葡萄糖誘導性失活及降解抗性轉運蛋白基因及其用途的制作方法

專利名稱：葡萄糖誘導性失活及降解抗性轉運蛋白基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白基因及其用途，特別涉及具有 優異的低聚糖(麥芽糖、麥芽三糖等)分解性的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造 方法等。
背景技術：
在制造啤酒、發泡酒、威士忌等麥芽發酵飲料時，將麥芽等進行糖化后的麥汁中含 有的糖主要為葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖這3種。這些來自麥芽的糖的比率，可根據糖化方 法發生若干變化，但在不添加酶劑、不添加糖化淀粉等的情況下，沒有大的改變，可以說為 大約1 5 1的比例。其中，葡萄糖是單糖，是最適合于酵母的糖，首先被分解。在葡萄糖存在下，酵母中有多種基因的轉錄過程受到抑制。將這種抑制控制稱為 葡萄糖阻遏。將麥芽糖、麥芽三糖轉運到酵母中時所必須的多種轉運蛋白均受到此抑制。 并且已知受到葡萄糖阻遏的基因的產物，進一步被翻譯后，在葡萄糖存在下也會失活。已知 α-葡萄糖苷轉運蛋白也屬于這一類，在葡萄糖存在下被快速降解。因為麥芽糖、麥芽三糖 分解的第一步驟是，通過該轉運蛋白將其轉運到酵母細胞內，所以如果轉運蛋白被降解，那 么這些分解也會停止。這就是將轉運蛋白的表達稱為分解的限速步驟的理由。非專利文獻 1 =Brondijk, Τ. H.，van der Rest, Μ. Ε.，Pluim, D.，de Vries, Y. de.， Stingl, K. , Poolman, B. , and Konings, W. N. (1998) J Biol Chem 273 (25)，15352-15357非專利文獻2 =Medintz, I.，Wang, X.，Hradek, Τ.，and Michels, C. Α. (2000) Biochemistry 39 (15)，4518—4526非專利文獻3 =Gadura, N.，and Michels, C. Α. (2006) Curr Genet 50(2)，101-114

發明內容
發明要解決的課題在這種情況下，期望提供表達不易因葡萄糖導致失活或降解的低聚糖轉運蛋白、 使麥芽糖等低聚糖的分解性提高的酵母。解決課題的方法本發明者為了解決上述課題進行了精心研究，開發出了用于篩選不易因葡萄糖導 致失活、降解的轉運蛋白(以下稱為“對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性轉運蛋白”)或 篩選使其表達的酵母的新方法，并且根據該篩選方法，找到了對葡萄糖誘導性失活/降解 具有抗性的轉運蛋白或包含其的酵母，從而完成了本發明。即本發明涉及編碼對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的基因、被 該基因編碼的轉運蛋白、該基因的表達受到調控的轉化酵母、通過使用該基因的表達受到 調控的酵母制造酒類的方法等。更加具體地說，本發明提供以下所示的多核苷酸、含有該多 核苷酸的載體、導入了該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒類的制造方法等。(1)多核苷酸，其為選自由下述(a) (f)所組成的組中的多核苷酸，
(a)多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸，(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸，(c)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白由序列號2的氨基酸 序列中1 15個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且對葡萄糖 誘導性失活/降解具有抗性，(d)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白具有與序列號2的氨 基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(e)多核苷酸，其含有與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核 苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷 酸，以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸 的堿基序列的互補堿基序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘導性 失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷酸。(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其為選自由下述(g) (i)所組成的組中的多核 苷酸，(g)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白由序列號2的氨基酸 序列或序列號2的氨基酸序列中1 5個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基 酸序列組成、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(h)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白具有與序列號2的氨 基酸序列有97%以上的同一性的氨基酸序列、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(i)多核苷酸，其含有與由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸，或者含有與由序 列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖 誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷酸。(3)如上述⑴或⑵所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。(4)如上述(1)或(2)所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成 的蛋白質的多核苷酸。(5)如上述(1) (4)中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。(6)蛋白質，其為被上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。(7)載體，其含有上述⑴ (5)中任一項所述的多核苷酸。(8)轉化酵母，其中導入了上述(7)所述的載體。(9)如上述⑶所述的釀造用酵母，其中，通過導入上述(7)所述的載體，低聚糖分 解能力提高。(10)如上述⑶所述的釀造用酵母，其中，通過增加上述(6)所述的蛋白質的表達 量，低聚糖分解能力提高。(11)酒類的制造方法，其中，使用上述⑶ (10)中任一項所述的酵母。(12)如上述(11)所述的酒類的制造方法，其中，釀造的酒類是麥芽飲料。(13)如上述(12)所述的酒類的制造方法，其中，釀造的酒類是葡萄酒。(14)酒類，其為利用上述(11) (13)中任一項所述的方法制造的酒類。
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發明的效果通過使用本發明涉及的酵母，具有可加快含有麥芽糖等低聚糖的酒醪的發酵速度 的優點。本發明涉及的轉運蛋白基因，可導入任何釀造用酵母或實驗室酵母中。特別是在大 量含有葡萄糖、果糖等單糖的發酵原液中含有本發明涉及的轉運蛋白可轉運的低聚糖(麥 芽糖、麥芽三糖、松二糖(Turanose)、海藻糖(trehalose)等)的情況下，更加有效。


圖1是表示實驗室酵母株在2-脫氧葡萄糖存在下生長繁殖的不同的圖。圖2表示MAL21基因的堿基序列。圖3表示Mal2 Ip的氨基酸序列。圖4-1是Mal21p/Mal31p/Mal61p的氨基酸序列的比對圖。圖4-2是Mal21p/Mal31p/Mal61p的核苷酸序列的比對圖。圖4-3是接續圖4-2。圖4-4是接續圖4-3。圖5是表示具有MAL21/MAL61基因的菌株在2_脫氧葡萄糖存在下生長繁殖的不 同的圖。圖6是表示Mal21p及Mal61p在葡萄糖存在下的降解速度的圖。圖7是表示使MAL21/MAL61基因高表達的實驗室株在麥芽糖培養基上的生長繁殖 的圖。圖8是表示使MAL21基因高表達的下面啤酒酵母株的發泡酒或者發泡酒(富含葡 萄糖)麥汁中的麥芽糖發酵速度的圖。圖9是表示使Mal21p轉運蛋白高表達的上面啤酒酵母的麥汁中的麥芽糖發酵速 度的圖。圖10是表示質粒ρ JHXSB的組成的圖。圖11是表示質粒ρJHIXSB的組成的圖。
圖12是表示質粒pYCGPY的組成的圖。圖13是表示質粒pUP3GLP的組成的圖。
具體實施例方式本發明者認為，如果能夠控制翻譯后的轉運蛋白因葡萄糖導致的失活或降解，即 使在葡萄糖存在下，麥芽糖及麥芽三糖也可被酵母更高效地分解。基于這種想法進行精 心研究，結果從自然界中發現了不易被降解的α “葡萄糖苷轉運蛋白Mal21p，并且確認 Mal21p的降解速度遠遠低于其他轉運蛋白。此外，通過使新獲取的不易因葡萄糖導致失活或降解的轉運蛋白進行高表達，確 實成功地提高了在麥芽糖培養基上的增殖速度，并且在啤酒釀造中可加快麥芽糖的分解速 度。本發明根據這種設想和研究成果而得以完成。本發明中序列號1 6表示以下基因的堿基序列或以下轉運蛋白的氨基酸序列。序列號1 MAL21核苷酸序列序列號2 Mal21p α -葡萄糖苷轉運蛋白氨基酸序列
序列號3 MAL31核苷酸序列序列號4Mal31p α -葡萄糖苷轉運蛋白氨基酸序列序列號5 MAL61核苷酸序列序列號6 Maieip α -葡萄糖苷轉運蛋白氨基酸序列本說明書中使用的“ α _葡萄糖苷轉運蛋白”是指與α _葡萄糖苷的轉運相關的蛋 白質，作為α-葡萄糖苷轉運蛋白，包括麥芽糖轉運蛋白、麥芽三糖轉運蛋白等。1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供的多核苷酸是(a)多核苷酸，含有由序列號1的堿基序列組成 的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷 酸。多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA。在本發明中作為對象的多核苷酸，并不限定于編碼上述序列的蛋白質的多核苷 酸，還包括編碼與該蛋白質具有同等功能的蛋白質的其他多核苷酸。作為功能同等的蛋白 質，可例舉出，例如(c)由序列號2的氨基酸序列中1 15個(優選為1 14個、1 13 個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸發生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組 成、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白。作為這種蛋白質，可例舉出，由序列號2的氨基酸序列中例如1 14個、1 13 個、1 12個、1 11個、1 10個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個(1 數個)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、1個氨基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或 添加后的氨基酸序列組成、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白。上述氨基 酸殘基的缺失、取代、插入及/或添加的數量，通常情況下越小越好。此外，作為這種蛋白 質，可例舉，(d)具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、 94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2%以上、 99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上或99. 9%以上 同一性的氨基酸序列，且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白。上述同源性的 數值通常情況下越大越好。<葡萄糖誘導性失活/降解抗性的評價>在本發明中，對葡萄糖誘導性失活/降解的抗性，例如，可按以下方法進行評價。 首先，確認表達各轉運蛋白的菌株在含有0 2mM的2-脫氧葡萄糖的包含2%麥芽糖的完 全合成培養基(SCM)(無氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Basew/o amino acids) 6. 7g/ L、麥芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L-組氨酸鹽酸 鹽20mg/ml、L-精氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸 30mg/ml、L-異亮氨酸30mg/ml、L-賴氨酸鹽酸鹽30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨 酸 100mg/ml、L-天冬氨酸 100mg/ml、L-纈氨酸 150mg/ml、L-蘇氨酸 200mg/ml、L-絲氨酸 400mg/ml)或者在含有0 2mM的2-脫氧葡萄糖的麥芽糖等的最小必需培養基(無氨基酸 酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids) 6. 7g/L、麥芽糖等 5g/L，但對于營養缺 陷型轉化株，含有其營養素)上的生長繁殖狀況，即使產生葡萄糖誘導性失活/降解信號的 狀態的酵母，也要篩選其轉運蛋白具有麥芽糖轉運活性并發揮作用的菌株。接著，將該菌株 接種到YPD (酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，30°C振蕩培養一夜。將
6培養液接種到YPM培養基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麥芽糖5g/L)中，使0D660 =1.0，30°C振蕩培養2. 5小時，并進行集菌。測取60個0D660單位的細胞，使其懸浮于預 先在30°C保溫的降解速度測定用培養基[無氨基酸酵母氮源(不含氨)(Yeast Nitrogen Basew/o amino acids and ammonia) 1. 7g/L、葡萄糖 20g/L、環己酰亞胺 25 μ g/L] 30ml 中， 30°C進行溫育。在適當的時間(0、10、20、30及40分鐘或者0、30、60、90及120分鐘)抽取 細胞懸浮液樣品5ml，快速離心棄除上清液，將細胞用乙醇干冰冷凍。根據通常方法從冷凍 細胞中檢測轉運蛋白，測定蛋白條帶的強度，由其減少速度計算半衰期。在本發明中優選的 轉運蛋白，例如，與Mal31p或Mal61p比較，具有2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6 倍以上或8倍以上的半衰期。本發明還提供(e)多核苷酸，其含有與由序列號1的堿基序列的互補堿基序列組 成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白 的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多 核苷酸的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘 導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷酸。在本發明中優選的多核苷酸為上述(a) (f)中規定的多核苷酸、含有編碼由序 列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸、或者含有由序列號1的核苷酸 序列組成的多核苷酸的多核苷酸。更優選為由序列號1特定的多核苷酸。在此，“在嚴謹條件下進行雜交的多核苷酸”是指，例如，以由序列號1的堿基序 列的互補堿基序列組成的多核苷酸、或者編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或 一部分作為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等所得到的多核 苷酸(例如DNA)。作為雜交的方法，例如可使用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley & Sons 1987-1997 等中所記載的方法。本說明書中所述的“嚴謹條件”，可以為低嚴謹條件、中嚴謹條件及高嚴謹條件中 的任一種。“低嚴謹條件”，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、32°C 的條件。此外，“中嚴謹條件”，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5% SDS、50%甲酰胺、 42 °C的條件。“高嚴謹條件”，例如為5 X SSC、5 X Denhardt溶液、0. 5 % SDS、50 %甲酰胺、 50°C的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效獲得具有高同源性的DNA。但是，作 為影響雜交的嚴謹性的因素，認為有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等 多種因素，如果是本領域技術人員，通過適當選擇這些因素可實現同樣的嚴謹性。此外，雜交中使用市售的試劑盒時，例如可使用Alkphos Direct LabellingReagents (Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據試劑盒中附帶的說明方案， 與標記后的探針保溫過夜后，在55°C的條件下用含有0. 1 % (w/v) SDS的1次洗滌緩沖液洗 滌膜后，可檢出雜交后的DNA。除上述以外，作為可雜交的DNA，可例舉，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件， 使用默認參數計算時，與編碼序列號2或4的氨基酸序列的DNA有約90%以上、91 %以 上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 99. 以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上 99. 8%以上、99. 9%以上同一性的DNA。此外，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可使用根據Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268，1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873， 1993)決定。已開發了基于BLAST算法的被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF, et al J. Mol. Biol. 215 :403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數例如為score = 100、wordlength = 12。此外，使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數例如為score = 50、 wordlength = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認參數。2.本發明的蛋白質本發明提供被上述(a) (i)中任一個多核苷酸所編碼的蛋白質。本發明的優選 蛋白質為由序列號2的氨基酸序列中1 15個(優選1 14個、1 1 3個、1 12個、 1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、 1 2個或1個)氨基酸發生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成，且對葡萄糖 誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白。作為這種蛋白質，可例舉，由序列號2的氨基酸序列中上述數量的氨基酸殘基發 生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成，且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗 性的轉運蛋白。此外，作為這種蛋白質，可例舉，具有與序列號2的氨基酸序列有上述同源 性的氨基酸序列，且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白。這種蛋白質，可使用 《Molecular Cloning 3》、C《urrent Protocolsin Molecular Biology》、“Nuc. Acids. Res., 10,6487(1982) ”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79，6409 (1982) ”、“Gene, 34，315 (1985)，，、 "Nuc. Acids. Res.，13,4431 (1985) ”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，488 (1985) ” 等所述的 定點突變引入法而獲得。本發明的多核苷酸涉及的蛋白質的氨基酸序列中1 15個(優選為1 14個、 1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5 個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或添加，是 指在同一序列中的任意并且1 15個、1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10 個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個的 氨基酸序列中的位置上，缺失、取代、插入及/或添加1 15個、1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個的氨基酸殘基，缺失、取代、插入及添加中的2種以上可同時發生。下面列舉可互相取代的氨基酸殘基，同一組中包含的氨基酸殘基可互相取代。A 組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基 絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、 異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、 鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸； F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。本發明的蛋白質，也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等化學合成法制造。此外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、Perkin Elmer公 司、Pharmacia 公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega 公司、 PerS印tive公司、島津制作所等制造的肽合成儀進行化學合成。3.本發日月的jH本及導入該jH本的轉仆Jg母本發明提供含有上述多核苷酸的載體。本發明的載體，優選含有上述(a) ⑴
8中任一項所述的多核苷酸(DNA)、或由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或者編碼由序 列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。并且，本發明的載體通常以包含表達盒的 形式構成，該表達盒包含的結構要素為(χ)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)與該啟動 子以正向或反向連接的上述任一項所述的多核苷酸(DNA)；以及(ζ)與RNA分子的轉錄終 止及多聚腺苷化作用相關，在酵母內發揮作用的信號。此外，要使上述本發明的蛋白質進行 高表達時，優選將上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)以相對于該啟動子的正 向導入，以促進這些多核苷酸的表達。作為向酵母中導入時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、 染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，作為YEp型載體，已知有YEp24(J.R.Br0ach et al. , Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83，1983)，作為 YCp 型載體，已知有 YCp50(M. D. Rose et al.，gene，60，237，1987)，作為 YIp 型載體，已知有 YIp5 (K. Struhlet al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USP，76，1035，1979)，且 容易獲得。此外，也可使用染色體整合型的pUP3GLP(0mura，F. et al.，FEMS Microbiol. Lett.，194，207，2001)(圖 13)、pJHIXSB (圖 11)、ρYCGPY (Kodama，Y. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，67，3455，2001)(圖 12), ρ JHXSB (圖 10)等單拷貝復制型的質粒。作為用于調控酵母中的基因表達的啟動子/終止子，只要在釀造用酵母中發揮 作用的同時不受醪液中的糖、氨基酸等成分的濃度影響，可以任意組合。例如可利用甘油 醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的啟動子等。這 些基因均已被克隆，如在Μ. F. Tuite et al.，EMBO J.，1，603 (1982)中有詳細記載，通過已 知的方法可容易地獲得。在表達載體中使用的啟動子，根據發酵醪液的糖組成、糖濃度、多 種轉運蛋白的組合等，可有效地改變成具有適當轉錄活性的啟動子。作為轉化時使用的選擇性標記，因釀造用酵母不能利用營養缺陷型標記，因此，可 利用遺傳霉素(Geneticin)抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUPl) (Marin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984)、淺藍菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(豬腰淳嗣等，生物 化學，64，660，1992 ；Hussain et al.，gene，101，149，1991)(日語原名Λ 矛 Λ豬腰淳嗣 6，生化學，64，660，1992 ；Hussain etet al.，gene, 101，149，1991)等。將上述構建的載體 導入宿主酵母內。作為本發明中利用的宿主酵母，可例舉，可用于釀造的任何酵母，例如啤酒、葡 萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體可例舉，酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發 明中，可使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus) W34/70等、卡爾斯伯 酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456 等、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954 等。并且還可使用威士忌酵母，如釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等；葡萄酒酵母，如協會葡萄酒用1號、葡萄酒 用3號、葡萄酒用4號等；清酒酵母，如協會酵母清酒用7號、清酒用9號等，但并不限于這 些酵母。在本發明中，優選使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。制備本說明書中所述的各轉運蛋白基因時使用的染色體DNA，并不限定于釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC20598、ATCC96955等的菌株，只要是屬于具有各基因 的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，可以從任何酵母中制備。作為酵母的轉化方法，可利用通常使用的公知方法。例如，可實施電穿孔法“Meth.Enzym.，194，pl82(1990) ”、原生質球法(Spheroplast) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) ”、乙酸鋰法"J. Bacteriology, 153，pl63 (1983) ”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、Methods in yeastgenetics, 2000 Edition :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等記載的方法，但并不限于這些方法。此外，轉化菌株，通過將宿主的營養缺陷型互補基因例如URA3整合到表達質粒 中，可以用不含尿嘧啶的瓊脂培養基來篩選。或者通過將抗藥性基因例如對于環己酰亞胺 的抗藥性基因YAP1、或者遺傳霉素抗生素(Geneticin)抗性基因G418R整合到表達質粒 中，可以用含有環己酰亞胺(例如0.3yg/ml)、或者遺傳霉素抗生素(Geneticin)(例如 300yg/ml)的瓊脂培養基來篩選。更具體地說，將宿主酵母在標準酵母營養培養基(如YEPD培養基 “GeneticEngineering. Vol. 1，Plenum Press, NewYork, 117(1979) ”等)中培養至 0D600nm 值為1 6。將該培養酵母離心分離并收集、洗滌，用濃度約為IM 2M的堿性離子金屬 離子、優選用鋰離子進行預處理。將上述細胞在約30°C下靜置約60分鐘，然后，與導入的 DNA (約1 20 μ g)同時在約30°C下，靜置約60分鐘。添加聚乙二醇，優選添加約4，000 道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度為約20% 50%。在約30°C下靜置約30分鐘后，將上述細 胞在約42°C下加熱處理約5分鐘。優選用標準酵母營養培養基將上述細胞懸浮液洗滌，加 入到規定量的新鮮標準酵母營養培養基中，約30°C下靜置約60分鐘。然后，將其移植到含 有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基上，獲得轉化體。此外，對于通常的克隆技術，可參照《Molecular Cloning 3K"Methods inYeast Genitics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、 ColdSpring Harbor, NY) ”等。4. ^m mmmm^iiuΜmrn^mn的酒類將上述本發明的載體導入適合釀造作為制造對象的酒類的酵母中，通過使用該酵 母，可制造具有氨基酸組成特征的酒類。作為對象的酒類，可以為啤酒、葡萄酒、威士忌、清 酒等，但并不限于這些。在制造上述酒類時，除使用本發明獲得的釀造酵母代替親株之外，可利用公知的 方法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往的方法完全相同，不會因制造發酵時間縮 短的酒類而增加成本。也就是說，根據本發明能夠使用已有的設備不增加成本地進行制造。5.本發明的酵母的評價方法構建含有獲取的多核苷酸的表達載體，根據常規方法將其導入酵母中，將導入了 該基因的酵母在低聚糖培養基(例如麥芽糖、麥芽三糖培養基)上進行培養。通過測定培 養時該酵母中包含的轉運蛋白對葡萄糖誘導性失活/降解的抗性、該酵母的低聚糖分解能 力、增殖速度、在麥汁中的發酵速度等，可評價該酵母的適應性。對葡萄糖誘導性失活/降 解的抗性、低聚糖分解能力、增殖速度、在麥汁中的發酵速度等，可通過下述實施例中使用 的方法進行評價。實施例以下通過實施例對本發明更加詳細地說明，但應該注意到本發明并不限于這些實 施例。[試驗方法]
在本實施例中使用的試驗項目和試驗方法如下所示。只要無特別限制，本實施例 中的試驗方法以此為標準。<MAL61，MAL31 及 MAL21 基因的獲取〉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MAL61及MAL31基因己被克隆，其堿基 序列已被報道。本說明書中使用的MAL31(序列號3)從酵母基因組數據庫(Saccharomyces Genome Database)注冊號YBR298C中獲得，MAL61(序列號5)從基因庫(GenBank)注冊 號X17391中獲得。MAL61及MAL31基因，是通過以其堿基序列信息為基礎，使用從具有各 基因的酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中制備的染色體DNA作為PCR模板，通 過PCR擴增、分離MAL61、及MAL31基因而獲取。對于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MAL21，已知其被III號染色體編 碼，可并不知道DNA序列。但是因為考慮到被II號染色體編碼的MAL31、被VIII號染色體 編碼的MAL61基因具有99%以上的同一性，所以預測MAL21也具有相當高的同一性。事實上我們利用從GENBANK注冊號X17391中獲得的MAL61的DNA序列設計了引物 5 ‘ AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA3 ‘(序列號 7)和 5，TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3，(序列號 8)。 然后，以具有MAL21基因、但不具有其他α-葡萄糖苷轉運蛋白基因的酵母的染色體DNA為 模板,通過PCR可獲取MAL21。具體來說，MAL31是由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C(ATCC204508(Rose, Μ. D. ， Winston, F. and Hieter, P. (1990) =Methods inYeast Genetics :A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY) )、MAL21 是由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC20598、而且 MAL61是由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ATCC96955，使用相同的引物通過PCR獲 取。使用Invitrogen公司的Τ0Ρ0 TA cloning kit，將獲取的DNA片段插入載體pCR(注冊 商標)2. 1-T0P0后，通過DNA測序確認插入的基因序列。對于MAL31及MAL61，確認與數據庫中注冊的序列(分別為基因組數據庫注冊號 YBR298C及GenBank注冊號X17391)相同。對于MAL21，獨立地對10個克隆以上測序，確 定了其序列(序列號1)。此外，使用的引物中起始密碼子的上游有XbaI或者SacI位點，終止密碼子的下游 有BamHI位點，并已整合到表達載體內。通過使用染色體DNA的PCR的目標基因的擴增以 及其后的分離，包括PCR引物的制備，均可利用本領域技術人員公知的方法進行。MAL21的 堿基序列如圖2所示，氨基酸序列如圖3所示。<表達質粒、文庫構建質粒>在本發明中，使用(1) (4)的4個表達載體。(l)pJHXSB (圖 10)(2)pJHIXSB (圖 11)(3)pYCGPY (圖 12)(4)pUP3GLP (圖 13)〈酵母株〉在本發明中，在獲取轉運蛋白基因和進行菌株之間比較時，使用菌株⑴ (5)， 在利用轉運蛋白高表達的菌株確認生長繁殖速度、發酵速度時，使用菌株(6) (8)。(1)釀酒酵母 S288C(ATCC204508) (MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)
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(2)釀酒酵母 ATCC96955 (MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 mal 11MAL12 mall3 ura3-52 leu2_3 leu2_112 trpl his)(3)釀酒酵母 ATCC20598 (MATa sue MAL2 MELl his4 leu2)(4)釀酒酵母CBll (Berkley Stock Center) (MATa adel MAL61 MAL62MAL63 AGTl MAL12 MAL31 MAL32)(5)釀酒酵母HHlOOl (MATa SUC2 mal mel gal2 CUPl TPIl: :TPIlpr_MAL32_G418R ura3)(6)釀酒酵母 Δ 152MS (MATa mal61: :TRP1 MAL62 MAL63 mal64 mal IlMAL 12 mal 13 leu2-3 leu2-112 his URA3::TDH3p::MAL62)(7)上面啤酒酵母AH135(8)下面啤酒酵母 Weihenstephan 194<轉運蛋白的麥芽糖或麥芽三糖轉運活性的評價>天然型轉運蛋白的轉化株(以不具有α-葡萄糖苷轉運蛋白基因的菌株作為宿 主)中導入的轉運蛋白基因的表達，可通過在以0. 5%的麥芽糖或者麥芽三糖為唯一碳源， 含有抗霉素3mg/L的最小必需培養基(無氨基酸酵母氮源(YeastNitrogen Base w/o amino %土如)6.78/1、麥芽糖或者麥芽三糖58/1、抗霉素31^/1)上有無生長繁殖來檢驗。即使是 α-葡萄糖苷轉運蛋白不發揮作用的菌株，在以麥芽糖或者麥芽三糖為唯一碳源的最小必 需培養基上，也會有略微增殖。但是，如果加入呼吸阻斷劑的抗霉素，在以麥芽糖或者麥芽 三糖為唯一碳源的最小必需培養基上，該菌株無法生長繁殖，所以可明確地判斷α-葡萄 糖苷轉運蛋白的功能。例如，使用鉬金勺從YPD平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/ L、葡萄糖20g/L)上挑取一供試菌株，在Iml的滅菌水中一次洗滌后，再懸浮于滅菌水中使 0D660 = 0. 2。將其進行集菌，再次懸浮于Iml的滅菌水中，然后將細胞懸浮液在以麥芽糖 或麥芽三糖為唯一碳源的試驗培養基上直接劃線確認生長繁殖狀況，通過這樣確認具有麥 芽糖或麥芽三糖的轉運活性。<轉運蛋白的2-脫氧葡萄糖抗性的評價>已知2-脫氧葡萄糖(2-D0G)只能代謝為2-D0G-6-磷酸，所以是不能作為碳源的 糖類似物，但與葡萄糖產生同樣水平的葡萄糖阻遏或者同樣水平的葡萄糖誘導失活。因此， 在這種平板上生長繁殖的菌株，具有不易因葡萄糖導致失活的α-葡萄糖苷轉運蛋白的可 能性高。為了檢驗對于2-D0G的抗性，制作了 麥芽糖最小必需培養基(無氨基酸酵母氮 源(Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids) 6. 7g/L、麥芽糖 20g/L、0_2. OmM 2-脫氧葡萄 糖)，或在含有麥芽糖的完全合成培養基(SCM)(無氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids) 6. 7g/L、麥芽糖 20g/L、硫酸腺嘌呤 20mg/ml、尿嘧啶 20mg/ml、L-色氨酸 20mg/ml、L-組氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-精氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪 氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-異亮氨酸30mg/ml、L-賴氨酸鹽酸鹽30mg/ml、L-苯 丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L-天冬氨酸100mg/ml、L-纈氨酸150mg/ml、L-蘇氨 酸200mg/ml、L-絲氨酸400mg/ml)上加入OmM 2. OmM的2-脫氧葡萄糖(2-D0G)的平板。 通過將各轉運蛋白表達株的0D660 = 0. 2的細胞懸浮液的稀釋系列在試驗培養基上分別點 樣3 μ 1，30°C培養2 3天來檢驗。<轉運蛋白的菌體內蓄積量的測定>
轉運蛋白的菌體內的蓄積量，例如可通過Western印跡法進行測定。例如從IOml 的培養液中回收對數增殖期的供試菌株，在溶解緩沖液中(8M尿素、5% (w/v)SDS,40mM Tris-HCl (pH6. 8)、0. ImM EDTA、1% β-巰基乙醇)通過用玻璃珠攪拌破碎，獲得細胞提取 液。將總蛋白質為60μ g的試樣用SDS-凝膠電泳展開，轉印到硝基纖維素膜上后使用兔多 克隆抗Mal61p抗體，進行Western印跡分析。兔多克隆抗Mal61p抗體根據以下方法獲取。 將編碼 Mal61p 的 N 末端區域(Metl_Leul81)的 DNA 與 pET 表達載體(Expression vector) (Novagen公司)的GST tag的下游連接，轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)中，將其轉化體的細胞 破碎液加入GST結合樹脂柱中，通過洗脫制備與柱子結合的蛋白質。詳細內容根據Novagen 公司的 pET Expression System, GST · Bind Affinity Resins (Novagen 社)內附加的操 作指南。制備的融合蛋白質，通過SDS-PAGE確認純度后，將其作為抗原免疫兔子，獲得多克 隆抗體。對于抗體的有效性，通過下述方法確認，即將表達了 α-葡萄糖苷轉運蛋白基因 的酵母株和不具有該基因的其宿主株在YPM培養基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、 麥芽糖5. Og/L)上培養，使用其細胞破碎液、本抗體利用上述方法進行Western印跡分析。 利用本抗體僅在表達了 α “葡萄糖苷轉運蛋白基因的酵母株破碎液中，檢測出與68kDa的 α-葡萄糖苷轉運蛋白分子量一致的陽性條帶。<轉運蛋白的降解速度的測定>將表達各轉運蛋白的菌株接種于YPD中，30°C振蕩培養一夜。將培養液接種于YPM 培養基中，使0D660 = 1. 0，30°C振蕩培養2. 5小時，并進行集菌。測取60個0D660單位的細 胞，使其懸浮于預先在30°C保溫的降解速度測定用培養基[無氨基酸酵母氮源(不含氨) (Yeast Nitrogen Base w/o amino acids andammonia) 1. 6g/L、葡萄糖 20g/L、環己酉先亞胺 25 μ g/L] 30ml中，30°C進行溫育。在適當的時間(0、10、20、30及40分鐘或者0、30、60、90 及120分鐘)抽取細胞懸浮液樣品5ml，快速離心棄除上清液，將細胞用乙醇干冰冷凍。根 據上述方法從冷凍細胞中檢測轉運蛋白，測定蛋白條帶的強度，由其減少速度計算半衰期。<麥芽糖分解能力的評價>使轉運蛋白進行組成型表達的酵母對麥芽糖的分解，通過在適合該酵母的條件 下，使酵母進行有氧培養或發酵，測定培養基中的麥芽糖量，由此進行評價。糖的測定，可利 用本領域技術人員公知的方法，例如通過使用IR檢測器的液相色譜法進行測定。下述含有 本發明的核苷酸序列的轉化酵母中，麥芽糖的吸收能力得到改善。^MM 1 有葡萄糖誘！^牛失活/降解抗件的q -轉運g白的 帝選制作在含有2%麥芽糖的完全合成培養基(SCM)中加入2-脫氧葡萄糖 (2-D0G) OmM 2mM的平板。已知2-脫氧葡萄糖(2-D0G)只能代謝為2-D0G-6-磷酸，所以 是不能作為碳源的糖類似物，但與葡萄糖產生同樣水平的葡萄糖阻遏或者同樣水平的葡萄 糖誘導失活。因此，在該平板上生長繁殖的菌株，具有不易因葡萄糖導致失活的α-葡萄糖 苷轉運蛋白的可能性高。對于各種酵母株，用細胞懸浮液點樣，在30°C進行溫育。其結果， 具有MAL21的酵母株ATCC20598與其他菌株不同，在含有ImM的2-D0G的平板上也生長繁 殖，因此可預測MAL21是不易因葡萄糖導致降解的轉運蛋白(圖1)。于是，根據MAL61的5， 上游和3’下游的堿基序列信息設計引物(序列號7及8)，以ATCC20598的基因組DNA作為 模板，通過PCR擴增MAL21基因，克隆入Invitrogen公司的pCR2. 1-T0P0內，進行DNA測序。 堿基序列(序列號1)如圖2所示，氨基酸序列(序列號2)如圖3所示。Mal21p/Mal31p/Mal61p/的氨基酸序列的比對如圖4-l、Mal21p/Mal31p/Mal61p/的核苷酸序列的比對圖如 圖4-2 4-4所示。將該MAL21基因整合到質粒pJHIXSB (圖11)的SacI-BamHI位點。將該質粒 PJHIMAL21經URA3基因上的EcoRV切割后，通過TPIl啟動子作為組成型轉錄的表達單元， 整合到酵母HHlOOl內，作為HH206株。因為HH1001是mal-株的X2180-1A的ura3-的姐 妹株，整合了 TPIlp: :MAL32(編碼麥芽糖酶基因)，所以麥芽糖酶進行組成型表達。通過對 HH206株在含有OmM 2mM 2-D0G的SCM平板上的生長繁殖狀況進行檢驗，結果，具有MAL61 及MAL31基因的HH108及HH227株，在1. OmM的2-D0G平板上均不能生長繁殖，而HH206株 在2. OmM的2-D0G平板上生長繁殖(圖5)。并且，使用抗Mal61p抗體，通過Western印跡法檢驗Mal21p的葡萄糖誘導降解速 度，結果半衰期約為2小時。與此相對，Mal31p和Mal61p的半衰期約為20分鐘，與其他轉 運蛋白相比，確認Mal21p具有相當長的半衰期(圖6)。實施例2 :MAL61高表汰株和MAL21株高表汰株在壽芽糖培養基上的牛長繁殖將MAL61和MAL21整合到質粒pYCGPY的TDH3啟動子的下游SacI-BamHI位點，將 各質粒作為PYCGPYMAL61及pYCGPYMAL21。質粒pYCGPY是具有CEN-ARS的YCp型質粒，具有 G418抗性基因、Ap抗性基因等(圖12)。將pYCGPYMAL61及pYCGPYMAL21轉化入Δ 152MS 株。Δ 152MS株是通過TRPl標記物破壞ATCC96955具有的MAL61，導入TDH3啟動子控制下的 MAL62(麥芽糖酶基因)的菌株。將 Δ 152MS(pYCGPYMAL61)和 Δ 152MS (pYCGPYMAL21)接種 到YPM(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麥芽糖5. Og/L)中，在30°C振蕩培養，使0D660 =o 每 1. 5 小時測定 0D660 (圖 7)。Δ 152MS (pYCGPYMAL21)與 Δ 152MS (pYCGPYMAL61)相 比，在麥芽糖中生長繁殖快，在實驗室株中，證實了對于葡萄糖誘導性降解具有抗性的轉運 蛋白的效果。實施例3 使MAL21高表達的下面啤酒酵母的發泡酒麥汁發酵試驗將對于葡萄糖誘導性降解具有抗性的轉運蛋白MAL21整合到質粒pUP3GLP的 XbaI (或者SacI)-BamHI位點。pUP3GLP用圖13表示。pUP3GLP是YIp型質粒，轉運蛋白基 因通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(TDH3p)表達。將各質粒經URA3中的EcoRV位點切 割后，轉化入下面啤酒酵母(Weihenst印hanl94)，涂布于含有0. 3 μ g/ml的環己酰亞胺的 YPG平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L)上。通過PCR來確認目標表 達盒已插入Weihenstephan 194的染色體上的URA3基因內。將Weihenstephan194(URA3: :TDH3p: :MAL21)和親株Weihenstephan 194接種到 2種發泡酒麥汁中。發泡酒麥汁是除水之外的原料中的麥芽使用比率低于25%且使用了糖 化淀粉、啤酒花等的麥汁。發泡酒用麥汁的一種是初期浸出物濃度為14. 0%，含有組成比為 葡萄糖1. 2%、麥芽糖6. 6%、麥芽三糖2. 2%的糖。另一種富含葡萄糖的發泡酒麥汁是初期 浸出物濃度為15.6%，含有組成比為葡萄糖4.7%、麥芽糖5.4%、麥芽三糖1.7%的糖。分 別通過在相同量的麥汁(終濃度、麥芽比率低于25%)中，加入糖組成不同的糖化淀粉來制 備。在各發泡酒麥汁中加入濕菌體，使其為7. 5g/L，在15°C進行發酵，測定發酵中酒醪的麥 芽糖濃度。其結果如圖8所示。在任一種發泡酒麥汁中，MAL21高表達株對麥芽糖的分解速度均比親株 Weihenstephan 194顯著加快。特別是富含葡萄糖的發泡酒麥汁，其效果顯著。初期浸出物濃度高是指葡萄糖濃度高，充分體現了對于葡萄糖誘導性降解具有抗性的轉運蛋白的效^ οt施例4 :#MAL21高表汰的卜.面啤酒酵母的.汁發酵i式齡將對于葡萄糖誘導性降解具有抗性的轉運蛋白MAL21整合到質粒pUP3GLP的 XbaI (或者SacI)-BamHI位點。pUP3GLP用圖13表示。pUP3GLP是YIp型質粒，轉運蛋白基 因通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(TDH3p)表達。將各質粒經URA3中的EcoRV位點切 割后，轉化入上面啤酒酵母AH135中，涂布于含有0. 3μ g/ml的環己酰亞胺的YPG平板(酵 母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L)上。通過PCR來確認目標表達盒已插入到 AH135的染色體上的URA3基因內。將AH135(URA3: :TDH3p: :MAL21)加入初期浸出物濃度為 13%或者20%的100%麥芽麥汁中，使濕菌體為5g/L，15°C進行發酵，測定發酵中的酒醪的 麥芽糖濃度，其結果如圖9所示。不論使用哪一種菌株，麥芽糖的分解速度均比親株AH135加快。特別是初期浸出 物濃度為20%時，其效果顯著。初期浸出物濃度高是指葡萄糖濃度高，可以說體現了對于葡 萄糖誘導性降解具有抗性的轉運蛋白的效果。并且確認對于葡萄糖誘導性降解具有抗性的 轉運蛋白的高表達，不僅對下面啤酒酵母有效，而且對上面啤酒酵母也有效。綜上所述，發現在幾種酵母中原來存在的Mal21p與其它α-葡萄糖苷轉運蛋白不 同，不易因葡萄糖導致降解。并且確認，使用表達該轉運蛋白的酵母(實驗室株、釀造用酵 母均可)時，可加快酒醪中的麥芽糖等該轉運蛋白可轉運的糖的分解。特別是葡萄糖等單 糖濃度高時更加有效。工業實用性包含本發明涉及的具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的酵母，低聚糖 分解能力提高，分解麥芽糖等低聚糖的能力優異。這種酵母可有效利用于啤酒、葡萄酒的釀 造中。
權利要求
多核苷酸，其特征在于，選自由下述(a)～(f)所組成的組中，(a)多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸，(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸，(c)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白由序列號2的氨基酸序列中1～15個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(d)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(e)多核苷酸，其含有與由序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷酸，以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的堿基序列的互補堿基序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，選自由下述(g) (i)所組成的組中，(g)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白由序列號2的氨基酸序列 或序列號2的氨基酸序列中1 5個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序 列組成、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(h)多核苷酸，其含有編碼轉運蛋白的多核苷酸，該轉運蛋白具有與序列號2的氨基酸 序列有97%以上的同一性的氨基酸序列、且對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性，(i)多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸，或者含有與由序列號1 的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交、且編碼對葡萄糖誘導性 失活/降解具有抗性的轉運蛋白的多核苷酸。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，含有由序列號1的堿基序列組成的 多核苷酸。
4.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，含有編碼由序列號2的氨基酸序列 組成的蛋白質的多核苷酸。
5.如權利要求1 4中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，其為DNA。
6.蛋白質，其特征在于，其為被權利要求1 5中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
7.載體，其特征在于，含有權利要求1 5中任一項所述的多核苷酸。
8.轉化酵母，其特征在于，其中導入了權利要求7所述的載體。
9.如權利要求8所述的釀造用酵母，其特征在于，通過導入權利要求7所述的載體，提 高了低聚糖分解能力。
10.如權利要求9所述的釀造用酵母，其特征在于，通過增加權利要求6所述的蛋白質 的表達量，提高了低聚糖分解能力。
11.酒類的制造方法，其特征在于，使用權利要求8 10中任一項所述的酵母。
12.如權利要求11所述的酒類的制造方法，其特征在于，釀造的酒類是麥芽飲料。
13.如權利要求12所述的酒類的制造方法，其特征在于，釀造的酒類是葡萄酒。
14.酒類，其特征在于，其為利用權利要求11 13中任一項所述的方法制造的酒類。
全文摘要
本發明涉及對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白的基因及其用途，特別涉及具有優異的低聚糖(麥芽糖、麥芽三糖等)分解性的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類、其制造方法等。特別是本發明涉及Mal21p等對葡萄糖誘導性失活/降解具有抗性的轉運蛋白、編碼該轉運蛋白的基因、利用該轉運蛋白的酒類的制造方法等。
文檔編號C12N1/19GK101978053SQ20088000063
公開日2011年2月16日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者大村文彥, 畠中治代 申請人:三得利控股株式會社