專利名稱：：抗除草劑的大蒜的制備方法及由其制備的抗除草劑的大蒜的制作方法抗除草劑的大蒜的制備方法及由其制備的抗除草劑的大蒜
技術領域：
：本發明涉及抗除草劑的大蒜植物體的制備方法以及由該方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。
背景技術：
：大蒜與洋蔥及蔥同為百合科作物，在經過漫長的栽培以及體細胞突變后，在全世界范圍內選擇性地分化為多個地域種(Pooler，M.R.andP.W.Simon.1993.Euphytica68:121-130)。但其遺傳變異非常有限。特別是由于不能有性繁殖，因此不能通過基因重組和雜交來培育品種。再者，作為營養繁殖作物，大蒜因感染病毒數量驟降，根據報道，因感染OYDV而減少的大蒜數量達到36-60%(Lotetal.，1994.PlantPathol.43:537-546)。大蒜栽培中存在的問題之一是，除草費功夫，并且在高溫期沒有適當的除草劑。為了開發大蒜的培育方法、挖掘大蒜的功能性基因，需要開發轉化的方法。為了成功地進行轉化需要開發出將外部基因導入蔥屬植物的基因組的詳細方法。根據報道，蔥屬植物轉化困難，蔥屬植物的轉化中最常用的方法是利用根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)禾卩基因槍法。Dommisse等(Dommisseetal.,1990.PlantScience69:249-257)利用根癌農桿菌(11種)、懸鉤子土壤桿菌(A.rubi)(1種)、發根土壤桿菌(A.rhizogenes)(6種)從洋蔥中確認了根瘤反應和冠瘦瘤生產，因此提示了轉化的可能性。最近Eady(Eady，C.C.1995.NewZealandJ.ofCropandHorticulturalScience23:239-250，Eadyetal.，2000.PlantCellRep.19:376-381)禾口Zheng(Zhengetal,,2001.MolecularBreeding7，101-115)確認了利用農桿菌在洋蔥的合子胚和未成熟胚上進行轉化，并且gusA基因可以穩定表達，而Zheng利用墳丘形洋蔥即冬蔥(shallot)實現了1.95。/。的轉化率。報道轉化大蒜的事例已有三件:kondo等(KondoT，H.Hasegawa,andM.Suzuki.2000.PlantCellRep.19(10):989-993)對從原生質體中誘導出的愈傷組織進行農桿菌的轉化，確認了gusA的表達;Park等(Park，M.Y.2000.PhDDiss.,SeoulNationalUniversity)利用基因槍法導入了對除草劑具有抗性的乙酸乳酸合成酶基因；Zheng等(Zhengetal.，2001.MolecularBreeding7,101-115)利用根癌農桿菌導入BT抗性基因，但是轉化效率不高。到現在為止，己開發的除草劑抗性基因有bar、aroA、bxn(Powlesetal.，1997.In:sparksDL(ed)AdvAgron58:57-93)基因。目前，己從吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中分離出對除草劑具有抗性的bar基因，并用于開發(Thompsonetal.，1987EMBOJ.6(9):25:2516-2523)除草劑抗性作物。據報道，在世界范圍內用于商業目的的抗除草劑作物有大豆、玉米、棉花、油菜等，占世界轉化作物栽培面積(1億200萬公頃)的68%(JamesC.2006.ISAAAbriefs35-2006.www.isaaa.org)，且以后還會急劇增加。
發明內容本發明是為了滿足上述的要求而提出的。本發明利用農桿菌把除草劑抗性基因導入到大蒜里，以制備抗除草劑的大蒜。為了解決上述課題，本發明提供了制備抗除草劑的大蒜植物體的方法以及用這種方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。具體方法如下(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和0.05-0.25mg/L的卩引哚基乙酸(IAA)的MS培養基上培養7-9周，以誘導產生愈傷組織的階段；(2)將上述經過誘導產生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達載體的根癌農桿菌在共同培養基上共同培養，以進行轉化的階段，所述重組植物表達載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經過共同培養的大蒜細胞接種到添加有抗生素的選擇性培養基上培養11-13周，以進行篩選的階段；以及(4)將上述經過篩選的大蒜細胞接種到再分化培養基上，以進行再分化的階段。根據本發明，可以提供抗除草劑的大蒜以解決大蒜栽培中存在的除草問題，從而提高農民的收獲。圖1是轉化載體pBmP35sGFPHYR的示意圖。圖2是轉化的大蒜組織表達GFP的圖片(A:GFP的瞬時表達；B，C:GFP在愈傷組織12周后的表達)。圖3是轉化的大蒜的再分化植株。圖4是確認轉化體中潮霉素基因的PCR分析圖(泳道M:lkbDNA梯度分子量標記；泳道P:質粒pBmP35sGFPHYR;泳道N:沒有轉化的個體；泳道1-13:轉化的個體)。圖5是使用限制酶//^^///對轉化的植物體進行DNA分析的結果圖(泳道N:沒有轉化的個體；泳道1-13:轉化的個體)。圖6是在轉化的植物體中GFP表達的圖(A:轉化的植物體；B:沒有轉化的植物體的幼胚；C:轉化的植物體的幼胚)。圖7是對噴施0.5%的草銨磷表現出的除草劑抗性結果(A:沒有轉化的個體；B:轉化的植物體)。具體實施方式、為了實現本發明的目的，本發明提供了采用4個如下階段制備抗除草劑的大蒜植物體的方法(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2,4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和0.05-0.25mg/L的IAA的MS培養基上培養7-9周，以誘導產生愈傷組織的階段；(2)將上述經過誘導產生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達載體的根癌農桿菌在共同培養基上共同培養，以進行轉化的階段，所述重組植物表達載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經過共同培養的大蒜細胞接種到添加有抗生素的選擇性培養基上培養11-13周，以進行篩選的階段；以及(4)將上述經過篩選的大蒜細胞接種到再分化培養基上，以進行再分化的階段。首先，為了得到植物體細胞胚的愈傷組織，把大蒜的根接種到添加有植物生長調節物質的MS(Murashige&Skoog,MS)培養基上進行植物體細胞胚的誘導。這時的植物生長調節物質有2，4-D和IAA，如在本發明的誘導產生愈傷組織的第(1)階段中，最好在MS培養基中添加0.5-2mg/L的2，4-D和0.05-0.25mg/L的IAA，其中，2，4-D和IAA的最適的濃度分別是lmg/L和0.2mg/。在所述的第(2)階段中，植物表達載體是插入有抗除草劑基因的載體，其中抗除草劑基因可以是bar、aroA、bxn等等，優選為bar基因。導入bar基因的大蒜可以通過草銨磷篩選。上述植物表達載體最好是圖1中的pBmP35sGFPHYR載體。上述載體中插入了連接有綠色熒光蛋白(GFP)基因和潮霉素基因的bar基因，該bar基因連接Pnos啟動子和Tnos終止子。在所述的(2)階段中，所述共同培養的時間可以是5-7天，優選為6天。在這里所講的共同培養的時間是指把大蒜愈傷組織和具有重組植物表達載體的根癌農桿菌進行共同培養以將載體導入到大蒜愈傷組織中的時間。在所述的(2)階段中，所述共同培養的培養基是添加有0.5-2mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)和150-250mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏(chu)培養基，或者是添加有0.5-2mM的MES和150-250mg/L的半胱氨酸以及50-150mg/L的二硫蘇糖醇(DTT)的l/2chu培養基；其中，優選的培養基是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2chu培養基或者是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的DTT的1/2chu的培養基。最優選的培養基是添加有lmM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2chu培養基。在所述的第(3)階段中，在選擇性培養基上培養大蒜細胞11-13周，其中，最優選為12周。所使用的抗生素可以是用于植物重組表達載體抗性基因的潮霉素和卡那霉素等。在所述的第(4)階段中，所使用的再分化培養基中添加有4-6mg/L的激動素和0.5-2mg/L的萘乙酸(NAA);其中，最優選添加有5mg/L的激動素和lmg/L的NAA。本發明還提供了上述方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。因導入的抗除草劑基因不同，大蒜對于不同的除草劑具有相應的抗性。比如，當導入抗除草劑基因為bar時，則對于除草劑草銨磷具有抗性。因此，用本發明的方法制備的抗除草劑的大蒜有效地解決了大蒜栽培中的除草問題。以下利用實施例詳細說明本發明。但是，實施例的目的只是用于說明本發明，本發明并不局限于這些實施例。實驗方法1、在培養的植物體中誘導產生愈傷組織以及對植物體進行再分化產生植物體是通過誘導培養在培養基中的大蒜的根所產生的愈傷組織而實現的。為了從根組織中誘導產生愈傷組織，選擇適當濃度的2，4-D、IAA和NAA的組合(表l)，培養8周后，從根組織中誘導出愈傷組織。且為了從愈傷組織再分化成植物體，可以選擇適當的激動素和NAA的組合(表3)。2、轉化以及篩選轉化載體是連接有綠色熒光蛋白(GFP)基因和潮霉素基因的bar基因插入在pBm43GW中所形成的pBmP35sGFPHYR載體，所述bar基因連接Pnos啟動子和Tnos終止子(圖1)。EHA101是農桿菌菌株，且在LB培養基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl)上培養2天后，轉移到轉化培養基中懸浮培養，將在600nm處的吸光值調整到1.0。將愈傷組織接種到添加有IOO)liM的乙酰丁香酮的共同培養基上培養10分鐘以上。為了觀察不同條件的共同培養基對轉化效率的影響，如表2所示，使用了N6(Chuetal.，1975.Sci.Sinica18:659-668)、1/2N6、MS(MurashigeT，RSkoog.1962.PhysiolPlant15:473-479)、B5(Gamborgetal.,1968.Exp.CellRes.18:434-437)等培養基。且為了觀察硫氧化物的影響，在各種培養基中添加以下物質以觀察組合的效果，如表2所示，在MS培養基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在N6培養基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在B5培養基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在1/2N6培養基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)、DTT(100mg/L)。共同培養一般是在22。C下暗培養3-6天。在添加25mg/L的潮霉素、100mg/L的萬古霉素、200mg/L的頭噻孢肟、lmg/L的2，4-D和0.2mg/L的IAA的MS培養基上培養12周。為了有效篩選轉化的組織，在顯微鏡下篩選穩定表達GFP的組織。再分化的植物體在MS培養基上培養4周后通過馴化移栽到溫室。3、轉化體的分析取0.5g植物體的葉片，用DNAQIAamp試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)提取植物體的DNA，然后以潮霉素基因的5'端啟動子5'陽GCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3，(如SEQIDNo.:l)和3'端終止子5'-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3，(如SEQIDNo.:2)進行PCR，擴增所需的潮霉素基因片段。PCR條件包括在95t:下加熱2分鐘，然后在以下條件下進行30個循環在92。C下加熱30秒，62。C下加熱30秒，以及72。C下加熱60秒。通過在顯微鏡下觀察GFP的表達來篩選在共同培養期間和繼代培養期間轉化的愈傷組織和轉化的植物體。在馴化10周左右后，在植物體上噴施0.5%的草銨磷來進行生物鑒定，并且對轉化的大蒜還進行了DNA分析。首先提取大蒜的基因組DNA，提取方法是取溫室里的大蒜植物體的葉子2-3g，以Dellaporta等(Dellaportaetal.，1983.AplantDNAminipreparation:version2.PlantMolecularBiologyReporter1,19-22)的方法提取DNA，然后用Nanodr叩分光光度計ND-1000)測定它的濃度，接著把25昭/L的各種DNA樣品用100單位的///^////進行消化，然后把消化的DNA在1%濃度的瓊脂糖凝膠中電泳17個小時(0.5倍的TBE，25V)。DNA通過毛細管作用轉移到尼龍HyboncTM-W膜(AmershamLifescience,英國)上以進行雜交。使用RedyprimellRandomPrimeLabelingSystem(AmershamLifescience,英國)對通過PCR從30ng的bar基因中得到的產物DNA進行標記。雜交和印跡的洗滌按照標準方法進行。為了識別標志，使用了BAS-1800IIBio-Imaging分析儀(FUJIFILM)。實施例1、從培養的植物體的根組織中誘導產生愈傷組織以及對植物體進行再分化從培養的大蒜植物體的根組織誘導愈傷組織時，在MS培養基中添加2，4-D和IAA比添加2,4-D和2ip(異戊烯基腺苷)誘導產生愈傷組織的誘導率高83%。添加的2，4-D和IAA的最適的濃度分別是lmg/L和0.2mg/L(表1)。如果2,4-D和IAA的濃度偏高時，將影響植物體的再分化。在添加5mg/L激動素和lmg/LNAA的培養基中進行植物體的再分化時，再分化率達到51%,但是，只添加激動素時植物體不能進行再分化(表3)。實施例2、轉化以及篩選研究表明在大蒜基因轉化中，農桿菌和愈傷組織共同培養6天時愈傷組織的GFP表達比較多；當在添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2N6培養基中，或在添加有lmM的MES和200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的DTT的1/2N6培養基中共同培養培養6天左右時，可以提高轉換效率；其中，最好的組合是在1/2N6培養基中添加lmM的MES和200mg/L的半胱氨酸(表2)。在這種條件下比別的方法更有效地提高了轉化的效率。轉化體的篩選是通過把細胞體接種到添加有25mg/L的潮霉素的MS培養基上進行的；培養12周后，將在顯微鏡下鑒定為表達GFP的組織進行繼代培養(圖2和圖3)。以前是以gusA為標記基因，在觀察組織后，被觀察的組織不能被再利用；但是，本發明的方法是以GFP為標記基因，因此可以隨時觀察GFP的表達部位，且可以對篩選出的表達GFP的愈傷組織的部位進行培養，所以對轉化體的篩選有更好的效果。當表達GFP的愈傷組織大小達到3mm時，接種到再分化培養基上培養8周，以對植物體進行再分化。把再分化的植物體接種到MS培養基上進行4周的馴化過程，然后移栽到溫室栽培。實施例3、對轉化體的分析為了篩選轉化的組織，共同培養6天后在顯微鏡下觀察瞬時的表達，發現在再分化植物體的根，莖，葉中也顯著表達GFP(圖6)。采用以潮霉素基因為引物進行PCR的方法分析轉化體，結果發現轉化的植物體中擴增出大量的895bp大小的DNA片段，而沒有轉化的植物體中沒有觀察到擴增的DNA片段(圖4)。此外，用限制酶酶切轉化體的基因組DNA，進行DNA雜交，分析出除草劑抗性基因是否轉到植物體中(圖5)。為了確認除草劑抗性基因是否轉到植物體中，還進行了生物鑒定。把0.5%的草銨磷噴施到溫室栽培的大蒜植物體上，6天后觀察，發現轉化的植物體正常，而沒有轉化的植物體已經死亡(圖7)。表l、大蒜的愈傷組織的形成率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1)形成的愈傷組織的數目/取的根組織的數目表2、在不同的共同培養基中培養時表達的GFP數目<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>l)MES:lmM;半胱氨酸200mg/L;DTT:100mg/L表3、植物體的愈傷組織的再分化率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1)植物體的再分化的愈傷組織的數目/選取的愈傷組織的數目序列表<110>韓國農村振興廳<120>抗除草劑的大蒜的制備方法及由其制備的抗除草劑的大蒜<160>2<170>Kopatentln1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gctgcgccgatggtttctacaa<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2gcgcgtctgctgctccatacaa權利要求1、一種抗除草劑的大蒜植物體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下階段(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.05-0.25mg/L的吲哚基乙酸的MS培養基上培養7-9周，以誘導產生大蒜愈傷組織的階段；(2)將上述經過誘導產生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達載體的根癌農桿菌在共同培養基上共同培養，以進行轉化的階段，所述重組植物表達載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經過共同培養的大蒜細胞接種到添加有抗生素的選擇性培養基上培養11-13周，以進行篩選的階段；以及(4)將上述經過篩選的大蒜細胞接種到再分化培養基上，以進行再分化的階段。2、根據權利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述抗除草劑基因為bar基因。3、根據權利要求2所述的方法，其中，所述植物表達載體為圖1中的pBmP35sGFPHYR載體。4、根據權利要求1所述的方法，其中，在所述第(1)階段中，所述MS培養基中添加有lmg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.2mg/L的吲哚基乙酸。5、根據權利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養的時間為5-7天。6、根據權利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養基為添加有0.5-2mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸和150-250mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培養基，或者為添加有0.5-2mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸、150-250mg/L的半胱氨酸以及50-150mg/L的二硫蘇糖醇的1/2楚氏培養基。7、根據權利要求6所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養基為添加有lmM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸和200mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培養基，或者為添加有lmM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸、200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的二硫蘇糖醇的1/2楚氏培養基。8、根據權利要求7所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養基為添加有lmM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸和200mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培養基。9、根據權利要求1所述的方法，其中，在所述第(3)階段中，在所述添加有抗生素的選擇性培養基上培養12周。10、根據權利要求1所述的方法，其中，在所述第(4)階段中，在所述再分化培養基中添加有4-6mg/L的激動素和0.5-2mg/L的萘乙酸。11、根據權利要求10所述的方法，其中，在所述第(4)階段中，在所述再分化培養基中添加有5mg/L的激動素和lmg/L的萘乙酸。12、一種抗除草劑的大蒜植物體，其特征在于，該抗除草劑的大蒜植物體是根據權利要求1-11中的任意一項所述的方法制備的。全文摘要本發明是關于抗除草劑的大蒜植物體的制備方法以及由該方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。具體地說，所述抗除草劑的大蒜植物體的制備方法包括以下階段(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.05-0.25mg/L的吲哚基乙酸的MS培養基上培養7-9周，以誘導產生大蒜愈傷組織的階段；(2)將上述經過誘導產生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達載體的根癌農桿菌在共同培養基上共同培養，以進行轉化的階段，所述重組植物表達載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經過共同培養的大蒜細胞接種到添加有抗生素的選擇性培養基上培養11-13周，以進行篩選的階段；以及(4)將上述經過選擇的大蒜細胞接種到再分化培養基上，以進行再分化的階段。文檔編號C12N15/29GK101451139SQ200810178430公開日2009年6月10日申請日期2008年11月26日優先權日2007年12月3日發明者安栗均,尹武卿,郭正浩,高官達申請人:韓國農村振興廳