葡萄糖誘導性失活及降解抗性轉運蛋白基因及其用途的制作方法

專利名稱：葡萄糖誘導性失活及降解抗性轉運蛋白基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白基因及其用途，特別涉及對低 聚糖(麥芽糖、麥芽三糖等)分解性優異的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類、其制造方法等。
背景技術：
在制造啤酒、發泡酒、威士忌等麥芽發酵飲料時，將麥芽等進行糖化后的麥汁中所 含有的糖主要為葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖這3種。這些來自麥芽的糖的比率，根據糖化方 法可具有若干變化，但在不添加酶劑、不添加糖化淀粉的情況下，則無大的改變，可以說大 約是1 5 1的比例。其中，葡萄糖是單糖，是最適合于酵母的糖，首先被分解。酵母中有多種基因在葡萄糖存在下轉錄過程受到抑制，將這種抑制控制稱為葡萄 糖阻遏。將麥芽糖、麥芽三糖轉運到酵母中所必需的多種轉運蛋白均受到此種抑制。并且 已知這些受到葡萄糖阻遏的基因的產物，即使在翻譯后，也會在葡萄糖存在下失活。已知 α-葡萄糖苷轉運蛋白也屬于這一類，在葡萄糖存在下被快速降解。因為麥芽糖、麥芽三糖 分解的第一步驟是通過該轉運蛋白將其轉運到酵母細胞內，所以如果轉運蛋白被降解，則 這些分解也會停止，這就是將轉運蛋白的表達稱為分解的限速步驟的理由。非專利文獻 1 Brondijk, Τ. H.，van der Rest, Μ. Ε.，Pluim, D.，deVries, Y. de.， Stingl, K. , Poolman, B., and Konings, W. N. (1998)J BiolChem 273 (25)，15352-15357非專利文獻2 Medintz, I.，Wang, X.，Hradek, Τ.，and Michels, C. Α. (2000) Biochemistry 39 (15)，4518—4526非專利文獻3 Gadura,N. ,and Michels,C. Α. (2006)Curr Genet 50 (2)，101-114

發明內容
發明要解決的課題在這種情況下，期望提供包含不易因葡萄糖而導致失活或降解的低聚糖轉運蛋 白、且使麥芽糖等低聚糖的分解能力提高的酵母。解決課題的方法本發明者為了解決上述課題進行了刻苦研究，開發出了用于篩選不易因葡萄糖而 導致失活、降解的轉運蛋白(以下稱為“葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白”)或包含 其的酵母的新方法，并且根據該篩選方法，找到了葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白 或包含其的酵母，從而完成了本發明。即，本發明涉及編碼葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白的基因、被該基因編 碼的轉運蛋白、該基因的表達受到調控的轉化酵母、通過使用該基因的表達受到調控的酵 母來制造酒類的方法等。更加具體地說，本發明提供以下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸 的載體、導入了該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒類的制造方法等。(1)多核苷酸，其編碼由使序列號4、6、8或10的氨基酸序列發生突變后的突變序列組成、且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白，其中，使序列號4、6或8的氨基酸序列的第39 52位的氨基酸序列(QGKKSDFDLSHLEY 或QGKKSDFDLSHHEY)、或者序列號10的氨基酸序列的第44 57位的氨基酸序列 (GKKDSAFELDHLEF)中發生1 5個氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突變。(2)如上述1所述的多核苷酸，其編碼由使所述第39 52位的氨基酸序列或第 44 57位的氨基酸序列以外的序列部分進一步發生1 15個氨基酸的缺失、取代、插入及 /或添加的突變后的突變序列組成的轉運蛋白。(3)如上述1或2所述的多核苷酸，其中，使序列號4、6或8的氨基酸序列的第 46 51位的氨基酸序列(DLSHLE或DLSHHE)、或者序列號的10的第51 56位的氨基酸 序列(ELDHLE)中發生1 5個氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突變。(4)多核苷酸，其包含由序列號 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47 或 49 的 堿基序列組成的多核苷酸。(5)多核苷酸，其包含由序列號29、33、35、39、41、43或47的堿基序列組成的多核苷酸。(6)多核苷酸，其包含編碼由序列號 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48 或 50的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。(7)多核苷酸，其包含編碼由序列號30、34、36、40、42、44或48的氨基酸序列組成 的蛋白質的多核苷酸。(8)如上述1 7中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。(9)蛋白質，其為由上述1 8中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。(10)載體，其中含有上述1 8中任一項所述的多核苷酸。(11)轉化酵母，向其中導入了上述10所述的載體。(12)如上述10所述的釀造用酵母，其中，通過導入上述10所述的載體，提高了低 聚糖分解能力。(13)如上述12所述的釀造用酵母，其中，通過增加上述9所述的蛋白質的表達量， 提高了低聚糖分解能力。(14)酒類的制造方法，其中，使用上述11 13中任一項所述的酵母。(15)如上述14所述的酒類的制造方法，其中，釀造的酒類是麥芽飲料。(16)如上述14所述的酒類的制造方法，其中，釀造的酒類是葡萄酒。(17)酒類，其為利用上述14 16中任一項所述的方法制造的酒類。(18)獲取包含具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的酵母的方法，其 中，包括步驟(1)，將多個被測酵母在含有2-脫氧葡萄糖的低聚糖培養基上培養，將生長 繁殖水平作為指標，篩選包含不易因葡萄糖而導致失活或降解的轉運蛋白的酵母；步驟(2)，通過比較步驟(1)中篩選的酵母中包含的轉運蛋白的氨基酸序列和因 葡萄糖而導致失活或降解的水平已知的轉運蛋白的氨基酸序列，鑒定有助于提高因葡萄糖 而導致的失活或降解的難度的氨基酸殘基或氨基酸序列；步驟(3)，根據步驟(2)中獲得的氨基酸序列信息，設計編碼具有葡萄糖誘導性失 活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸；以及
步驟(4)，將步驟(3)中設計的多核苷酸導入酵母中，將該酵母在低聚糖培養基上 培養，測定該酵母中包含的轉運蛋白的葡萄糖誘導性失活/降解抗性、該酵母的低聚糖分 解能力、增殖速度及/或在麥汁中的發酵速度。(18a)上述18所述的方法，其中，上述步驟(1)中多個被測酵母是自然界中存在的 酵母，或者是使從自然界中獲得的發生突變的酵母。(18b)上述18所述的方法，其中，上述步驟(4)中的導入步驟(3)設計的多核苷 酸的酵母包含在Mal31p蛋白質的氨基酸序列中引入定點突變后的突變型Mal31p蛋白質、 在Maieip蛋白質的氨基酸序列中引入定點突變后的突變型Maieip蛋白質、在Mttlp蛋白 質的氨基酸序列中引入定點突變后的突變型Mttlp蛋白質、或者在Agtlp蛋白質的氨基酸 序列中引入定點突變后的突變型Agtlp蛋白質。發明的效果通過使用本發明涉及的酵母，本發明具有可加快含有麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖 的酒醪的發酵速度的優點。本發明涉及的轉運蛋白基因可導入任何釀造用酵母或實驗室酵 母中。特別是在大量含有葡萄糖、果糖等單糖的發酵原液中含有本發明涉及的轉運蛋白可 轉運的低聚糖(麥芽糖、麥芽三糖、松二糖(Turanose)、海藻糖(trehalose)等)的情況下， 更加有效。


圖1是表示實驗室酵母株在2-脫氧葡萄糖存在下的生長繁殖的不同的圖。圖2是表示MAL21基因的堿基序列。圖3是表示Mal2 Ip的氨基酸序列。圖4是表示Mal21p、Mal31p及Mal61p在葡萄糖存在下的降解速度的圖。圖5是表示突變型Mal31p在葡萄糖存在下的降解速度的圖。圖 6 是表示 Mal21/Mal31/Mal61/Mttl/Agtl 的比對。圖 7 是表示 Mal21/Mal31/Mal61/Mttl/Agtl 的比對(接續圖 6)。圖8是表示突變型Agtlp在葡萄糖存在下的降解速度的圖。圖9是表示具有突變型MAL61基因的菌株在2_脫氧葡萄糖存在下的生長繁殖的 不同的圖(對降解速度產生大的影響的氨基酸殘基的鑒定)。圖10是表示突變型Maieip在葡萄糖存在下的降解速度的圖(對降解速度產生大 的影響的氨基酸殘基的鑒定)。圖11是表示具有天然型MTTl和突變型MTTl基因的菌株在2-脫氧葡萄糖存在下 的生長繁殖的不同的圖。圖12是表示高表達MAL21基因的實驗室株在麥芽糖培養基上的生長繁殖的圖。圖13是表示高表達MAL21基因的下面啤酒酵母株的發泡酒或者發泡酒(富含葡 萄糖)麥汁中麥芽糖發酵速度的圖。圖14是表示高表達不易因葡萄糖而導致降解的轉運蛋白的上面啤酒酵母的麥汁 中麥芽糖發酵速度的圖。圖15是表示質粒pJHXSB的組成圖。圖16是表示質粒ρJHIXSB的組成圖。
圖17是表示質粒pYCGPY的組成圖。圖18是表示質粒pUP3GLP的組成圖。圖19是表示質粒pYCp49H的組成圖。
具體實施例方式本發明者認為，如果能夠控制翻譯后的轉運蛋白因葡萄糖而導致的失活或降解， 即使在葡萄糖存在下，麥芽糖及麥芽三糖也可被酵母更高效地分解。基于這種想法進行了 刻苦研究，結果從自然界中發現了不易被降解的α-葡萄糖苷轉運蛋白Mal21p，并且證明 Mal21p的降解速度遠遠低于其他轉運蛋白。此外，利用UV使轉運蛋白基因發生突變，采用獨特的方法成功篩選出了具有葡萄 糖誘導性失活或降解抗性的轉運蛋白。更加具體地說，使容易因葡萄糖而導致失活或降解 的α “葡萄糖苷轉運蛋白Mal31p和Agtlp發生突變，獲取了多種不易被降解的轉運蛋白。 并且從這些突變型轉運蛋白的氨基酸序列及Mal21p的氨基酸序列中，鑒定出有助于提高 降解難度的氨基酸殘基。其結果是，對于下面啤酒酵母具有的新型α-葡萄糖苷轉運蛋白 Mttlp，根據其信息通過進行氨基酸取代，成功地將其改造為不易因葡萄糖而導致失活或降 解的轉運蛋白。此外，通過高表達發現的或者新獲取的不易因葡萄糖而導致失活或降解的 轉運蛋白，確實成功地提高了在麥芽糖培養基中的增殖速度。且在啤酒釀造中可提高麥芽 糖的分解速度。根據這種設想和研究成果，本發明得以完成。本發明中獲得的基因及其核苷酸序列，以及被這些基因編碼的轉運蛋白及其氨基 酸序列如下所示。序列號1 :MAL21的核苷酸序列序列號2 :Mal21p α -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列序列號3 :MAL31的核苷酸序列序列號4 :Mal31p α -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列序列號5 :MAL61的核苷酸序列序列號6:Mal61 α -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列序列號7 =MTTl的核苷酸序列序列號8 =Mttlp α -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列序列號9 =AGTl的核苷酸序列序列號10 =Agtlp α -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列序列號25 :MAL61[D46G]的核苷酸序列序列號26 :Mal61p[Gly46]的氨基酸序列序列號27 :MAL61[L50H]的核苷酸序列序列號28 :Mal61p[His50]的氨基酸序列序列號29 :MAL61 [D46G, L50H]的核苷酸序列序列號30 :Mal61p[Gly46, His50]的氨基酸序列序列號31 =AGTl [E56K]的核苷酸序列序列號32 =Agtlp[Lys56]的氨基酸序列序列號33 =AGTl [E56G]的核苷酸序列
序列號34 =Agtlp[Gly56]的氨基酸序列序列號35 =MTTl [D46G]的核苷酸序列序列號36 =Mttlp[Gly46]的氨基酸序列序列號37 :MAL31 [E51V]的核苷酸序列序列號38 :Mal31p[Val51]的氨基酸序列序列號39 :MAL31[S48P]的核苷酸序列序列號40 :Mal31p[Pro48]的氨基酸序列序列號41 :MAL31[H49P]的核苷酸序列序列號42 :Mal31p[Pro49]的氨基酸序列序列號43 :MAL31 [L50P]的核苷酸序列序列號44 :Mal31p[Pro50]的氨基酸序列序列號45 :MAL31 [E51K]的核苷酸序列序列號46 :Mal31p[Lys51]的氨基酸序列序列號47 :MAL31 [L50F, E51K]的核苷酸序列序列號48 :Mal31p[Phe50, Lys5I]的氨基酸序列序列號49 :MAL31 [H49R]的核苷酸序列序列號50 :Mal31p[Arg49]的氨基酸序列本說明書中使用的“ α _葡萄糖苷轉運蛋白”是指與α _葡萄糖苷的跨膜轉運相關 的蛋白質，這種α-葡萄糖苷轉運蛋白包括麥芽糖轉運蛋白、麥芽三糖轉運蛋白等。1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供的多核苷酸是編碼由使序列號4、6、8或10的氨基酸序列發 生突變后的突變序列組成、且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸， 其中，使序列號4、6或8的氨基酸序列的第39 52位的氨基酸序列(QGKKSDFDLSHLEY 或QGKKSDFDLSHHEY)、或者序列號10的氨基酸序列的第44 57位的氨基酸序列 (GKKDSAFELDHLEF)中發生1 5個(優選1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸的 缺失、取代、插入及/或添加的突變的多核苷酸(具體為DNA，以下有時也簡稱為“DNA”)。 本發明還包括由使上述氨基酸序列的第39 52位或第44 57位的氨基酸序列的氨基 酸序列以外的序列部分，進一步發生1 15個(優選1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突變后的突變序列組成的上述轉運蛋 白。進一步，本發明的優選蛋白質，包括使上述序列號4、6或8的氨基酸序列的第 46 51位的氨基酸序列(DLSHLE或DLSHHE)、或者序列號10的第51 56位的氨基酸序 列(ELDHLE)中發生1 5個(優選1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸的缺失、 取代、插入及/或添加的突變的上述轉運蛋白。本發明的優選轉運蛋白，包括由序列號26、 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列組成的蛋白質，更優選包括由序 列號30、34、36、40、42、44或48的氨基酸序列組成的蛋白質。此外，作為本發明的轉運蛋白，可例舉，由在序列號26、28、30、32、34、36、38、40、 42、44、46、48或50的氨基酸序列中，缺失、取代、插入及/或添加例如1 15個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個(1 數個)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、 1個氨基酸殘基后的氨基酸序列組成，并且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。 通常情況下，上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或添加的數量越小越好。此外，作為這種蛋白質，可例舉，具有與序列號26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46,48或50的氨基酸序列具有約90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95% 以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2 %以上、99. 3 %以上、 99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上的同一性的氨 基酸序列，并且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。通常情況下，上述同源性數 值越大越好。<葡萄糖誘導性失活/降解抗性的評價>在本發明中，葡萄糖誘導性失活/降解抗性，可按例如以下方法進行評價。首先， 確認表達各轉運蛋白的菌株在含有0 2mM 2-脫氧葡萄糖的麥芽糖等的最小必需培養基 (無氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids) 6. 7g/L、麥芽糖等 20g/L，但 對于營養缺陷型轉化株，含有其營養素)、或者在含有0 8. OmM的2-脫氧葡萄糖的麥芽 糖完全合成培養基(SCM)(無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、 尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L_組氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L_精氨酸鹽酸鹽20mg/ml、 L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-異亮氨酸30mg/ml、L-賴氨 酸鹽酸鹽30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L_天冬氨酸100mg/ml、L_纈 氨酸150mg/ml、L-蘇氨酸200mg/ml、L-絲氨酸400mg/ml)中的生長繁殖狀況，即使產生葡 萄糖誘導性失活/降解信號的酵母，也要從中篩選其轉運蛋白具有麥芽糖轉運活性并發揮 作用的菌株。接著，將該菌株接種到YPD(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/ L)中，30°C振蕩培養過夜。將培養液接種到YPM培養基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/ L、麥芽糖5g/L)中，使0D660 = 1.0，30°C振蕩培養2.5小時，并收集菌。測取60個0D660 單位的細胞，使其懸浮于30ml預先在30°C保溫的降解速度測定用培養基[無氨基酸酵母氮 源(不含氨)(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and ammonia) 1. 7g/L、葡萄糖 20g/ L、環己酰亞胺中，30°C進行溫育。在適當的時間(0、10、20、30及40分鐘或者0、
30、60、90及120分鐘)抽取細胞懸浮液樣品5ml，快速離心棄除上清液，將細胞用乙醇干冰 冷凍。根據常規方法檢測冷凍細胞中的轉運蛋白，測定蛋白條帶的強度，由其減少速度計算 半衰期。在本發明中優選轉運蛋白，例如與Mal31p比較，具有2倍以上、3倍以上、4倍以上、 5倍以上、6倍以上或8倍以上的半衰期。本發明還包括在嚴謹條件下與本發明的多核苷酸雜交，并且編碼具有葡萄糖誘導 性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸，該本發明的多核苷酸為編碼由使序列號4、6、 8或10的氨基酸序列發生突變后的突變序列組成、且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的 轉運蛋白的多核苷酸，其中，使序列號4、6或8的氨基酸序列的第39 52位的氨基酸序列 (QGKKSDFDLSHLEY或QGKKSDFDLSHHEY)、或者序列號10的氨基酸序列的第44 57位的氨 基酸序列(GKKDSAFELDHLEF)中發生1 5個(優選1 4個、1 3個、1 2個或1個) 氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突變的多核苷酸等。本發明的優選多核苷酸為上述特定的多核苷酸，具體為含有由序列號25、27、29、
31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸，更優選多核苷酸為含有由序列號29、33、35、39、41、43或47的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸。在 下述實施例中，已證明在Mal21p、突變Mal31p、突變Mal61p及突變Mttlp中序列號4、6或 8的第46 51位的氨基酸序列與葡萄糖誘導性失活/降解抗性相關，在Agtl中序列號10 的第51 56位的氨基酸序列與葡萄糖誘導性失活/降解抗性相關，因此，在進行突變時期 望考慮該序列信息。在此，“在嚴謹條件下進行雜交的多核苷酸(DNA) ”是指，以由序列號25、27、29、31、 33、35、37、39、41、43、45、47或49的堿基序列的互補堿基序列組成的DNA，或者編碼序列號 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列的DNA的全部或一部分作為探 針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等所得到的DNA。雜交方法，可 使用例如 Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中所記載的方法。本說明書中所述的“嚴謹條件”，可以為低嚴謹條件、中嚴謹條件及高嚴謹條件中 的任一種。“低嚴謹條件”，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、32°C 的條件。此外，“中嚴謹條件”，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5% SDS、50%甲酰胺、 42 °C的條件。“高嚴謹條件”，例如為5 X SSC、5 X Denhardt溶液、0. 5 % SDS、50 %甲酰胺、 50°C的條件。在上述條件中，溫度越高，越可能高效獲得具有高同源性的DNA。但是，影響雜 交嚴謹性的因素有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域 技術人員可通過適當選擇這些因素實現同樣的嚴謹性。此外，雜交中使用市售試劑盒時，可使用例如Alkphos Direct LabellingReagents (Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據試劑盒中附帶的說明方案， 與標記后的探針保溫過夜后，在55°C的條件下用含有0. 1 % (w/v) SDS的1次洗滌緩沖液洗 滌膜后，可檢出雜交后的DNA。除上述以外，作為可雜交的DNA，可例舉，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使 用默認參數計算時，與編碼序列號26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基 酸序列的DNA具有約90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96% 以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、 99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上99. 8%以上、99. 9%以上同一性的DNA。此外，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可根據Karlin及Altschul的BLAST算 法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,872264-2268，1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :5873， 1993)測定。已開發出基于BLAST算法的被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF, et al J. Mol. Biol. 215 :403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數例如為分數(score) =100、字長(wordlength) = 12。此外，使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數例如為分數 =50、字長=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認參數。2.本發明的蛋白質本發明提供由上述多核苷酸中任一個所編碼的蛋白質。本發明的優選蛋白質為 由序列號4、6、8或10的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 1 5個(優選1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、 1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有葡萄糖 誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。
作為這種蛋白質，可例舉，由序列號4、6、8或10的氨基酸序列中缺失、取代、插入 及/或添加上述數量的氨基酸殘基后的氨基酸序列組成，且具有葡萄糖誘導性失活/降解 抗性的轉運蛋白。作為這種轉運蛋白，優選例舉，由序列號26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48或50的氨基酸序列組成的蛋白質，更優選例舉由序列號30、34、36、40、42、44或48的 氨基酸序列組成的蛋白質。此外，作為這種蛋白質，可例舉，具有與序列號26、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有葡萄 糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。這種蛋白質，可使用《Molecular Cloning 3》、 《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc. Acids. Res. ，10，6487(1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”、"Gene，34，315 (1985)，，、"Nuc. Acids. Res.，13， 4431(1985) ”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82，488 (1985) ” 等所述的定點突變引入法而獲 得。本發明蛋白質的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 15個(優選為1 1 4個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、 1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸殘基，是指在同一序列中的任意并且 1 15個氨基酸序列的位置上，缺失、取代、插入及/或添加1 15個(優選為1 14個、 1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5 個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸殘基，缺失、取代、插入及添加中的2種以上 可同時發生。下面列舉可互相取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可互相取代。A 組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基 絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、 異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、 鳥氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3- 二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸； F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。本發明的蛋白質，也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等化學合成法制備。此外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、PerkinElmer公 司、Pharmacia 公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega 公司、 PerS印tive公司、島津制作所等制造的肽合成儀進行化學合成。3.本發日月的jH本及導入該jH本的轉仆Jg母本發明提供含有上述多核苷酸的載體。本發明的載體，含有上述任一項所述的多 核苷酸(DNA)。并且，本發明的載體，通常以包含表達盒的形式構成，該表達盒包含的結構要 素為(χ)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)以正向或反向與該啟動子連接的上述任一項 所述的多核苷酸(DNA)；以及(ζ)與RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化作用相關，在酵母內 發揮作用的信號。此外，要使上述本發明的蛋白質進行高表達，優選將本說明書中所述的多 核苷酸(DNA)相對于該啟動子正向導入，以促進這些多核苷酸(DNA)的表達。作為向酵母中導入時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、 染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，作為YEp型載體，已知有YEp24(J. R.Broach et al. , Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York,83,1983)；作為 YCp 型載體，已知有 YCp50(M. D.Rose et al.，gene，60，237，1987)；作為 YIp 型 載體，已知有 YIp5 (K. Struhl et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USP，76，1035，1979)，且容易獲 得。此外，也可使用染色體整合型 pUP3GLP(0mura，F. et al. ,FEMS Microbiol. Lett. , 194, 207，2001)(圖 18)、pJHIXSB (圖 16)、pYCGPY (Kodama，Y. etal.，Appl. Environ. Microbiol.， 67，3455，2001)(圖17), ρ JHXSB (圖15)等單拷貝復制型質粒。用于調控酵母中基因表達的啟動子/終止子，只要在釀造用酵母中發揮作用的同 時不受醪液中的糖、氨基酸等成分的濃度影響，可以任意組合。例如可利用甘油醛-3-磷酸 脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的啟動子等。這些基因均已 被克隆，如在Μ. F. Tuite et al.，EMB0J. ,1,603(1982)中有詳細記載，通過已知的方法可容 易地獲得。在表達載體中使用的啟動子，根據發酵醪液的糖組成、糖濃度、多種轉運蛋白的 組合等，可有效地改變成具有適當轉錄活性的啟動子。因釀造用酵母不能利用營養缺陷型標記，所以轉化使用的選擇性標記可利用遺 傳霉素(Geneticin)抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUPl) (Marin etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984)、淺藍菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(豬腰淳嗣等，生物化學， 64,660,1992 ；Hussain et et al.，gene，101，149，1991)等。將上述構建的載體導入宿主 酵母內。宿主酵母，可例舉可用于釀造的任何酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵 母等。具體地，可例舉酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發明中，可使用啤酒酵母 如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70 等；卡爾斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456 等；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC195U NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且還可使用威士忌酵母如釀酒酵母NCYC90等；葡萄 酒酵母如協會葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等葡萄酒酵母；清酒酵母如協會 酵母清酒用7號、清酒用9號等清酒酵母，但并不限于這些酵母。在本發明中，優選使用啤 酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。制備本說明書中所述的各轉運蛋白基因時使用的染色體DNA，并不限定于釀酒酵 母ATCC20598、ATCC96955等的菌株，只要是屬于具有各基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，可以從任何酵母中制備。酵母的轉化可利用通常使用的公知方法。例如可實施電穿孔法“Meth. Enzym.，194，pl82 (1990) ”、原生質球法(Spheroplast) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) ”、乙酸鋰法"J. Bacteriology, 153，pl63 (1983) ”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等記載的方法，但并不限于這些方法。此外，轉化菌株，可以通過將宿主的營養缺陷型互補基因(例如URA3)整合到表達 質粒中，用不含尿嘧啶的瓊脂培養基來篩選。或者可以通過將抗藥性基因(例如環己酰亞 胺的抗藥性基因YAPl或者遺傳霉素(Geneticin)的抗性基因G418R)整合到表達質粒中， 用含有環己酰亞胺(例如0. 3 μ g/ml)或者遺傳霉素(Geneticin)(例如300 μ g/ml)的瓊 脂培養基來篩選。更具體地說，將宿主酵母在標準酵母營養培養基(如YEPD培養基 "GeneticEngineering. Vol. LPlenum Press, New York，117 (1979)，，等)中培養至 0D600nm 值為1 6。將該培養酵母離心分離并收集、洗滌，用濃度約為IM 2M的堿性離子金屬離子(優選用鋰離子)進行預處理。將上述細胞在約30°C下靜置約60分鐘后，與待導入的 DNA (約1 20 μ g)同時在約30°C下靜置約60分鐘。添加聚乙二醇，優選添加約4，000道 爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20% 50%。在約30°C下靜置約30分鐘后，將上述細胞 在約42°C下加熱處理約5分鐘。優選用標準酵母營養培養基洗滌上述細胞懸浮液，并加入 到規定量的新鮮標準酵母營養培養基中，在約30°C下靜置約60分鐘。然后，將其轉移到含 有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基上，獲得轉化體。此外，對于常規克隆技術，可參照《Molecular Cloning 3K"Methods inYeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress> Cold Spring Harbor, NY) ”等。4. H日月白射酉力felU力誦i寸該力導白射酉-將上述本發明的載體導入適合釀造作為制造對象的酒類的酵母中，通過使用該酵 母，可制造具有特定氨基酸組成的酒類。可作為制造對象的酒類有啤酒、葡萄酒、威士忌、清 酒等，但并不限于這些。在制造上述酒類時，除使用本發明獲得的釀造酵母代替親株之外， 可利用公知的方法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往的方法完全相同，不會因制 造發酵時間縮短的酒類而增加成本。也就是說，根據本發明能夠使用已有的設備進行制造 而不增加成本。5.本發明酵母的獲取方法獲取包含本發明的具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的酵母的方法， 包括以下步驟⑴ (4)。[步驟⑴]在步驟(1)中，首先將多數被測酵母在含有2-脫氧葡萄糖的麥芽糖培養基上培 養，將其生長繁殖水平作為指標，篩選包含不易因葡萄糖而導致失活的轉運蛋白的酵母。作為被測酵母，可使用自然界存在的酵母，也可使用對從自然界獲取的酵母實施 突變后的酵母。作為被測酵母，可例舉，例如可用于釀造的任何酵母，例如啤酒、葡萄酒、 清酒等的釀造用酵母等。具體可以為酵母屬(Saccharomyces)等酵母，在本發明中可以 使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus) W34/70等，卡爾斯伯酵母 (Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456 等，釀酒酵母 NBRC1951、NBRC1952、 NBRC1953.NBRC1954等。并且也可以使用威士忌酵母如釀酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母如 協會葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等葡萄酒酵母；清酒酵母如協會酵母清酒 用7號、清酒用9號等清酒酵母，但并不限于這些酵母。在本發明中，優選使用啤酒酵母如 巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。此外，作為被測酵母，可優選使用下述實施例中 使用的酵母。在本發明中，被測酵母優選使用引入定點突變后的酵母。定點突變的引入，可使用本領域技術人員公知的方法進行。引入定點突變時沒 有限制，例如可利用(1)寡核苷酸引導的雙琥珀型法(Oligonucleotide-directed Dual Amber 法，ODA法)/Takara Biomedicals、(2) LA PCR體外產生突變法/Takara Biomedicals 及(3)ExSite PCR-BasedSite-Directed Mutagenesis 試劑盒/STRATAGENE。以下對各方 法進行簡單說明。(1)寡核苷酸引導的雙琥珀型法(0DA法)/Takara Biomedicals
在卡那霉素抗性基因(Km)具有琥珀型突變的質粒(pKF 18k_2/19k_2等)內插入 目標基因。獲得的DNA通過熱變性變為單鏈DNA后，與修復Km的琥珀型突變的合成寡核苷 酸和用于在目標基因中引入目標突變的突變用合成寡核苷酸同時進行雜交。在維持引入的 突變的同時使該DNA進行復制，最終僅篩選Km的琥珀型突變被完全修復的DNA。篩選出的 DNA中以高準確率在目標基因中引入目標突變。(2)通過LA PCR體外產生突變的方法/Takara Biomedicals將期望引入突變的DNA片段插入任意質粒的多克隆位點中。通過引入目標基因的 目標突變的引物和多克隆位點附近的引物進行PCR(I)。另一方面，通過在目標基因的突變 引入的相反方向使多克隆位點中的一個位點(A)消失的引物，進行可覆蓋插入的DNA片段 全體的PCR(II)。將PCR(I)及(II)的產物混合，進行包括引入的突變在內的插入DNA片段 全體可擴增的PCR。由此獲得的DNA片段中具有目標突變的片段，因為克隆位點(A)已消 失，所以用限制性內切酶(A)酶切PCR產物后，如果進行利用位點(A)的亞克隆操作，在此 被再克隆的片段理論上引入了所有的目標突變。(3)ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis 試劑盒/STRATAGENE將期望引入突變的DNA片段插入適當的質粒內。通過在dam+(有DNA甲基化酶活 性)的大腸桿菌內增殖所獲得的DNA，使GATC序列中的A成為甲基化狀態。在正、反兩個 方向合成用于引入目標突變的合成寡核苷酸，將這些合成寡核苷酸作為引物利用所述質粒 作為模板進行PCR。PCR之后，對于獲得的DNA片段，用僅能酶切甲基化DNA的限制性內切 酶DpnI進行酶切，僅留下含有目標突變的DNA片段。將其用T4 DNA連接酶連接，形成環狀 DNA后即可回收在目標基因內引入目標突變的質粒。在本發明中，為了鑒定與MAL21轉運蛋白的葡萄糖誘導性降解抗性相關的殘基， 或者為了使MTTl轉運蛋白具有對于葡萄糖誘導性降解的抗性，將位于MAL61或者MTTl轉 運蛋白N末端細胞質側區域的第46位或者第50位氨基酸殘基，分別取代為甘氨酸或者組 氨酸。即將編碼天冬氨酸的密碼子GAT取代為編碼甘氨酸的密碼子GGT，將編碼亮氨酸的 密碼子CTT取代為編碼組氨酸的密碼子CAT。可通過利用本領域技術人員公知的方法分析 突變操作結束后DNA堿基序列來進行突變引入的確認。此外，被測酵母也可使用實施突變處理后的酵母。突變處理，例如可使用紫外線照 射、放射線照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等藥劑處理的化學 方法等任何方法(如參照大嶋泰治編著的“生物化學實驗法39 酵母分子遺傳學實驗法”， P67-75，學會出版中心等)。上述被測酵母優選使用包含在MAL31或AGTl蛋白質的氨基酸序列中引入定點突 變后的突變型MAL31或突變型AGTl蛋白質的被測酵母。在低聚糖培養基(例如，麥芽糖培養基)上的培養，可利用公知的方法。在這種培 養過程中，將該酵母的生長繁殖水平作為指標，篩選包含不易因葡萄糖而導致失活或降解 的轉運蛋白的酵母。轉化株(以不具有α-葡萄糖苷轉運蛋白基因的菌株作為宿主)中導入的轉運蛋 白基因進行表達并發揮作用，例如，可通過在以0. 5%的麥芽糖或者麥芽三糖為唯一碳源、 含抗霉素3mg/L的最小必需培養基(無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖或者麥芽三糖5g/ L、抗霉素3mg/L)上有無生長繁殖來檢驗。即使是α-葡萄糖苷轉運蛋白不發揮作用的菌株，在以麥芽糖或者麥芽三糖為唯一碳源的最小必需培養基上，也會有略微增殖。但是，如 果在以麥芽糖或者麥芽三糖為唯一碳源的最小必需培養基中加入呼吸阻斷劑抗霉素，該菌 株則無法生長繁殖，所以由此可明確地判斷α-葡萄糖苷轉運蛋白的功能。例如利用一個 鉬金勺從YPD平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)上挑取供試菌株，懸 浮于Iml的滅菌水中，0D660 = 0. 2。收集菌，并再次懸浮于Iml的滅菌水中，然后再進行10 倍、100倍的稀釋。將這些細胞懸浮液的系列稀釋液各3 μ 1點樣在試驗培養基上，30°C培養 2-3天。生長繁殖的菌株，表示整合了表達載體、導入的α-葡萄糖苷轉運蛋白進行表達并 發揮作用的菌株。接著，在含有0-2. OmM 2-脫氧葡萄糖的麥芽糖最小必需培養基(無氨基 酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖20g/L、2-脫氧葡萄糖0-2. OmM)上、或者在含有0_8. OmM 2-脫 氧葡萄糖的麥芽糖完全合成培養基(SCM)(無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖20g/L、硫酸 腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L_色氨酸20mg/ml、L_組氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L_精氨酸 鹽酸鹽20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-異亮氨酸 30mg/ml、L-賴氨酸鹽酸鹽30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L-天冬氨 酸100mg/ml、L-纈氨酸150mg/ml、L-蘇氨酸200mg/ml、L-絲氨酸400mg/ml)上進行同樣 點樣，篩選在2-脫氧葡萄糖存在下也可生長繁殖的菌株。可以判斷，在2-脫氧葡萄糖存在 下生長繁殖的菌株中，葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白進行表達并具有活性。[步驟⑵]下面，通過將步驟(1)篩選的酵母中包含的轉運蛋白的氨基酸序列和因葡萄糖而 導致失活的水平已知的轉運蛋白的氨基酸序列進行比較，鑒定有助于提高因葡萄糖而導致 的失活或降解的難度的氨基酸殘基或氨基酸序列。在該步驟中，根據常規方法從篩選的酵母中分離編碼轉運蛋白的基因，根據常規 方法確定該基因的DNA序列，由DNA序列翻譯成氨基酸序列。將所述待鑒定的氨基酸序列 和因葡萄糖而導致降解的水平已知的轉運蛋白的氨基酸序列進行比較。因葡萄糖而導致降 解的水平已知的轉運蛋白，例如，有α _葡萄糖苷轉運蛋白Mal31p、Mal61p、Mttlp、Agtlp 以及這些轉運蛋白的突變型蛋白質等(對于該各種核苷酸序列，例如參照Saccharomyces Genome Database 的 YBR298C (MAL31)及 YGR289C (AGTl)、以及 GenBank 的 X17391 (MAL61) 及DQ010171 (MTTl))。如下述實施例所述，根據該方法對具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性 特征的轉運蛋白和無該特征的轉運蛋白的氨基酸序列進行分析，結果確認Mal21p、Mal31p、 Mal61p及Mttlp中序列號2、4、6或8的第46 51位的氨基酸序列，Agtl中序列號10的 第51 56位的氨基酸序列與葡萄糖誘導性失活/降解抗性相關。對于各種氨基酸的位置， 參照圖6及圖7。[步驟⑶]在該步驟中，根據步驟(2)中獲得的氨基酸序列信息，設計編碼具有葡萄糖誘 導性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸。例如如上所述，因為確認Mal21p、Mal31p、 Mal61p及Mttlp中序列號2、4、6或8的第46 51位的氨基酸序列，Agtl中序列號10的 第51 56位的氨基酸序列與葡萄糖誘導性失活/降解抗性相關，所以進行突變時考慮這 種序列信息，設計例如編碼將該部分的氨基酸取代為其它氨基酸后的序列的多核苷酸。此 外，如上所述，因為可取代的氨基酸的種類在某種程度上可特定，所以可設計編碼將這種可 取代的氨基酸取代后的氨基酸序列的多核苷酸序列。作為基礎氨基酸序列，可例舉，例如從自然界獲得的Mal21p (序列號2)、在下述實施例中獲得的突變Mal31p (序列號38、40、42、 44,46或48)、突變Mal61p (序列號26或28)、突變Mttlp (序列號34)、突變Agtlp (序列號 32、34)等序列。[步驟4]在該步驟中，構建含有步驟(3)設計的多核苷酸的表達載體，根據常規方法將其 導入酵母中，將該酵母在低聚糖培養基(例如麥芽糖培養基)上進行培養。導入步驟(3) 設計的多核苷酸的酵母，優選包含在Mal31p蛋白質的氨基酸序列中引入定點突變后的突 變型Mal31p蛋白質、在Maieip蛋白質的氨基酸序列中引入定點突變后的突變型Maieip蛋 白質、在Mttlp蛋白質的氨基酸序列中引入定點突變后的突變型Mttlp蛋白質、或在Agtlp 蛋白質的氨基酸序列中引入定點突變后的突變型Agtlp蛋白質。進行培養時，通過測定該 酵母中包含的轉運蛋白的葡萄糖誘導性失活/降解抗性、該酵母的低聚糖分解能力、增殖 速度、在麥汁中的發酵速度等，可評價該酵母的適應性。葡萄糖誘導性失活/降解抗性、低 聚糖分解能力、增殖速度、在麥汁中的發酵速度等，可通過下述實施例中使用的方法進行評 價。實施例以下通過實施例對本發明進行更加詳細地說明，但本發明并不限于這些實施例。[試驗方法]在本實施例中使用的試驗項目和試驗方法如下所示。只要無特別限制，本實施例 中的試驗方法以此為標準。<MAL61, MAL31, MAL21 及 AGTl 基因的獲取 >已經克隆了釀酒酵母的MAL61、MAL31、AGTl基因，并報道了其堿基序列。本說明 書中使用的MAL31(序列號3)從酵母基因組數據庫(SaccharomycesGenome Database)注 冊號YBR298C中獲得，MAL61 (序列號5)從基因庫(GenBank)注冊號X17391中獲得，以及 AGTl (序列號9)從酵母基因組數據庫(Saccharomyces Genome Database)注冊號YGR289C 中獲得。因此，以MAL61、MAL31以及AGTl基因的堿基序列信息為基礎，使用從具有所述各種 基因的酵母釀酒酵母中制備的染色體DNA作為PCR模板，通過PCR擴增、分離來獲取MAL61、 MAL31 及 AGTl 基因。對于MAL21，已知其被III號染色體編碼，但并不知道其DNA序列。但是因為考慮 到被II號染色體編碼的MAL31與被VIII號染色體編碼的MAL61基因具有99%以上的同一 性，所以預測與MAL21也具有相當高的同一性。實際上本實施例中的MAL21、MAL31及MAL61基因的全部基因，以僅具 有各自的α-葡萄糖苷轉運蛋白的酵母的染色體DNA作為模板，使用相同引物 (5，AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA 3，(序列號 11)禾口 5，TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3，(序列 號 12))即可獲取。AGTl 是使用引物(5’ TGAGCTCACATAGAAGAACATCAAA 3，(序列號 13)和 5‘ATGGATCCATATGAAAAATATCATT 3，(序列號 14))來獲取的。具體來說，MAL31 和 AGTl 是利 用釀酒酵母S288C(ATCC204508 (Rose，Μ. D. ,Winston，F. and Hieter，P. (1990) =Methods in Yeast Genetics ALaboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY))通過PCR來獲取的，MAL61是利用釀酒酵母ATCC96955通過PCR 來獲取的，MAL21是利用釀酒酵母ATCC20598通過PCR來獲取的。
使用Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒將獲取的DNA片段插入到載體 pCR(注冊商標)2. 1-T0P0后，通過DNA測序確認插入的基因序列。對于MAL31、MAL61、 AGTl，確認與數據庫中注冊的序列(注冊號分別為YBR298C、X17391及YGR289C)相同。對 于MAL21，獨立對10個克隆以上測序，確定了其序列(序列號1)。此外，所使用引物中起始密碼子的上游有XbaI或者SacI位點，終止密碼子的下游 有BamHI位點，這些位點已整合到表達載體內。通過使用染色體DNA的目標基因的PCR擴 增以及其后的分離，包括PCR引物的制備，均可利用本領域技術人員公知的方法進行。<MTT1基因的獲取〉制備下面啤酒酵母Weihenstephan 34/70的基因組DNA，將質粒YCp49H(圖19)作 為載體，構建DNA文庫。將該文庫轉化到釀酒酵母HH150 (CBllAagtl ::G418R)中，涂布于 含有300μ g/ml潮霉素和0. 5%麥芽三糖的最小必需培養基上。因為CBll菌株是adel菌 株，所以作為腺嘌呤的前體的5-氨基咪唑核苷(5- 7 S 7 ^ S Ψ·； # * F )蓄積， 并進一步發生聚合從而使菌落呈紅色。AGTl被破壞的ΗΗ150 (CB11 Δ agtl :G418R)菌株涂 布于以麥芽三糖為唯一碳源的培養基上時，生長繁殖非常緩慢，并且菌落為白色。如果在培 養基上添加抗霉素，可完全阻止其在以麥芽三糖為唯一碳源的培養基上的生長繁殖。但是， 因為抗霉素的毒性高，所以可通過在不使用抗霉素的情況下篩選紅色菌落的試驗來獲取麥 芽三糖轉運蛋白。在30°C培養3天，將生長繁殖的紅色菌落在相同培養基上劃線，并確認在 相同培養基上的生長繁殖情況。從生長繁殖良好的21個紅色菌落中制備質粒，將該質粒轉 化到大腸桿菌DH5ci中，利用大腸桿菌大量制備質粒。再次轉化到HH150中，并涂布于相同 培養基上。從生長繁殖良好的18個紅色菌落中提取質粒。將插入片段的DNA進行測序，結果在17個中發現認為與MAL61有90%同一性的轉 運蛋白的相同序列。因為該基因具有與J. Dietvorst et. al. Yeast 2005 ；22 :775_788中 報道的MTTl (GenBank注冊號DQ010171)完全相同的序列，所以將該基因稱為MTTl (核苷酸 序列用序列號7表示，氨基酸序列用序列號8表示)。使用引物(5’TCTAGAATTACATCCAAGAC TATTAATTAACTATG 3，(序列號 15)和 5，TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3，(序列號 16))，通過 PCR在起始密碼子的上游導入XbaI位點、終止密碼子的下游導入BamHI位點，從而將MTTl 基因整合到表達載體內。<表達質粒、文庫構建質粒>在本發明中，使用⑴ (4)的4個表達載體，文庫構建用質粒使用(5)。(l)pJHXSB (圖 15)(2)pJHIXSB (圖 16)(3)pYCGPY (圖 17)(4)pUP3GLP (圖 18)(5)YCp49H (圖 19)〈酵母株〉在本發明中，在獲取轉運蛋白基因和進行菌株之間比較時使用菌株(1) (6)，在 利用轉運蛋白高表達菌株確認生長繁殖速度、發酵速度時使用菌株(7) (10)，在獲取突 變型基因時使用菌株(11)。(1)釀酒酵母 S288C(ATCC204508) (MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)
17
(2)釀酒酵母 ATCC96955(MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 malll MAL12mall3 ura3-52 leu2_3 leu2_112 trpl his)(3)釀酒酵母 ATCC20598 (MATa sue MAL2 MELl his4 leu2)(4)釀酒酵母CBll (Berkley Stock Center) (MATa adel MAL61 MAL62MAL63 AGTl MAL12 MAL31 MAL32)(5)下面啤酒酵母 Weihenstephan 34/70(6)釀酒酵母 HH150 = (CBl 1 Δ agtl G418R) (MATa adel MAL61 MAL62MAL63Aagtl: :G418R MAL12 MAL31 MAL32)(7)酉良 酒酵母 HH1001 (MATa SUC2 ma 1 me 1 ga 1 2 CUP1TPI1::TPIlpr-MAL32"G418R ura3)(8)釀酒酵母 Δ 152MS(MATa mal61: :TRP1 MAL62 MAL63 mal64 malll MAL12mall3 leu2-3 leu2-112 his URA3::TDH3p::MAL62)(9)上面啤酒酵母AH135(10)下面啤酒酵母 Weihenstephan 194(11)釀酒酵母 HH1002 (MATa SUC2 mal me 1 gal2 CUP 1 TPI1::TPIlpr-MAL32"G418R ura3 dogl dog2)〈定點突變的引入〉在本實施例中，將獲取的轉運蛋白基因導入表達載體pJHIXSB內后，使用引物(表 1)，通過 ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis 試劑盒/STRATAGENE 引入突變。 突變引入方法的詳細內容，根據STRATAGENE公司的操作指南。表1 表1定點突變使用的引物序列
突變型基因
引物序列
MAL61[D46G] MAL61[L50H] MAL61[D46G, L50HJ MIT1[D46G]
5, GTCTTTCCCATCTTGAGTACGGTCC 3,
S'-CAAAATCACTTTTCTTACCTTGCTCCT-S'
5'-ATGAGTACGGTCCAGGTTCACTAA-3· 5'-GATGGGAAAGATCAAAATCACTTTTC-3'
S'-GTCTTTCCCATCATGAGTACGGTCCA-S' 5'-CAAAATCACTTTTCTTACCTTGCTCCT-3' 5'.GTCTTTCCCATCATGAGTACGGTCC-3· S'-CAAAATCACTTTTCTTACCTTGCTCCT-S·<轉運蛋白的2-脫氧葡萄糖抗性的評價>已知2-脫氧葡萄糖(2-D0G)只能代謝成2-D0G-6-磷酸，所以是不能作為碳源的 糖類似物，但產生與葡萄糖同樣水平的葡萄糖阻遏或者同樣水平的因葡萄糖而導致失活。 因此，在這種平板上生長繁殖的菌株，具有不易因葡萄糖而導致失活的α -葡萄糖苷轉運 蛋白的可能性較高。使用以下2種培養基，通過下述方法來檢驗對2-D0G的抗性在[1] 含有0-2. OmM 2-脫氧葡萄糖的麥芽糖完全合成培養基(SCM)(無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、 麥芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L-組氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-精氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸 30mg/ml、L-異亮氨酸30mg/ml、L-賴氨酸鹽酸鹽30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨 酸 100mg/ml、L-天冬氨酸 100mg/ml、L-纈氨酸 150mg/ml、L-蘇氨酸 200mg/ml、L-絲氨酸 400mg/ml)，或者[2]含有0_2. OmM 2-脫氧葡萄糖的麥芽糖最小必需培養基(無氨基酸酵 母氮源6. 7g/L、麥芽糖20g/L)的任一種平板上，分別將各轉運蛋白表達株的細胞懸浮液的 系列稀釋液3 μ 1點樣在試驗培養基上，30°C培養2 3天。<轉運蛋白在菌體內蓄積量的測定>轉運蛋白的菌體內的蓄積量，可通過例如Western印跡法進行測定。例如從IOml 培養液中回收處于對數增殖期的供試菌株，在裂解緩沖液中(8M尿素、5% (w/v)SDS,40mM Tris-HCl (pH6. 8)、0. ImM EDTAU % β _巰基乙醇)通過用玻璃珠攪拌破碎，獲得細胞提取 液。用SDS-凝膠電泳分離總蛋白質為60 μ g的樣本，并轉印到硝基纖維素膜上，隨后使用 抗Mal61p的兔多克隆抗體進行Western印跡分析。抗Mal61p的兔多克隆抗體根據以下方法獲取。將編碼Mal61p N末端區域 (Metl-Leul81)的DNA與pET表達載體(Novagen公司)的GST標簽的下游連接，并轉化到大 腸桿菌BL21 (DE3)中，將所述轉化體的細胞破碎液加入到GST樹脂結合柱中，通過洗脫與柱 子結合的蛋白質來制備所述抗體。詳細內容根據Novagen公司的pET表達系統，GST -Bind 親和樹脂(Novagen社)內附加的操作指南。制備的融合蛋白質，通過SDS-PAGE確認純度 后，將其作為抗原來免疫兔從而獲得多克隆抗體。對于抗體的有效性，通過下述方法確認， 即將表達了 α-葡萄糖苷轉運蛋白基因(MAL61，MAL31，MAL21)的酵母株和不具有該基因 的宿主株在YPM培養基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麥芽糖5. 0g/L)上培養，利用 上述方法使用相應的細胞破碎液和所述抗體進行Western印跡分析。利用所述抗體，僅在 表達α-葡萄糖苷轉運蛋白基因的酵母株破碎液中，檢測出與68kDa的α -葡萄糖苷轉運 蛋白(MAL61，MAL31，MAL21)分子量一致的陽性條帶。構建編碼在Agtlp的C末端部串聯連接2個紅細胞凝集素(HA)標簽的融合蛋白的 基因，利用上述方法獲取表達該基因的菌株，來測定Agtlp的菌體內蓄積量。抗體使用抗紅 細胞凝集素(hematoagglutinin)的小鼠單克隆抗體(Covance, Research, Products, Inc. 公司)。<轉運蛋白的降解速度的測定>將表達各轉運蛋白的菌株接種于YPD中，30°C振蕩培養過夜。將培養液接種于YPM 培養基中，使0D660 = 1.0，30°C振蕩培養2. 5小時，并收集菌。測取60個0D660單位的細 胞，使其懸浮于30ml預先在30°C保溫的降解速度測定用培養基[無氨基酸酵母氮源(不含 氨)1.7g/L、葡萄糖20g/L、環己酰亞胺25yg/L]中，30°C進行溫育。在適當的時間(0、10、 20,30及40分鐘或者0、30、60、90及120分鐘)抽取細胞懸浮液樣品5ml，快速離心棄除上 清液，將細胞用乙醇干冰冷凍。根據上述方法從冷凍細胞中檢測轉運蛋白，測定蛋白條帶的 強度，由強度的減少速度計算半衰期。<突變型Mal61p/突變型Agtlp/突變型Mttlp/突變型Mal31p>本發明的突變型Mal61p/突變型Agtlp/突變型Mttlp/突變型Map31p，分別是表 2、3、4及5所示的13個轉運蛋白。表2突變型及天然型α -葡萄糖苷轉運蛋白(Maieip)第39 52位的氨基酸序表4突變型及天然型α-葡萄糖苷轉運蛋白(Mttlp)的第39 52位的氨基酸序
權利要求
多核苷酸，其編碼由使序列號4、6、8或10的氨基酸序列發生突變后的突變序列組成、且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白，其特征在于，使序列號4、6或8的氨基酸序列的第39～52位的氨基酸序列QGKKSDFDLSHLEY或QGKKSDFDLSHHEY、或者序列號10的氨基酸序列的第44～57位的氨基酸序列GKKDSAFELDHLEF中發生1～5個氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突變。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，編碼使所述第39 52位的氨基酸序列 或第44 57位的氨基酸序列以外的序列部分進一步發生1 15個氨基酸的缺失、取代、 插入及/或添加的突變后的突變序列組成的轉運蛋白。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，使序列號4、6或8的氨基酸序列的 第46 51位的氨基酸序列DLSHLE或DLSHHE、或者序列號10的第51 56位的氨基酸序 列ELDHLE中發生1 5個氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突變。
4.多核苷酸，其特征在于，包含由序列號25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或 49的堿基序列組成的多核苷酸。
5.多核苷酸，其特征在于，包含由序列號29、33、35、39、41、43或47的堿基序列組成的 多核苷酸。
6.多核苷酸，其特征在于，包含編碼由序列號26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48或50的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
7.多核苷酸，其特征在于，包含編碼由序列號30、34、36、40、42、44或48的氨基酸序列 組成的蛋白質的多核苷酸。
8.如權利要求1 7中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，其為DNA。
9.蛋白質，其特征在于，其為由權利要求1 8中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
10.載體，其特征在于，包含權利要求1 8中任一項所述的多核苷酸。
11.轉化酵母，其特征在于，該轉化酵母中導入了權利要求10所述的載體。
12.如權利要求11所述的釀造用酵母，其特征在于，通過導入權利要求10所述的載體， 提高了低聚糖分解能力。
13.如權利要求12所述的釀造用酵母，其特征在于，通過增加權利要求9所述的蛋白質 的表達量，提高了低聚糖分解能力。
14.酒類的制造方法，其特征在于，使用權利要求11 13中任一項所述的酵母。
15.如權利要求14所述的酒類的制造方法，其特征在于，釀造的酒類是麥芽飲料。
16.如權利要求14所述的酒類的制造方法，其特征在于，釀造的酒類是葡萄酒。
17.酒類，其特征在于，其為利用權利要求14 16中任一項所述的方法制造的酒類。
18.獲取包含具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的酵母的方法，其特征在 于，包括步驟1，將多個被測酵母在含有2-脫氧葡萄糖的低聚糖培養基上培養，將其生長繁殖 水平作為指標，篩選包含不易因葡萄糖而導致失活或降解的轉運蛋白的酵母；步驟2，通過比較步驟1中篩選的酵母中包含的轉運蛋白的氨基酸序列和因葡萄糖而 導致失活或降解水平已知的轉運蛋白的氨基酸序列，來鑒定有助于提高因葡萄糖導致的失 活或降解的難度的氨基酸殘基或氨基酸序列；步驟3，根據步驟2中獲得的氨基酸序列信息，設計編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解 抗性的轉運蛋白的多核苷酸；以及步驟4，將步驟3中設計的多核苷酸導入酵母中，將該酵母在低聚糖培養基上培養，測 定該酵母中包含的轉運蛋白的葡萄糖誘導性失活/降解抗性、該酵母的低聚糖分解能力、 增殖速度及/或在麥汁中的發酵速度。
全文摘要
本發明涉及葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白基因及其用途，特別涉及對低聚糖(麥芽糖、麥芽三糖等)分解性優異的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類、其制造方法等。特別是本發明涉及Mal21p、突變Mal31p、突變Mal61p、突變Mtt1p、突變Agt1p等葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白、編碼該轉運蛋白的基因、利用該轉運蛋白的酒類的制造方法等。
文檔編號C12C11/02GK101952425SQ20088000063
公開日2011年1月19日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者大村文彥, 畠中治代 申請人:三得利控股株式會社