雜交的α-葡萄糖苷轉運蛋白的制作方法

專利名稱：雜交的α-葡萄糖苷轉運蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及可加快麥汁等中所含有的麥芽糖/麥芽三糖分解的CI -葡萄糖苷轉運 蛋白等。
背景技術：
在啤酒、發泡酒、威士忌等麥芽發酵飲料的制造中，對麥芽等進行糖化而得到的麥 汁中所含有的糖主要為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖三種。這些來自麥芽的糖的比率可因糖化 方法不同而有若干改變，但在不添加酶劑、不添加糖化淀粉等時，則無大的變化，可以說為 1:5: 1左右的比例。其中，葡萄糖為單糖，作為最適合酵母的糖最先被分解。酵母具有 許多在葡萄糖存在下轉錄過程中受到抑制的基因。此抑制控制被稱為葡萄糖阻遏。向酵母 內轉運麥芽糖、麥芽三糖時所需要的多種轉運蛋白均受到此抑制。并且已知這些受到葡萄 糖阻遏的基因的產物，具有即使在翻譯后，也會在葡萄糖存在下失活的物質。還已知麥芽糖 轉運蛋白也屬于此類，在葡萄糖存在下會被迅速降解。因麥芽糖/麥芽三糖分解的第一步 驟是通過所述轉運蛋白將其轉運到酵母細胞內，所以，如果轉運蛋白被降解，則這些分解也 將停止。這就是轉運蛋白的表達被稱為分解的限速步驟的緣由。非專利文獻 1 :Brondijk, T. H.，van der Rest, M. E.，Pluim, D.，de Vries, Y. de.， Stingl，K.，Poolman，B.，and Konings, ff. N. (1998)J Biol Chem 273 (25)，15352-15357非專利文獻2 :Medintz, I.，Wang, X.，Hradek, T.，and Michels, C. A. (2000) Biochemistry 39 (15)，4518—4526非專利文獻3 :Gadura, N.，and Michels, C. A. (2006) Curr Genet 50(2)，101-114非專利文獻4:4)Han EK, Cotty F, Sottas C, Jiang H, Michels CA. (1995) MolMicrobiol. 17(6)，1093-107.因此，例如酵母中的Agtlp，因在葡萄糖存在下降解速度非常快，所以在高濃度葡 萄糖的培養中不能高效地發揮作用，這是問題之一。

發明內容
發明要解決的課題在這種情況下，希望制備出可加快含有麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖的發酵醪因酵 母引起的發酵速度的低聚糖轉運蛋白。特別是，若可以控制翻譯后的a-葡萄糖苷轉運蛋白Agtlp因葡萄糖而引起的降 解，則即使培養基中存在高濃度葡萄糖，也可以期待酵母更高效地分解麥芽糖、麥芽三糖， 所以，將制備不易因葡萄糖而引起失活或降解的a -葡萄糖苷轉運蛋白Agtlp作為課題。解決課題的方法本發明者根據此設想進行研究的結果是，制備出已知容易因葡萄糖而引起失活/ 降解的AGT1與從自然界中得到的不易因葡萄糖而引起失活/降解的MAL21的多個雜交基 因，并從中成功制備了不易因葡萄糖而引起失活/降解、且在底物特異性上與AGT1同樣可
3轉運麥芽三糖的雜交轉運蛋白，從而完成了本發明。S卩，本發明涉及編碼葡萄糖誘導性失活/降解抗性轉運蛋白的基因、由該基因編 碼的轉運蛋白、該基因表達受到調控的轉化酵母、使用該基因表達受到調控的酵母來制造 酒類的制造方法等。具體地說，本發明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、 導入了該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒類的制造方法等。(1)多核苷酸，其是編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷 酸，是包含由以下(a) (d)中任一項所述的多核苷酸組成的12次跨膜結構域編碼區、且 使5'端序列和/或3'端序列與異種多核苷酸重組而成的多核苷酸(a)多核苷酸，其由序列號3的第307 1659位堿基序列或序列號5的第283 1641位堿基序列組成；(b)多核苷酸，其是編碼序列號4的第103 553位氨基酸序列或序列號6的第 95 547位氨基酸序列的多核苷酸；(c)多核苷酸，其是編碼序列號4的第103 553位氨基酸序列中或序列號6的第 95 547位氨基酸序列中1 10個氨基酸發生缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列 的多核苷酸；及(d)多核苷酸，其是編碼與序列號4的第103 553位氨基酸序列或序列號6的第 95 547位氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的多核苷酸。(2)如⑴所述的多核苷酸，其中，異種多核苷酸序列是序列號1的12次跨膜結構 域的5'端序列和/或3'端序列。(3)如⑴所述的多核苷酸，其中，與5'端序列重組的位置在12次跨膜結構域的 預測TMD1編碼區內，與3 ‘端序列重組的位置在從12次跨膜結構域的預測TMD12編碼區起 始位置到預測TMD12編碼區終止位置后的96個堿基以內(向3'端方向的96個堿基)的 區域內，且在與序列號2和序列號4的對應氨基酸序列具有80%以上的同一性的區域內。(4)如(1)所述的多核苷酸，其中，與5’端序列重組的位置，在從序列號1或序列 號5的第175位堿基開始到12次跨膜結構域預測TMD1編碼區終止位置的區域內；12次跨 膜結構域與3'端序列的重組位置在從預測TMD12編碼區起始位置到預測TMD12編碼區終 止位置后的180個堿基以內(向3'端方向的180個堿基)的區域內。(5)如(1) ⑷中任一項所述的多核苷酸，其包含由序列號13、15或17的堿基 序列組成的多核苷酸。(6)如(1) ⑷中任一項所述的多核苷酸，其包含編碼由序列號14、16或18的 氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。(7)如(1) (6)中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。(8)蛋白質，其是由(1) (7)中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。(9)載體，其是包含(1) (7)中任一項所述多核苷酸的載體。(10)轉化酵母，其是導入有(9)所述的載體的轉化酵母。(11)如(10)所述的釀造用酵母，其是通過導入(9)所述的載體，提高了低聚糖分 解能力的釀造用酵母。(12)如(11)所述的釀造用酵母，其是通過增加(8)所述的蛋白質的表達量，提高 了低聚糖分解能力的釀造用酵母。
(13)酒類的制造方法，其中，使用(10) (12)中任一項所述的酵母。(14)如(13)所述的酒類的制造方法，其中，釀造的酒類是麥芽飲料。(15)如(13)所述的酒類的制造方法，其中，釀造的酒類是葡萄酒。(16)酒類，其是用(13) (15)中任一項所述的方法制造的酒類。本發明中，通過使用表達改造的雜交轉運蛋白基因的酵母，可加快包含麥芽糖、麥 芽三糖等低聚糖的醪液的發酵速度。改造后的雜交轉運蛋白基因可導入任何釀造用酵母、 實驗室酵母中。特別是在大量含有葡萄糖、果糖等單糖的發酵原液中含有麥芽糖、麥芽三 糖、松二糖、海藻糖等改造后的轉運蛋白可轉運的低聚糖時，更為有效。


圖1表示MAL21基因的堿基序列。圖2表示Mal21p的氨基酸序列。圖3表示Mal21p和Agtlp的氨基酸序列的比對。圖4表示Mal21p和Mttlp的氨基酸序列的比對。圖5表示Agtlp和Mal21p的底物特異性的不同。圖6表示Agtlp、Mal61p及Mal21p在葡萄糖存在下的降解速度。圖 7 表示 AMMp、AAMp、AMAp、MAAp、MMAp、MAMp 的序列模式圖。圖8表示具有AMMp、AAMp、AMAp、MAAp、MMAp、MAMp各雜交轉運蛋白的轉化酵母的 底物特異性。圖9表示具有AMMp、AAMp、AMAp、MAAp、MMAp、MAMp各雜交轉運蛋白的轉化酵母的 2-D0G抗性。圖10表示MMAp、MAAp、MAMp降解速度的測定。圖11表示高表達MAL21基因的下面啤酒酵母株的發泡酒或發泡酒(葡萄糖豐富) 麥汁中麥芽糖的發酵速度。圖 12 表示 pJHXSB。圖 13 表示 pYCGPY。圖 14 表示 pUP3GLP。
具體實施例方式本發明者基于以下設想進行了研究，S卩，如果可控制翻譯后的轉運蛋白因葡萄糖 而引起的失活或降解，則即使在葡萄糖存在的情況下，酵母也可更高效地分解麥芽糖及麥 芽三糖，結果發現了自然界中不易降解的a-葡萄糖苷轉運蛋白Mal21p，并證實了與其它 轉運蛋白相比，Mal21p的降解速度極為緩慢。通過高表達本發明中新制備的、不易因葡萄糖而引起失活或降解的雜交轉運蛋 白，確實成功地提高了麥芽糖培養基中的增殖速度。且在啤酒釀造中，成功加快了麥芽糖的 分解速度。本發明即是基于此種設想和研究成果而完成的。本發明中所得到的基因及其核苷酸序列、以及由這些基因編碼的轉運蛋白的氨基 酸序列如下所示。[序列號1]MAL21的核苷酸序列
[序列號2]Mal21p a -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列[序列號3]AGT1的核苷酸序列[序列號4]Agtlpa -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列[序列號5]MTT1的核苷酸序列[序列號6]Mttlpa -葡萄糖苷轉運蛋白的氨基酸序列[序列號7]AAM的核苷酸序列[序列號8]AAMp的氨基酸序列[序列號9]AMA的核苷酸序列[序列號10]AMAp的氨基酸序列[序列號11]AMM的核苷酸序列[序列號12]AMMp的氨基酸序列[序列號13]MAA的核苷酸序列[序列號14]MAAp的氨基酸序列[序列號15]MAM的核苷酸序列[序列號16]MAMp的氨基酸序列[序列號17]MMA的核苷酸序列[序列號18]MMAp的氨基酸序列本說明書中使用的“ a -葡萄糖苷轉運蛋白”，是指與a -葡萄糖苷的膜運輸有關 的蛋白質，此種a-葡萄糖苷轉運蛋白包括麥芽糖轉運蛋白、麥芽三糖轉運蛋白等。1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供了如下多核苷酸，其是編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性 的轉運蛋白的多核苷酸，包括(a)多核苷酸，所述多核苷酸包含由序列號3的第307 1659位堿基序列或序列號5的第283 1641位堿基序列組成的多核苷酸；以及(b) 12次跨 膜結構域編碼區，所述12次跨膜結構域編碼區由編碼序列號4的第103 553位氨基酸序 列或序列號6的第95 547位氨基酸序列的多核苷酸組成，并且使5'端序列和/或3' 端序列與異種多核苷酸重組而成。多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA。12次跨膜結構域，是指12個跨膜結構域TMD1到TMD12的范圍，包含各個跨膜結構 域TMD1、TMD2、. . .、TMD12及介于其間的序列。TMD1、TMD12等在TMD上附帶的各編號，表示 從氨基酸序列的N末端開始計數的跨膜結構域的編號。因此，12次跨膜結構域編碼區是指 編碼從TMD1到TMD12的范圍內的氨基酸序列的核苷酸序列，TMD1編碼區是指編碼TMD1的 氨基酸序列的核苷酸序列。本發明涉及使具有12次跨膜結構域的a-葡萄糖苷轉運蛋白的N末端和/或C 末端序列與其它具有12次跨膜結構域的轉運蛋白的N末端和/或C末端序列重組而形成 的轉運蛋白或編碼該轉運蛋白的多核苷酸。因此，在本說明書中，“異種多核苷酸”，是指編 碼與重組前轉運蛋白不同的轉運蛋白的多核苷酸。與異種多核苷酸重組時，可優選在重組 對象的多核苷酸和異種多核苷酸之間，進行核苷酸序列和/或氨基酸序列的比對，并在對 應的區域間進行重組。5'端序列和/或3'端序列，是指某一特定基因或DNA序列的旁側序列，即5'端 和/或3'端存在的序列。例如，12次跨膜結構域編碼區的5'端序列，包含用于使中央部
6分具有所述12次跨膜結構域的蛋白質的編碼區域開始翻譯的序列；12次跨膜結構域編碼 區的3'端序列，包含用于使中央部分具有12次跨膜結構域的蛋白質的編碼區域終止翻譯 的序列。本發明中，5'端序列及3'端序列，是指中間夾有12次跨膜結構域的5'端序列 和3'端序列。5'端的重組位置，例如可以在TMD1的區域內，也可以在從TMD1起始位置開 始的5'端上游。本發明的優選多核苷酸，可例舉由序列號3的第307 1659位堿基序列或序列號 5的第283 1641位堿基序列組成的多核苷酸、或由編碼序列號4的第103 553位氨基 酸序列或序列號6的第95 547位氨基酸序列的多核苷酸組成的12次跨膜結構域編碼區 的5'端和/或3'端序列與序列號1的12次跨膜結構域編碼區的5'端和/或3'端序 列重組而形成的，編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸。本發明中作為對象的多核苷酸，并不限定于編碼上述蛋白質序列的多核苷酸，還 包括編碼與此蛋白質功能同等的蛋白質的其他多核苷酸。功能同等的蛋白質，例如可舉出 (c)包含在序列號4的第103 553位氨基酸序列或序列號6的第95 547位氨基酸序列 中1 10個(優選1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、 1 2個或1個)氨基酸發生缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有葡萄糖誘導 性失活/降解抗性的轉運蛋白。此種蛋白質，可例舉包含序列號4的第103 553位氨基酸序列或序列號6的第 95 547位氨基酸序列中，例如1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個(1 數 個)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、1個氨基酸殘基發生缺失、取代、插入和/或添 加的氨基酸序列，且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。通常，上述氨基酸殘基 的缺失、取代、插入和/或添加的數量，優選越小越好。此外，此種蛋白質，可例舉(d)包含與序列號4的第103 553位氨基酸序列或 序列號6的第95 547位氨基酸序列具有約90%以上、91 %以上、92%以上、93%以上、 94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 以上、99. 2%以上、 99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上
同一性的氨基酸序列，且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。通常，上述同源性 的數值優選越大越好。<葡萄糖誘導性失活/降解抗性的評價>本發明中，葡萄糖誘導性失活/降解抗性，例如，可按以下方法進行評價。首先，確 認表達各轉運蛋白的菌株在含有0 2mM2-脫氧葡萄糖的麥芽糖等的最小必需培養基[無 氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids) 6. 7g/L、麥芽糖等 20g/L，但對 于有營養缺陷型的轉化株，包含其營養素]、或在含有0 2mM2-脫氧葡萄糖的麥芽糖等的 完全合成培養基(SCM)[無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿 嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L-組氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-精氨酸鹽酸鹽20mg/ml、 L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-異亮氨酸30mg/ml、L-賴氨 酸鹽酸鹽30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L_天冬氨酸100mg/ml、L_纈 氨酸150mg/ml、L-蘇氨酸200mg/ml、L-絲氨酸400mg/ml]中的生長繁殖狀況，即使產生了 葡萄糖誘導性失活/降解信號的酵母，也要從中篩選其轉運蛋白具有麥芽糖轉運活性且起 作用的菌株。接著，將此菌株接種到YPD(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，在30°C溫度下振蕩培養過夜。將培養液接種到YPM培養基(酵母浸膏10g/L、多聚 蛋白胨20g/L、麥芽糖5g/L)中，使0D660 = 1. 0，并在30°C溫度下振蕩培養2. 5小時后收 集菌。測取60個0D660單位的細胞，懸浮于30ml預先在30°C保溫的降解速度測定用培養 基[無氨基酸和銨鹽酵母氮源(1.6g/L、葡萄糖20g/L、環己酰亞胺25iig/L]中，在30°C溫 度下進行溫育。在適合的時間(0、10、20、30及40分鐘、或0、30、60、90及120分鐘)抽取 細胞懸浮液樣品5ml，迅速離心棄上清，并用乙醇干冰冷凍細胞。根據常規方法檢測冷凍細 胞中的轉運蛋白，測定蛋白條帶的強度，由其減少速度計算半衰期。本發明中的優選轉運蛋 白，例如，與Agtlp比較，具有2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上或8倍以上 的半衰期。<蛋白質跨膜結構域的規定>本發明中，上述(a)中記載的“序列號3的第307 1659位堿基序列或序列號5 的第283 1641位堿基序列”、及(b)中記載的“序列號4的第103 553位氨基酸序列 或序列號6的第95 547位氨基酸序列”，是預測的酵母中Agtlp或Mttlp的12次跨膜 結構域部分。這些蛋白質的跨膜結構域，可利用Stockholm大學理論化學蛋白預測服務器 上白勺撲予頁測禾呈序 Toppred2 (http ://bioweb. pasteur. fr/seqanal/interfaces/toppred. html) > ^^Ijffi EMBnet 白勺胃月莫 g禾呈 TMPRED Transmembrane regions detection (EMBnethttp://www. ch. embnet. org/index. html)等來預測(訪問日2008 年 8 月 29 日)。 對于 Mal61p 跨膜結構域的預測，在 Cheng，Q.，and Michels, C. A. (1989) Geneticsl23 (3)， 477-484中有記載。本說明書中，以下TMD1 TMD12的預測使用Stockholm大學理論化 學蛋白預測服務器上的拓撲預測程序Toppred2 (http //bioweb. pasteur. fr/seqanal/ interfaces/toppred. html)。圖3及圖4分別表示Mal21p和Agtlp的氨基酸序列比對，及Mal21p和Mttlp的氨 基酸序列比對圖。在各個圖中，顯示了同樣氨基酸(淡灰色)及同源性氨基酸(深灰色)、 非同源性氨基酸、空位㈠等的信息。此外，本發明提供如下多核苷酸，其中，3'端12次跨膜結構域編碼區與5'端序 列的重組位置在預測TMD1編碼區內，12次跨膜結構域編碼區與3'端序列的重組位置在從 預測TMD12編碼區起始位置到預測TMD12編碼區終止位置后的96個堿基以內的區域內，且 在與序列號2和序列號4的對應氨基酸序列具有80%以上同一性的區域內，編碼具有葡萄 糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。參照圖3，對于上述“預測TMDl”，Mal21p(序列號2)中第95 115位的氨基酸、 Agtlp (序列號4)中第103 123位區域的氨基酸表示所述預測位置。(圖3中預測TMD1 的位置表示Agtlp的預測位置。)因此，編碼它們的堿基序列，是MAL21(序列號1)中第 283 345位的區域、AGT1(序列號3)中第307 369位的區域。同樣，參照圖3，對于上 述“預測TMD12”，Mal21p(序列號2)中第526 546位區域的氨基酸、Agtlp (序列號4)中 第533 553位區域的氨基酸表示所述預測位置。(圖3中的預測TMD12位置表示Agtlp 的預測位置。)所以，各個預測TMD12編碼區，在MAL21(序列號1)中是第1576 1638位 的區域，在AGT1(序列號3)中是第1597 1659位的區域。因此，“從預測TMD12編碼區起 始位置到預測TMD12編碼區終止位置后的96個堿基以內的區域”，指MAL21(序列號1)時 是第1576 1734位內的堿基序列的區域，指AGT1(序列號3)時是第1597 1755位內
8的堿基序列的區域。上述“預測TMD12編碼區終止位置后的96個堿基以內的區域”，優選為 離預測TMD12編碼區終止位置的96堿基以內、更優選81堿基以內、進一步優選72堿基以 內的區域。各個對應的序列位置的一例如下表1所示。但根據前述預測程序，這些數值的 多個都可改變。
表 1 且本發明提供如下多核苷酸，其中，12次跨膜結構域編碼區和5'端序列的重組 位置在從序列號1的第175位堿基到12次跨膜結構域的預測TMD1編碼區終止位置的區域 內，12次跨膜結構域和3 ‘端序列的重組位置在從預測TMD12編碼區起始位置到預測TMD12 編碼區終止位置后的第180位堿基的區域內，且編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的 轉運蛋白。參照圖4，對于上述“預測TMDl”，Mal21p(序列號2)及Mttlp(序列號6)中第95 115位的氨基酸表示所述預測位置(即無空位)。因而，與“預測TMD1編碼區”對應的堿基 序列是MAL21(序列號1)及MTT1(序列號5)中第283 345位的區域。因此，“序列號1 或序列號5的從第175位堿基到預測TMD1編碼區終止位置的區域”，是指序列號1或序列號 5的第175 345位。第175位的堿基開始到預測TMD1編碼區終止位置的區域，因在此范 圍內的兩氨基酸序列完全一致，所以此范圍內的任何位置都可作為重組位置來被選擇(參 照圖4)。同樣，對于“預測TMD12”，Mal21p(序列號2)中第526 546位區域的氨基酸、 Mttlp(序列號6)中第527 547位區域的氨基酸表示所述預測位置。因而，“從預測TMD12 編碼區起始位置到預測TMD12編碼區終止位置后的180堿基以內的區域”，是指MAL21 (序 列號1)中第1576 1818位堿基序列的區域，MTT1 (序列號5)中第1579 1821位堿基 序列的區域。預測TMD12編碼區終止位置后的180個堿基以內的區域，因在此范圍內的兩 氨基酸序列完全一致，所以，在此范圍內的任何位置都可作為重組位置被選擇(參照圖4)。 各個對應的序列位置參照以下表2，但根據前述預測程序，這些數值的多個都可變化。表2 并且，本發明還包含如下多核苷酸，該多核苷酸包含由序列號13、15或17的堿基 序列組成的多核苷酸、或包含編碼由序列號14、16或18的氨基酸序列組成的蛋白質的多核 苷酸。進一步，本發明還包括如下多核苷酸，該多核苷酸包含在嚴謹條件下與上述(1) (4)中所述的多核苷酸或由序列號13、15或17的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸 雜交，且編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸。本發明的優選多核苷酸，為上述(1) (4)中規定的多核苷酸、包含編碼由序列號 14、16或18的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸、或含有由序列號13、15或 17的核苷酸序列組成的多核苷酸的多核苷酸，更優選為由序列號13、15或17特定的多核苷 酸。在此，“在嚴謹條件下雜交的多核苷酸(DNA) ”，是指例如以由序列號1或3的堿基 序列的互補堿基序列組成的DNA或編碼序列號2或4的氨基酸序列的DNA的全部或一部分 為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等所得到的DNA。雜交方 法，可使用例如Molecular Cloning 3rd Ed. >Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons 1987-1997等中所記載的方法。本說明書中所述的“嚴謹條件”，可為低嚴謹條件、中嚴謹條件及高嚴謹條件中的 任一種。“低嚴謹條件”，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、32°C的 條件。“中嚴謹條件”，例如，為5 X SSC、5 X Denhardt溶液、0. 5 % SDS、50 %甲酰胺、42 V的條 件。“高嚴謹條件”，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、50°C的條 件。在上述條件中，溫度越高，越有可能獲得高同源性DNA。但影響雜交嚴謹性的因素還有 溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域技術人員可通過適 當選擇這些因素，實現同樣的嚴謹性。此外，雜交中使用市售試劑盒時，可使用例如Alkphos Direct LabellingReagents (Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據試劑盒中附帶的說明方案， 與標記后的探針溫育過夜后，在55°C條件下用含有0. 1 % (w/v) SDS的1次洗滌緩沖液洗滌 膜，隨后可檢測雜交的DNA。除上述以外，作為可雜交的DNA，可例舉通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件， 使用默認參數計算時，與編碼序列號2或4的氨基酸序列的DNA具有約90%以上、91 %以 上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 99. 以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、 99. 8%以上、99. 9%以上同一性的DNA。另外，氨基酸序列或堿基序列的同一性可使用根據Karlin及Altschul的BLAST
10算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA，872264-2268，1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873， 1993)測定。已經開發出基于BLAST算法的被稱為BLASTN或BLASTX的程序(Altschul SF，et al :J Mol. Biol. 215 :403，1990)。當使用BLASTN分析堿基序列時，參數例如為分數 (score) = 100、字長(wordlength) = 12。另外，當使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數例 如為分數=50、字長=3。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認參數。2.本發明的蛋白質本發明提供由上述(1) (6)中所述的任一個多核苷酸編碼的蛋白質。本發明的 優選蛋白質為由序列號14、16或18的氨基酸序列中1 10個(優選1 9個、1 8個、 1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸發生缺失、取代、 插入和/或添加的氨基酸序列組成，且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。此 種蛋白質，可例舉由序列號14、16或18的氨基酸序列中如上所述數量的氨基酸殘基發生缺 失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列組成，且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運 蛋白。此外，此種蛋白質，還可例舉具有與序列號14、16或18的氨基酸序列有如上所述的同 源性的氨基酸序列，且具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白。此種蛋白質，可使用 《分子克隆》第 3 版、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc. Acids. Res.，10， 6487 (1982)，，、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,6409 (1982) ”、"Gene，34，315 (1985)，，、"Nuc. Acids. Res.，13,4431 (1985)，，、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,488 (1985) ”等中所述的定點 誘變法獲得。與本發明多核苷酸相關的蛋白質的氨基酸序列中1 10個(優選1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸殘基發生 缺失、取代、插入和/或添加，是指同一序列中任意且1 10個、1 9個、1 8個、1 7 個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個氨基酸序列的位置中，1 10個、 1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個氨基酸 殘基發生缺失、取代、插入和/或添加，缺失、取代、插入及添加中的兩種以上可同時發生。以下舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取 代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、 o-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天 冬氨酸、異谷氨酸、2_氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、 精氨酸、鳥氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3- 二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基 脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。本發明的蛋白質可通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等 的化學合成法制備。也可利用Advanced Chem Tech公司、珀金埃爾默(PerkinElmer)公 司、Pharmacia 公司、Protein Technology Instruments 公司、Synthecell-Vega 公司、 PerS印tive公司、島津制作所等所制造的肽合成儀進行化學合成。3.本發日月的jH本及導入該^本的轉仆,酵母另外，本發明提供含有上述多核苷酸的載體。本發明的載體，優選含有上述(1) ⑷中任一項所述的多核苷酸(DNA)、或由序列號13、15或17的堿基序列組成的多核苷酸、 或編碼由序列號14、16或18的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。且本發明的載體， 通常以包含表達盒的形式構成，該表達盒包含的結構要素為(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)以正向或反向與該啟動子連接的上述任一項所述的多核苷酸(DNA)；及(z)與 RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化有關的、在酵母內發揮作用的信號。此外，要使上述本發 明的蛋白質高表達，優選將上述多核苷酸相對于該啟動子正向導入，以促進上述(a) (i) 中任一項所述的多核苷酸(DNA)的表達。導入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體 整合型(Yip型)中的任一種。例如，作為YEp型載體已知有YEp24(J. R. Broach et al.， Experimental Manipulation of Gene Expression,Academic Press,New York,83,1983)、 作為YCp型載體已知有YCp50(M. D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、作為Yip型載體已知 有 YIp5(K. Struhl et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，76，1035，1979)，且易獲得。此夕卜，也 可使用染色體整合型的 pUP3GLP(0mura，F. et al.，FEMS Microbiol. Lett.，194，207，2001) (圖 14)、pJHIXSB、pYCGPY(Kodama，Y. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，67，3455，2001) (圖13)、pJHXSB(圖12)等單拷貝復制型質粒。用于調控酵母中基因表達的啟動子/終止子，只要在釀造用酵母中起作用，同時 不受醪液中糖或氨基酸等成分濃度的影響，可任意組合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脫氫 酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克 隆，如在M.F. Tuite et al.，EMB0 J.，1，603 (1982)中有詳細記載，通過已知方法可很容易 地獲得。表達載體中使用的啟動子可以根據發酵醪的糖組成、糖濃度、或多個轉運蛋白的 組合等，可有效地改變成具有適當轉錄活性的啟動子。因釀造用酵母不能利用營養缺陷型 標記，所以，轉化時使用的選擇性標記可利用遺傳霉素(Geneticin)抗性基因G418r、銅抗 性基因(CUP1) (Marin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984)、淺藍菌素抗性基 因(fas2m, PDR4)(豬腰淳嗣等，生物化學，64，660，1992 ；Hussain et al.，gene，101，149， 1991)等。將如上所述構建的載體導入宿主酵母內。宿主酵母可例舉可用于釀造的任意酵 母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可列舉酵母屬(Saccharomyces) 等的酵母，在本發明中，可使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus) W34/70 等，卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456 等，釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954 等。并且還可使用 威士忌酵母，例如釀酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母，例如協會葡萄酒用1號、同3號、同4號 等葡萄酒酵母；清酒酵母，例如協會酵母、清酒用7號、同9號等清酒酵母，但不限于此。本 發明中，優選使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。用于制備本說明書中所述的各轉運蛋白基因的染色體DNA，并不限定于釀酒酵 母ATCC20598、ATCC96955等的菌株，只要是屬于具有各基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，可以從任何酵母中制備。酵母的轉化方法，可使用通常使用的公知方法。例如，可使用電穿孔法“Meth. Enzym.，194，pl82 (1990) ”、原生質球法(Spheroplast 法)"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)，，、醋酸鋰法"J. Bacteriology, 153，pl63 (1983)，，、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75 pl929(1978)、Methods in yeast genetics,2000 Edition :A Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實施，但不限于此。此外，轉化株，可通過將宿主的營養缺陷型互補基因(例如將URA3)整合到表達質 粒中，在不含尿嘧啶的瓊脂培養基中篩選。或可通過將抗藥性基因(例如對環己酰亞胺的抗藥性基因、YAP1或遺傳霉素(Geneticin)的抗性基因G418R)整合到表達質粒中，在含有 環己酰亞胺(例如0. 3 u g/ml)或遺傳霉素(Geneticin)(例如300 u g/ml)的瓊脂培養基 中篩選。更具體地說，將宿主酵母置于標準酵母營養培養基[例如YEPD培養基“Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York，117 (1979) ”等]中培養至 0D600nm 值為 1 6。將此培養酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1 2M的堿離子金屬離子(優選鋰 離子)進行預處理。將所述細胞在約30°C的條件下靜置約60分鐘后，與待導入的DNA(約 1 20 y g)同時在約30°C的條件下靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優選加入約4000道爾 頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20% 50%。在約30°C下靜置約30分鐘后，將所述細胞在 約42°C條件下加熱處理約5分鐘。優選用標準酵母營養培養基洗滌所述細胞懸浮液，并加 入到規定量的新鮮標準酵母營養培養基中，約30°C下靜置約60分鐘。之后，移到含有作為 選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基中，獲得轉化體。其他有關的常規克隆技術，可參照(《分子克隆》第3版)、“MethodS in YeastGenetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold SpringHarbor, NY) ”等。4. H日月白射酉力fe力誦i寸該力feffell胃白射酉-將上述本發明的載體導入適合釀造作為制造對象的酒類的酵母中，通過使用該酵 母，可制造具有特定氨基酸組成的酒類。作為制造對象的酒類例如可例舉啤酒、葡萄酒、威 士忌、清酒等，但并不限于此。制造這些酒類時，除使用本發明中所獲得的釀造酵母來代替親株以外，可利用公 知的方法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往的方法完全相同，不會因制造發酵時 間縮短的酒類而增加成本。也就是說，根據本發明，可在使用已有設備在不增加成本的情況 下進行制造。5.酵母的評價方法構建含有本發明中制備的多核苷酸的表達載體，將其根據常規方法導入酵母中， 首先在含有2-脫氧葡萄糖的麥芽糖、麥芽三糖培養基中培養，將其生長繁殖水平作為指 標，篩選含有不易因葡萄糖而引起失活的轉運蛋白的酵母。然后，使所得到酵母在低聚糖培 養基(例如，麥芽糖、麥芽三糖培養基)中培養。在進行該培養時，可通過測定所述酵母中 含有的轉運蛋白的葡萄糖誘導性失活/降解抗性，所述酵母的低聚糖分解能力、增殖速度、 在麥汁中的發酵速度等，評價所述酵母的適應性。葡萄糖誘導性失活/降解抗性、低聚糖分 解能力、增殖速度、在麥汁中的發酵速度等，可通過后述實施例中使用的方法來評價。實施例以下通過實施例更詳細說明本發明，但本發明不限于以下實施例。試驗方法本實施例中使用的試驗項目及試驗方法如下所示。無特殊情況下，本實施例中的 試驗方法根據以下所示進行。<MAL21，AGT1 基因的獲取〉已經克隆了釀酒酵母的AGT1基因，并報道了其堿基序列。本說明書中所述的AGT1 的核苷酸序列(序列號3)從酵母基因組數據庫(SaccharomycesGenome Database)(注冊號YGR289C)獲取。以AGT1基因的堿基序列信息為基礎，將從具有AGT1基因的釀酒酵母 中制備的染色體DNA作為PCR模板，通過PCR進行擴增、分離而獲得AGT1基因。此外，對于MAL21，已知由III號染色體編碼，但其DNA序列還不為人知。但是，基 于由II號染色體編碼的MAL31與染色體VIII號編碼的MAL61基因具有99%以上的同一性 的考慮，預測與MAL21也具有相當高的同一性。實際上，我們根據從GenBank(注冊號X17391)獲取的MAL61的DNA序列設計 了引物[5，AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA 3’(序列號 19)和 5’ TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3’(序列號20)]。并且以具有MAL21基因但不具有其他a-葡萄糖苷轉運蛋白基因的 酵母染色體DNA為模板，用PCR可得到MAL21 (其核苷酸序列用序列號1表示，氨基酸 序列用序列號2表示)。AGT1是使用引物[5 ’ TGAGCTCACATAGAAGAACATCAAA 3 ’(序列 號 21)禾P 5’ ATGGATCCATATGAAAAATATCATT 3，(序列號 22)]獲得。具體地說，AGT1 由釀 酒酵母 S288C[ATCC204508(Rose, M. D.，Winston, F. and Hieter, P. (1990) Methods in YeastGenetics :A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY)]通過 PCR 獲得，MAL21 由釀酒酵母 ATCC20598，通過 PCR 獲得。 使用Invitrogen公司的T0P0 TA克隆試劑盒將獲取的DNA片段插入到載體pCR(注冊商 標)2. 1-T0P0中，通過DNA測序確認插入的基因序列。對于AGT1，確認與在數據庫中注冊的注冊號YGR289C的堿基序列相同。對于 MAL21，將10克隆以上獨立測序，確定了其堿基序列(序列號1)。此外，在所使用的引物中起始密碼子的上游有Xbal或SacI位點，終止密碼子的下 游有BamHI位點，這些位點已整合到表達載體內。通過使用染色體DNA而進行的目的基因 的PCR擴增及其后的分離，包擴PCR引物的制備，可使用本領域技術人員公知的方法進行。 MAL21的堿基序列如圖1所示，氨基酸序列如圖2所示。〈表達質粒〉本發明中，使用⑴ (3)的3種表達載體。(l)pJHXSB (圖 12)(2)pYCGPY (圖 13)(3)pUP3GLP (圖 14)〈酵母株〉本發明中，轉運蛋白基因的獲取使用菌株⑴ (3)，轉運蛋白的表達和菌株間的 比較使用菌株(4)及(5)，發酵速度的確認使用菌株(6)。(1)釀酒酵母 S288C(ATCC204508) (MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)(2)釀酒酵母 ATCC96955(MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 malllMAL12 mal 13 ura3-521eu2-31eu2-112trpl his)(3)釀酒酵母 ATCC20598 (MATa sue MAL2 MEL1 his4 leu2)(4)釀酒酵母HH1001(MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1TPI1: :TPIlpr_MAL32_G418R ura3)(5)釀酒酵母 A 152 (MATa mal61 A :TRP1 MAL62 MAL63 mal64 malllMAL12 mal 13 ura3-521eu2-31eu2-112 trpl his)(6)下面啤酒酵母 Weihenst印han 194
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<限制性內切酶識別位點的引入>通過使用具有限制性內切酶識別位點序列的引物進行PCR，引入限制性內切酶識 別位點。引物的DNA序列如表3所示。具體地說，通過以插入了 AGT1或MAL21基因的質粒 PCR(注冊商標)2. 1-T0P0為模板，用表4所示的引物的組合進行PCR，從而對于AGT1基因， 得到了 AGTl-SaS、AGTl-SaK、AGTl-SK、AGTl-SB 及 AGT1-KB 的五個 DNA 片段，對于 MAL21 基 因,得到了 MAL21-SaS、MAL21_SaK、MAL21-SK、MAL21-SB 及 MAL21-KB 的五個 DNA 片段。各 片段的模式圖如以下表2及3所示。所得到的DNA片段插入質粒pCR(注冊商標)2. 1-T0P0 中進行測序，確認除導入的限制性內切酶位點以外，沒有從原來的基因中取代的堿基。各個 DNA片段使用限制性內切酶SacI、SalI、KpnI、BamHI等從質粒中切出，用于下述雜交轉運蛋 白基因的構建中。<雜交轉運蛋白基因的構建>構建了圖7所示的6種雜交轉運蛋白基因AAM、AMA、AMM、MAA、MAM及MMA。各個 雜交轉運蛋白，通過將上述項中得到的各種片段用圖7所示的組合整合到表達載體pYCGPY 的SacI-BamHI位點來獲得。詳細地說，用SacI和BamHI切割pYCGPY并用細菌堿性磷酸酶 (Bacterial alkali phosphatase)進行脫磷酸化處理，將所述線性化載體與上述DNA片段 連接后，轉化到大腸桿菌(E.Coli)DH5a中。由數個氨芐青霉素抗性菌落制備質粒，用只在 MAL21或AGT1基因中存在的限制性內切酶的組合切割后，通過瓊脂糖凝膠電泳，根據檢測 片段的大小來確認目的雜交轉運蛋白基因已整合到載體pYCGPY中。pYCGPY中，轉運蛋白基 因從PYK1啟動子開始轉錄。此外，用SacI-BamHI從pYCGPY中切出各個雜交轉運蛋白，并 整合到表達載體PJHXSB的SacI-BamHI位點中。pJHXSB中，轉運蛋白基因從TPI1啟動子開 始轉錄。另外，本發明中使用的MMA、MAA、MAM等突變體標記，指連續含有以下各個核苷酸 序列的核苷酸序列，最初的字母指編碼來自12次跨膜結構域的N末端結構域(5'端)的氨 基酸序列的核苷酸序列，第2個字母指編碼來自12次跨膜結構域的氨基酸序列的核苷酸序 列，第3個字母指編碼來自12次跨膜結構域的C末端結構域(3'端)的氨基酸序列的核苷 酸序列。字母M指來自MAL21，字母A指來自AGT1。S卩，野生型AGT1可標記為AAA，將AGT1 的12次跨膜結構域的N末端用MAL21的對應結構域取代的雜交突變體標記為MAA。〈酵母的轉化〉用可表達通過上述方法得到的天然型轉運蛋白基因或雜交轉運蛋白基因的質粒 轉化酵母。轉化株(以不具有a-葡萄糖苷轉運蛋白基因的菌株為宿主)根據所使用的質 粒的標記在培養基中進行篩選，對于pYCGPY，則在含有300 u g/mlG418的YPD培養基中篩 選。另外，對于PJHXSB，當宿主使用HH1001等ura-株時，在不含尿嘧啶的合成培養基(例 如最小必需培養基[無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、葡萄糖20g/L])等中篩選。<轉運蛋白的麥芽糖或麥芽三糖轉運活性的評價>天然型轉運蛋白或構建的雜交轉運蛋白的轉化株(以不具有a-葡萄糖苷轉運 蛋白基因的菌株為宿主)中所導入的轉運蛋白基因的表達，可通過在以0.5%的麥芽糖或 麥芽三糖作為唯一碳源的最小必需培養基(但對于有營養缺陷型的轉化株，需含有其營養 素)中觀察其生長繁殖的有無來判定。例如用一鉬金環從YPD平板(酵母浸膏10g/L、多聚 蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中挑取供試菌株，用1ml的滅菌水洗滌一次后，再次懸浮于滅菌水中，使0D660 = 0. 2。收集菌并再一次懸浮于1ml的滅菌水中，通過在以麥芽糖或麥芽 三糖為唯一碳源的試驗培養基中直接劃線培養所述細胞懸浮液來確認生長繁殖狀況，確認 其具有麥芽糖或麥芽三糖轉運活性。<轉運蛋白的2-脫氧葡萄糖抗性的評價>由于2-脫氧葡萄糖(2-D0G)不能代謝成2-D0G-6-磷酸以上，所以是不能成為碳 源的糖類似物，但可產生與葡萄糖同樣水平的葡萄糖阻遏或因葡萄糖而引起失活。因此，在 此平板上生長繁殖的菌株具有不易因葡萄糖而引起失活的a-葡萄糖苷轉運蛋白的可能 性較高。為分析對2-D0G的抗性，制備含有0 2mM的2-脫氧葡萄糖的麥芽糖等的最小必 需培養基[無氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖等20g/L，但對于具有營養缺陷型的轉化株， 含有其營養素]、或含有0 2mM的2-脫氧葡萄糖的麥芽糖完全合成培養基(SCM)[無氨基 酸酵母氮源6. 7g/L、麥芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ ml、L-組氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-精氨酸鹽酸鹽20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸 30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L_異亮氨酸30mg/ml、L_賴氨酸鹽酸鹽30mg/ml、L_苯丙氨 酸 50mg/ml、L-谷氨酸 100mg/ml、L_ 天冬氨酸 100mg/ml、L_ 纈氨酸 150mg/ml、L_ 蘇氨酸 200mg/ml、L_絲氨酸400mg/ml]。將各轉運蛋白表達株的0D660 = 0. 2的細胞懸浮液的系 列稀釋液3 u 1分別點樣在試驗培養基中，通過30°C下培養2 3天來分析。<轉運蛋白在菌體內蓄積量的測定>轉運蛋白的菌體內蓄積量，可通過例如Western印跡法分析。例如，從10ml培 養液中回收處于對數增殖期的供試菌株，在裂解緩沖液[8M尿素、5% (w/v)SDS,40mM Tris-HCl(pH6.8)、0. ImM EDTAU% 3 _巰基乙醇]中用玻璃珠攪拌破壞，獲得細胞提取液。 用SDS-凝膠電泳分離總蛋白為60 y g的樣品，轉印到硝酸纖維素膜上，然后用抗Mal61p的 兔多克隆抗體進行Western印跡分析。抗Mal61p兔多克隆抗體如下獲得。將編碼Mal61p的N末端區(Metl_Leul81)的 DNA連接在pET表達載體(Novagen公司)的GST標簽下游，并轉化到大腸菌BL21 (DE3)中， 將所述轉化體的細胞破碎液加入到GST樹脂結合柱中，通過洗脫與柱子結合的蛋白來制備 所述抗體。詳細方法按照Novagen公司的pET表達系統，GST Bind 親和樹脂(Novagen 公司)中附帶的說明進行。制備的融合蛋白用SDS-PAGE確認純度后，以其作為抗原來免疫 兔，得到多克隆抗體。對于抗體的有效性，通過使a-葡萄糖苷轉運蛋白基因表達的酵母株 和不具有該基因的宿主株在YPM培養基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麥芽糖5. 0g/ L)中培養，利用本抗體并通過上述方法，對細胞破碎液進行Western印跡分析來確認。通 過所述抗體，僅在表達a-葡萄糖苷轉運蛋白基因的酵母株破碎液中，檢測出與68kDa的 a-葡萄糖苷轉運蛋白分子量一致的陽性條帶。且對于雜交轉運蛋白，用本抗體只能檢測 出N末端部為Mal21p型的轉運蛋白、MMAp、MAMp及MAAp。Agtlp的菌體內蓄積量，構建編 碼在Agtlp的C末端部串聯連接2個紅細胞凝集素標簽的融合蛋白的基因，用上述方法獲 取表達該基因的菌株，來測定Agtlp的菌體內蓄積量。抗體使用抗紅細胞凝集素的小鼠單 克隆抗體(Covance, Research，Products，Inc.公司)。<轉運蛋白降解速度的測定>將表達各轉運蛋白的菌株接種于YPD中，30°C下振蕩培養過夜。將培養液接種于 YPM培養基中，使0D660 = 1. 0，30°C下振蕩培養2. 5小時收集菌。測取60個0D660單位的
16細胞，使其懸浮于30ml在預先進行30°C保溫的降解速度測定用培養基[無氨基酸酵母氮 源(不含氨)(Yeast Nitrogen Base w/o amino acidsand ammonia) 1. 7g/L、葡萄糖 20g/ L、環己酰亞胺25mg/L)中，在30°C溫度下溫育。在適當的時間(0、10、20、30及40分鐘或 0、30、60、90及120分鐘)抽取5ml細胞懸浮液，迅速離心后棄上清，將細胞用乙醇干冰冷 凍。冷凍后的細胞用上述方法檢測轉運蛋白，測定蛋白條帶的強度，由強度的減少速度計算 半衰期。<麥芽糖分解能力的評價>對于組成型表達轉運蛋白的酵母對麥芽糖的分解，通過在適合該酵母的條件下有 氧培養酵母或使其發酵，測定培養基中的麥芽糖量來評價。糖的測定，可通過本領域技術人 員周知的方法，例如通過使用IR檢測器的液相色譜法來測定。實施例1 :Mal21p和Agtlp在葡萄糖存在下的降解諫度將通過PCR得到的MAL21基因和AGT1基因插入到表達載體pYCGPY中，并轉化到酵 母A152中。在以0.5%的麥芽糖或麥芽三糖為唯一碳源、含有20mg/L尿嘧啶、20mg/L組 氨酸、30mg/L亮氨酸、300y g/ml遺傳霉素的最小必需培養基(MM)中劃線培養轉化株(圖 5)。具有MAL21的菌株只能在麥芽糖培養基中生長繁殖，而具有AGT1的菌株可在麥芽糖、 麥芽三糖的任一種培養基中生長繁殖，這說明只有AGT1可轉運兩種糖。而后，構建編碼在 Agtlp的C末端部串聯連接兩個紅細胞凝集素標簽的融合蛋白的基因、AGT1-2HA，并將其插 入到表達載體PJHXSB中。將MAL61和MAL21也插入到pJHXSB中。將這些載體轉化到酵母 HH1001中。使用兩種轉化株，利用試驗方法項中所示的方法，通過Western印跡法測定葡萄 糖存在下的降解速度。其結果如圖6所示，與Mal61p或Mal21p相比，Agtl_2Hap的半衰期 較短(參照圖6，Agtl-2HAp 14分鐘、Mal61p 25分鐘、Mal21p 118分鐘)。還可獲知，同 樣是a-葡萄糖苷轉運蛋白，但與Mal61p相比，Mal21p具有極長的半衰期(Mal61p :25分 鐘，Mal21p :118 分鐘)。^MM 2 雜交轉運g白的構建禾PI底4勿特牛的石角i人Agtlp 禾口 Mal21p 屬于 MFS (Major facilitated sugar transporter,主要的易化 糖載體)，從其氨基酸序列的類似性來說，認為均具有12個跨膜結構域，N末端和C末端為 細胞質結構域。與Agtlp和Mal21p的底物特異性或活性有關的位點，還不為人所知。從兩 者的氨基酸序列比對來看，認為N末端和C末端細胞質結構域部分的類似性低，中央的12 個跨膜結構域部分的類似性高(參照圖3)。因此，認為中央的12個跨膜結構域部分具有 轉運活性，或者說有可能是決定底物特異性的部分。分別以如下方式通過PCR獲取AGT1和 MAL21基因，S卩，使編碼N末端或C末端細胞質結構域部分、和編碼中央部的12次跨膜結構 域部分的兩端均具有限制性內切酶位點。使用的引物如表3所示，得到的片段和使用的引 物對的關系如表4所示。通過組合上述物質，構建多種雜交的轉運蛋白基因。將使用的重組 位置用圖3中的十字印表示，各雜交體的名稱及模式圖為如圖7所示。詳細內容如試驗方法 中所述。如圖7所示，將插入了各雜交轉運蛋白基因的表達載體pYCGPY轉化到酵母A152 中。在以0.5%的麥芽糖或麥芽三糖為唯一碳源，且含有20mg/L尿嘧啶、20mg/L組氨酸、 30mg/L亮氨酸、300 u g/ml遺傳霉素的最小必需培養基(MM) [MM 無氨基酸酵母氮源6. 7g/ L、5g/L麥芽糖或麥芽三糖、20mg/L組氨酸、30mg/L亮氨酸、20mg/L尿嘧啶、300 u g/ml遺傳 霉素]中劃線培養轉化株(圖8)。由其結果可知，中央部的12次跨膜結構域來自Agtlp的3個雜交轉運蛋白、AAMp.MAMp.MAAp具有轉運麥芽三糖的活性。
表3用于限制性內切酶切割位點導入的引物
(上述的序列分別在序列號23 32中所記載) 表4用于獲得片段的PCR引物對 ^MM 32-脫,氧,抗件將實施例2中記載的雜交轉運蛋白基因用SacI-BamHI從pYCGPY中切出，整合到 pJHXSB的SacI-BamHI位點內。將構建的各個表達載體轉化到HH1001中。HH1001是mal-株 X2180-1A的ura3-姊妹株，因整合有TPIlp :MAL32 (編碼了麥芽糖酶基因)，所以麥芽糖酶 以組成型表達。制備在含有2%麥芽糖的完全合成培養基(SCM)中加入OmM 2mM的2-脫氧葡萄糖(2-D0G)的平板，如試驗方法中所述，測定各轉化株的2-D0G抗性。因2-D0G不能 代謝成2-D0G-6-磷酸以上，所以是不能成為碳源的糖類似物，但已知可引起與葡萄糖同一 水平的葡萄糖阻遏或因葡萄糖而引起失活。因此，在此平板中生長繁殖的菌株很有可能具 有不易因葡萄糖而引起失活的a-葡萄糖苷轉運蛋白。其結果如圖9所示。具有來自MAL21 的N末端細胞質結構域的雜交轉運蛋白MMAp、MAAp，在ImM的2-D0G的培養基中也能生長 繁殖。此外，MAMp在2mM的2-D0G的培養基中也能生長繁殖，與天然型Mal21p同樣具有對 2-D0G的抗性，所以，可知其不易受到葡萄糖的降解誘導。棚列4身■運舶&軍鰣如實施例3中所示，認為具有來自MAL21的N末端細胞質結構域的雜交轉運蛋白 MMAp、MAAp及MAMp不易受到葡萄糖的降解誘導。因此，為確認這一點，用試驗方法中所示的 方法，測定葡萄糖存在下MMAp、MAAp及MAMp的降解速度(圖10)。所有的雜交轉運蛋白均 具有比Agtl-2HAp長的半衰期。特別是MAMp的半衰期是119分鐘，具有與Mal21p (118分) 基本相同的半衰期，改良了因葡萄糖存在而被迅速降解的a-葡萄糖苷轉運蛋白Agtlp，成 功構建了不易被降解的轉運蛋白。1 誦i寸高表汰MAL21的下面啤酒酵母的發泡i酒.汁發酵i式齡將對葡萄糖誘導性降解具有抗性的轉運蛋白MAL21整合到質粒PUP3GLP的 Xbal (或SacI)-BamHI位點內。pUP3GLP如圖14所示。pUP3GLP是Yip型質粒，轉運蛋白基 因通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(TDH3p)表達。在URA3的EcoRV位點切割各質粒后， 將其轉化到下面啤酒酵母(Weihenst印han 194)中，并涂布在含有0. 3 u g/ml環己酰亞胺 的YPG平板(酵母浸膏10 g/L、多聚蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L)上。目的表達盒被插入 到Weihenst印han 194染色體上的URA3基因中，這一點可通過PCR來確認。將Weihenst印han194(URA3: :TDH3p: :MAL21)和親株Weihenst印han 194接種到 兩種發泡酒麥汁中。發泡酒麥汁是在除水之外的原料中麥芽的使用比率低于25%，且使用 了糖化淀粉、啤酒花等的麥汁。發泡酒用麥汁中的一種的初期浸出物濃度為14. 0%，含有組 成比為葡萄糖1. 2%、麥芽糖6. 6%、麥芽三糖2. 2%的糖。另一種富含葡萄糖的發泡酒麥汁 的初期浸出物濃度為15. 6%，含有組成比為葡萄糖4. 7%、麥芽糖5. 4%、麥芽三糖1. 7%的 糖。各發泡酒麥汁，分別通過在等量麥汁(最終濃度、麥芽比率低于25%)中添加糖組成不 同的糖化淀粉來制備。在各發泡酒麥汁中加入濕菌體，使其成為7. 5g/L，并15°C下進行發 酵，測定發酵中酒醪的麥芽糖濃度。其結果如圖11所示。在任一發泡酒麥汁中，MAL21高表達株的麥芽糖分解速度均顯著快于親株 ffeihenstephan 194。特別是富含葡萄糖的發泡酒麥汁，其效果顯著。初期浸出物濃度高是 指葡萄糖濃度高，這充分體現了轉運蛋白對葡萄糖誘導性降解具有的抗性效果。因此，例如 從圖10及圖11的結果中可看出，導入了雜交轉運蛋白MAAp或MAMp的酵母，在高濃度單糖 (例如葡萄糖等)時促進麥芽三糖分解的效果十分值得期待。產業上的可利用性如上所述，發現a-葡萄糖苷轉運蛋白Agtlp與其他a-葡萄糖苷轉運蛋白相比， 在葡萄糖存在下的半衰期短。且還發現，同樣是a-葡萄糖苷轉運蛋白，Mal21p與Mal61p 不同，Mal21p不易因葡萄糖存在而發生降解。構建了 6種雜交轉運蛋白，結果發現中央的 12次跨膜結構域是Agtlp型的雜交轉運蛋白AAMp、MAAp及MAMp均轉運麥芽三糖。且還發
19現，與Agtlp相比，N末端的細胞質結構域是Mal21p型的雜交轉運蛋白MAAp、MMAp及MAMp， 均在葡萄糖存在下不易發生降解。其中，具有Mal21p的N末端和C末端細胞質結構域，只 有中央的12次跨膜結構域是Agtlp型的雜交轉運蛋白MAM，具有與Mal21p同等的長半衰 期，且轉運麥芽三糖，所以，如使用表達突變型轉運蛋白的酵母(不論是實驗室株還是釀造 用酵母)，可加快醪液中的麥芽三糖等轉運蛋白可轉運的糖的分解。特別是在葡萄糖等單糖 濃度高時更為有效。
權利要求
多核苷酸，其是編碼具有葡萄糖誘導性失活/降解抗性的轉運蛋白的多核苷酸，其特征在于，包含由以下(a)～(d)中任一項所述的多核苷酸組成的12次跨膜結構域編碼區、且使5′端序列和/或3′端序列與異種多核苷酸重組而成，(a)多核苷酸，其由序列號3的第307～1659位堿基序列或序列號5的第283～1641位堿基序列組成；(b)多核苷酸，其是編碼序列號4的第103～553位氨基酸序列或序列號6的第95～547位氨基酸序列的多核苷酸；(c)多核苷酸，其是編碼序列號4的第103～553位氨基酸序列中或序列號6的第95～547位氨基酸序列中1～10個氨基酸發生缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的多核苷酸；及(d)多核苷酸，其是編碼與序列號4的第103～553位氨基酸序列或序列號6的第95～547位氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其中，異種多核苷酸序列是序列號1的12次跨膜結 構域的5'端序列和/或3'端序列。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其中，12次跨膜結構域編碼區與5'端序列的重組位 置在12次跨膜結構域的預測TMD1編碼區內，12次跨膜結構域與3'端序列的重組位置在 從12次跨膜結構域的預測TMD12編碼區起始位置到預測TMD12編碼區終止位置后向3 ‘端 的96個堿基以內的區域內，且在與序列號2和序列號4的對應氨基酸序列具有80%以上同 一性的區域內。
4.如權利要求1所述的多核苷酸，其中，12次跨膜結構域編碼區與5’端序列的重組位 置在從序列號1或序列號5的第175位堿基到預測TMD1編碼區終止位置的區域內；12次 跨膜結構域編碼區與3'端序列的重組位置在從預測TMD12編碼區起始位置到預測TMD12 編碼區終止位置后向3'端的180個堿基以內的區域內。
5.如權利要求1 4中任一項所述的多核苷酸，其中，包含由序列號13、15或17的堿 基序列組成的多核苷酸。
6.如權利要求1 4中任一項所述的多核苷酸，其中，包含編碼由序列號14、16或18 的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
7.如權利要求1 6中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
8.蛋白質，是由權利要求1 7中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
9.載體，其是包含權利要求1 7中任一項所述多核苷酸的載體。
10.轉化酵母，其是導入有權利要求9所述載體的轉化酵母。
11.如權利要求10所述的釀造用酵母，其是通過導入權利要求9所述的載體，提高了低 聚糖分解能力的釀造用酵母。
12.如權利要求11所述的釀造用酵母，其是通過增加權利要求8所述的蛋白質的表達 量，提高了低聚糖分解能力的釀造用酵母。
13.酒類的制造方法，其中，使用了權利要求10 12中任一項所述的酵母。
14.如權利要求13所述的酒類的制造方法，其中，所釀造的酒類是麥芽飲料。
15.如權利要求13所述的酒類的制造方法，其中，所釀造的酒類是葡萄酒。
16.酒類，其是用權利要求13 15中任一項所述方法制造的酒類。
全文摘要
本發明涉及可加快麥汁等中所含有的麥芽糖、麥芽三糖分解的α-葡萄糖苷轉運蛋白等。特別是本發明涉及因葡萄糖而引起失活/降解的AGT1和MAL21等α-葡萄糖苷轉運蛋白，通過AGT1與MAL21的雜交，不易因葡萄糖而引起失活/降解，且可與AGT1同樣轉運麥芽三糖。例如通過使用本發明的表達α-葡萄糖苷轉運蛋白的酵母，可加快含有麥芽糖/麥芽三糖等低聚糖的醪液的發酵速度。
文檔編號C12C11/00GK101861388SQ200880000649
公開日2010年10月13日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者大村文彥, 畠中治代 申請人:三得利控股株式會社