木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組合發酵工藝的制作方法

專利名稱：木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組合發酵工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種使用發酵或使用酶的方法生產乙醇的工藝，尤其涉及一種從纖維素材料 基質中用發酵或用酶的方法生產乙醇的工藝。
背景技術：
隨著傳統化石燃料供應的日益緊張以及化石燃料的不可再生性，燃料乙醇作為理想的替 代能源之一受到越來越多的關注。相比于汽油，乙醇具有更高的辛烷值，燃燒更潔凈高效， 產生更少的臭氧前體物和C02。目前，幾乎所有的燃料乙醇都是利用糧食原料生產出來，美
國主要利用玉米，巴西主要利用蔗糖，但絕大多數國家不具有這樣的農業基礎生產燃料乙醇。 人們不得不把目光轉向供應更豐富價格更低廉的木質纖維素，如農林廢棄物(包括農作物秸 稈、甘蔗渣、鋸木屑、刨花等)。盡管木質纖維素原料供應充足且價格低廉，但由于轉化成乙 醇的工藝復雜且成本較高而阻礙了這種重要資源更廣范圍的利用。目前木質纖維生物質轉化 成乙醇的關鍵問題，是缺少低成本的打破木質素與纖維素緊密結合使纖維素和半纖維素解聚 而釋放出游離的糖分子的技術，缺少高效利用己糖和戊糖生產乙醇的發酵工藝。
多數木質纖維素原料中，纖維素(約占干重的35%至50%)被其它結構性生物高分子包 埋，主要是半纖維素(占干重的20% 30%)和木質素(占干重的5% 30%),但只有纖維素和 半纖維素可解聚生成可被用于發酵乙醇的單糖分子，而這種結構阻礙了纖維素和半纖維素的 有效利用，且纖維素本身的晶體結構也不利于酶解。木質纖維原料的理化特性決定了其具有 不同于淀粉(如玉米、高粱)和糖類(如甘蔗、甜菜)原料轉化的難度和復雜性。此外，在 乙醇發酵方面，適宜乙醇發酵的釀酒酵母(Sacc/^om少cMce/^v/w'"e，中國工業微生物菌種保 藏中心CICC1517)與運動發酵單胞菌(ZjwowomwwoWto，美國典型培養物保藏中心ATCC 31821 )只能代謝葡萄糖而不能代謝木糖，而能夠利用木糖發酵生產乙醇的菌種大腸桿菌KOll
(j&cfen'c似"co//，美國典型培養物保藏中心ATCC 55124)對乙醇的耐受力又不如前兩者。
發明內容
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本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種操作簡單、成本低廉、環保 無污染且能有效提高乙醇產量和木質纖維利用率的木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組合發酵 工藝。
為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組 合發酵工藝，包括蒸汽爆破預處理、酶解糖化和乙醇發酵三個歩驟，其特征在于所述乙醇發 酵是指將酶解糖化制得的酶解液調pH值至6.0-7.5后，接種大腸桿菌KOll和釀酒酵母進行發酵，或者接種大腸桿菌KOll和運動發酵單胞菌進行發酵，或者接種大腸桿菌KOll、釀酒 酵母和運動發酵單胞菌進行發酵。
上述蒸汽爆破預處理是指在蒸汽爆破裝置中裝入木片(長2.5~5cm、寬2~3cm、厚 0.2~0.5cm)，并使蒸汽爆破裝置中維持200 24(TC的溫度、2~5 MPa的蒸汽壓力10-25分鐘， 再瞬間釋放壓力。所述木片的木料主要來自楊木或杉木。所述的蒸汽爆破裝置可以選用市場 上銷售的蒸汽爆破儀，其一般包括蒸汽發生器、恒壓反應器和接收裝置幾個主要部分；恒壓 反應器呈直立圓筒狀，將木片放入恒壓反應器中以后隨即通入高溫(如21(TC)蒸汽，同時 利用恒壓反應器上的夾套進行加熱，達到設定的溫度、壓強和維壓時間后打開恒壓反應器底 部的球閥釋放壓力，爆破完成。
上述工藝中的酶解糖化步驟具體包括以下工序調節蒸汽爆破預處理后所得木漿的pH 值至4.5 5.5，按每克爆破木漿干重(木漿干重可用放入的木片質量近似替代)添加20 50FPIU 的纖維素酶，在45 55'C條件下酶解48 72h，酶解時的攪拌速度為100~250 rpm。
上述工藝的乙醇發酵過程中，酶解液的pH值可以用3M的氫氧化鉀溶液進行調節，發酵 前進行微生物接種時，先接種預先培養的大腸桿菌KOll至大腸桿菌KOll細胞干重在調pH 值后的酶解液中初始濃度達到0.16 0.33mg/ml，再接種預先培養的釀酒酵母和/或運動發酵單 胞菌至釀酒酵母和/或運動發酵單胞菌細胞干重在調pH值后的酶解液中初始濃度達到 0.12~0.45 mg/ml。
上述工藝的乙醇發酵過程中，乙醇發酵的發酵時間為48 96h，發酵溫度為30 35。C，發 酵時的攪拌速度為100 250rpm。
與現有技術相比，本發明的優點在于首先，通過蒸汽爆破預處理來增加生物酶與木質 纖維素的接觸面積，進而提高酶解效率；其次，通過綜合利用多菌種進行組合發酵，有效釋 放木質纖維素中的纖維素和半纖維素成分，獲得高產量的乙醇，提高木質素纖維的利用率。 本發明的方法工藝簡單、成本低、環保無污染，對于解決目前能源短缺及開辟新能源來源渠 道的問題，具有重要的現實意義。


圖1為本發明的工藝流程圖。 .具體實施方式
實施例1
一種木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組合發酵工藝，包括以下步驟
(1)蒸汽爆破預處理將楊木(也可用杉木)切成長2.5~5 cm、寬2~3 cm、厚0.2~0.5 cm 的木片，取150g的木片裝入蒸汽爆破儀(可外購)中，于24(TC， 3MPa的蒸汽壓力下維持20分鐘，再瞬間釋放壓力，使木片爆破成木槳；
(2) 酶解糖化取2 L爆破后的木漿倒入體積為3L的發酵罐中，此時發酵罐中纖維素 含量約為3.5% (w/v)(—般小于6.5%)，用3M氫氧化鉀溶液調節爆破木漿的pH值至4.8， 加入2100FPIU的纖維素酶，在溫度48°C、攪拌速度150 rpm的條件下酶解72 h得到酶解液；
(3) 乙醇發酵將酶解液用3M氫氧化鉀溶液調節至pH值為6.5，接種預先培養的大腸 桿菌KOll至其細胞干重在酶解液中的初始濃度為0.33mg/ml，再接種預先培養的釀酒酵母菌 液100ml，發酵溫度為30 35 °C，攪拌速度為100~200 rpm，發酵96h后測定乙醇含量。
相比于分別利用大腸桿菌KOll或釀酒酵母發酵的乙醇產量1.452g/l和3.356g/l，本實施 例利用大腸桿菌KOll和釀酒酵母混合發酵的乙醇產量可達到3.526 g/l。
實施例2
本實施例的步驟(1)蒸汽爆破預處理和步驟(2)酶解糖化與實施例1相同，但在步驟 (3)乙醇發酵過程中，利用運動發酵單胞菌替代釀酒酵母，其余工藝參數不變。
實驗結果表明，相比于分別利用大腸桿菌K011或運動發酵單胞菌發酵的乙醇產量1.452 g/1和2.144 g/1，本實施例利用大腸桿菌K011和運動發酵單胞菌混合發酵的乙醇產量可達到 2.795 g/1。
實施例3
本實施例的發酵罐中纖維素含量約為6.1% (w/v)，在乙醇發酵過程中，取預先培養的大 腸桿菌KOll、釀酒酵母、運動發酵單胞菌各200ml (大腸桿菌KOll培養l天、酵母培養2 天、運動發酵單胞菌培養4天)離心混合后得沉淀，加入無菌水制成3菌種混合菌懸液共50ml， 加入混合菌懸液至發酵罐進行發酵。其余步驟及工藝參數與實施例1、實施例2相同。
結果表明，本實施例利用大腸桿菌KOll、釀酒酵母和運動發酵單胞菌3菌種混合發酵 的乙醇產量可達到13.79 g/1。
上述各實施例中大腸桿菌K011接種物通過以下方法制備1L搖瓶中裝入500ml 土豆-葡萄糖(LB)培養基，添加質量濃度10%的葡萄糖，接種大腸桿菌KOll， 30°C、 100rpm條 件下培養24小時；10000xg條件下離心10分鐘，去上清，LB培養基懸浮液作為接種物。
上述各實施例中釀酒酵母接種物通過以下方法制備準備培養基，其中包含胰蛋白胨 10g/l、酵母膏5 g/l、 NaCl2 10 g/l、 MgS04 0.25 g/l、 KH2P042.5 g/l、 CaCl2 0.25 g/1和葡萄糖 15g/l，調節培養基的pH值至7.0 7.2，接種釀酒酵母，30°C、 150 rpm條件下培養48 h作為接種物。
上述各實施例中運動發酵單胞菌接種物通過以下方法制備準備培養基，其中包含100 g/1
的葡萄糖、10g/l的酵母膏和2g/l的KH2PO4，接種運動發酵單胞菌，在pH值為6.0、 32°C、 150 rpm的條件下培養96 h后作為接種物。
上述各實施例中產出的乙醇含量采用氣相色譜法進行測定。氣相色譜法的主要參數如下
氣相色譜儀PerkinElmer Clarus 500;色譜柱HP-INNOWAX;
載氣高純氮氣；載氣流速Upsi;
檢測器氫離子火焰檢測器(FID);檢測器溫度為25(TC; Hb流速45ml/min;空氣流速450ml/min;
進樣口溫度20(TC;
進樣方式分流，分流比為30:1;進樣量0.6^1;
爐溫程序升溫，初始溫度50。C， 10°C/min升至120°C， 20。C/min升至180°C，共10min; 樣品的制備發酵液10000xg，離心10分鐘，取0.9ml上清液，加入0.1ml 0.8g/l的正 丙醇作為內標物，用lml正丁醇萃取IO分鐘。
權利要求
1、一種木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組合發酵工藝，包括蒸汽爆破預處理、酶解糖化和乙醇發酵三個步驟，其特征在于所述乙醇發酵是指將酶解糖化制得的酶解液調pH值至6.0～7.5后，接種大腸桿菌KO11(Escherichia coli，ATCC55124)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，CICC1517)進行發酵，或者接種大腸桿菌KO11和運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis，ATCC31821)進行發酵，或者接種大腸桿菌KO11、釀酒酵母和運動發酵單胞菌進行發酵。
2、 根據權利要求1所述的工藝，其特征在于所述的蒸汽爆破預處理是指在蒸汽爆破裝置 中裝入木片，并使蒸汽爆破裝置中維持200 24(TC的溫度、2-5MPa的蒸汽壓力10 25分鐘，再瞬間釋放壓力。
3、 根據權利要求2所述的工藝，其特征在于所述木片的木料來自楊木或杉木。
4、 根據權利要求1所述的工藝，其特征在于所述酶解糖化具體包括以下工序調節蒸汽 爆破預處理后所得木漿的pH值至4.5~5.5，按每克爆破木漿干重添加20~50 FPIU的纖維素酶， 在45 55。C條件下酶解48 72h，酶解時的攪拌速度為100 250卬m。
5、 根據權利要求1所述的工藝，其特征在于所述大腸桿菌KOll的接種量滿足大腸桿菌 K011細胞干重在調pH值后的酶解液中初始濃度達到0.16 0.33 mg/ml;所述釀酒酵母和/或 運動發酵單胞菌的接種量滿足釀酒酵母和/或運動發酵單胞菌的細胞干重在調pH值后的酶解 液中初始濃度達到0.12~0.45 mg/ml。
6、 根據權利要求1所述的工藝，其特征在于所述乙醇發酵過程中，發酵時間為48 96h， 發酵溫度為30 35 °C，發酵時的攪拌速度為100 250rpm。
全文摘要
本發明公開了一種木質纖維生產燃料乙醇的多菌種組合發酵工藝，包括蒸汽爆破預處理、酶解糖化和乙醇發酵三個步驟，其中乙醇發酵是指將酶解糖化制得的酶解液調pH值至6.0～7.5后，接種大腸桿菌KO11和釀酒酵母進行發酵，或者接種大腸桿菌KO11和運動發酵單胞菌進行發酵，或者接種大腸桿菌KO11、釀酒酵母和運動發酵單胞菌進行發酵。本發明的多菌種組合發酵工藝具有操作簡單、成本低廉、環保無污染且能有效提高乙醇產量和木質纖維素利用率等優點。
文檔編號C12P39/00GK101475976SQ20081023749
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月30日 優先權日2008年12月30日
發明者易琳琳, 王義強, 章懷云, 艾斌凌, 陳介南 申請人:中南林業科技大學