專利名稱：：豬瘟重組腺病毒及其在制備豬瘟基因工程疫苗中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及重組病毒，尤其涉及一株豬瘟重組腺病毒，本方面還涉及該重組腺病毒在制備豬瘟基因工程疫苗中的用途，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：豬瘟(classicalswinefever，CSF)是由豬癟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種嚴重危害養豬業的毀滅性傳染病。該病死亡率高達80-90%，世界動物衛生組織(0IE)將其列入OIE疾病名錄，我國也將其列為一類傳染病。CSFV為有囊膜的正鏈RNA病毒(Moe皿igV.Introductiontoclassicalswinefevervirus,diseaseandcontrolpolicy.VetMicrobiol,2000，73(2-3):93-102.),其基因組大小約為12.3kb，含有一個大的開放閱讀框架(0RF)，編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，此多聚蛋白經病毒和宿主細胞酶的作用，形成4個成熟的結構蛋白(C、Es、E1和E2)以及至少7個非結構蛋白。E^和E2糖蛋白是CSFV的主要保護性抗原，均能獨自誘導機體產生中和性抗體，保護機體免受強毒的攻擊(MeyersQTautzN，StarkR,etal.Rearrangementofviralsequencesincytopathogenicpestiviruses.Virology,1992,91(l):368-386.)。E2蛋白由ORF編碼的^Arg至^Leu之間的370個氨基酸殘基組成，位于病毒囊膜表面，參與病毒的感染過程。在豬瘟病毒編碼的蛋白中，E2是最不保守的一種蛋白，但又是豬瘟病毒的主要保護性抗原，能誘導機體產生中和抗體，成為近年來研制新型疫苗和血清學診斷抗原的主要靶蛋白。隨著分子生物學技術的迅速發展，特別是重組DNA技術的建立，使得各種病毒用作載體成為可能。目前比較成熟的病毒載體主要有逆轉錄病毒、腺病毒及痘苗病毒等載體。其中，腺病毒載體以其安全、高效、宿主范圍廣、轉移和表達外源基因能力強的特點，成為繼逆轉錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應用較廣的一種基因載體(AdamE,NaszI.Significanceofrecombinantadenovirusinexperimentalgenetherapy.OrvHetil，1995,136(15):755-761.)，尤其是復制缺陷型人血清5型腺病毒載體，近年來在重組病毒活載體疫苗的構建上得到了廣泛的應用，這種載體到目前為止已經發展到了第三代，由于缺失了病毒非必要基因區(El/E3)，使得能夠攜帶大片段的外源基因，而且只能夠在特定的細胞系中繁殖。另外，該載體系統還引入了CMV啟動子，使得外源基因可以高水平的表達(Ambriovi6A，AdamM，MonteilM,etal.Efficacyofreplication-defectiveadenovirus畫vectoredvaccines:protectionfollowingintramuscularinjectionislinkedtopromoterefficiencyinmusclerepresentativecells.Virology,1997,238(2)327-335.)。近年來，E1和E3區缺失的腺病毒載體越來越得到研究者的青睞，因為這種載體有諸多優勢易于制備，操作方便，可攜帶較大的外源片段，可感染的宿主細胞多，導入效率高，理化性質穩定，易于分離純化，不整合到宿主細胞的基因組(Randrianarison畫JewtoukoffV，PerricaudetM.Recombinantadenovirusesasvaccines.Biologicals,1995，23(2):145-157.)。另外，重組腺病毒可同時表達多個基因，而且還可以對表達產物進行正確的翻譯后修飾，應用這種腺病毒載體構建的活載體疫苗在誘導體液免疫上較DNA疫苗及滅活疫苗效果好，而且在動物體內不存在人腺病毒抗體，不用考慮母源抗體的干擾問題(BangariDS，MittalSK.Developmentofnonhumanadenovirusesasvaccinevectors.Vaccine,2006，24(7):849-862.)。諸多研究證實，利用腺病毒載體構建重組病毒疫苗有很好的免疫效果。Wang等(2006)構建了表達豬圓環病毒2型衣殼蛋白的重組腺病毒，將此重組病毒免疫豬后，能夠檢測到高水平的特異性抗體，攻毒后免疫豬得到完全保護(WangX,JiangP,LiY,etal.Protectionofpigsagainstpost-weaningmultisystemicwastingsyndromebyarecombinantadenovirusexpressingthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.VetMicrobiol,2007，121(3-4):215—224.)。Zhou等(2007)構建了雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白(M0MP)基因的重組腺病毒，用重組腺病毒免疫SPF雛雞，然后用強毒菌株攻擊，90%的雛雞獲得了保護(ZhouJ，QiuC，CaoXA,etal.Constructionandimmunogenicityofrecombinantadenovirusexpressingthemajoroutermembraneprotein(MOMP)ofCWawjv^op/z//"戸/toc/inchicks.Vaccine,2007,25(34):6367~6372.)。Wesley等(2004)4各表達H3N2亞型豬流感病毒核蛋白和血凝素蛋白的重組腺病毒免疫了豬，4w后就產生了病毒特異性的HI抗體，并對強毒的攻擊產生了完全的保護作用(WesleyRD,TangM,LagerKM.Protectionofweanedpigsbyvaccinationwithhumanadenovirus5recombinantvirusesexpressingthehemagglutininandthenucleoproteinofH3N2swineinfluenzavirus.Vaccine，2004,22(25-26):3427-3434.)。迄今為止，尚缺乏一種含有豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒，該重組腺病毒具有良好的免疫效力，可用于制備豬瘟疫苗。
發明內容本發明目的是提供一株重組腺病毒，該重組腺病毒含有豬瘟病毒E2基因，具有良好的免疫效力，可用于制備豬瘟疫苗。本發明目的是通過以下技術方案來實現的一株重組腺病毒，命名為rAdV-E2，其微生物保藏號是CGMCCNo.2429;分類命名豬瘟重組腺病毒；保藏時間2008年4月1日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所。本發明為了明確腺病毒是否可以作為豬瘟基因工程疫苗的載體，構建了表達CSFVE2基因的重組腺病毒，并在家兔上評價了其免疫效力。本發明應用復制缺陷型人血清5型腺病毒載體系統，構建了含有豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒rAdV-E2，應用Westernblot及間接免疫熒光試驗均能檢測到豬瘟病毒E2蛋白的表達。通過比較rAdV-E2與其親本病毒的一步生長曲線，發SL二者在增殖特點上沒有明顯區別。為了分析rAdV-E2是否具有免疫效力，本發明在兔體上進行了免疫攻毒試驗。實驗結果顯示，免疫后2周即可檢測到豬瘟特異性抗體的產生，在免疫后5周抗體滴度達到峰值(部分家兔抗體阻斷率達到80%以上)，這說明本發明所構建的重組腺病毒rAdV-E2具有較好的免疫原性。豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是在家兔上反復傳代致弱而得到的一株豬瘟弱毒疫苗，對豬只有良好的安全性和免疫效力。盡管C株對各種年齡豬沒有致病性，但對家兔(特別是大白兔)有一定的致病性，通過耳靜脈接種家兔可以產生定型熱(體溫升高rc以上，持續i2h以上)，并且疫苗病毒在體內淋巴組織內廣泛復制，其中脾臟中病毒含量最高。因此，通常采用耳靜脈接種家兔，在其發熱后期取其脾臟來制備c株疫苗種毒。接種過c株的家兔(獲得免疫保護)再次接種c株時則不再出現定型熱。利用c株在家兔上的這一特點，可以評價疫苗的免疫效力。鑒于此，本發明以家兔作為模型評價了所構建的重組腺病毒rAdV-E2的免疫效力。首先用rAdV-E2接種家兔，然后用C株進行攻擊，實驗結果顯示，接種rAdV-E2的家兔與接種C株的家兔一樣，攻毒后均未出現定型熱，并且用實時熒光定量RT-PCR從其脾臟中均未檢出C株的病毒RNA，而接種野生型腺病毒的對照家兔在攻毒后全部出現定型熱，并且在其脾臟中可檢出大量拷貝的C株病毒RNA(103拷貝數/uL以上)，這表明，本發明所構建的rAdV-E2可以保護家兔免于C株的攻擊，具有良好的免疫效力，可用于制備豬瘟基因工程疫苗。圖1重組腺病毒rAdV-E2感染293細胞后引起的細胞病變；A:正常293細胞；B:rAdV-E2感染的293細胞。圖2重組腺病毒rAdV-E2的PCR鑒定；M:DL2000分子量標準；1-3:第6、8和10代rAdV-E2;4:水對照。圖3用間接免疫熒光試驗檢測E2蛋白在重組腺病毒rAdV-E2感染293細胞中的表達；A:rAdV-E2感染的293細胞；B:正常293細胞。圖4用Westernblot分析E2蛋白在重組腺病毒rAdV_E2感染293細胞的表達；1:蛋白質分子量標準；2:rAdV-E2細胞裂解上清；3:桿狀病毒表達的重組E2蛋白；4:正常293培養液上清；5:野生型腺病毒。圖5重組腺病毒rAdV-E2的一步生長曲線。圖6重組腺病毒rAdV-E2免疫兔后產生的抗體滴度。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實驗材料質粒、載體和生化試劑腺病毒載體系統包括腺病毒骨架載體pAdEasy-l和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV、以及大腸桿菌BJ5183感受態菌均購自Stratagene公司；質粒pCDST(含有CSFVE2基因的質粒)可按照文獻所公開的方法進，亍構建(YuX,TuC，LiH，etal.DNA-mediatedprotectionagainstclassicalswinefevervirus.Vaccine,2001Jan8;19(11-12):1520畫5.);大腸桿菌JM109、DH5a感受態細胞和293T細胞由哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點試驗室保存；ftnel和PacI均為NEBBioLabs產品。實施例1重組腺病毒rAdV-E2的構建及鑒定1.1重組腺病毒穿梭載體的構建用限制性內切酶^HI和EcoRV雙酶切腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，純化回收酶切后的載體；用BainHI和EcoRV雙酶切pCDST，純化回收酶切后的E2基因；將目的基因E2與穿梭載體連接，按常規方法轉化至JM109感受態菌，經卡那霉素抗性篩選，挑取單個抗性菌落接種至5mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，培養過夜，提取質粒，進行PCR、酶切和測序鑒定，測序正確的命名為pSC-E2。1.2重組腺病毒質粒的獲得將pSC-E2用限制性內切酶Rziel線性化，電轉化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-1的BJ5183感受態菌(AdEasy-1-BJ5183)中。經卡那霉素抗性篩選，提取質粒，用PacI酶切鑒定，將陽性重組腺病毒質粒進行測序，正確的命名為pAdV-E2。1.3轉染將pAdV-E2轉化DH5a感受態菌，以大量增殖重組質粒。用質粒中量提取試劑盒提取重組腺病毒質粒，用PacI酶切，乙醇沉淀滅菌，超凈工作臺無菌吹干，用無菌超純水溶解沉淀，保證質粒的濃度約為1-2pg/|iL，用Lipofectamine2000轉染試劑進行轉染，具體操作按說明書進行。1.4重組腺病毒的純化與鑒定將包裝的初代重組腺病毒(命名為rAdV-E2)反復凍融后，離心取上清，接種293細胞，連續傳10代，觀察細胞病變情況；取6、8和10代病毒，用蛋白酶K處理后，通過PCR檢測目的基因。同時取6、8和10代重組腺病毒感染的293細胞，用豬瘟病毒E2單抗6E10(彭伍平.利用噬菌體展示技術鑒定豬瘟病毒E2蛋白抗原表位.中國農業科學院研究生院碩士論文，2007)和HQ06(侯強，彭伍平，孫元等.豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區編碼基因的原核表達及其單克隆抗體的制備.中國獸醫科學，2008，38(1):1-5)進行間接免疫熒光試驗及Westernblot分析，以檢測目的基因的表達情況。實驗結果重組腺病毒傳至第5代后，于24-48h內細胞病變完全(細胞變大、變圓、聚集成葡萄串樣)(圖1)。取第6、8和10代重組病毒，用PCR均能檢測到目的基因(1.2kb)(圖2)。用間接免疫熒光試驗及Westernblot均能檢測到目的基因的表達(圖3和圖4)。1.5重組病毒增殖滴度測定分別用103TCID5。重組腺病毒(rAdV-E2)和其親本病毒(野生型腺病毒，wtAdV)接種293細胞，分別于接毒后12、24、36、48、60和72h收取病毒并進行毒價測定，建立重組腺病毒與野生型病毒的一步生長曲線，分析兩者在生長動力學上是否存在差異。實驗結果通過病毒滴度測定，發現重組腺病毒rAdV-E2與其親本病毒生長曲線沒有明顯差異(圖5)。電鏡觀察顯示，重組病毒感染293細胞后24h,可觀察到少量完整病毒粒子，大部分沒有核酸；在感染后48h病毒粒子幾乎全部組裝完全，病毒滴度達到峰值，隨后逐漸減少。試驗例1重組病毒rAdV-E2的免疫效力試驗一、實驗方法選取豬瘟抗體陰性的長耳白兔15只(購自黑龍江省生物制品一廠)隨機分成3組，每組5只，第一組經后腿肌肉注射接種108TCID5。(lmL)的重組腺病毒rAdV-E2，第二組經同樣途徑接種同樣劑量的野生型腺病毒(wtAdV)，第三組通過耳靜脈注射100RID5。的豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)。免疫后每周對所有家兔通過耳靜脈采血，收集血清，應用阻斷ELISA試劑盒(IDEXX公司)按說明書檢測豬瘟抗體。免疫后6周，用100RIDs。C株通過耳靜脈接種對所有試驗兔進行攻擊，攻毒后每隔6小時測定家兔直腸溫度，連續測定3天，確定家兔是否存在定型熱反應。攻毒后3天，咅峰所有試驗兔，采集脾臟，應用已報到的實時熒光定量RT-PCR^檢測其中C株病毒RNA含量。二、實驗結果1、重組病毒rAdV-E2誘導的免疫應答rAdV-E2免疫兔于免疫后2周開始產生豬瘟特異性抗體(抗體阻斷率達到40%以上)，隨后抗體水平逐漸升高，于免疫后5周抗體達到峰值，而wtAdV免疫兔一直沒有產生豬瘟特異性抗體(圖6)。2、重組病毒rAdV-E2對家兔的保護作用攻毒后rAdV-E2免疫兔和C株免疫兔均未出現定型熱反應，而對照組家兔全部出現了定型熱反應(表l)，實時熒光定量RT-PCR檢測表明，從rAdV-E2免疫兔均沒有檢測到C株病毒RNA，而從對照兔均能檢測到，且病毒RNA含量達到了103拷貝/uL(表2)。說明免疫rAdV-E2后誘導機體產生了針對豬瘟的特異性抗體，該抗體對豬瘟病毒的攻擊具有保護作用。表l用C株攻毒后免疫兔產生的定型熱反應<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注連續3次測溫體溫升高rc以上，判定為有定型熱反應。表2用實時熒光定量RT-PCR檢測攻毒后免疫兔脾臟內豬瘟病毒RNA含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>一注"-"未檢出。權利要求1、一株表達豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒rAdV-E2，其微生物保藏號是CGMCCNo.2429。2、由權利要求1所述的重組腺病毒rAdV-E2衍生的其它重組腺病毒。3、一種豬瘟基因工程疫苗，其特征在于含有權利要求l所述的重組腺病毒rAdV-E2。4、權利要求1所述的重組腺病毒rAdV-E2在制備豬瘟疫苗中的用途。全文摘要本發明公開了一株重組腺病毒rAdV-E2，其微生物保藏號是CGMCCNo.2429。本發明應用復制缺陷型腺病毒載體系統，構建了含有豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒rAdV-E2，并以家兔作為模型，評價了rAdV-E2的免疫效力，試驗結果顯示，免疫后2周免疫兔產生了豬瘟特異性抗體，在免疫后5周抗體滴度達到峰值，免疫兔可以抵抗豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)的攻擊，表明本發明rAdV-E2具有良好的免疫效力，可用于制備豬瘟基因工程疫苗。文檔編號C12N15/861GK101285056SQ20081009321公開日2008年10月15日申請日期2008年4月23日優先權日2008年4月23日發明者于墨陽,仇華吉,元孫,丹成,朱慶虎,娜李,梁冰冰,涂長春,王宇飛,祁巧芬申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所