檢測食品沙門氏菌的Taqman探針熒光定量PCR方法

專利名稱：：檢測食品沙門氏菌的Taqman探針熒光定量PCR方法
技術領域：
：本發明涉及一種食品中病原菌的快速檢測方法，特別是一種Taqman探針熒光定量PCR檢測食品沙門氏菌的方法，屬于食品檢測生物
技術領域：
，適用于食品中沙門氏菌屬的定量檢測。
背景技術：
：沙門氏菌是人畜共患病原菌之一，不僅能導致仔豬副傷寒、流產等動物疾病，還能使人類發生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，發病患者表現為腹瀉、發熱、腹痛或痙孿、嘔吐、頭痛和惡心等典型癥狀，甚至死亡。目前世界各國政府對動物性產品中沙門氏菌的限量標準均制定出非常嚴格的規定，對肉、蛋、奶類畜產品中沙門氏菌的規定均為不得檢出。沙門氏菌在污染食品中含量低，同時食品本身的性質以及食品的加工過程均會干擾病原菌的檢測。因此，需要建立一種快速、準確、可靠的檢測方法。我國現行的國家和行業標準檢驗方法費力、耗時，從樣品的制備、前增菌、增菌到選擇性分離培養、生化鑒定等，需要47d才能完成。因此，建立一種快速有效的食源性沙門氏菌的定量檢測方法，以提高檢驗速度、準確性和最低檢測限，使受污染的食品得到及時的處理，以滿足公共衛生、食品衛生、畜牧獸醫和口岸檢疫的需要。據文獻報道，基于PCR技術檢測沙門氏菌所采用的主要基因有/w/f,由仏yw丄yz^MSWA^以及vZ"S等。但某些基因存在一些問題，如采用/m^基因可造成假陰性，漏檢Sa/加o"eWa/!'c//eW以及&/mow〃a.se"/te"6wg血清型，而且它還會擴增一些非沙門氏菌，造成假陽性。另外，上述有些基因是某一種或某幾種沙門氏菌所特有的序列，只適用于檢測某些沙門氏菌，而非整個沙門氏菌屬，容易漏檢。Fi/ny為沙門氏菌的特異性基因，在沙門氏菌內高度保守，同時相對于其它物種而言具有高度特異性。Yeh等對yZ附y作為沙門氏菌的特異性檢測指標進行了評價，力mF基因特異性引物能全部擴增出45株沙門氏菌，而25株非沙門氏菌結果呈陰性，因此力附7基因可以作為鑒定沙門氏菌的指標(YehKS，ChenTH，LiaoCW，ChangCS，LoHC.PCRamplificationoftheSalmonellatyphimuriumgenesequencetodetecttheSalmonellaspecies.IntJFoodMicrobiol.2002,78(3):227-34.)。針對ymy基因設計引物，運用實時熒光定量PCR方法快速檢測沙門氏菌的報道，例如鄭友限等，TaqMan探針法實時熒光定量PCR快速檢測沙門菌的探討.中國食品衛生雜志，2006，18:311-313;李光偉等，沙門氏菌熒光實時定量PCR檢測試劑的研制及應用.微生物學通報，2007，34:496-499。這兩篇文章未對人工污染沙門氏菌的鮮豬肉和鮮雞蛋進行檢測，最低檢測限和定量限比較高。迄今為止，未見有公開發表的與本發明相類似的發明專利。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌的方法，該方法能夠快速、準確、穩定和高靈敏地檢測食品中沙門氏菌。本發明是通過以下技術方案實現的一種熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌的方法，采用GeneBank登陸號為M90677的沙門氏菌,w;r基因序列，設計特異引物和Taqman探針，以常規水煮裂解法提取的腸炎沙門氏菌基因組DNA為模板進行熒光定量PCR，其步驟如下A.所述的特異引物對序列為FlGCGCTACCTGTCTCCTGTATTGA，F2ACGCCCAGCCATACGGATA;所述的Taqman探針序列為FP3AGCTACGCGCGCTCAGTTGGCA其中FP3探針的5'端標記有FAM熒光報告基團，3，端標記有TAMRA基團；B.PCR反應程序為94。C變性3min，以95°C5s56°C20s擴增40個循環，最后25°C3min保溫，在56'C進行單點熒光檢測；C.反應體系設為25pl，體系組成反應緩沖液為10XTaqPCRbuffer,MgZ+濃度為3.5mM，dNTPs濃度為0.2mM，T叫酶2.5U,引物Fl和F2的濃度均為0.1nM，探針FP3濃度為0.4pM,腸炎沙門氏菌基因組DNA5pl，無菌水9phD.所述的水煮裂解法步驟為取菌懸液lml于10000rpm離心5min，沉淀重懸于300pl無菌三蒸水中，混勾，置沸水浴中裂解20min;然后置-20。C冷凍5min'10000rpm離心5min,所得上清液即為所述的腸炎沙門氏菌基因組DNA樣品，取所述的上清液5^1作反應模板。更詳細的技術方案是-本發明采用報道的沙門氏菌_/"^基因序列(GeneBank登陸號M90677)，設計特異引物和Taqman探針，在優化的反應程序和反應體系下，以水煮裂解法提取的腸炎沙門氏菌系列稀釋液的基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR，繪制標準曲線，根據線性關系I^和擴增效率E來衡量重復樣品數據是否一致和不同拷貝數的初始模板是否具有相同的擴增效率。此Taqman探針熒光定量PCR方法檢測細菌濃度在9.9><10。-9.9xl07cfia/ml范圍內呈良好的線性范圍，R2=0.998，擴增效率E-109JW;在9.9xl02-9.9xio7cfti/ml內重復性好，批內Ct值標準偏差(StD):0.02-0.55，變異系數(CV):0.09-1.67;批間Ct值標準偏差(StD):0.17-1.29，變異系數(CV):1.05-4.63;具有很強的特異性(5株陽性菌，檢測結果均為陽性；8株陰性菌，檢測結果均為陰性)；人工污染沙門氏菌的鮮豬肉和鮮雞蛋的檢測中，當檢樣中沙門氏菌初始含菌量分別為13cfU/10g(鮮豬肉)和13cfu/10g(鮮雞蛋，包括全雞蛋和去殼雞蛋)，經過24h的增菌后，檢測結果均為陽性。Taqrnan探針熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌的方法，具體步驟如下1、設計、合成引物和Taqman探針在GeneBank中搜索沙門氏菌屬的yw瞎因序列，對其同源性進行比較，其同源性在99%以上。根據鼠傷寒沙門氏茼/w堪因序列(GeneBank登陸號M90677)，按照引物和探針設計原則，設計一對引物，并在該引物的擴增區域內設計l條熒光探針。探針5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記的熒光淬滅基團是TAMRA。2、熒光定量PCR反應程序和反應體系的優化和建立通過對Mg^濃度、引物探針濃度比和退火溫度(Tm)的選擇，以最低Ct值和最高相對熒光強度值(RFU)為篩選指標，確定最佳反應體系和反應程序。3、建立標準曲線以8個稀釋度的腸炎沙門氏菌菌懸液提取的基因組DNA作為標準樣品建立標準曲線。同時對6個稀釋度菌懸液基因組DNA進行三次獨立試驗，每個濃度各三個重復，通過對實驗結果Ct值的平均值和變異系數來評價方法的穩定性或可重復性。4、人工污染沙門氏菌的靈敏度按美國FDA和USDA/FSISMLG4.02的方法人工接種食品樣品(鮮豬肉和鮮雞蛋)，按建立的定量PCR方法對24h增菌培養的菌懸液進行檢測，確定人工污染沙門氏菌的食品樣品的檢測靈敏性。所述的引物對序列為FlGCGCTACCTGTCTCCTGTATTGAF2ACGCCCAGCCATACGGATA所述的探針序列為-FP3AGCTACGCGCGCTCAGTTGGCA其中FP3探針的5'端標記有FAM熒光報告基團，3'端標記有TAMRA基團。PCR反應程序為94。C變性3min，以95。C5s56。C20s擴增40個循環，最后25。C3min保溫，在56。C進行單點熒光檢測。總反應體系設為25nl，體系組成為反應緩沖液為10XTaqPCRbuffer,Mg"濃度為3.5mM，dNTPs濃度為0.2mM，Taq酶2.5U，引物F1和F2的濃度均為0.1nM，探針FP3濃度為0.4^M，腸炎沙門氏菌基因組DNA5無菌水所述的樣品，待檢時，采用水煮裂解法提取基因組DNA，具體步驟如下吸取搖勻的培養菌懸液lml于1.5ml微量離心管中，常溫下10000rpm離心5min，小心棄去上清液，沉淀重懸于300pl無菌三蒸水中，上下顛倒混合5s，置沸水浴中裂解20min。細菌裂解液于-2(TC冷凍放置5min，10000rpm離心5min，棄去細胞碎片，取5tU上清液作為反應模板。與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果1、靈敏度高，特異性強；2、操作簡單，可重復性高；3、檢測時間短，從樣品DNA的提取到上機檢測出結果僅需約2h(不包括增菌和預處理)4、適用范圍廣，可用于食品樣品如豬肌肉、雞蛋等中沙門氏菌的檢測，其最低檢測限為每10g鮮豬肌肉和鮮雞蛋中能檢出沙門氏菌13cfu。5、本方法可替代傳統的食品微生物的檢測方法。序列表SEQIDN0:1是以引物F1和F2擴增的沙門氏菌刀wy基因片段序列(長度為135bp)。圖l:是沙門氏菌Real-timePCR檢測靈敏性的擴增結果。由上往下依次是:9.9x107cfo/ml、9.9xl06cf\a/ml、9.9xl05cfb/ml、9.9xl04cfWml、9.9x103cfli/ml、9.9x102cfWml、9.9xl0'cfu/ml和9.9xl()0cfii/ml。圖2:是沙門氏菌Real-TimePCR檢測的標準曲線。橫坐標表示初始模板量的log值，縱坐標表示每個稀釋樣品的Ct值。圖3:是沙門氏菌普通PCR檢測靈敏性的PCR擴增電泳圖。M:DNAMarkerDL2000,從上往下依次為2000bp,1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1-8分別為9.9xl07cfWml、9.9xl06cfU/ml、9.9xi05cfii/ml、9.9x104cfU/ml、9.9xl03cfWml、9.9xl02cfu/ml、9.9xl0丄cfu/ml和9.9xlOucfU/ml。圖4:是沙門氏菌Real-timePCR檢測特異性的擴增結果。從上往下依次為腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌(其DNA用細菌基因組DNA提取試劑盒提取，上海杰瑞)、臨床分離沙門氏菌S28、鼠傷寒沙門氏菌。基線以下樣品為大腸桿菌0157:H7、大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌、雙歧桿菌、脆弱擬桿菌、空腸彎曲桿菌、腸球菌、臨床分離大腸桿菌E26和陰性對照。圖5:是沙門氏菌Real-timePCR重復檢測3次的擴增結果。圖6:是本發明擴增的沙門氏菌,7Wl^因片段序列(長度為135bp)，圖中下劃線是探針序列。具體實施例方式實施例l1、設計、合成引物和Taqman探針從GenBank中獲取各種不同來源的沙門氏菌的/w堪因序列，應用PrimerExpress軟件分析基因序列，根據引物和探針設計原則，在這些序列的保守區域篩選到能擴增目標片段長度為135bp的一對引物，并在該引物的擴增區域內設計l條熒光探針。探針5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記的熒光淬滅基團是TAMRA，由上海基康生物工程技術服務有限公司合成。引物對的序列是Fl(正向引物)GCGCTACCTGTCTCCTGTATTGA;F2(反向引物)ACGCCCAGCCATACGGATA;探針序列是FP3AGCTACGCGCGCTCAGTTGGCA;其中FP3探針的5'端標記有FAM熒光報告基團，3'端標記有TAMRA基團。2、熒光定量PCR反應程序和反應體系的優化和建立反應條件的優化主要包括Mg^濃度、引物探針濃度比和退火溫度(Tm)的選擇。在Real-TimePCR反應程序中，固定反應體系，調整不同的退火溫度(55°C65°C)，以相同濃度腸炎沙門氏菌DNA為模板進行檢測，以最低Ct值和最高相對熒光強度值(RFU)為標準進行篩選，確定最佳退火溫度。在最佳退火溫度下'選用MgZ+濃度分別為lpM、1.5|iM、2.5pM、3.5pM、4.5nM、6pM，在最佳引物探針濃度配比下，優選最佳Mg^濃度。試驗以相同濃度腸炎沙門氏菌標準菌株DNA為模板，在最佳Mg2+濃度下，弓l物濃度分別為0.1nM、0.2pM、0.4pM、0.6HM、0.8pM、l.OnM，探針濃度分別為0.1hM、0.2mM、0.3^M、0.4^M，以最低Ct值和最高相對熒光強度值(RFU)-為篩選指標，優選引物和探針最佳濃度。3、標準菌液的制備將甘油低溫保存的腸炎沙門氏標準菌50040(購自中國藥品生物制品檢定所，菌株編號為50040)置冰上解凍，接種到增菌培養液緩沖蛋白胨水(配方胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，12水磷酸氫二鈉9g,磷酸二氫鉀1.5g，補充蒸餾水至1000mL,調pH至7.2)內培養復蘇。對于常溫保存的腸炎沙門氏標準菌菌種50040，直接接種到上述緩沖蛋白胨水中培養復蘇，復蘇后的腸炎沙門氏標準菌菌種50040劃線到SS瓊脂(SS瓊脂的干燥培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司)平板上增殖。取單個菌落接種于上述緩沖蛋白胨水溶液培養24h，將純菌液用緩沖蛋白胨水稀釋成0.5麥氏濃度的菌懸液。取O.lml按10倍遞增稀釋法稀釋至10—i10'濃度，并選擇10"4、10—5、1(T"個稀釋度各0.1ml于做好的計數培養皿上，同一稀釋度做三個平行，均勻鋪板后放入37'C恒溫箱中培養24h后取出可計數培養皿，計算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數。并按下列公式進行計算每毫升中菌落形成單位(cfii戶同一稀釋度三次重復的平均菌落數x稀釋倍數x10。規定30300個菌落為合適范圍。將計數后的菌懸液稀釋至13、410和11100cft!/10(Vl濃度菌液用于人工接種。4、方法穩定性和靈敏度考核以無菌操作將沙門氏菌的過夜培養液充分混勻后，按10倍遞增稀釋至10—i10^濃度，分別提取核酸DNA，用本發明的熒光定量PCR檢測體系進行檢測，考察檢測下限，對靈敏性進行評價；選擇經過傳統方法鑒定的與沙門氏菌相關的腸道類細菌(參見的圖4的說明)分別提取核酸DNA進行Real-timePCR檢測，以考核該體系的特異性；此外，進行三次獨立試驗，每個濃度各三次重復，通過對實驗結果Ct值的平均值和變異系數來評價方法的穩定性或可重復性。結果顯示，本發明的方法在9.9xl()GcfWml9.9xl(^cfu/ml范圍內，標準曲線呈良好的線性關系，R2=0.998，擴增效率E二109.3X。對6種不同濃度的菌液重復檢測3次，擴增得到的Ct值見表1，Ct值變異系數在合理范圍內(最大為1.67%,均小于5%)。三次單獨實驗各三個重復的結果見表2，變異系數均小于5%，在稀釋度大于或等于10'5時重復性比較好，說明本方法在菌液濃度^9.9x102cfU/ml時穩定性好。實施例21、人工接種沙門氏菌對食品樣品的定量PCR檢測(1)人工接種樣品的制備A.不含殼蛋樣品處理用硬刷子在水流下刷洗雞蛋。將干凈雞蛋在含0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的200ppm氯離子溶液中浸泡30min。力B8mL5.25%次氯酸鈉到含lgSDS的992mL蒸餾水中，制備200ppmcl70."/。SDS溶液。這種消毒劑需在使用前臨時制備。無菌操作打開雞蛋，勻漿。無菌操作稱取10g勻漿液到滅菌的250ml錐形瓶內。加90ml緩沖蛋白胨水，并振蕩充分混勻。表lTaqManPCR檢測沙門氏菌的穩定性檢測<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>B.雞蛋全蛋樣品處理雞蛋全蛋用勻漿器勻漿lmin，無菌操作稱取雞蛋蛋液10g置于無菌的250ml錐形燒瓶中，加卯ml所述的緩沖蛋白胨水并振蕩充分混勻。C.豬肌肉樣品處理無菌操作條件用剪刀剪碎豬肌肉，置組織勻漿器8000rpm勻漿lmin，稱取10g勻漿樣品放入滅菌的250ml錐形瓶內。加入卯ml滅菌的緩沖蛋白胨水，并振蕩充分混勻。在上述各勻漿液中人工加入O、13、410和ll100cfo沙門氏菌'每一個接種水平三個平行，37。C恒溫箱中培養2024h。同時設置未接種樣品作為對照。實驗重復兩次。取增菌液備用。另將未接種沙門氏菌的樣品增菌液做10倍系列稀釋，進行平板菌落計數，計算三個平行板上的平均菌落數，以確定食品樣品中背景干擾菌的數量。(2)人工接種樣品的檢測采用熒光定量PCR法的人工接種沙門氏菌的全雞蛋、去殼蛋和豬肌肉的檢出情況如表3-5，該方法在l3dW0g、4~10dW10g、11100cfW10g的接種濃度上均能檢出陽性。未接種細菌的食品樣品中背景干擾菌的計數結果如表6所示，該定量PCR方法在最高濃度為14.8x10scfti/ml干擾菌的存在下，仍能檢測出目標菌，說明該方法抗干擾性強。表3不同接種細菌濃度的全雞蛋的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4不同接種細菌濃度的不含殼雞蛋的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5不同接種細菌濃度的豬肌肉檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、模板DNA制備采用水煮裂解法，吸取搖勻的培養菌懸液lml于1.5ml微量離心管中，常溫下10000r/min離心5min，小心棄去上清液，沉淀重懸于30(V1無菌三蒸水中，上下顛倒混合5s，置沸水浴中裂解20min。細菌裂解液于-20'C冷凍放置5min，10000r/m離心5min，棄去細胞碎片，取5pl上清液作為反應模板。_表6不同食品樣品的背景干擾菌的計數結果_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表<110〉華中農業大學〈120〉檢測食品沙門氏菌的Taqman探針熒光定量PCR方法<130〉<141〉2008-10-07<歸1<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211〉135<212〉DNA<213>沙門氏菌(Salmonella)<220〉<221〉gene〈222〉(1)..(135)<223〉〈220〉<221〉primer—bind<222〉(117)..(135)11〈223〉〈220〉<221>primer_bind〈222〉(l)..咖<223><400>1gcgctacctgtctcctgtattgaggcgcttaaccagctacgcgcgctcagttggcaacaa60agcgatatccagatttacctgctggtatcagataaaacctccgctataacacagtttatc120cgtatggctgggcgt13權利要求1、一種熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌的方法，其特征在于，采用GeneBank登陸號為M90677的沙門氏菌fimY基因序列，設計特異引物和Taqman探針，以水煮裂解法提取的腸炎沙門氏菌基因組DNA為模板進行熒光定量PCR，其步驟如下A．所述的特異引物對序列為F1GCGCTACCTGTCTCCTGTATTGA，F2ACGCCCAGCCATACGGATA；所述的Taqman探針序列為FP3AGCTACGCGCGCTCAGTTGGCA其中FP3探針的5’端標記有FAM熒光報告基團，3’端標記有TAMRA基團；B．PCR反應程序為94℃變性3min，以95℃5s56℃20s擴增40個循環，最后25℃3min保溫，在56℃進行單點熒光檢測；C．反應體系設為25μl，體系組成反應緩沖液為10×TaqPCRbuffer，Mg2+濃度為3.5mM，dNTPs濃度為0.2mM，Taq酶2.5U，引物F1和F2的濃度均為0.1μM，探針FP3濃度為0.4μM，腸炎沙門氏菌基因組DNA5μl，無菌水9μl；D．所述的水煮裂解法步驟為取菌懸液1ml于10000rpm離心5min，沉淀重懸于300μl．無菌三蒸水中，混勻，置沸水浴中裂解20min；然后置-20℃冷凍5min，10000rpm離心5min，所得上清液即為所述的腸炎沙門氏菌基因組DNA樣品，取所述的上清液5μl作反應模板。全文摘要本發明涉及一種檢測食品沙門氏菌的Taqman探針熒光定量PCR方法。針對fimY基因設計引物和Taqman探針，熒光定量PCR。在優化的反應程序和反應體系下，以水煮裂解法提取的腸炎沙門氏菌標準菌株10倍系列稀釋液的基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR，繪制標準曲線，根據線性關系R²和擴增效率E來衡量重復樣品數據是否一致和不同拷貝數的初始模板是否具有相同的擴增效率。應用本發明建立的方法，對人工污染的豬肌肉和雞蛋樣本進行檢測，該方法能在最高濃度為14.8×10⁸cfu/ml干擾菌的存在下，在1～3cfu/10g的接種濃度上檢出陽性。本發明使用fimY基因特異引物和Taqman探針，在優化的反應條件下檢測食品中污染的沙門氏菌時，具有更高的穩定性、特異性和靈敏性，是一種快速、準確的沙門氏菌檢測方法。文檔編號C12Q1/68GK101363061SQ200810197170公開日2009年2月11日申請日期2008年10月7日優先權日2008年10月7日發明者劉振利,彭大鵬,戴夢紅,旭王,王玉蓮,袁宗輝,謝長清,陳冬梅,陶燕飛,黃玲利申請人:華中農業大學