專利名稱：：一種用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑。
背景技術：
：農作物秸稈是一種重要的生物資源，具有數量大、分布廣和種類多等特點。據報道，我國各類農作物秸稈年總產量達7億噸以上，其中稻草2.3億噸，玉米秸稈2.2億噸，豆類和秋雜糧秸稈10億噸，花生、薯類藤蔓和甜菜葉等1.0億噸，占世界總秸稈量的30%左右。但是，長期以來，這些秸稈資源卻沒有得到合理的開發利用。近幾年來，由于農作物產量的大幅度提高和農村薪材結構的改變，越來越多的秸稈成為廢棄物，既浪費了資源又污染了環境。因此，解決我國剩余秸稈問題對資源利用和環境污染治理極其重要。秸稈是冬季我國東北地區反芻動物的主要飼料，但由于秸稈主要由木質纖維素組成，養分低、適口性差、消化率低、作為飼料的品質差、動物不愿采食，因而如何提高秸稈的適口性、提高其飼用價值是解決我國秸稈公害、提高有機物利用率的一大熱點。采用發酵方法可以在保存秸稈中營養成分的同時，提高飼料的適口性，是提高秸稈飼料品質的主要手段之一。但是秋冬季節氣溫比較低，青貯飼料中主要的活動因子一乳酸菌的活動受到限制，目前，還沒有專門針對低溫的秸稈飼料發酵菌劑。
發明內容本發明的目的是提供一種用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑。本發明所提供的用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的活性成分包括沙克乳酸桿菌(Xactobacillussakei)禾口仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)。所述秸稈飼料低溫發酵菌劑中，所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和所述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)的集落形成單位數目比為(70-80):(20-30)，具體為79:21。所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)具體可為沙克乳酸桿菌(Xactobacillussakei)JCM1157，所述仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)具體可為仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774。本發明所提供的秸稈飼料低溫發酵菌劑的活性成分也可僅有由所述沙克乳酸桿菌(Xactobacillussakei)禾口所述仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)組成。所述秸稈飼料低溫發酵菌劑中，所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和所述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774可分別獨立包裝，也可混合在一起。本發明的秸稈飼料低溫發酵菌劑可為液體制劑，也可為固體制劑。在上述秸稈飼料低溫發酵菌劑的活性成分的培養物中加入甘油、EDTA等物質，即得到秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑，該液體菌劑中的活菌數量和菌的活性可以長期保持穩定，對飼喂的動物也比較安全；在上述液體菌劑中加入吸附載體，如加入麥飯石和/或秸稈粉等，即可獲得秸稈飼料的低溫固體發酵菌劑，該固體菌劑中的吸附載體與沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)具有高度的親和力，對飼喂的動物安全，可以使制成的固體菌劑保質期長，方便運輸和使用，且干燥、冷凍處理都不會降低固體菌劑中活菌的數量和活性。上述液體菌劑中，所述活性成分、甘油和EDTA的配比為1X10"CFU:(l-5)g甘油(1-2)gEDTA，具體為1X10"CFU:5g甘油lgEDTA。上述固體菌劑中，所述活性成分和所述吸附載體的配比為1X106CFU:(l-10)g吸附載體，具體為1X106CFU:5g吸附載體。本發明所制備的菌劑可用于降解各種植物秸稈(如玉米秸稈、水稻秸稈等)制備秸稈飼料。本發明的用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑中的各種菌具有高度的協同作用，自體形成穩定的生態系統，能在未經滅菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占據優勢，在5-l(TC的環境下可以迅速產生大量乳酸，降低發酵料的PH值，改善飼料的發酵品質，提高飼料的營養價值和適口性，對飼喂的動物安全，且應用簡易，成本低廉。具體實施例方式實施例1、發酵菌劑中活性成分的篩選R-MRS培養基的組成(g/L):<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>將取自東北水稻產區的稻桿粉碎成l2cm長的小段，將上述稻桿、取自該地區的土壤和上述稻桿和土壤的混合物各O.5g分別接入10mlR-MRS培養基中，5t:冰箱中厭氧培養。10d后，分別取上述三種培養液各15ill接入300ul新鮮的R-MRS培養基中，每4d轉接一次，連續繼代培養。測定培養液的pH值和乳酸的產量。選擇pH值下降迅速，產乳酸量較多且對外界環境變化相對穩定的培養物，篩選其中的活性成分。通過分子生態學方法建立16SrDNA克隆文庫對上述獲得的培養物進行研究，結果表明，上述培養物中的組成菌主要為沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)。實施例2、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制備沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別購自日本微生物保存中心和韓國生命工學研究所基因銀行。1、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制備將沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157禾P仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別接種到R-MRS培養基中，l(TC靜置培養24h，將79ml上述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157的發酵液和21ml上述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的發酵液混合，使混合發酵液中，沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的集落形成單位數目比為79:21，該混合發酵液中的集落形成單位數目為lX108CFU/ml。將上述混合發酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:5g:lg的配比混合，得到秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑。將上述獲得的秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑和玉米秸稈按照lml:500g的配比混合，沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774在30。C條件下厭氧發酵2d，乳酸菌大量繁殖，產生大量乳酸，發酵料的pH值迅速降低。利用分子生態學技術一變性梯度凝膠電泳法(DGGE)證明，在發酵料中，以沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774為主的乳酸菌迅速控制發酵過程，并且在發酵過程中穩定存在。發酵lOd后，得到用于制備秸稈飼料的低溫固體發酵菌劑。2、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的發酵效果實驗將50g上述步驟1獲得的用于制備秸稈飼料的固體發酵菌劑分別接種到1000g玉米秸稈或1000g稻桿中，常溫發酵30d后，測定發酵料的pH值和乳酸的含量，同時以未接種秸稈飼料發酵菌劑的玉米秸稈和稻桿作為對照。實驗設三次重復，結果表明，接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的玉米秸稈發酵料比未接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的玉米秸稈的pH值降低8.54%±0.84%，乳酸含量提高了158.35%±4.65%;接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的稻桿發酵料比未接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的稻桿的pH值降低9.6X±0.84%，乳酸含量提高了145.56%±4.89%，玉米秸稈發酵料和稻桿發酵料的品質得到了明顯改善。實施例3、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制備沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別購自日本微生物保存中心和韓國生命工學研究所基因銀行。1、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制備將沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157禾P仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別接種到R-MRS培養基中，l(TC靜置培養24h，將70ml上述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157的發酵液和20ml上述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的發酵液混合，使混合發酵液中，沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的集落形成單位數目比為70:20，該混合發酵液中的集落形成單位數目為lX108CFU/ml。將上述混合發酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:lg:lg的配比混合，得到秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑。將上述獲得的秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑和玉米秸稈按照lml:100g的配比混合，沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774在30°C條件下厭氧發酵2d，乳酸菌大量繁殖，產生大量乳酸，發酵料的pH值迅速降低。利用分子生態學技術一變性梯度凝膠電泳法(DGGE)證明，在發酵料中，以沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774為主的乳酸菌迅速控制發酵過程，并且在發酵過程中穩定存在。發酵lOd后，得到用于制備秸稈飼料的低溫固體發酵菌劑。2、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的發酵效果實驗將50g上述步驟1獲得的用于制備秸稈飼料的固體發酵菌劑分別接種到1000g玉米秸稈或lOOOg稻桿中，常溫發酵30d后，測定發酵料的pH值和乳酸的含量，同時以未接種秸稈飼料發酵菌劑的玉米秸稈和稻桿作為對照。實驗設三次重復，結果表明，接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的玉米秸稈發酵料比未接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的玉米秸稈的PH值降低8.04%±0.64%，乳酸含量提高了152.35%±4.25%;接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的稻桿發酵料比未接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的稻桿的pH值降低8.6X±0.74%，乳酸含量提高了142.56%±3.89%，玉米秸稈發酵料和稻桿發酵料的品質得到了明顯改善。實施例4、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制備沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別購自日本微生物保存中心和韓國生命工學研究所基因銀行。1、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的制備將沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157禾P仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別接種到R-MRS培養基中，l(TC靜置培養24h，將80ml上述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157的發酵液和30ml上述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的發酵液混合，使混合發酵液中，沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的集落形成單位數目比為80:30，該混合發酵液中的集落形成單位數目為lX108CFU/ml。將上述混合發酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:5g:2g的配比混合，得到秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑。將上述獲得的秸稈飼料的低溫液體發酵菌劑和玉米秸稈按照lml:1000g的配比混合，沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774在30。C條件下厭氧發酵2d，乳酸菌大量繁殖，產生大量乳酸，發酵料的pH值迅速降低。利用分子生態學技術一變性梯度凝膠電泳法(DGGE)證明，在發酵料中，以沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774為主的乳酸菌迅速控制發酵過程，并且在發酵過程中穩定存在。發酵lOd后，得到用于制備秸稈飼料的低溫固體發酵菌劑。2、用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑的發酵效果實驗將50g上述步驟1獲得的用于制備秸稈飼料的固體發酵菌劑分別接種到1000g玉米秸稈或lOOOg稻桿中，常溫發酵30d后，測定發酵料的pH值和乳酸的含量，同時以未接種秸稈飼料發酵菌劑的玉米秸稈和稻桿作為對照。結果表明，接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的玉米秸稈發酵料比未接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的玉米秸稈的pH值降低8.43%±0.76%，乳酸含量提高了149.35%±4.35%;接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的稻桿發酵料比未接種秸稈飼料低溫發酵菌劑的稻桿的PH值降低9.3%±0.94%，乳酸含量提高了142.86%±4.67%，玉米秸稈發酵料和稻桿發酵料的品質得到了明顯改善。權利要求一種用于制備秸稈飼料的發酵菌劑，它的活性成分包括沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)。2.根據權利要求1所述的菌齊U，其特征在于所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)的集落形成單位數目比為(70-80):(20-30)。3.根據權利要求2所述的菌齊U，其特征在于所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)的集落形成單位數目比為79:21。4.根據權利要求1-3中任一所述的菌齊U，其特征在于所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)為沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157，所述仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)為仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774。5.根據權利要求1-4中任一所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括甘油和EDTA。6.根據權利要求5所述的菌劑，其特征在于所述活性成分、甘油和EDTA的配比為1X10"CFU:(1-5)g甘油(l-2)gEDTA，優選為1X10"CFU:5g甘油lgEDTA。7.根據權利要求6所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括吸附載體，所述吸附載體為麥飯石和/或秸稈粉。8.根據權利要求7所述的菌劑，其特征在于所述活性成分和所述吸附載體的配比為ixio6cfu:(i-io)g吸附載體，優選為ixio6cfu:5g吸附載體。9.根據權利要求1-8中任一所述的菌齊U，其特征在于所述沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分別獨立包裝或混合在一起。10.權利要求1-9中任一所述的發酵菌劑在制備秸稈飼料中的應用。全文摘要本發明公開了一種用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑。它的活性成分包括沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)。本發明的用于制備秸稈飼料的低溫發酵菌劑中的各種乳酸菌具有高度的協同作用，自體形成穩定的生態系統，能在未經滅菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占據優勢，迅速產生大量乳酸，降低發酵料的pH值，改善飼料的發酵品質，提高飼料的營養價值和適口性，對飼喂的動物安全，且應用簡易，成本低廉。文檔編號C12R1/01GK101735962SQ20081022631公開日2010年6月16日申請日期2008年11月12日優先權日2008年11月12日發明者崔宗均,楊洪巖,王小芬申請人:中國農業大學