專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其在劍麻脫膠中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物及微生物發酵領域，具體的說，本發明涉及一種具有產果膠酶 和木聚糖酶能力的可用于劍麻生物脫膠或制漿的枯草芽孢桿菌，以及該菌株在劍麻脫膠中 的應用。
背景技術：
劍麻是我國具有特色優勢的天然纖維原料，其纖維具有潔白、質地堅韌、富于彈 性、耐磨等特性，纖維長寬比大，成紙時單位面積中纖維之間相互交織的次數多，纖維分布 細密，成紙強度高，是優良的造紙原料，特別是它產量高、生長快、采伐齡短等特點，為木材 造紙原料所不及。盡管現代科技不斷取得進步，但是劍麻纖維所具有的質地堅韌、富于彈 性、拉力強、抗撕裂、耐磨、防腐等特性是合成纖維無法替代的，新技術的發展，特別是劍麻 纖維與塑料混合制作可降解塑料及用于汽車輕工業的復合材料等開發成功，使劍麻纖維的 使用范圍極大擴大，劍麻纖維已被用來制作高級紙、特種紙，如造幣紙、航空、航海圖紙等。劍麻制漿的研究多集中在傳統的化學法或機械法，劍麻經化學法制漿，除成本高、 污染重、得率低之外，更破壞了劍麻特有的強韌特性，降低了原漿白度。機械法則具有能耗 高、制漿強度低的弊端。除此之外，劍麻經化學法、機械法制漿前還需利用機械對劍麻去皮 “除青”，但是機械除青后滯留在劍麻纖維束上劍麻皮屑難以去除，一方面增加了后續制漿 過程中的燒堿用量(化學法)和耗能(蒸汽爆破法)，另一方面，影響了制漿過程中纖維分 散、單纖維游離和漿白度。生物制漿是指利用微生物或其酶制劑所具有的分解能力，來除去制漿原料或漿中 的不利于制漿的其它成分(如果膠、半纖維素、木質素、脂質等)，使植物組織和纖維彼此分 離制成紙漿的過程，它不但能減少機械法等能源的消耗，減少化學法所帶來的環境污染，而 且紙張在各方面的性能上也優于化學法，如紙漿強度、抗張指數、撕裂指數、耐破指數和白 度均有所增加。目前，國內外對麻類的生物制漿集中在如苧麻、紅麻、亞麻、大麻等韌皮纖維 麻類的生物脫膠制漿方面，而對葉纖維類麻中的劍麻的生物脫膠、制漿，鮮有相關的菌株和 酶制劑報道，這與劍麻生長地域性、劍麻表皮質地致密、果膠含量高，普通微生物難以作用 等原因有關。解決劍麻脫膠有利于劍麻纖維的暴露，為制漿提供優良的原料。關于劍麻脫 膠的研究發明人在國內外率先取得了一點進展，在提出B2菌具有一定的劍麻脫膠能力(陳 青，韓雙艷等，劍麻生物制漿或脫膠菌株的篩選與鑒定及其初步應用，農業工程學院，2008， 24(6) :277-281)，但長達72h小時的脫膠處理周期成為應用于生產實際的瓶頸。因此，尋找 更為合適的脫膠條件，大大縮短脫膠處理時間成為當務之急。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有使劍麻生物脫膠作用的的枯草芽孢桿菌菌株 Bacillussubtilis B2,并提供枯草芽孢桿菌在劍麻脫膠中的應用，應用該菌株使劍麻可在 35 55小時實現生物脫膠。
本發明的目的通過如下技術方案實現本發明提供用于劍麻脫膠為目的的可生產果膠酶和木聚糖酶的菌株，該菌從多年 劍麻種植基地的土壤中分離得到，在營養瓊脂培養基上生長。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》 (第九版)及《常見細菌系統鑒定手冊》鑒定，其生理生化特征與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)最相符。同時其 16S rDNA 序列(已提交 GeneBank，No. EF639849)在 GenBank 中進行同源比對，結果表明，菌株B2與Bacillus subtilis具有較高的同源性，同源性達 99%。生物學特性為菌體桿狀，革蘭氏染色陽性、在液體培養基中呈絮狀生長，有芽孢，芽 孢呈柱形或橢圓形，好氧、過氧化氫酶陽性，革蘭氏染色陽性，對葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、 木糖等能發酵產酸、對乳糖、半乳糖不產酸、能水解淀粉，利用檸檬酸，在7% NaCl的肉湯中 生長良好。本發明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis B2)已于2008年8月5日提交 中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 208115。保藏地址為湖北省武漢市武 漢大學(430072)。該菌的培養特征、生理生化特征、16S rDNA序列如下培養特征與形態觀察B2在液體培養基中菌體呈絮狀生長，細胞呈桿狀，運動，革蘭氏染色陽性，有芽孢， 芽孢呈柱形或橢圓形，如圖2所示。生理生化特征鑒定根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》，對B2進行生理生化鑒 定，其生理生化特征與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)最相符，其生理生化結果如表1 所示，表明該菌革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陽性，能發酵葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖 產酸產酸、對乳糖、半乳糖不產酸、能水解淀粉，利用檸檬酸，在7% NaCl的肉湯培養中生長 良好，此外經觀察可知，在50°C下不生長，但其菌落形態不同于常見的枯草芽孢桿菌菌落形 態。表 1
4 (注+表示陽性，-表示陰性)16S rDNA 全序列提取B2菌的16S rDNA序列，測序顯示為1446bp，如SEQ. ID. NOl所示。根據B2菌的16S rDNA建立系統發育樹。發現B2菌與枯草芽孢桿Baillus subtili subsp. NBRC 101245 和 Bacillus subtilis subsp. natto 的親緣關系最近，進一步證明，B2 菌株隸屬枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌在劍麻脫膠中的應用以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis B2)為 菌種單菌接種于種子培養基，置于37°C氣浴或水浴搖床，150rpm 250rpm，培養8 12h， 至OD6tltl達到0. 6 1時，以接種量2% 20% (體積比)轉接到脫膠培養基中，在脫膠 培養基加入鮮劍麻葉，鮮劍麻葉與脫膠培養基的質量體積比為0. 05 0. 2kg/l，培養溫度25°C 42 °C，搖床轉速為150 250rpm，35h 55h內完成劍麻脫膠。所述脫膠培養基成分為0. 02 0. 05g/ml碳源，0. 01 0. 03g/ml氮源，pH5. 0 8. 0 ；所述碳源為劍麻、木聚糖、麩皮、玉米芯、果膠、葡萄糖和木糖中的一種或多種；所述氮源為硝酸銨、硫酸銨、尿素、黃豆粉、牛肉膏、蛋白胨中的一種或多種。所述種子培養基的成分為營養瓊脂培養基。即IOOOmL培養基中含牛肉膏3g，蛋白 胨 10g, NaCl 5g，，瓊脂 20g，ρΗ7· 2 7. 4，所述液體種子培養基為營養肉湯培養基。即IOOOmL培養基中含牛肉膏3g，蛋白胨 10g, NaCl 5g, pH7. 2 7. 4。本發明涉及的劍麻生物脫膠輔助制漿具有以下優勢1.能準確地對纖維共生物的分解，其工作原理就是利用酶的專一性，徹底去除雜 質而不損傷纖維本身。現有技術報道0.1千克劍麻鮮葉置于1升的培養基中(培養基濃度 為0. 01g/ml的黃豆粉，自然pH)，至于37°C、200r/min的搖床，72h可實現完全脫膠(劍麻 生物制漿或脫膠菌株的篩選與鑒定及其初步應用，農業工程學院，2008，24 (6) 277-281)， 利用本發明中的脫膠條件，脫膠時間較現有技術可縮短1倍，35h即可實現完全脫膠。2.具有生物脫膠透徹性。準確地分解到零為止而不會出現矯枉過正。這一特性使 劍麻纖維脫膠在工業化的生產過程中的品質控制得到保證。纖維的制成率和得漿率得到相 應提高。3.溫和的條件，簡捷的工藝，即使在十分簡陋的條件下也可以完成脫膠。脫膠菌在 溫和的PH值和溫度下，以劍麻表皮為營養可完成自我繁殖，只要經過足夠的時間就可以完 成對劍麻表皮非纖維素成分的降解。4.生產成本低，脫膠質量穩定，一方面，大幅度減少了燒堿等化工原料的投入，降 低成本的同時，降低了無機污染物；另一方面，獲得的原漿強度大，白度好，得率高，是單純 的化學法和機械法制漿不能共同具備的。
圖Ia為肉眼觀察到的本發明利用Bacillus subtilis B2對劍麻脫膠的效果圖；圖Ib為肉眼觀察到的現有技術對劍麻脫膠的效果圖；圖2a為未經脫膠作用的劍麻的電鏡圖；圖2b為現有技術脫膠的劍麻的電鏡圖；圖2c為本發明實施例4脫膠的劍麻的電鏡圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用以說明而非限 制本發明的技術方案。不脫離本發明精神和范圍的任何修改或局部替換，均應涵蓋在本發 明的權利要求范圍當中。實施例1 劍麻脫膠菌的富集及篩選廣東省湛江市紅星農場收集劍麻生產地土樣9種，各稱取1. OOg,加入到裝有99mL 無菌水和適量滅菌玻璃珠的三角瓶中，振蕩均勻得菌懸液，取0. 5mL菌懸液接入牛肉蛋白
6胨富集培養基中，培養1天后再從富集培養基中接菌液至脫膠培養基中，在30°C，150r/min 條件下培養3d后，觀察有無脫膠現象。為使脫膠性能穩定，對具有脫膠作用的混合菌群進行馴化，即循環脫膠，具體方法 如下脫膠3天后的有脫膠效果的脫膠液，轉接富集培養基中培養ld，再轉接脫膠培養基中 培養3d后，仍有脫膠作用的又轉接至富集培養基中培養ld，如此通過循環脫膠實現馴化。 通過馴化，去除了脫膠性能不穩定的菌群。循環脫膠三次后的持續有脫膠效果的發酵液涂 布于營養瓊脂培養基上，分離出不同的單菌。分離的單菌轉接入脫膠培養基中，30°C，150r/ min條件下培養4d后，發現脫膠能力最強的一株細菌，命名為B2。實施例2 菌株的分類鑒定根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)及《常見細菌系統鑒定手冊》鑒定，B2在 液體培養基中菌體呈絮狀生長，細胞呈桿狀，運動，革蘭氏染色陽性，有芽孢，芽孢呈柱形 或橢圓形，其生理生化特征與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)最相符，在50°C下不 生長，但其菌落形態不同于常見的枯草芽孢桿菌菌落形態。同時其16S rDNA序列(已提 交GeneBank，No. EF639849)在GenBank中進行同源比對，結果表明，菌株B2與Bacillus subtilis具有較高的同源性，同源性達99%。生物學特性為菌體桿狀，革蘭氏染色陽性、 在液體培養基中呈絮狀生長，有芽孢，芽孢呈柱形或橢圓形，好氧、過氧化氫酶陽性，革蘭氏 染色陽性，對葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖等能發酵產酸、對乳糖、半乳糖不產酸、能水解 淀粉，利用檸檬酸，在7%NaCl的肉湯中生長良好，該菌已于2008年8月5日提交中國典型 培養無保藏中心保藏，保藏編號CCTCC M 208115。實施例3 脫膠中木聚糖酶酶、果膠酶酶活測定由于果膠酶、半纖維素酶(主要為木聚糖酶)和纖維素酶降解底物的糖苷鍵，生成 含還原端基產物，故采用常用的還原糖測定法一DNS法。果膠酶(木聚糖酶)可水解底物果膠(木聚糖)，生成半乳糖醛酸(木糖)等醛 糖，醛糖與3，5—二硝基水楊酸共熱產生棕紅色的氨基化合物，其還原糖的量和含有呈色氨 基化合物的反應液顏色深淺成正比，在540nm下測其吸光度，可計算出果膠酶(木聚糖酶) 酶活。(I)DNS 試劑用400mL蒸餾水溶解6. 3g 3，5—二硝基水楊酸，逐步加入21g氫氧化鈉，再加入 185g四水合酒石酸鉀鈉、5. Og苯酚、5. Og無水亞硫酸鈉，溫水浴(不超過48°C )，不斷攪拌， 直至溶液清澈透明。用蒸餾水定容至IOOOmL,保存在棕色瓶中，與二氧化碳隔絕，靜置5 7天后使用，貯存期為6個月。(2) pH 7. 0的磷酸一梓檬酸緩沖溶液取Na2HPO4 ·12Η20 71. 62g,C6H8O7 .H2O 21. Olg，分別定容到 lOOOmL，按 16. 47 3. 53
混合，即可。(3)底物的配制果膠底物稱取1. OOg果膠，用pH 7.0的磷酸一梓檬酸緩沖溶液溶解，于磁力攪拌 器上恒速攪拌0. 5h，用緩沖溶液定容至100mL。存放在0 4°C冰箱里。木聚糖底物稱取1. OOg木聚糖，加入20mL的pH 7. 0的磷酸一梓檬酸緩沖溶液， 加熱至其完全溶解后，用緩沖溶液定容至lOOmL。存放在0 4°C冰箱里。
(4)酶活測定將Bacillus subtilis B2接種于50ml含2%木聚糖，1 %黃豆粉，自然pH的液體 培養基中培養，發酵30h時取出2mL發酵液，40C、IOOOOrpm離心5min，取上清夜，即為粗酶 液。酶活測定方法為①取25mL比色管，加入粗酶液1. 0mL，50°C保溫5min，加入預先恒溫 到50°C的底物1. OmL,具塞搖勻，準確反應30min ；②加1. 5mLDNS試劑并搖勻，立即置沸水 中顯色5min，取出流水冷卻，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻；③以滅活酶液(100°C滅活IOmin) 作對照，用分光光度計測定酶活性，在波長540nm處測吸光度，參照標準曲線計算生成的還 原糖量。在上述測定條件下，以每分鐘水解底物生成1 μ g還原糖所需酶量定義為一個酶活 性單位，單位為U/mL。經計算，木聚糖酶酶活為92U/mL，果膠酶酶活178U/mL。實施例4 利用Bacillus subtilis B2對劍麻脫膠保存于營養瓊脂斜面培養基的Bacillus subtilis B2劃線于營養瓊脂平板上，接 種后的平板置于37°C培養箱培養24h后，從平板上挑取單菌落接種于含5mL營養肉湯培養 基的試管中，試管放于37°C氣浴搖床，200rpm，過夜培養至0D_ = 0. 6作為種子液。(1)取 1.5mL種子液接種于裝有30mL含麩皮0.6g，牛肉膏0.9g，pH 6. O的150mL培養瓶中，培養 瓶中同時加入3g的已消毒鮮劍麻葉，置于30°C、200r/min的搖床中脫膠。(2)與現有技術 對照。參考陳青等文獻報道(劍麻生物制漿或脫膠菌株的篩選與鑒定及其初步應用，農業 工程學院，2008，24 (6) 277-281)，取2mL種子液同時接種于裝有20mL含2g劍麻鮮葉，0. 2g 黃豆粉，自然pH的IOOmL培養瓶中，培養瓶至于37°C、200r/min的搖床中脫膠。兩搖瓶培養35h后，將劍麻葉從搖瓶內取出，輕輕用蒸餾水洗滌表面，肉眼觀察劍 麻葉表面脫膠情況。從圖Ia中可以看出，本實施例劍麻表皮全部去除，露出白色纖維，而現 有技術條件下脫膠，35h時，如圖Ib所示，劍麻纖維大部分還被綠色膠質表皮包圍。掃描電 鏡下觀察，圖2a為未經脫膠作用的劍麻的電鏡圖。本實施例脫膠條件下作用35h，如圖2c 所示，纖維束表面的膠質已經完全去除，纖維縱向表面變得光滑，纖維束之間無膠質，彼此 分離。如圖2b所示，現有技術條件下脫膠效果相比大大降低，劍麻纖維表面仍殘留膠質覆 蓋層，纖維束僅略微露出。由此可見，本發明提供的劍麻脫膠條件下脫膠時間比現有技術的 72h縮短了 1倍，可縮短劍麻纖維用于制漿的處理周期，加快工藝進度，縮短整個制漿造紙 的流程時間，和降低處理成本。實施例5 對劍麻脫膠保存于營養瓊脂斜面培養基的Bacillus subtilis B2劃線于營養瓊脂平板上，接 種后的平板置于37°C培養箱培養20h后，從平板上挑取單菌落接種于含5mL營養肉湯培養 基的試管中，試管放于37°C氣浴搖床，250rpm，過夜培養至0D_ = 0. 6時，取ImL接種于裝 有20mL含營養肉湯培養基的IOOmL培養瓶中，培養至0D_ = 1時作為種子液。20mL種子 液接種于200mL含8g果膠，4g硫酸銨，pH7. O的IL培養瓶中，培養瓶中同時加入40g的已 消毒鮮劍麻葉，置于37°C、250r/min的搖床中脫膠，40h可以完全脫膠。較現有技術的72h 縮短了 32h。實施例6 對劍麻脫膠保存于營養瓊脂斜面培養基的Bacillus subtilis B2劃線于營養瓊脂平板上，接 種后的平板置于37°C培養箱培養36h后，從平板上挑取單菌落接種于含5mL營養肉湯培養 基的試管中，試管放于37°C氣浴搖床，150rpm，過夜培養至0D_ = 0. 8時，取2mL接種于裝有40mL含2g玉米芯，1. 2g硝酸銨，pH8. 0培養基的250mL培養瓶中，培養瓶中同時加入6g 的已消毒鮮劍麻葉，置于42°C、250r/min的搖床中脫膠，50h可以完全脫膠。較現有技術的 72h 縮短了 22h。實施例7:對劍麻脫膠保存于營養瓊脂斜面培養基的Bacillus subtilis B2劃線于營養瓊脂平板上，接 種后的平板置于37°C培養箱培養28h后，從平板上挑取單菌落接種于含5mL營養肉湯培養 基的試管中，試管放于37°C氣浴搖床，250rpm，過夜培養至0D_ = 18時，取2mL接種于裝有 50mL含Ig葡萄糖，0. 5g蛋白胨，pH5. 0培養基的250mL培養瓶中，培養瓶中同時加入4g的 已消毒鮮劍麻葉，置于30°C、200r/min的搖床中脫膠，55h完全脫膠。較現有技術的72h縮 短了 17h。SEQ. ID. NOl TCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTT ACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTAC TAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCT CGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGT CATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGG TTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCC CCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAA ACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGA GTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTA CCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCA CTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCC AGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCC CAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAG GTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCA TCACTCACG
CGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGG GCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCA CCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAA ACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCG TCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGT
權利要求
一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis B2)，其特征在于其保藏編號CCTCC M 208115。
2.權利要求1所述枯草芽孢桿菌在劍麻脫膠中的應用其特征在于以枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis B2)為菌種單菌接種于種子培養基，置于37°C氣浴或水浴搖床， 150rpm 250rpm，培養8 12h，至OD6tltl達到0. 6 1時，以接種量2% 20% (體積比) 轉接到脫膠培養基中，在脫膠培養基加入鮮劍麻葉，鮮劍麻葉與脫膠培養基的質量體積比 為0. 05 0. 2kg/l，培養溫度25°C 42°C，搖床轉速為150 250rpm，35h 55h內完成劍 麻脫膠。
3.根據權利要求2所述的枯草芽孢桿菌在劍麻脫膠中的應用，其特征在于所述脫膠 培養基成分為0. 02 0. 05g/ml碳源，0. 01 0. 03g/ml氮源，pH5. 0 8. 0 ；所述碳源為劍麻、木聚糖、麩皮、玉米芯、果膠、葡萄糖和木糖中的一種或多種；所述氮源為硝酸銨、硫酸銨、尿素、黃豆粉、牛肉膏、蛋白胨中的一種或多種。
4.根據權利要求2所述的枯草芽孢桿菌在劍麻脫膠中的應用，其特征在于所述種子 培養基的成分為營養瓊脂培養基。
5.根據權利要求2所述的枯草芽孢桿菌在劍麻脫膠中的應用，其特征在于所述液體 種子培養基為營養肉湯培養基。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌及其在劍麻脫膠中的應用。該枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis B2)保藏編號CCTCCM208115。應用時，以枯草芽孢桿菌為菌種單菌接種于種子培養基，置于37℃氣浴或水浴搖床，培養8-12h，至0D600達到0.6-1時，以接種量2％～20％(體積比)轉接到脫膠培養基中，在脫膠培養基加入鮮劍麻葉，培養溫度25℃～42℃，搖床轉速為150～250rpm，35h～55h內完成劍麻脫膠。本發明具有培養條件粗放、生長繁殖快等優點，35h可完成劍麻脫膠，不損傷纖維，無環境污染，可代替機械除青用于劍麻脫膠制漿工藝前預處理。
文檔編號C12R1/125GK101880637SQ20081021960
公開日2010年11月10日 申請日期2008年12月3日 優先權日2008年12月3日
發明者劉志成, 林影, 鄭穗平, 陳青, 韓雙艷 申請人:華南理工大學