP)標記檢測用試劑盒。本發明還涉及一種免疫測定用試劑盒及用該免疫測定用試劑盒的免疫測定方法。
背景技術：
：堿性磷酸酶(以下也稱ALP)是一種在酶聯免疫測定法中通常作為標記使用的酶。ALP在從高等動物到細菌幾乎所有生物中都能看到，在高等動物中有內臟器官特異性異酶。血液等體液中已知含有來源于肝臟的ALP和來源于骨骼的ALP等內源性ALP。因此，以ALP為標記進行免疫測定時，不僅ALP標記，來源于標本的內源性ALP也與底物反應，從而難以獲得正確的測定結果。作為有助于抑制這種內源性ALP影響的物質，有針對內源性ALP的抑制劑(以下也稱內源性ALP抑制劑)。以下列舉使用內源性ALP抑制劑抑制內源性ALP影響的方法。美國專利第5948630號作為減少內源性ALP影響的方法，介紹使用含人ALP抑制劑的漂洗成份。EP公開公報第530490號上記述的方法是，把ALP標記到結合在CD4等細胞表面標記物的抗體，用此ALP標記抗體分類淋巴細胞的亞型。在此，使用了含底物的約pH9.5的緩沖劑/底物溶液和含左旋咪唑的pH7.4的細胞清洗液。美國專利第5948630號在實施例中記述，使用含有作為底物的4-MUP和作為內源性ALP抑制劑的左旋咪唑的底物/清洗液。ALP的pH為堿性，故一般為了在合適的條件下讓ALP標記與底物反應，含底物的試劑都被設定為堿性。在專利文獻1中也記述了洗滌劑成份的合適pH范圍約為7.0至10.0。然而，左旋咪唑等內源性ALP抑制劑在堿性條件下會變得不穩定。因此，有時專利文獻1中記述的洗滌劑成份為了穩定內源性ALP抑制劑而不能使用。根據EP公開公報第530490號上的記述，將用ALP標記抗體處理的細胞用細胞清洗液清洗二遍后，再加入緩沖劑/底物溶液測定ALP活性所引起的染色。一般來說，細胞清洗液在清洗后要從細胞除去，因此，ALP標記和底物反應的反應液中實際上不含細胞清洗液。因此，當清洗時未能充分抑制內源性ALP時，ALP標記和底物反應時就可能無法消除內源性ALP的影響。
發明內容本發明的范圍只由后附權利要求書所規定，在任何程度上都不受這一節
發明內容的陳述所限。本發明提供一種堿性磷酸酶標記檢測用試劑盒，包括可與靶向物質結合的堿性磷酸酶標記物，堿性磷酸酶相應的底物，含抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與所述靶向物質結合的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。所述耙向物質是含待測物質和經抗原抗體反應可與之結合的第一結合物的復合物中的待測物質。所述的試劑盒可用于競爭法免疫測定，此時所述靶向物質指經抗原抗體反應可與待測物質結合的第一結合物。所述堿性磷酸酶標記物含可與靶向物質結合的第二結合物和堿性磷酸所述的試劑盒含有所述輔助試劑液的堿性磷酸酶和底物的反應液為堿性。所述底物液為堿性，所述輔助試劑液為中性或酸性。所述底物液和所述輔助試劑液含有緩沖劑，所述底物液有大于所述輔助試劑液的緩沖能。所述抑制劑為左旋咪唑。所述堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶為來源于細菌的堿性磷酸酶或來源于腸的堿性磷酸酶。本發明還提供一種免疫測定用試劑盒，包括經抗原抗體反應可與待測物質結合的第一結合物，固定含第一結合物和待測物質的復合物的固相，可與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物，含有堿性磷酸酶相應底物的底物液；及含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。本發明再提供一種使用競爭法的免疫測定用試劑盒，包括堿性磷酸酶標記物，可通過抗體抗原反應與待測物質和堿性磷酸酶標記物結合的第一結合物，固定第一結合物的固相，含有堿性磷酸酶相應底物的底物液；及含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與第一結合物結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。本發明另提供一種免疫測定的方法，包括固定步驟，在固相上形成一種復合物，所述復合物含有標本中的待測物質、可與待測物質結合的堿性磷酸酶標記物、經抗原抗體反應可與待測物質結合的、并可與固相結合的第一結合物；反應步驟，讓與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶與底物液中所含堿性磷酸酶相應底物在含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑的輔助試劑液存在的情況下發生反應；及測定步驟，檢測堿性磷酸酶與底物反應生成的產物。本發明又一種使用競爭法的免疫測定方法，包括混合步驟，將標本、堿性磷酸酶標記物、經抗原抗體反應可與堿性磷酸酶標記物和標本中的待測物質結合的第一結合物和固定第一結合物的固相混合起來；反應步驟，讓與固定在固相上的第一結合物結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶與底物液中所含堿性磷酸酶相應底物在含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑的輔助試劑液存在的情況下發生反應；及測定步驟，檢測堿性磷酸酶與底物反應生成的產物。所述混合步驟可以先混合標本、第一結合物和固相后，再在所得的混合物中混入堿性磷酸酶標記物。所述混合步驟可以先混合標本、第一結合物和堿性磷酸酶標記物后，再在所得的混合物中混入固相。圖1為本發明的免疫測定用試劑盒的一實施方式的模式圖。圖2為在參考例中加入加速試驗后的比較試劑1的分光光度計用比色皿的側面照片(a)和加入加速試驗后的粒子分散液的分光光度計用比色皿的側面照片(b)。圖3為顯示實施例中使用比較試劑2時各陰性標本的分布狀態的分布圖(直方圖)。圖4為顯示實施例中使用粒子分散液時各陰性標本的分布狀態的分布圖(直方圖)。'具體實施例方式下面將參照本發明的優選實施方案。ALP標記檢測用試劑盒在本說明書中，所謂"ALP標記檢測用試劑盒"是一種用于檢測ALP標記的試劑盒，包括，可與靶向物質結合的堿性磷酸酶(ALP)標記物、ALP相應的底物及含抑制內源性ALP的抑制劑、在與上述靶向物質結合的ALP標記物中的ALP和底物反應時添加的輔助試劑液。在本說明書中所謂的ALP標記檢測用試劑盒所含"輔助試劑液"是在上述固相免疫測定法中，固相上的ALP標記與底物反應時添加的試劑。在ALP標記檢測用試劑盒中輔助試劑液是作為與底物液不同的試劑設置的。輔助試劑液只要是固相上的ALP標記與底物反應時添加的試劑液即可，比如當固相為粒子是，可以作為粒子分散液使用，以使與底物的反應在有ALP標記的粒子分散于液態中的狀態下進行。本說明書中所謂的"接觸"包括混合。免疫測定用試劑盒上述ALP標記檢測用試劑盒也可以作為在用固相的免疫測定法中使用的免疫測定用試劑盒。本實施方式的免疫測定用試劑盒是固相免疫測定法使用的檢測ALP標記的試劑盒。上述固相免疫測定法包括利用夾心法的免疫測定法和利用競爭法的免疫測定法。在此對這些測定法進行簡單的說明。本說明書中的"第一結合物"在夾心法中，指經抗原抗體反應可與標本中待測物質結合、且可與固相結合的物質。在競爭法中，"第一結合物"指經抗原抗體反應可與ALP標記物和標本中待測物質結合、且可與固相結合的物質。本說明書所謂"游離第一結合物"指標本、第一結合物和固相混合所得第一結合物中，未形成含待測物質的復合物、即沒有與標本中的待測物質結合的第一結合物。固相免疫測定法包含的步驟為讓待測物質、經抗原抗體反應與該待測物質結合的第一結合物與固相接觸，在固相上形成至少含待測物質和第一結合物的復合物。一般說來，上述復合物因上述第一結合物固定在上述固相上而吸附于固相上。此固相上不僅有上述復合物，還吸附有未與待測物質形成復合物的第一結合物(以下也稱游離第一結合物)。夾心法是在上述固相上吸附的物質(復合物和游離第一結合物)中，僅標記復合物，根據該標記的檢測結果測定待測物質。而競爭法是在固相上吸附的物質(復合物和游離第一結合物)中，標記游離第一結合物，根據該標記的檢測結果測定待測物質。上述第一結合物無特別限制，只要是經抗原抗體反應能與待測物質結合的物質即可。比如，如果待測物質是抗體，第一結合物可以是與該抗體特異性結合的抗原。作為第一結合物的抗原無特別限制，只要是有作為待測物質的抗體能識別的位點(表位)的抗原即可。而如果待測物質為抗原，則作為第一結合物可以是與該抗原特異性結合的抗體。作為第一結合物的抗體是能與作為待測物質的抗原特異性結合的抗體即可，也包括抗體的碎片及其衍生物。作為具體例子，可列舉出Fab碎片、F(ab')碎片、F(ab)2碎片和sFv碎片等。抗體類型可以使用IgG、IgM，但不限于此。上述復合物只要是根據固相免疫測定法在固相上形成、且至少含有待測物質和第一結合物的復合物即可，無特別限制。比如當用結合到待測物質的一次抗體和結合到該一次抗體上的標記二次抗體標記復合物時，上述復合物可以含待測物質、第一結合物和一次抗體。ALP標記物含有與靶向物質結合的第二結合物和ALP。在此，'鄰向物質"指成為ALP標記目標的物質，在夾心法中，是由待測物質和第一結合物構成的復合物中的待測物質。在競爭法中，是游離第一結合物。因此，夾心法測定時，ALP標記物所含第二結合物能與上述步驟獲得的固相上的復合物或游離第一結合物中復合物結合，該第二結合物被ALP標記。競爭法測定時，ALP標記物所含第二結合物能與上述步驟獲得的固相上的復合物或游離第一結合物中游離第一結合物結合，該第二結合物用ALP標記。上述第二結合物無特別限定，只要是免疫測定法使用的物質即可，可根據待測物質的種類和測定法等適當選擇。比如，當在運用夾心法的免疫測定法中，待測物質為抗原時，第二結合物是直接或間接地與作為待測物質的抗原結合的物質。作為直接與抗原結合的第二結合物可以用與抗原特異性結合的抗體。該抗體只要能與作為待測物質的抗原特異性結合即可(無特別限定)，也包括抗體的碎片及其衍生物。具體比如有Fab碎片、F(ab，)碎片、F(ab)2碎片和sFv碎片等。抗體類型可以使用IgG、IgM，但不限于此。此時，作為第一結合物的抗體和作為第二結合物的抗體最好識別抗原的不同位點(表位)。作為能與作為待測物質的抗原間接結合的第二結合物，可以使用能與和抗原特異性結合的一次抗體結合的二次抗體。此時，二次抗體可結合一次抗體，一次抗體可結合待測物質。作為二次抗體比如有人抗相應的IgG、IgM、IgY等抗體。在上述一次抗體附加生物素時，可以用抗生朊類取代上述二抗作為第二結合物。上述一次抗體只要能與作為待測物質的抗原特異性結合即可，無特別限制，也包括抗體的碎片及其衍生物。此時，作為第一結合物的抗體和作為第二結合物的抗體最好識別抗原的不同位點(表位)。上述二次抗體只要是與一次抗體結合的抗體即可，無特別限定，也包括抗體的碎片及其衍生物。當免疫測定法為夾心法，待測物質為抗體時，第二結合物為能與作為待測物質的抗體結合的物質。作為這種第二結合物可以使用能與抗體結合的抗原和抗體。作為第二結合物的抗體如有相對于人抗的IgG、IgM、IgY等抗體。當免疫測定法為競爭法，待測物質為抗原時，第二結合物為能與作為固化在固相上的第一結合物的抗體結合的物質。具體而言，可以使用能與作為第一結合物的抗體結合的抗原。作為第二結合物的抗原只要具有作為第一結合物的抗體能識別的位點(表位)即可，無特別限定。當免疫測定法為競爭法，待測物質為抗體時，第二結合物為能與作為固化在固相上的第一結合物的抗原結合的物質。具體而言，可以使用能與作為第一結合物的抗原結合的抗體。作為第二結合物的抗體只要是能與作為第一結合物的抗原特異性結合的抗體即可，無特別限定，也包括抗體的碎片及其衍生物。作為用于標記的ALP，只要不能被輔助試劑液中所含內源性ALP抑制劑抑制即可，無特別限定。比如有來源于腸的ALP、來源于菌的ALP等。作為來源于腸的ALP如有來源于牛腸的ALP等。作為來源于菌的ALP如有來源于大腸菌的ALP、來源于酶的ALP等。從比活性和生產率的觀點來說，最好是來源于腸的ALP。用于標記的ALP可以由天然分離而得，也可以是用基因重組法和化學合成法等一直為人所知的方法合成的ALP。作為標記使用的ALP的最佳pH因其種類不同而各異，但來源于腸的ALP的最佳pH值為pH9~10，來源于菌的ALPpH值為8~9。在上述第二結合物標記ALP的方法可以利用眾所周知的方法。作為標記ALP的方法比如有戊二醛法、高碘酸架橋法、馬來酰亞胺架橋法、碳二亞胺法和活性酯法等。在免疫測定用試劑盒中，ALP標記物可以為溶解于緩沖液的液態，也可以是冷凍干燥成固體、用時加水等液體使用的液態。從試劑盒使用操作的簡便性來說，最好ALP標記物為溶解于緩沖液的液態。輔助試劑液為固相免疫測定中使用的試劑液，含有抑制內源性ALP的抑制劑(以下也稱內源性ALP抑制劑)，在固相上的ALP與底物反應時添加，該固相上吸附有結合了ALP標記物的復合物。輔助試劑液為競爭法固相免疫測定中使用的試劑液，含內源性ALP抑制劑，在固相上的ALP與底物反應時添加，該固相上吸附有結合有ALP標記物的第一結合物。即輔助試劑液為含有內源性ALP抑制劑的試劑，是在固相免疫測定法中，在固相上的ALP標記與底物反應時添加的試劑。輔助試劑液只要是固相上的ALP標記與底物反應時添加的試劑液即可，比如當使用粒子作為固相時，可以作為粒子分散液使用，以使與底物的接觸在含有ALP標記的粒子分散在液體的狀態下進行。作為內源性ALP抑制劑，只要是不抑制標記用ALP而僅抑制來自標本的內源性ALP的物質即可，無特別限制。具代表性的內源性ALP抑制劑如有左旋咪唑。左旋咪唑化學式為(-)2，3，5，6-四氫-6-苯基咪唑〔1，2-b〕噻唑。左旋咪唑的大部分同族體是眾所周知的，這些同族體也可以作為內源性ALP抑制劑使用。作為這種同族體，比如有左旋咪唑的苯基環上有碳原子數1~6的低級烷基取代基的同族體、左旋咪唑的苯基環上有氯、溴等鹵基取代基的同族體等。作為外消旋型左旋咪唑的四咪唑也可以用作內源性ALP抑制劑。作為其同族體，可例舉四咪唑、L-p-溴四咪唑。此外，作為內源性ALP抑制劑還有5，6-二氫-6-(2-萘基)咪唑(1，2-b〕噻唑等。上述內源性ALP抑制劑己知在堿性條件下會變得不穩定。因此，從試劑中的內源性ALP抑制劑保存穩定性考慮，輔助試劑液以能使內源性ALP抑制劑保持穩定的pH值為宜。輔助試劑液pH值比如以中性或酸性為宜。具體來說，輔助試劑液pH值以pH48為宜，pH67更好。在免疫測定用試劑盒中，底物液可以呈ALP標記的最佳pH值的堿性。但是，在免疫測定用試劑盒中，輔助試劑液與底物液是不同的試劑。、因此，即使底物液為堿性，內源性ALP抑制劑也不會隨之變得不穩定，從而可以使輔助試劑液在內源性ALP抑制劑穩定的條件下添加到試劑里。以此可以提供內源性ALP抑制劑保存穩定性優越的試劑盒。另外，輔助試劑液在固相上的ALP標記與底物反應時添加。即，與洗滌液不同，不會在固相與底物混合前被除去，從而可以在ALP標記與底物反應時充分抑制內源性ALP。使用含有這種輔助試劑液的免疫測定用試劑盒可以長期進行準確的免疫測定。上述輔助試劑液最好為將上述內源性ALP抑制劑溶解在適當緩沖液中的液態。作為輔助試劑液中所含緩沖液以可在中性或酸性條件下使用的緩沖劑為宜。具體而言，有磷酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、MES(2-嗎啉乙磺酸)、PIPES(1.4-哌嗪二乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉)丙磺酸)、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)或Tricine(三(羥甲基)甲基甘氨酸)、TEA(三乙醇胺)等。作為緩沖劑以在堿性附近沒有緩沖能的緩沖劑為好，具體而言就是MES。輔助試劑液中的緩沖劑濃度可根據所用緩沖劑種類適當選擇。輔助試劑液中的緩沖劑濃度比如可以是2mM100mM，3mM50mM更好，最好是5mM20mM。ALP標記和底物液中所含底物的反應液中也含有輔助試劑液，但因ALP的最適pH為堿性，此反應液最好為堿性。因此，免疫測定用試劑盒中可含在反應液中的輔助試劑液和后述底物液的pH、緩沖劑的種類和緩沖劑的濃度等都應設定為使反應液為堿性。底物液含有ALP的底物。作為底物可以使用在該
技術領域：
眾所周知的ALP發光底物和顯色底物等。作為ALP的化學發光底物，比如有AMPPD(3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基4-(3"-磷酰氧基傳-l，2-二氧雜環丁垸)、CDP-star(注冊商標)(4-氯-3-(甲氧基螺{1,2-二氧環己烷-3，2，-(5，-氯)三環[3.3丄13，7]}-4-yl)苯基磷酸2鈉)、CSPD(注冊商標)(3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧環已垸-3，2-(5，-氯)三環[3.3丄13，7]癸烷}-4-yl)苯基磷酸2鈉)等。作為ALP的顯色底物有對硝基苯酯、5-溴-4-氯-3』引哚磷酸(BCIP)、四唑硝基藍(NBT)、碘硝基四唑(INT)等。當ALP標記與上述發光底物和顯色底物接觸時，引起酶反應，檢測此反應生成物的發光和顯色，即可檢測ALP標記。上述底物液最好為將上述底物溶解在適當緩沖液中的液體。底物濃度可根據底物的種類適當選擇。緩沖液可根據底物的種類適當選擇，可以使用在該
技術領域：
眾所周知的緩沖液。標記的ALP的最佳pH為堿性，故底物液最好為堿性。作為底物液的pH無特別限定，只要pH能使ALP標記和底物接觸的反應液為堿性即可。作為底物液的pH以pH812為宜，pH9ll更好。如上所述，輔助試劑液可以為中性或酸性。因此，受輔助試劑液pH的影響，ALP標記和底物接觸的反應液中的pH有可能不是堿性。因此，為了降低輔助試劑液pH的影響，最好讓底物液的緩沖能大于輔助試劑液。調節底物液和輔助試劑液的緩沖能的方法無特別限定，可以利用眾所周知的方法。一般來說，緩沖劑濃度越高緩沖液的緩沖能越大。因此，底物液的緩沖劑濃度設定得高于輔助試劑液，就可以使底物的緩沖能大于輔助試劑液。這種緩沖劑的濃度可依所用緩沖劑種類適當選擇。底物的緩沖劑濃度比如可設定為是輔助試劑液的緩沖劑濃度的至少2倍，5倍20倍更好，815倍最好。具體而言，底物的緩沖劑濃度以4mM1000mM為宜，10mM500mM更好，50mM200mM最好。將上述輔助試劑液所含緩沖劑設定為在堿性附近無緩沖能的緩沖劑，可以使底物液的緩沖能大于輔助試劑液。作為底物液所含緩沖劑，最好是在堿性條件下可使用的緩沖液。具體而言，甲基甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、乙基乙醇胺(EAE)、二乙醇胺(DEA)、2-氨基-2-甲基-l-丙醇(AMP)。其中，最好是在ALP最佳pH有緩沖能的DEA和AMPo上述免疫測定用試劑盒在用ALP作為標記的免疫測定法中也是特別使用固相的免疫測定中所用的試劑盒。作為這種免疫測定法，只要是以ALP作為標記的方法即可，無特別限定。具體而言，有EIA法、ELISA法等。作為固相，只要是在通常免疫測定法中使用的固相即可無特別限定。作為該固相的材料，比如有膠乳、橡膠、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯樹脂、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯-異丁烯酸甲酯共聚物、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏二氟乙烯樹脂(PVDF)和硅等聚合物；瓊脂糖；明膠；紅細胞；硅膠、玻璃、非活性礬土和磁性體等無機材料等。也可以將這些材料的一種或二種以上組合使用。作為固相的形狀，只要是用于免疫測定的普通固相形狀即可，無特別限定，比如可以是酶標板、試管、微珠、粒子和納米粒子等。作為粒子，有磁性粒子、聚苯乙烯膠乳等疏水性粒子、在粒子表面有氨基、羧基等親水基的共聚膠乳粒子、紅細胞和明膠等。從測定自動化的角度說，固相以磁性粒子和膠乳等為宜，其中磁性粒子更好。磁性粒子是以有磁性的材料為基材的粒子。這種磁性粒子在該
技術領域：
人所共知，已知有以Fe203和/或Fe304、鈷、鎳、鐵酸鹽、鎂等為基材的粒子。以蛋白質等向磁性粒子結合為目的，基材表面用聚合物包被的磁性粒子更好。在上述免疫測定用試劑盒中，ALP標記物、底物液和輔助試劑液分別包裝。圖1為ALP標記物、底物液和輔助試劑液在液態下的試劑盒一例。圖1中，ALP標記物盛放在第一試劑容器1中，底物液盛放在第二試劑容器2中，輔助試劑液盛放在第三試劑容器3中。免疫測定用試劑盒也可根據要求另備裝在其他試劑容器中的其他試劑。免疫測定用試劑盒還可根據需要備有稀釋試劑之一或若干用的一種或數種緩沖液、使用說明書、可用于反應的容器等。上述免疫測定用試劑盒也可包含在用固相的免疫測定法中使用的其他試劑。具體而言，免疫測定用試劑盒包括經抗原抗體反應可與待測物質結合的第一結合物，固定含第一結合物和待測物質的復合物的固相，可與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶(ALP)標記物，含有ALP相應底物的底物液；及含有抑制內源性ALP的抑制劑、在與復合物中待測物質結合的ALP標記物的ALP和底物反應時添加的輔助試劑液。此免疫測定用試劑盒作為用于競爭法免疫測定的免疫測定用試劑盒時，包括堿性磷酸酶(ALP)標記物，可通過抗原抗體反應與待測物質和ALP標記物結合的第一結合物，固定第一結合物的固相，含有ALP相應底物的底物液；及含有抑制內源性ALP的抑制劑、在與第一結合物結合的ALP標記物的ALP和底物反應時添加的輔助試劑液。上述第一結合物可使用上面例示的物質。在免疫測定用試劑盒中，第一結合物也可以是液態，也可為用時溶解在適當溶劑(比如水和緩沖液等)使用的固態。從試劑盒的使用操作的簡便性來看，最好第一結合物為溶解于溶劑的液態。緩沖液可以使用免疫測定常用的緩沖液，比如包括PIPES、TEA、Tris、MES和磷酸緩沖液等。上述固相可以使用以上例示的固相。在免疫測定用試劑盒中，固相可以是懸濁或接觸的形態，也可以是用時在適當溶劑(比如水和緩沖液等)懸濁或接觸使用的固態。從試劑盒的使用操作的簡便性來看，上述固相最好是在溶劑中懸濁或接觸的形態。緩沖液可以使用免疫測定常用的緩沖液，比如含PIPES、TEA、Tris、MES和磷酸緩沖液等。在免疫測定用試劑盒中第一結合物可以固定在固相上，也可以不固定。第一結合物固定在固相上時，免疫測定用試劑盒含有比如含固定有第一結合物的固相的試劑、ALP標記物、底物液和輔助試劑液。用此免疫測定用試劑盒進行免疫測定時，標本、含固定有第一結合物的固相的試劑和ALP標記物的混合順序無特別限定。下面舉例說明使用此試劑盒進行的免疫測定。首先，混合標本和含固定有第一結合物的固相的試劑，在固相上形成含有待測物質和第一結合物的復合物。再混合吸附有復合物的固相和ALP標記物，使ALP標記物結合到吸附在固相上的復合物。向吸附有結合了ALP標記物的復合物的固相添加輔助試劑液和底物液，再在含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液存在的情況下使固相上的ALP標記和底物液所含底物反應。以此可以在ALP標記和底物接觸的溶液中一方面使來自標本的內源性ALP有效地得到抑制，一方面使ALP標記和底物產生酶反應。然后，檢測ALP標記和底物酶反應生成的產物的發光和顯色，即可正確地測定待測物質。第一結合物固定在固相上的方法是公認的方法。該固定比如可以通過物理吸附法、共有結合法、離子結合法以及這些方法的組合等進行。也可以利用生物素和抗生朊類的結合將第一結合物固定在固相上。促成第一結合物在固相上固定的中間物質組合除上述生物素和抗生朊類外，還可以有半抗原和抗半抗原抗體、鎳和組氨酸標簽、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉移酶等。作為半抗原和抗半抗原抗體如有DNP和抗DNP抗體。在本說明書中，"抗生朊類"指包括抗生朊和鏈球菌抗生朊。第一結合物未固定在固相上時，免疫測定用試劑盒比如包括含第一結合物的試劑、含固相的試劑、ALP標記物、底物液和輔助試劑液。用此免疫測定用試劑盒進行夾心法免疫測定時，標本、含第一結合物的試劑、含固相的試劑和ALP標記物的混合順序無特別限定。下面舉例說明用此試劑盒進行的免疫測定。先混合標本和含第一結合物的試劑，形成含有待測物質和第一結合物的復合物。再混合復合物和含有固相的試劑，使復合物吸附到固相上。然后混合吸附有復合物的固相和ALP標記物，使ALP標記物結合到復合物。向吸附有結合了ALP標記物的復合物的固相添加輔助試劑液和底物液，再在含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液存在的情況下使固相上的ALP標記和底物液所含底物反應。以此可以在ALP標記和底物接觸的溶液中一方面使來自標本的內源性ALP有效地得到抑制，一方面使ALP標記和底物產生酶反應。然后，檢測ALP標記和底物酶反應生成的產物的發光和顯色，即可正確地測定待測物質。當用此免疫測定用試劑盒進行競爭法免疫測定時，可以先混合標本、含第一結合物的試劑和含固相的試劑之后，再混合ALP標記物，也可以先混合標本、含第一結合物的試劑和ALP標記物后，再混合含固相的試劑。當第一結合物未固定在固相上時，最好固相結合位點上附加第一結合物，可與固相結合位點結合的第三結合物固定在固相上。這樣可以在固相上形成含有待測物質和第一結合物的復合物。固相結合位點和第三結合物只要是能在用試劑盒的條件下接觸時特異性結合的物質組合即可，無特別限定。這些組合比如有生物素和抗生朊類、半抗原和抗半抗原抗體、鎳和組氨酸標簽、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉移酶等。作為半抗原和抗半抗原抗體如有DNP和抗DNP抗體。以生物素和抗生朊類的組合為宜，最好固相結合位點含生物素，第三結合物質為抗生朊類。在本說明書中，"抗生朊類"指包括抗生朊和鏈球菌抗生朊。固相結合位點和第三結合物組合的各個物質哪一個固定在粒子上都可，無特別限定。當第三結合物質是抗生朊類時，可以通過使抗生朊結合到己結合有能與抗生朊結合的物質比如生物素的固相上，將抗生朊類固定在固相上。也可以用日本專利公開第2006-226689號上記述的方法將抗生朊類固定在固相上。使抗生朊類結合的固相也可以從比如JSR株式會社和戴諾生物技術公司(DynalBiotech)等購買。運用競爭法時，作為ALP標記物使用能與固相上的游離第一結合物結合的ALP標記物。比如，當固相為粒子、輔助試劑液使用粒子分散液時，吸附結合有ALP標記物的復合物的粒子被分散到粒子分散液中，在其中添加底物液。免疫測定方法上述免疫測定用試劑盒可以用于免疫測定方法。這種免疫測定方法包括以下步驟固定步驟，在固相上形成一種復合物，該復合物含有標本中的待測物質、可與待測物質結合的堿性磷酸酶(ALP)標記物、經抗原抗體反應可與待測物質結合的、并可與固相結合的第一結合物；反應步驟，讓與復合物中待測物質結合的ALP標記物的ALP與底物液中所含ALP相應底物在含有抑制內源性ALP的抑制劑的輔助試劑液存在的情況下發生反應；及測定步驟，檢測ALP與底物反應生成的產物。當這種免疫測定方法是競爭法免疫測定時，包括混合步驟，將標本、堿性磷酸酶(ALP)標記物、經抗原抗體反應可與ALP標記物和標本中的待測物質結合的第一結合物和固定第一結合物的固相混合起來；反應步驟，讓與固定在固相上的第一結合物結合的ALP標記物的ALP與底物液中所含ALP相應底物在含有抑制內源性ALP的抑制劑的輔助試劑液存在的情況下發生反應；及測定步驟，檢測ALP與底物反應生成的產物。在上述測定方法中，固定步驟(即在固相上形成復合物，該復合物含有標本中的待測物質、可與待測物質結合的堿性磷酸酶(ALP)標記物、經抗原抗體反應可與待測物質結合并可與固相結合的第一結合物。)可以通過將標本中的待測物質、ALP標記物、第一結合物和固相混合來實現。混合標本中待測物質、ALP標記物、第一結合物和固相的方法可以使用上述免疫測定用試劑盒記述的方法。在上述競爭法免疫測定中，混合標本、堿性磷酸酶(ALP)標記物、經抗原抗體反應可與ALP標記物和標本中待測物質結合的第一結合物和固定第一結合物的固相的混合步驟可以使用上述用于競爭法免疫測定的免疫測定用試劑盒記述的方法。如上述免疫測定用試劑盒記述，第一結合物可以固定在固相上，也可以不固定在固相上。上述待測物質是一般可以通過免疫測定檢測出其存在或可以定量其含量的物質即可，無特別限定。比如，蛋白質、糖類、脂蛋白、激素等。這種待測物質比如包括人類免疫缺乏病毒(HIV)及其抗體、人類T淋巴細胞白血病病毒1型(HTLV-1)及其抗體、丙型肝炎病毒(HCV)及其抗體、乙型肝炎病毒(HBV)及其抗體、癌胚抗原(CEA)、C反應蛋白(CRP)、梅毒密螺旋體(TP)抗體、al抗胰蛋白酶、od-巨球蛋白、P2-巨球蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白、銅藍蛋白、鐵蛋白、胚乳、血紅蛋白A1、血紅蛋白A1C、肌球素、肌漿球蛋白、Dupan-2、甲胎蛋白(AFP)、組織多肽抗原(TPA)、載脂蛋白A-l、載脂蛋白E、風濕因子、抗鏈球菌溶血素"O"(ASO)、抗凝血酶in(AT-III)、纖溶酶-a2纖溶酶抑制物復合物(PIC)、凝血酶-抗凝血酶III復合物(TAT)、血栓調節蛋白(TM)、組織型纖溶酶原激活物抑制劑復合物(tPAIC)、甲狀腺激素(三碘甲狀腺原氨酸(T3)、游離T3(FT3)、四碘甲狀腺原氨酸(T4)、游離T4(FT4)、)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、皮質醇、胰島素等。含有上述待測物質的標本包括血液、血漿，血清和尿液等標本和對上述標本進行前處理所得試樣。作為上述前處理，比如有通過離心分離和過濾等辦法除去非溶性物質等。與上述待測物質特異性結合的抗原或抗體可以使用免疫測定用試劑盒中記述的抗原或抗體。作為上述固相的粒子可以使用免疫測定用試劑盒中記述的粒子。在上述免疫測定方法中，在含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液存在的條件下讓與復合物中待測物質結合的ALP標記物中的ALP與底物液中所含ALP的底物發生反應，可按照上述免疫測定用試劑盒中記述的方法進行。在上述競爭法的免疫測定方法中，在含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液存在的條件下讓結合到固相上的第一結合物的ALP標記物中的ALP與底物液中所含ALP的底物發生反應，可按照上述免疫測定用試劑盒中記述的方法進行。通過此步驟，在ALP標記與底物接觸的溶液中，可以一方面有效地抑制來源于標本的內源性ALP，同時催化ALP標記與底物發生酶反應。檢測ALP標記與底物發生酶反應所生成的產物的發光和顯色，即可正確地測定待測物質。檢測ALP標記與底物反應的產物的步驟可以用該
技術領域：
眾所周知的方法進行。檢測反應產物可以用適當的儀器測定反應生成物所發出的光和色等。作為該儀器，比如有分光光度計、照度計等。以下根據實施例具體說明本發明。本發明不限于這些實施例。在實施例中使用的試劑如下(1)HBs抗體試劑的制備用專利公開2006-321746號公報上記述的雜交瘤HBs-1053產生的1053抗體作為HBs抗體。用BiotinylationKit(Sulfo-OSu)((株)同仁化學研究所)生物素化HBs抗體。將所得生物素化HBs抗體溶解于0.1MMES緩沖液(pH6.5)，使濃度達到1.0|ig/mL，以此為HBs抗體試劑。雜交瘤HBs-1053由Sysmex株式會社委托國際保藏，國際保藏號為FERMBP-10582。(2)磁性粒子試劑的制備將市場銷售的鏈親和素包被磁性粒子(以下稱"ST磁性粒子")溶解于20mMMES緩沖液(pH6.5)中，使其濃度達到1%，以此為磁性粒子試劑。(3)ALP標記HBs抗體試劑的制備專利公開第2006-321746號公報上記述的雜交瘤HBs-149抗體產生的149抗體作為HBs抗體使用。用EMCS((株)同仁化學研究所)標記此HBs抗體。將所得ALP標記化HBs抗體溶解于O.lMMES緩沖液(pH6.5)，使濃度達到0.3^/mL，以此為ALP標記HBs抗體試劑。雜交瘤HBs-149由Sysmex株式會社委托國際保藏，國際保藏號為FERMBP-10583。(4)粒子分散液的制備制備含左旋咪唑的粒子分散液作為內源性ALP抑制劑。粒子分散液成份如下粒子分散液成份10mMMES緩沖液(pH6.5)ImM或2mM左旋咪唑鹽酸鹽(東京化成工業(株))(1)底物液CDP-star(注冊商標)(AppliedBiosystems)參考例1本例為調查上述(4)制備的粒子分散液中所含內源性ALP抑制劑的保存穩定性。本例中使用的粒子分散液的左旋咪唑濃度為lmM。具體而言，用上述粒子分散液進行以下加速試驗。加速試驗即將粒子分散液放入50mL容器(材質聚丙烯)中，在暗處55。C下靜置6天。靜置后將容器恢復到室溫，將粒子分散液從容器移至分光光度計用比色皿，確認有無析出。作為比較，使用了將左旋咪唑混入專利公開平成2-207800號公報上記述的高pH胺緩沖液中制備的試劑(比較試劑1)。專利公開平成2-207800號公報上記述了使用ALP的免疫測定用試劑盒，據記述，與內源性ALP抑制劑一起加入2-氨基-2-甲基-l-丙醇等指定的胺，即使在高pH條件下也可以使左旋咪唑保持穩定。比較試劑1的成份如下。試驗方法除將粒子分散液換成比較試劑1夕卜，其他與上述相同。比較試劑1的成份0.1MAMP緩沖液(pH9.6)lmM左旋咪唑鹽酸鹽(東京化成工業(株))圖2顯示了上述試驗的結果。圖2為加入了加速試驗后的各試劑的分光光度計用比色皿側面照片。圖2中的(a)為使用粒子分散液的結果，圖2中的(b)為使用比較試劑l的結果。如上所述，比較試劑1使用的緩沖液是專利公開平成2-207800號公報上記述的高pH胺緩沖液。據專利公開平成2-207800號公報上記述，在AMP等一定的高pH胺緩沖液中，在堿性條件下左旋咪唑也是穩定的。然而，從圖2(b)的結果確認，用比較試劑l時溶液中有析出。分析該析出物得知，析出物來源于左旋咪唑(數據沒有顯示)。以此可以判斷，用比較試劑l左旋咪唑保存的穩定性不好。而從圖2(a)的結果確認，粒子分散液中完全無析出。從以上得知，粒子分散液有優越的內源性ALP抑制劑保存穩定性。實施例1本例調查了上述(4)制備的粒子分散液中所含內源性ALP抑制劑降低內源性ALP影響的效果。本例中使用的粒子分散液的左旋咪唑濃度為2mM。具體而言，先用上述(1)(5)制備的試劑測定HBs抗原陰性標本的發光強度。測定方法如下首先混合25^iL標本和30pL上述HBs抗體試劑，42'C培養約3分鐘，使標本中的HBs抗原和HBs抗體試劑中的生物素化HBs抗體發生反應。然后，在此混合液中添加上述磁性粒子試劑3(HiL，培養約2分鐘，將由HBs抗原和生物素化HBs抗體組成的復合物固定在ST磁性粒子上。用約150^L清洗液(O.l%Tween20、20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5))漂洗此ST磁性粒子后，在清除了清洗液的ST磁性粒子中加入上述ALP標記HBs抗體試劑100pL，42'C下培養約3分鐘，使ALP標記HBs抗體結合到ST磁性粒子上的復合物中。用約150nL上述清洗液漂洗3次此ST磁性粒子。在清除了清洗液的ST磁性粒子中加入上述粒子分散液50pL，讓ST磁性粒子在粒子分散液中分散后，在此添加上述底物液100pL，用LUMI-COUNTER700((株)MICROTECCO)測定發光強度。作為標本使用的是41種HBs抗原陰性血清(陰性血清141)。用含有BSA的0.1MTEA緩沖液(5Q/。BSA、pH7.0)作為陰性質控品進行了測定。還用HBs抗原陽性血清作為陽性質控品進行了測定。結果見表1和表2。作為比較，用不含左旋咪唑的10mMMES緩沖液(pH6.5)(比較試劑2)取代含有左旋咪唑的粒子分散液進行了測定。測定方法除用比較試劑2取代上述粒子分散液外，其他與上述相同。結果如表1和表2所示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表中，"NP"為陰性質控品，"PC"為陽性質控品。"有左旋咪唑"一欄中顯示了用含有左旋咪唑的粒子分散液測得的發光強度計數值(Counts)。"無左旋咪唑"一欄中顯示了用不含左旋咪唑的比較試劑2測得的熒光強度計數值(Counts)。圖3和圖4為顯示各陰性標本對于發光強度計數值的分布狀態的分布圖(直方圖)。這些分布圖以橫軸為計數值，該計數值以100為單位劃分區間，以縱軸為各區間所含標本數。求HBsAg為0.03U/mL的計數值，以此為判斷值。圖3的判斷值為3092，圖4的判斷值為2855。判斷值以上則可判斷為陽性，判斷值以下則可判斷為陰性。圖3為使用不含左旋咪唑的比較試劑2的結果，根據表1和2的"無左旋咪唑"欄的發光強度計數值繪制。圖4為使用含左旋咪唑的粒子分散液的結果，根據表1和2的"有左旋咪唑"欄的發光強度計數值繪制。從圖3和圖4的結果可以看出，使用含有左旋咪唑的粒子分散液，從陰性標本獲得的發光強度差異很小，用于測定的全部陰性標本的計數值約為8001300。特別是關于在圖3顯示出較高計數值(約15002700)的陰性標本在圖4其計數值較低，其分布移至低值一側。這說明那些陰性標本是內源性ALP影響較大的標本。而且得知，使用含有左旋咪唑的粒子分散液，可以抑制這種標本中的內源性ALP，有效地消除其影響。關于圖3中在判斷值附近顯示計數值的陰性標本，在圖4其計數值變低，其分布移至低值一側。由此得知，使用含有左旋咪唑的粒子分散液可以有效地消除內源性ALP的影響，防止假陽性的發生。從以上可以知道，含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液其內源性ALP抑制劑的保存穩定性優越，使用含有這種輔助試劑液的試劑盒可以有效地抑制內源性ALP，獲得精確的測定結果。比如，使用含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液可以使內源性ALP抑制劑在ALP標記與底物酶反應的反應液中達到所需要的量，在這一點上也比使用含有內源性ALP抑制劑的清洗液更有利。而且，以粒子為固相、以輔助試劑液為粒子分散液的免疫測定有時清洗液的用量比一項測定中粒子分散液的用量還多。比如，在上述實施例中，在一次測定中粒子分散液為50pL，而清洗液約為900ML。這樣，使用含有內源性ALP抑制劑的輔助試劑液(粒子分散液)可比使用含有內源性ALP抑制劑的清洗液降低內源性ALP抑制劑相關成本。權利要求1.一種堿性磷酸酶標記檢測用試劑盒，包括可與靶向物質結合的堿性磷酸酶標記物，堿性磷酸酶相應的底物，含抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與所述靶向物質結合的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述靶向物質是含待測物質和經抗原抗體反應可與之結合的第一結合物的復合物中的待測物質。3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于可用于競爭法免疫測定，此時所述靶向物質指經抗原抗體反應可與待測物質結合的第一結合物。4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標記物含可與耙向物質結合的第二結合物和堿性磷酸酶。5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于含有所述輔助試劑液的堿性磷酸酶和底物的反應液為堿性。6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述底物液為堿性。7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述輔助試劑液為中性或酸性。8.如.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述底物液和所述輔助試劑液含有緩沖劑，所述底物液有大于所述輔助試劑液的緩沖能。9.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述抑制劑為左旋咪唑。10.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶為來源于細菌的堿性磷酸酶或來源于腸的堿性磷酸酶。11.一種免疫測定用試劑盒，包括經抗原抗體反應可與待測物質結合的第一結合物，固定含第一結合物和待測物質的復合物的固相，可與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物，含有堿性磷酸酶相應底物的底物液；及含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。12.—種使用競爭法的免疫測定用試劑盒，包括堿性磷酸酶標記物，可通過抗體抗原反應與待測物質和堿性磷酸酶標記物結合的第一結合物，固定第一結合物的固相，含有堿性磷酸酶相應底物的底物液；及含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與第一結合物結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。13.—種免疫測定的方法，包括固定步驟，在固相上形成一種復合物，所述復合物含有標本中的待測物質、可與待測物質結合的堿性磷酸酶標記物、經抗原抗體反應可與待測物質結合的、并可與固相結合的第一結合物；反應步驟，讓與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶與底物液中所含堿性磷酸酶相應底物在含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑的輔助試劑液存在的情況下發生反應；及測定步驟，檢測堿性磷酸酶與底物反應生成的產物。14.一種使用競爭法的免疫測定方法，包括混合步驟，將標本、堿性磷酸酶標記物、經抗原抗體反應可與堿性磷酸酶標記物和標本中的待測物質結合的第一結合物和固定第一結合物的固相混合起來；反應步驟，讓與固定在固相上的第一結合物結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶與底物液中所含堿性磷酸酶相應底物在含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑的輔助試劑液存在的情況下發生反應；及測定步驟，檢測堿性磷酸酶與底物反應生成的產物。15.如權利要求14所述的方法，其特征在于所述混合步驟可以先混合標本、第一結合物和固相后，再在所得的混合物中混入堿性磷酸酶標記16.如權利要求14所述的方法，其特征在于所述混合步驟可以先混合標本、第一結合物和堿性磷酸酶標記物后，再在所得的混合物中混入固相。全文摘要本發明提供一種堿性磷酸酶標記檢測用試劑盒，包括可與靶向物質結合的堿性磷酸酶標記物，相應底物，含抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與上述靶向物質結合的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。免疫測定用試劑盒，包括經抗原抗體反應與待測物質結合的第一結合物，固定含第一結合物和待測物質的復合物的固相，與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物，含有堿性磷酸酶相應底物的底物液；含有抑制內源性堿性磷酸酶的抑制劑、在與復合物中待測物質結合的堿性磷酸酶標記物的堿性磷酸酶和底物反應時添加的輔助試劑液。免疫測定的方法，包括固定步驟在固相上形成一種復合物；反應步驟讓堿性磷酸酶與相應底物反應；測定步驟檢測產物。文檔編號C12Q1/42GK101281200SQ200810090640公開日2008年10月8日申請日期2008年4月2日優先權日2007年4月3日發明者土屋博,小田原卓哉申請人:希森美康株式會社