植物中的蛋白生產的制作方法

專利名稱：：植物中的蛋白生產的制作方法
技術領域：
：本發明涉及在植物中生產蛋白的方法。本發明還提供可用于在植物中生產蛋白的核苷酸序列。本發明的目標是提供一種在植物中生產蛋白的改進方法。本發明提供一種在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(A)，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以獲得經修剪的植物或所述植物的經修剪部分，ii)將與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接的編碼目的蛋白的一種或多4種核酸序列以瞬時方式引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中，禾口iii)將所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。所述目的蛋白可為抗體、抗原、疫苗或酶。本發明還涉及上文所述方法，其中在所述引入步驟(步驟ii)中，兩種或兩種以上的核酸序列可被引入所述植物中。此外，所述兩種或兩種以上的核酸序列之一可編碼沉默抑制子。例如，所述沉默抑制子可為HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV_p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。本發明還包括上文所述方法，其中在所述引入步驟(步驟ii)中，可用農桿菌(agronacteri咖)將一種或多種核酸序列引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。所述農桿菌可在真空下或通過使用注射器被引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。此外，在上述引入步驟(步驟ii)中，所述調控區包括一種來自光合基因的啟動子。例如，所述調控區可包括質體藍素啟動子，質體藍素3'UTR轉錄終止序列，或既包括質體藍素啟動子又包括3'UTR轉錄終止序列。本發明還涉及一種在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(B)，包括i)以瞬時方式引入一種或多種編碼目的蛋白的核酸序列，所述核酸序列與在所述植物或所述植物的一部分中有活性的來自光合基因的調控區可操作地連接，禾口ii)將所述植物或所述植物的一部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。所述目的蛋白可為抗體、抗原、疫苗或酶。本發明還涉及上文所述方法(B)，其中在所述引入步驟(步驟i)中，兩種或兩種以上的核酸序列被引入所述植物中。此外，所述兩種或兩種以上的核酸序列之一可編碼沉默抑制子。例如，所述沉默抑制子可為HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。本發明還包括上文所述方法(B)，其中在所述引入步驟(步驟i)中，一種或多種核酸序列可用農桿菌引入所述經修剪的植物或所述植物的經剪部分中。所述農桿菌可在真空下或通過使用注射器被引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。此外，在上述引入步驟(步驟ii)中，所述調控區包括一種來自光合基因的啟動子。例如，所述調控區可包括質體藍素啟動子，質體藍素3'UTR轉錄終止序列，或既包括質體藍素啟動子又包括3'UTR轉錄終止序列。本發明還提供一種在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(方法C)，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以獲得經修剪的植物或所述植物的經修剪部分，ii)以瞬時方式引入一種或多種編碼目的蛋白的核酸序列，所述序列與在所述植物或所述植物的一部分中有活性的來自光合基因的調控區可操作地連接，禾口iii)將所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分保持在允許編碼所述目的蛋5白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。所述目的蛋白可為抗體、抗原、疫苗或酶。本發明還涉及上文所述方法(C)，其中在所述引入步驟(步驟ii)中，兩種或兩種以上的核酸序列被引入所述植物中。此外，所述兩種或兩種以上的核酸序列之一可編碼沉默抑制子。例如，所述沉默抑制子可為HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVpl9、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV_p23、GLRaV-2p24、GBV_pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。本發明還包括上文所述方法(C)，其中在所述引入步驟(步驟ii)中，一種或多種核酸序列可用農桿菌引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。所述農桿菌可在真空下或通過使用注射器被引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。此外，在上述引入步驟(步驟ii)中，所述調控區包括一種來自光合基因的啟動子。例如，所述調控區可包括質體藍素啟動子，質體藍素3'UTR轉錄終止序列，或既包括質體藍素啟動子又包括3'UTR轉錄終止序列。本發明提供一種用瞬時表達系統于在植物中驅動目的蛋白表達的簡化植物表達系統。根據本文所述的方法，目的蛋白可獲得高產。本文所述的瞬時共表達系統避免了現有技術(例如Bakker，2005)所述的長生產時間，以及原種突變或糖工程轉基因系的選擇過程及其作為親本品系的應用。這也同時避免了突變或糖工程植物在生產力、花粉生產、種組(Bakkeretal2005)和生存力(Boissonetal.，2005)的方面中經常遇到的問題。本文所述的瞬時轉移系統達到每千克葉重含1.5g高質量抗體表達水平，超過有報道的在任何使用其他表達系統(包括多病毒基系統和轉基因植物)的植物中的抗體累積表達水平。如本文所述，在所需核酸構建體浸潤之前，將植物修剪至可觀察到表達水平(以總合成蛋白的％表示)和產量(每kg鮮重的蛋白mg數)有所增加。這是用包括但不限于注射器浸潤或真空浸潤的若干浸潤方法觀察到的。多種修剪方法例如但不限于機械修剪或化學修剪都增加了表達水平和蛋白產量。使用來自光合基因的調控區，例如但不限于來自編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大/小亞基或者質體藍素的基因的調控區，或者使用來自光合基因的調控區被發現可增加表達水平和產量。此外，發現使用結合光合基因的調控區和修剪可增加表達水平和蛋白產量。浸潤技術允許在小型試驗設備中每天生產數量以克計的此抗體，這允許使用這種瞬時表達系統在極短的時限內生產臨床試驗材料和在每年為規模多至千克級別的市場提供特許產品。單次親和色譜步驟后可從被浸潤的葉子中獲得高質量抗體。此發明的內容并不必描述本發明的所有方面。本發明的這些和其他方面會通過下面對附圖的描述更加清楚，其中圖1A示出了為表達若干蛋白而裝配的表達盒的實例。R612包括都處于一個質體藍素啟動子和5'UTR控制下的編碼C5-1LC和C5-1HC的核苷酸序列，以及一個質體藍素終止子。R610包括都處于一個質體藍素啟動子和5'UTR控制下的編碼C5-1LC和C5-1HC-KDEL的核苷酸序列，以及一個質體藍素終止子。R514包括都處于2X35S煙草蝕紋病毒(TEV)啟動子前導序列控制下的編碼C5-1LC(C5-1LC:C5-1輕鏈編碼序列)和C5-1HC的核苷酸序列，以及一個N0S終止子；C5-1LC:C5-1輕鏈編碼序列；C5-1HC:C5_1重鏈編碼序列。935包括都處于一個質體藍素啟動子和5'UTR控制下的編碼人IgG-LC和人IgG-HC的核苷酸序列，以及一個質體藍素終止子。312包括處于一個質體藍素啟動子和5'UTR控制下的編碼流感抗原的核苷酸序列，以及一個質體藍素終止子。圖1B示出了所述質體藍素啟動子和5'UTR的核苷酸序列(SEQIDNO:19)，其中轉錄起始位點以粗體表示，翻譯起始位點以下劃線標出。圖1C示出了所述質體藍素3'UTR和終止子的的核苷酸序列(SEQIDNO:20)，其中終止位點以下劃線標出。圖1D示出了用于R512和R513裝配(assembly)的中間質粒中的2X35S(SEQIDNO:33)和N0S(SEQIDNO:34)序列。NOS終止子(SEQIDNO:34)以斜體示出；2X35S啟動子以粗體表示(SEQIDNO:33)。限制酶切位點以下劃線標出。圖2示出了用各種表達盒浸潤的本氏煙草(Nicotianabenthamiana)葉中C5-1抗體的積聚。圖2A示出了在有或沒有共表達沉默抑制子如HcPro的情況下，注射器浸潤R514(35S基表達盒)、R610和R612(質體藍素基表達盒)后產生的C5_l抗體的積聚情況。圖2B示出了在有或沒有共表達沉默抑制子(如HcPro)的情況下，用R610和R612(質體藍素基表達盒)在真空浸潤或注射器浸潤的葉子中產生的C5-1抗體的積聚情況。所示值對應對3個植物(注射器)的6次測量或對約12個植物(250g)的各個浸潤批次的6次測量的平均積聚水平和標準偏差。圖3示出了對注射器和真空浸潤植物的提取物中C5-l積聚的蛋白印跡分析。圖3A示出了用過氧化物酶綴合的羊抗鼠IgG(H+L)對用R612(用于分泌，泳道l)或用R610(用于內質網滯留，泳道2)浸潤的植物的提取物的免疫印跡。Cl:100ng商品化小鼠IgGl(SigmaM9269)，上樣作為電泳遷移率對照；C2:12iig從假浸潤生物質(空載體)中提取的總蛋白。C3:加入(spike)到12iig從假浸潤的生物質(空載體)中提取的總蛋白中的100ng商品化小鼠IgGl(SigmaM9269)。圖3B示出了用過氧化物酶綴合的人IgG對用R612(用于分泌，泳道l)或用R610(用于內質網滯留，泳道2)浸潤的植物的提取物的活性免疫印跡。Cl:2yg從雜交瘤細胞(Khoudietal.，1999)中純化的對照C5-1;C2:75yg從假浸潤的生物質(空載體)中提取的總蛋白。圖4示出了對從用R612(用于分泌，泳道1)或R610(用于內質網滯留，泳道2)浸潤的植物中純化的抗體的分析。圖4A顯示在非還原條件下對粗提取物和純化抗體進行的SDS-PAGE。圖4B顯示在還原條件下對純化抗體進行的SDS-PAGE。圖4C顯示用過氧化物酶綴合的人IgGl進行純化抗體的活性免疫印跡。圖4D示出了對從不同浸潤批次純化的6組C5-l中污染物的比較。C:2.5iig商品化小鼠IgGl(SigmaM9269)，上樣作為電泳遷移率對昭。圖5A示出了用于天然(R622)和雜交(R621)形式的半乳糖基轉移酶的表達裝配的盒實例的示意圖。GNTI-CTS:N-乙酰葡萄糖胺轉移酶I的CTS結構域；GalT-CAT:人P-l，4-半乳糖基轉移酶的催化結構域；GalT:人P-l，4-半乳糖基轉移酶。圖5B示出了GalT(UDP-Gal:betaGlcNacP_1，4_半乳糖基轉移酶多肽1;P_1，4_半乳糖基轉移酶I)的核苷酸序列(SEQIDN0:14)，其中ATG起始位點以下劃線標出；跨膜結構域以下劃線和斜體表示；粗體序列對應人P-l，4-GalT的催化結構域；FLAG表位以斜體表示。圖5C示出了GalT(UDP-Gal:betaGlcNacP_1，4_半乳糖基轉移酶多肽1;P_1，4_半乳糖基轉移酶I)的氨基酸序列(SEQIDNO:15)。跨膜結構域以下劃線和斜體表示；粗體序列對應人13-1，4-GalT的催化結構域；FLAG表位以斜體表示。圖5D示出了GNTIGalT的核苷酸序列(SEQIDN0:17)，其中ATG起始位點以下劃線標出；跨膜結構域(CTS)以下劃線和斜體表示；粗體序列對應人P-l，4-GalT的催化結構域；FLAG表位以斜體表示。圖5E示出了GNTIGalT的氨基酸序列(SEQIDNO:18)。跨膜結構域(CTS)以下劃線和斜體表示；粗體序列對應人P-l，4-GalT的催化結構域；FLAG表位以斜體表示。圖5F示出了N_乙酰葡萄糖胺轉移酶(GNT1;SEQIDNO:21)的CTS結構域(胞質尾區，跨膜結構域，干區)。圖5G示出了CTS的氨基酸序列(SEQIDNO:22)。圖6示出了來自表達C5-1的植物并進行了蛋白質染色或蛋白質印跡分析的提取物的圖。頂圖示出了考馬斯染色的PAGE凝膠。上數第二圖示出了用與P-l，4-半乳糖特異性結合的雞冠剌桐凝集素(Erythrinacristagaliagglutinin,ECA)進行的親和檢測。上數第三圖示出了用抗_a1，3-巖藻糖抗體進行的蛋白印跡分析。底圖示出了用抗_131，2_木糖特異抗體進行的蛋白印跡分析。R612:C5-1單獨表達；R612+R622:C5_1與GalT共表達(共浸潤);R612+R621:C5_1與GNTl-GalT共表達。圖7示出了機械或化學修剪對表達的影響的實例。圖7A示出了在真空農桿菌浸潤植物中修剪(包括浸潤之前12小時的機械修剪和浸潤之前7天的化學修剪)對抗原表達(流感表達，參見圖1，312)的影響。圖7B示出了在真空農桿菌浸潤植物中浸潤之前12小時的機械修剪對抗體表達(人IgG，參見圖1，935)的影響。圖7C示出了在注射器農桿菌浸潤植物中機械修剪對抗原(流感，參見圖1，312)表達的影響；條件1:對照，未修剪植物；條件2:機械修剪的植物。圖8示出了在真空農桿菌浸潤植物中，轉化當天，轉化之前3、2或1天的修剪(機械修剪)或未修剪(對照)對抗原積聚(流感抗原)的影響的實例。圖9示出了在真空浸潤植物中沉默抑制子(HcPro)和修剪(浸潤之前12小時的機械修剪)對抗體表達(人IgG，參見圖1，935)的綜合作用的實例。Plasto-HcPro-修剪935單獨表達(不修剪，無沉默抑制子的共表達)；Plasto-HcPro+修剪用935轉化之前12小時的機械修剪(無沉默抑制子的共表達)；Plast0+HCPr0-修剪935和HcPro的共表達(沉默抑制子；不修剪)；Plasto+HcPro+修剪935和HcPro共表達之前12小時的機械修剪。具體實施例方式本發明涉及在植物中生產蛋白的方法。本發明還提供可用于在植物中生產蛋白的核苷酸序列。本發明提供一種在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(A)。在其基本形式中，所述方法包括以瞬時方式引入一種或多種編碼目的蛋白的核酸序列，所述序列與在所述植物或所述植物的一部分中有活性的來自光合基因的調控區可操作地連接，并將所述植物或所述植物的一部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。所述方法可進一步包括，首先修剪所述植物或所述植物的一部分，然后引入編碼目的蛋白的一種或多種核酸序列。在此方法中，在修剪所述植物或所述植物的一部分之后，將與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接的編碼目的蛋白的一種或多種核酸序列以瞬時方式引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。然后將所述植物或所述植物的一部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。當將使用這種方法生產所述目的蛋白與用不包括使用來自光合基因的調控區或修剪步驟或兩者都不包括的相似瞬時轉化方法生產相同目的蛋白進行比較時，可發現使用所述方法可獲得高產量的所述目的蛋白。已發現設計用于穩定的轉基因表達系統的表達盒中所用的啟動子在用于瞬時表達系統時效率較低(Giritchetal.2006，Fisher，1999a)。Giritchetal(12206)顯示使用每種IgG亞基的不同載體(一種基于TMV，另一種基于PVX)的共表達，連同一種重組酶和兩種病毒復制酶可獲得范圍在200mg/kg之內的表達水平。如本文所述，已經發現包括葉表達效率已知的增強子序列的啟動子在瞬時表達中是有效的。一個非限制性的實例包括用于調控質體藍素表達的啟動子(PweeandGray1993，其以引用的方式納入本文中)。不希望受理論約束，光合基因的上游調控元件與核基質的連接可介導強表達(Sandhuetal.，1998;Chuaetal.，2003)。例如從豌豆質體藍素基因的翻譯起始位點向上游多至784的序列可用于介導強報告基因表達。依照本發明，可使用光合基因的調控區，例如但不限于來自質體藍素的調控區(US7，125，978，其以引用的方式納入本文中)或者來自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的調控區(US4，962，028，其以引用的方式納入本文中)，葉綠素a/b結合蛋白(CAB;Leutwileretal.，1986，其以引用的方式納入本文中)，ST-LS1(與光合系統II的放氧復合物締合；Stockhausetal.1989，其以引用的方式納入本文中)。人們發現來自編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大/小亞基或者質體藍素的基因的調控區，或者使用來自光合基因的調控區與修剪，可增加表達水平和產量。例如，如圖2A所述，由所述光合啟動子(來自質體藍素；參見圖2A，R610，R612)驅動的目的編碼區浸潤后的表達水平與由35S驅動的相同編碼序列相比更高。因此，本發明提供一種在植物或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(A)，包括i)以瞬時方式引入一種或多種編碼目的蛋白的核酸序列，所述序列與在所述植物或所述植物的一部分中有活性的來自光合基因的調控區可操作地連接，禾口ii)將所述植物或所述植物的一部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。可在引入一種或多種核酸序列的步驟之前修剪所述植物或所述植物的一部分。已經發現在所需核酸構建體浸潤之前，修剪植物可增加表達水平(以總合成蛋白的％表示)和產量(每kg鮮重的蛋白mg數)。這是使用若干浸潤方法(包括但不限于注射器浸潤或真空浸潤)和各種修剪方法(例如但不限于機械修剪或化學修剪)觀察到的。不希望受理論約束，浸潤前修剪可導致生長頂端優勢的喪失，并可導致生長劑如赤霉酸或乙烯含量的減少。這轉而可剌激葉中光合能力增加和光合基因轉錄速率增加。因此使用來自光合基因的調控區可導致更高的蛋白產量。此外，結合使用來自光合基因的調控區和降低生長抑制劑(如乙烯或赤霉酸)含量的化學修剪可導致更高的蛋白產量。根據本文所述的方法，通過使用機械或化學修剪方法，和真空或注射器浸潤可觀察到修剪對目的蛋白產量增加的影響。當例如注射器浸潤之后損傷所述植物時，可觀察到由于修剪導致的的產量增加(參見圖7C)。這表明，蛋白表達的增加不僅是對植物損傷的應答。修剪是指去除一個或多個腋芽、一個或多個頂芽、或者既去除一個或多個腋芽又去除一個或多個頂芽。修剪也可包括殺死、誘死或只降低頂芽和腋芽的生長而不將所述芽從植物上去除。所述芽的生長的降低(或降低芽生長)是指所述芽與未經處理的芽相比在例如代謝活性、或限定時間內大小增長上表現出約50-100%，或其間任何量的降低。修剪也可通過采用降低頂端優勢的化合物實現。如果出于修剪的目的使用化合物，那么所使用的劑量一般為所述化合物的廠商推薦的劑量。修剪(機械或化學修剪)可在浸潤之前約20天到浸潤之后約2天或其間任何時間，例如浸潤之前約7天(168小時)到浸潤之后約2天(48小時)或其間任何時間，例如浸潤之前約48小時(2天)到浸潤后約1天(24小時)或其間任何時間，或者從浸潤之前約20天、19天、18，天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天或168、144、120、96、72、60、50、40、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1小時到浸潤之后約1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時或其間任何時間進行。如果修剪發生在浸潤之前72小時或更早，那么所述修剪方法優選化學修剪，因為使用機械修剪方法可發生再生。如果所述修剪方法為化學修剪，那么可在浸潤之前采用更長的浸潤前時間，例如2、3、4、5、6或7天，或其間任何時間。技術人員可容易地確定修建之前的適合間隔。修剪可通過本領域技術人員所知的任何方法實現，所述方法包括但不限于所述芽的機械去除，例如但不限于切下、剪下、摘心、擠壓(例如使用鉗子等)，以及局部冷凍(例如將液氮流局部引到所述芽上或用已被合適冷源冷卻的鉗子或其他設備環繞所述芽，所述冷源包括液氮、干冰、乙醇干冰、冰等，從而使所述芽的溫度降低以降低所述芽的生長或將所述芽殺死)。修剪還包括化學修剪，例如，采用殺死或降低所述芽生長的除草劑(化合物；修剪劑)，或采用殺死或降低所述芽生長的生長調節劑。使用化學修剪是一種修剪處理的有效方式，可通過將化合物噴涂、霧濺、浸泡在植物上，或將植物浸在含有所述化合物的溶液中而容易地處理所述植物。植物可在浸潤步驟之前被處理一次或多次。可以使用的化合物的實例包括但不限于除草劑例如植物生長調節劑乙烯利(Eth印hon)(如Bromeflor、Cerone、Chloreth印honEthrel、Florel、Prep禾口Flordimex)、比久(Daminozide)(丁二酸單_2，2-二甲肼、琥珀酸_2，2-二甲酰肼、如B-nine、Alar、Kylar、SADH、B-nine、B-995、丁酰肼(aminozide))、Atrimmec(舌夂草克納(dikegulacsodium))、馬來酉先月井(maleichydrazide)(1，2-二氫-3，6-噠嗪二酮)、2-4-D(2，4-二氨苯氧乙酸)，并包括赤霉酸合成抑制劑，例如但不限于Cycocel(矮壯素(chlormequatchloride))、A-Rest(嘧啶醇)、三唑類，例如Bonzi(多效唑(paclobutrazol))、S麗gic(烯效P坐(uniconazole))或3-氨基-l，2，4三唑(3-AT)。這些化合物可在用于植物生長改良的已知劑量范圍內使用，例如所用的劑量范圍可為所述化合物廠商推薦的劑量。這些化合物也可在低于用于植物生長改良的已知劑量的劑量范圍內使用，例如所用的劑量范圍可為所述化合物廠商推薦的劑量的75%、50%、25%、10%。根據所選生長調節劑，這些化合物的使用劑量可以從約0.2ppm到約5000卯m，和其間任何量。此外，所述修剪劑(化合物)可被使用一次，或按需要補充使用。例如，所10述化合物可被使用一次，或可被使用多次，以在浸潤之前或之后對所述植物進行化學修剪。如果使用化學修剪，那么可從浸潤之前約20天到浸潤之后約12天或其間任何時間使用所述化合物，例如在浸潤之前14天、7天或5天有效地使用化合物。如圖7A、7B、7C、8和9所示，浸潤之前修剪植物導致所述目的蛋白表達的增加。使用機械或化學修剪都可觀察到此效果。因此，本發明提供一種在植物或植物的一部分中合成目的蛋白的方法，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以獲得經修剪的植物或所述植物的經修剪部分，ii)將與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接的編碼目的蛋白的一種或多種核酸序列以瞬時方式引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中，禾口iii)將所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。編碼所述目的蛋白的核酸序列可通過任何本領域技術人員所知的合適方法被引入所述植物或所述植物的一部分中，例如通過，不應被視為限制的，真空浸潤或注射器浸潤。真空浸潤方法是本領域已知的，可包括但不限于K即ilaetal.(1997)所述的方法，此文獻以引用的方式納入本文中。浸潤還指使用注射器浸潤將編碼所述目的蛋白的核酸序列引入植物或植物的一部分中(LiuandLomonossoff，2002，其以引用的方式納入本文中)。本發明所用方法和前人所述方法(例如Kapilaetal.，1997或LiuandLomonossoff，2002)在含有乙酰丁香酮的培養基中培養農桿菌，以用于瞬時轉化。已知乙酰丁香酮或其他苯酚信號分子可正向調控農桿菌的毒性機制(virmachinery)。當將農桿菌在存在或缺少乙酰丁香酮的條件下培養時，觀察到了本文所述目的蛋白的表達水平的增加。轉錄后基因沉默(PTGS)可參與限制植物中轉基因的表達，馬鈴薯病毒Y的沉默抑制子(HcPro)的共表達可用于減少轉基因mRNA的特異性降解(Brignetietal.，1998)。備選的沉默抑制子為本領域所熟知，并可如本文所述使用(Chibaetal.，2006，Virology346:7-14，其以引用的方式納入本文中)，例如但不限于TEV-pl/HC-Pro(煙草蝕紋病毒-pl/HC-Pro)、BYV-p21、番茄叢矮病毒的P19(TBSVp19)、番茄皺縮病毒的衣殼蛋白(TCV-CP)、黃瓜花葉病毒的2b(CMV-2b)、馬鈴薯X病毒的p25(PVX-p25)、馬鈴薯M病毒的pll(PVM-pll)、馬鈴薯S病毒的pll(PVS-pll)、藍莓枯黃病毒的pl6(BScV-p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)、葡萄巻葉伴隨病毒2的p24(GLRaV_2p24)、葡萄A病毒的pl0(GVA-p10)、葡萄B病毒的pl4(GVB-p14)、獨活潛隱病毒的p10(HLV-p10)、或者大蒜普通潛隱病毒的pl6(GCLV-p16)。因此，沉默抑制子，例如但不限于，HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-p10、GCLV-pl6或GVA-p10，可與編碼所述目的蛋白的核酸序列共表達以進一步確保植物內蛋白生產的高水平。如圖9所示，沉默抑制子與編碼所述目的蛋白的核酸序列的共表達導致所述目的蛋白的產量明顯增加。如果在浸潤之前修剪植物，也能觀察到所述效果。因此，本文所述的合成目的蛋白的方法可包括將兩個或兩種以上的核酸序列引入所述植物或所述植物的一部分中。例如，所述兩種或兩種以上的核酸序列之一可編碼沉默抑制子。為舉例說明目的蛋白的高產方法，本發明描述了一種驅動目的蛋白(如復合蛋白，例如抗體)表達的植物表達系統。復合蛋白在農桿菌浸潤植物例如本氏煙草(Nicotianabenthamiana)中的表達產生了達到1.5g/kgFW(約25XTSP)的蛋白水平。所述目的蛋白的分泌和內質網滯留形式分別達到了558和757mg/kg/FW的平均水平。在所提供的非限制性實施例中，所獲得的這種抗體表達水平為用多病毒瞬時表達系統生產的抗體的表達水平的3倍(Giritchetal.2006)，并遠高于非病毒性農桿菌浸潤表達系統的水平(如V卿eroetal.1999)。在本文所提供的不應被看作限制性的實施例中，所述抗體包括較少巖藻糖基化、木糖基化以及同時巖藻糖基化和木糖基化J-聚糖的修飾糖基化模式。植物和一般哺乳動物之間N-糖基化不同的影響是圍繞用植物進行治療藥物生產的概念的關注重點。植物-特異性聚糖的存在可有助于縮短植物生產蛋白在血液中的半衰期，或者相同聚糖會在患者中引起超敏反應。在這種方式，所述目的蛋白可以高產量被生產并缺少可引起超敏反應或參與過敏反應的聚糖。然而，應理解，本文所述的瞬時蛋白生產方法可用于任何目的蛋白，包括不含修飾糖基化的蛋白。本發明描述了一種在特征為具有修飾糖基化模式的植物中合成目的蛋白的方法。所述方法包括目的蛋白連同表達人P-l，4-半乳糖基轉移酶(hGalT，也稱為GaltT;SEQIDNO:14)的核苷酸序列的共表達。hGalT也可與N-乙酰葡萄糖胺轉移酶(GNT1;SEQIDNO:21，圖5f;氨基酸SEQIDN0:22，圖5g)的CTS結構域融合以產生GNTl-GalT雜交酶，所述雜交酶與所述目的蛋白共表達。使用雜交GNTl-GalT序列可將hGalT的催化結構域定位到其中存在復合N_聚糖成熟的早期階段的順面高爾基體中。所述目的蛋白也可與包含與GalT融合的CTS結構域的雜交酶如GNTl-GalT(R621;圖5a;SEQIDNO:18，由SEQIDN0:17編碼)共表達。然而，如果目的蛋白包含低水平的巖藻糖基化，然而卻仍然需要包含木糖基化和半乳糖基化的蛋白，那么，GalT可與所述目的蛋白共表達。目的蛋白的"修飾糖基化"是指包含修飾糖基化的所述目的蛋白的N-聚糖譜(profile)(例如，如本文所述)與野生型植物產生的目的蛋白的N-聚糖譜不同。糖基化修飾可包括所述目的蛋白一種或多種聚糖的增加或減少。例如，所述目的蛋白可顯示木糖基化減少、巖藻糖基化減少，或者同時顯示木糖基化和巖藻糖基化都減少。或者，所述目的蛋白的N-聚糖譜可以這樣一種方式被修飾，所述方式可使得半乳糖苷化的數量增加，并且任選地，木糖基化減少、巖藻糖基化減少或者木糖基化和巖藻糖基化均減少。此外，當生產復合目的蛋白時，其核苷酸序列可編碼一種以上所述復合蛋白的肽或結構域。例如，如果所述目的蛋白是一種抗體，則其核苷酸序列可包含兩種核苷酸序列，其中每種序列均編碼所述抗體的一部分，例如一種核苷酸序列可編碼抗體輕鏈，第二種序列編碼抗體重鏈。圖1給出了這種構建體的非限制性實例，其中構建體R612和R610的每一個都包括兩種核苷酸序列，其中一個編碼與在植物中有活性的調控區(例如但不限于US7，125,978中所述的質體藍素啟動子，所述文獻以引用的方式納入本文中)可操作地連接的C5-1LC(C5-1的輕鏈)，第二個編碼與在植物中有活性的調控區(例如但不限于所述質體藍素啟動子，US7，125，978，所述文獻以引用的方式納入本文中)可操作地連接的C5_l的重鏈(C5-1HC)。如圖1所示，對于R610，KDEL序列可與肽2A或2B之一的C末端區融合，例如，但不應被看做限制性的，所述KDEL序列可與所述抗體的重鏈融合以確保所述抗體被內質網滯留。由所述核苷酸序列編碼的每種蛋白都可被糖基化。對用瞬時表達生產的純化產物的考馬斯染色顯示存在多種低豐度的雜質。這些片段似乎是產物相關的，并且所有70kDa以上的雜質都含有至少一個Fab，如活性印跡所示(圖3B)。植物提取物中存在的產物相關的雜質的成分和含量與在哺乳動物細胞生成系統中觀察到的那些類似。因此，一般用于治療性抗體純化的純化步驟(例如陰離子交換、親和與陽離子交換)可容易地獲得調控機構對治療用途的蛋白所要求的純度。如圖6所示，通過使用本文所述的方法，可生產表現修飾糖基化譜的目的蛋白。例如，當目的蛋白與GNTl-GalT共表達時，產生具有免疫遺傳學上不可檢測的巖藻糖或木糖殘基的目的蛋白。對目的蛋白的表位的MALDI-T0F分析表明，當目的蛋白與GalT或GNTl-GalT共表達時，可獲得具有修飾糖基化模式的目的蛋白。所述植物、所述植物的一部分或植物材料可用作飼料，可對所述植物或所述植物的一部分進行最低程度的加工，或者所述目的蛋白可從所述植物或所述植物的一部分中提取出來，并且如果需要的話，所述可用標準方法分離和純化所述目的蛋白。可對編碼所述目的蛋白的核苷酸序列進行額外修飾以確保高產量。編碼所述目的蛋白的核酸序列也可與編碼這樣一種活性序列的序列(例如但不限于，KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)或其他已知的ER滯留序列，如HDEL)融合，所述活性序列將所述蛋白滯留在內質網(ER)中。本文所述的蛋白生產的方法可包括使用可用作生產目的蛋白的"平臺"的植物。例如，所述平臺植物一般以穩定的方式表達一種或多種以某種方式修飾所述目的蛋白生產的蛋白，例如，產生具有修飾N-糖基化的目的蛋白。例如，所述平臺植物可表達一種或多種編碼GalT、GNTl-GalT、或GalT和GNTl-GalT的第一種核苷酸序列。為生產所述目的蛋白，在修剪所述植物形成平臺植物或平臺植物的一部分后，用瞬時轉化將編碼所述目的蛋白的第二種核苷酸序列引入所述平臺植物中，然后所述第二種核苷酸序列被表達從而產生的所述目的蛋白，在這種情況下包含具有修飾的N-糖基化的聚糖。然而應理解，可根據需要使用穩定表達其他蛋白的平臺植物用于修飾所述目的蛋白。所述植物或所述植物的一部分可用作飼料，或者可對所述植物或所述植物的一部分進行最低程度的加工，或者所述目的蛋白可從所述植物或所述植物部的一分中提取出來，并且如果需要的話，所述可用標準方法分離和純化所述目的蛋白。本發明提供一種用平臺植物或平臺植物的一部分表達具有修飾糖基化的目的蛋白的方法，所述平臺植物或平臺植物的一部分包括編碼GalT、GNTl-GalT、GalT和GNTl-GalT的核苷酸序列或它們的組合，其中每種序列都與在所述平臺植物中有活性的調控區可操作地連接。所述平臺植物或平臺植物的一部分因此可用于表達編碼一種或多種目的蛋白的第二種核苷酸序列，所述第二種核苷酸序列與一個或多個在所述平臺植物中有活性的第二調控區可操作地連接。對所述第一種核苷酸序列、第二種核苷酸序列或第一種核苷酸序列和第二種核苷酸序列進行密碼子優化，以在所述平臺植物或平臺植物的一部分中表達。所述方法包括，首先修剪所述平臺植物或所述平臺植物的一部分。修剪后，將與在所述植物中有活性的調控區可操作地連接的編碼目的蛋白的一種或多種核酸序列以瞬時方式引入所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分中。然后將所述植物或所述植物的一部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。對編碼目的蛋白或修飾所述目的蛋白糖基化的酶的核苷酸序列(例如GalT、GNTl-GalT、GalT和GNTl-GalT或它們的組合)進行密碼子優化以提高在所述植物中的表達水平。密碼子優化是指選擇用于合成結構基因或其片段的寡核苷酸構建塊的以及它們隨后的酶裝配的合適DNA核苷酸，從而接近植物中的密碼子選擇。所述序列可為用與由Sardana等人(PlantCellR印orts15:677-681;1996)概述的方法類似的方法針對植物中的密碼子選擇而優化的合成序列。來自雙子葉植物的高表達基因的密碼子選擇表可從若干來源獲得，包括Murrayetal.(NucAcidsRes.17:477-498;1989)。此外，序列優化也可包括減少密碼子串聯重復、消除隱蔽剪切位點、減少重復序列(包括反向重復)并可使用例如Leto1.0(Entelechon，Germany)石角定。"可操作地連接"是指特定序列直接或間接相互作用以執行預期功能如介導或調節基因表達。例如，可操作地連接的序列的相互作用可被與所述可操作地連接的序列相互作用的蛋白所介導。當目標序列被功能性地連接從而允許所述目標序列的轉錄被所述轉錄調控區介導或調節時，所述轉錄調控區就與所述目標序列可操作地連接。術語"植物的一部分"是指從植物獲得的任何部分，包括整個植物，來自所述植物的組織例如但不限于葉、葉和莖、根，空中部分包括葉、莖，以及任選地所述植物的花齊部分、來自所述植物的細胞或原生質體。術語"植物材料"是指來自植物的任何材料。植物材料可包括整個植物、組織、細胞或它們的任何組分。此外，植物材料可包括細胞內植物成分、細胞外植物成分、植物的液體或固體提取物，或它們的組合。此外，植物材料可包括植物、植物細胞、組織、液體提取物或它們的組合，并來自植物葉、莖、果實、根或它們的組合。植物材料可包括未經任何加工步驟處理的植物及其一部分。然而，也應涵蓋，所述植物材料可經過如下定義的最低程度的加工步驟處理或更嚴格的加工處理，包括用本領域公知的技術(包括但不限于色譜、電泳等)進行部分或大量蛋白純化。術語"最低程度的加工"是指植物材料(例如包含目的蛋白的植物或其一部分)被部分純化以得到植物提取物、勻漿物、植物勻漿物組分等(即最低程度的加工)。部分純化可包括但不限于，打破植物細胞結構從而獲得包含可溶性植物成分的組合物，以及可通過例如但不限于離心、過濾或其組合分離的不溶性植物成分。在這點上，在葉或其他組織的細胞外空間中分泌的蛋白可用真空或離心提取容易地得到，或者組織可在壓力下通過穿過滾筒或研磨等而被提取以從所述細胞外空間中榨出或釋放所述蛋白。最低程度的加工也可包括制備可溶性蛋白的粗提取物，因為這些制品會含有來自副植物產物的微量雜質。此外，最低程度的加工可包括水相提取葉中的可溶性蛋白，然后用任何合適的鹽沉淀。其他方法可包括大規模浸漬和汁液提取以允許直接使用所述提取物。所述植物材料可以植物材料或組織的形式口服遞送給受試者。所述植物材料可作為膳食補充劑的一部分連同其他植物一起給予，或以膠囊封裝的形式給予。也可根據需要濃縮所述植物材料或組織以提高或增加適口性，或連同其他材料、組分或藥物賦形劑一起提供。應涵蓋，可根據需要和情況以各種方式將包含目的蛋白的植物給予受試者，例如動物或人類。例如，可提取來自所述植物的目的蛋白，然后以粗制、部分純化或純化形式使用。如果所述蛋白將被純化，那么它可從可食用或不可食用的植物中生產。此外，如果所述蛋白通過口服給予，那么可收集所述植物組織并直接喂送給所述受試者，或者所收集的組織可在喂送前被干燥，或者不進行收集而使動物直接啃食所述植物。將所收集的植物組織作為動物飼料中的食品增補劑提供也被認為在本發明的范圍之內。如果將所述植物組織在幾乎不進行或不進行進一步加工的情況下喂送給動物，那么優選所給予的植物組織是可食用的。如在實施例中更詳細地描述的，將GalT、GNTl-GalT和所述目的蛋白以瞬時方式引入植物中。用合適的抗體進行的免疫分析表明，所述轉化細胞中存在分子量為150kDa的蛋白(圖2、3A和3B)。此外，在來自表達任一構建體的植物的提取物中檢測到了GalT或GNTl-GalT，并且當GNTl-GalT在所述植物中表達時，觀察到了目的蛋白的N-糖基化的改變(圖6)。因此，重組表達的GalT或GNTl-GalT在植物中是有生物學活性的。"類似物"或"衍生物"包括對編碼GalT(SEQIDNO:14)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17)的核苷酸序列的任何取代、刪除或加入，只要所述序列編碼可修飾目的蛋白的糖基化譜的蛋白，所述修飾為，例如與在無GalT(SEQIDNO:14)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17)的情況下產生的目的蛋白的糖基化譜相比，減少所述目的蛋白的聚糖的巖藻糖基化、木糖基化或者巖藻糖基化和木糖基化二者，或者增加所述目的蛋白的半乳糖苷化。例如由所述序列編碼的蛋白可在N-聚糖成熟過程中加上一個末端半乳糖。核酸序列的衍生物和類似物一般與所述核酸序列具有80%以上的相似性(同一性)。對于兩種或兩種以上的核酸或多肽序列，術語"同一的"或"同一性"百分比是指，當用序列比較算法(例如Altschuletal.，Nuc.AcidsRes.25:3389—3402(1977)禾口Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)以及這些算法的任何升級版)或通過手動比對和肉眼檢查，在一個比較窗口或指定區域上進行最大對應的比較和比對時，測得兩種或兩種以上序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即對特定區域為60%同一性，優選65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的同一性)。序列相似性可通過使用默認參數(Program:blastn;Database:nr;Expect10;filter:lowcomplexity;Alignment:pairwise;Wordsize:11)，用BLAST算法來測定。所述序列的類似物或衍生物也包括在嚴格雜交條件下(參見Maniatisetal.，inMolecularCloning(ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory,1982，p.387-389，或Ausubel，etal.(eds)，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1，GreenPublishingAssociates,Inc.，andJohnWiley&Sons,Inc.，NewYork,atp.2.10.3)，與本文所述的GalT(SEQIDNO:14)和GNTl-GalT(SEQIDN0:17)序列中的任何一個雜交的那些核苷酸序列，只要所述序列編碼可修飾目的蛋白糖基化譜(例如，與在無GaIT(SEQIDNO:14)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17)的情況下產生的目的蛋白的糖基化譜相比，減少所述目的蛋白的聚糖的巖藻糖基化、木糖基化或巖藻糖基化和木糖基化二者，或者增加所述目的蛋白的半乳糖苷化)的蛋白。例如由所述序列編碼的蛋白可在N-聚糖成熟過程中加上一個末端半乳糖。這種嚴格雜交條件的實例可為在7%SDS、lmMEDTA、0.5MNa2HP04、pH7.2中在65。C下與合適探針例如但不限于[gama_32P]dATP標記的探針雜交16-20小時。然后在5%SDS、lmMEDTA、40mMNa2HP04、pH7.2中洗滌30分鐘。然后在l%SDS、lmMEDTA、40mMNa2HP04、pH7.2中洗滌30分鐘。可重復在這種緩沖液中的洗滌以降低背景。"調控區"、"調控元件"或"啟動子"是指一般但不總是位于基因的蛋白編碼區上游的核酸部分，其可存在于DNA或RNA中，或既存在于DNA又存在于RNA中。當調控區具有活性，并與目的基因可操作的關聯或可操作地連接時，可導致所述目的基因的表達。調控元件可介導器官特異性或者控制發育基因或時序基因活化。"調控區"包括啟動子元件、具有基礎啟動子活性的核心啟動子元件、可由外界剌激誘導的元件、介導啟動子活性的元件如負調控元件或轉錄增強子。如本文所用，"調控區"也可包括轉錄后有活性的元件，例如，調節基因表達的調控元件如翻譯和轉錄增強子、翻譯和轉錄抑制子、上游激活序列以及mRNA不穩定決定子。若干這些后期元件可位于所述編碼區的近端。在本發明的上下文中，術語"調控元件"或"調控區"一般是指一般但不總是位于一個結構基因的編碼序列上游(5')的一段DNA序列，其通過提供對RNA聚合酶和/或轉錄所需的其他因子的識別以在特定位點起始，從而控制所述編碼區的表達。然而，應理解，位于內含子中或所述序列的3'端的其他核苷酸序列也可有助于調控目的編碼區的表達。用于提供對RNA聚合酶或其他轉錄因子的識別以確保在特定位點起始的調控區的一個實例為啟動子元件。大多數但非全部真核細胞啟動子元件含有TATA盒——通常位于轉錄起始位點上游約25個堿基對處的由腺嘌呤和胸腺嘧啶的核苷酸堿基對構成的一段保守核酸序列。啟動子元件包括負責起始轉錄的基礎啟動子元件以及調整基因表達的其他調控元件(如上所述)。組成型調控區在植物的各個部分和在植物的整個發育中持續指導基因表達。已知組成型調控元件的實例包括與CaMV35S轉錄物(0de11etal.，1985，Nature,313:810-812)、水稻肌動蛋白l(actin1)(Zhangetal，1991，PlantCell,3:1155-1165)、肌動蛋白2(Anetal.，1996，PlantJ.，10:107-121)或tms2(U.S.5，428，147，其以引用的方式納入本文中)，以及磷酸丙糖異構酶1(Xuet.al.，1994，PlantPhysiol.106:459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejoetal，1993，PlantMol.Biol.29:637-646)、擬南芥(Arabidopsis)泛素1和6基因(Holtorfetal，1995，PlantMol.Biol.29:637-646)以及煙草翻譯起始因子4A基因(Mandeletal，1995PlantMol.Biol.29:995-1004)關聯的啟動子。本文所用的術語"組成型"并非必然表示處于所述組成型調控區控制下的基因在所有細胞類型中都以相同水平表達，而是所述基因在廣泛范圍的細胞類型中表達，盡管經常觀察到豐度的變化。來自光合基因的調控區或啟動子也適用于本發明。例如，調控區或啟動子可來自編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的大/小亞基(rubisco;US4，962，028，其以引用的方式納入本文中)、質體藍素(US7，125，978，其以引用的方式納入本文中；圖lb;SEQIDNO:19)、葉綠素a/b結合蛋白(CAB;Leutwileretal.，1986，其以引用的方式納入本文中)，ST-LS1(與光合系統II的放氧復合物關聯；Stockhausetal.1989，其以引用的方式納入本文中)的基因。—種或多種本發明的核苷酸序列可在任何合適的植物宿主中表達。合適宿主的實例包括但不限于擬南芥(Arabidopsis)、苜蓿、油菜、蕓苔屬(Brassicaspp.)、玉米、煙草屬(Nicotianaspp.)包括本氏煙草(Nicotianabenthamiana)禾口普通煙草(Nicotianatobaccum)、苜蓿、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、大麥、向日葵、棉花等。—個或多個本發明的嵌合遺傳構建體可進一步包含3'非翻譯區。3'非翻譯區是指包含如下DNA片段的基因部分，所述DNA片段含有多聚腺苷酸化信號和任何其他能夠影響mRNA加工或基因表達的調控信號。所述多聚腺苷酸化信號的一般特征為影響所加入的多聚腺苷酸定位到mRNA前體的3'末端。多聚腺苷酸信號通常與標準形式5'AATAAA-3'的存在同源性而被識別，盡管變體并不少見。一個或多個本發明的嵌合遺傳構建體也可根據需要進一步包括增強子(翻譯或轉錄增強子)。這些增強子區對本領域技術人員來說是廣為人知的，并且可包括ATG起始密碼子和鄰近序列。所述起始密碼子必須與編碼區的開放閱讀框同相(inphase)以確保整個序列的翻譯。合適的3'區的非限制性實例為包括質體藍素3'UTR的3'轉錄非翻譯區，包括轉錄終止序列(SEQIDNO:20);農桿菌致瘤(Ti)質粒基因(如本領域所知的)如胭脂堿合酶(Nosgene)，和植物基因如大豆儲存蛋白基因和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亞基的多聚腺苷酸化信號。如果需要，本發明的構建體可進一步被操作以包括選擇性標記。然而，這可能不需要。可用的選擇性標記包括提供對化學藥品如抗生素(例如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素)或除草劑(如草胺膦、草甘膦、氯磺隆，等等)的抗性的酶。類似地，可使用產生可通過顏色改變識別的化合物的酶如GUS(13-葡萄糖醛酸酶)，或產生可通過發光識別的化合物的酶，如熒光素酶或GFP。所考慮到的本發明的一部分還包括含有本發明嵌合基因構建體，可用作適于本文所述的瞬時蛋白表達的平臺植物的轉基因植物、植物細胞或種子。從植物細胞再生整個植物的方法也為本領域所知。通常，將轉化的植物細胞在合適的培養基中培養，所述培養基可含有選擇性試劑如抗生素，其中選擇性標記用于方便對轉化的植物細胞的確認。一旦形成愈傷組織，就可依據已知方法通過采用合適的植物激素促進芽形成，并且將所述芽轉移至植物再生的根培養基中。因此所述植物可用于從種子或使用植物繁殖技術重復產生。轉基因植物也可不使用組織培養而生成。穩定轉化和再生這些生物體的方法已在本領域中建立并為本領域技術人員所知。獲得轉化和再生植物的方法對本發明并非關鍵性的。"轉化"是指在基因型、表型或兩者上均表現出的遺傳信息(核苷酸序列)的物種間轉移。遺傳信息從嵌合構建體到宿主的物種間轉移可為可遺傳的且所述遺傳信息的轉移被認為是穩定的，或者所述轉移可為瞬時的且所述遺傳信息的轉移不是可遺傳的。本發明還包括如下合適載體，其包含適于與穩定或瞬時表達系統配合使用的所述嵌合構建體。所述遺傳信息也可存在于一個或多個構建體中。例如，可將編碼目的蛋白的核苷酸序列引入一個構建體中，將編碼可修飾所述目的蛋白糖基化的蛋白的第二種核苷酸序列引入另一個構建體中。因此這些核苷酸序列可在本文所述的植物中以瞬時方式共表達。還可使用如下構建體，其包含既編碼目的蛋白又可編碼修飾所述目的蛋白糖基化譜的蛋白的核苷酸序列。在此情況下，所述核苷酸序列包括包含與啟動子或調控區可操作地連接的編碼所述目的蛋白的第一種核酸序列的第一序列，和包含編碼可修飾所述目的蛋白糖基化譜的蛋白的第二種核酸序列的第二序列，所述第二序列與啟動子或調控區可操作地連接。"共表達"是指兩種或兩種以上的核苷酸序列在所述植物中在大致相同的時間并且在所述植物的相同組織中表達。然而，所述核苷酸序列不需在完全相同的時間表達。而是，所述兩種或兩種以上核苷酸序列的表達方式使所編碼的產物有機會相互作用。例如，可修飾所述目的蛋白糖基化的蛋白可在所述目的蛋白表達的時期之前或之中表達，從而使得發生對所述目的蛋白的糖基化的修飾。所述兩種或兩種以上核苷酸序列可用瞬時表達系統共表達，其中在兩種序列都能表達的條件下，在大致相同的時間將所述兩種或兩種以上序列引入所述植物中。或者，包含所述核苷酸序列之一(例如編碼可修飾所述目的蛋白糖基化譜的蛋白的序列)的平臺植物可以穩定方式被轉化，而將編碼所述目的蛋白的另一種核苷酸序列以瞬時方式引入所述平臺植物中。在這種情況下，編碼可修飾所述目的蛋白糖基化譜的蛋白的序列可在所需發育階段中在所需組織內表達，或者其表達可使用誘導啟動子來誘導，并且編碼所述目的蛋白的另一種序列可在相似條件下和相同組織中表達，以確保所述核苷酸序列共表達。可用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等將本發明的構建體引入植物細胞中。這些技術的綜述參見例如WeissbachandWeissbach，MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,NewYorkVIII，pp.421-463(1988);GeiersonandCorey，PlantMolecularBiology,2dEd.(1988);以及MikiandIyer，FundamentalsofGeneTransferinPlants.InPlantMetabolism,2dEd.DT.De皿is，DHTurpin，DDLefebrve，DBLayzell(eds)，AddisonWesly，LangmansLtd丄ondon，pp.561-579(1997)。其他方法包括直接DNA導入、使用脂質體、電穿孔，例如使用原生質體、微注射、微粒或晶須、以及真空浸潤。參見，例如，Bilang，etal.(Gene100:247-250(1991)，Scheidetal.(Mol.Gen.Genet.228:104-112，1991)，Guercheetal.(PlantScience52:111-116，1987)，Neuhauseetal.(Theor.ApplGenet.75:30-36，1987)，Kleinetal.，Nature327:70-73(1987);Howelletal.(Science208:1265，1980)，Horschetal.(Science227:1229-1231，1985)，DeBlocketal.，PlantPhysiology91:694-701，1989)，MethodsforPlantMolecularBiology(WeissbachandWeissbach，eds.，AcademicPressInc.，1988)，MethodsinPlantMolecularBiology(SchulerandZielinski，eds.，AcademicPressInc.，1989)，LiuandLomonossoff(JVirolMeth，105:343-348，2002，)，美國專利4,945,050;5,036,006和5，100，792，以及1995年5月10日提交的美國專利申請流水號08/438，666和1992年9月25日提交的07/951，715(全部所述文獻都以引用的方式納入本文中)。如下所述，瞬時表達方法可用于表達本發明的構建體(參見LiuandLomonossoff，2002，JournalofVirologicalMethods,105:343-348，其以引用的方式納入本文中)。或者，可使用如K即ilaetal.，1997(其以引用的方式納入本文中)所述的基于真空的瞬時表達方法。這些方法可包括，例如但不限于，農桿菌接種或農桿菌浸潤、注射器浸潤的方法，然而也可使用上述其他瞬時方法。用農桿菌接種、農桿菌浸潤或注射器浸潤時，包含所需核酸的農桿菌混合物進入組織(如葉、所述植物的空中部分(包括莖、葉或花)、所述植物的其他部分(莖、根、葉)或整個植物)的細胞間隙。穿過表皮后，農桿菌感染所述細胞并將t-DNA拷貝轉移到所述細胞中。所述t-DNA作為游離基因被轉錄并且其mRNA被翻譯，導致在感染細胞中產生所述目的蛋白，然而，t-DNA進入核內是暫時的。"目的基因"、"目的核苷酸序列"或"目的編碼區"(這些術語可互換使用)是指將要在植物或植物的一部分中表達的任何基因、核苷酸序列或編碼區。這種目的核苷酸序列可包括但不限于產物為目的蛋白的序列或編碼區。目的蛋白的實例包括，例如但不限于，工業用酶例如纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、過氧化物酶、枯草桿菌蛋白酶；用于飼料、食品或飼料和食品兩者的蛋白質補充料、保健品、增值產品或其組分；藥物活性蛋白，例如但不限于生長因子、生長調節劑、抗體、抗原及其片段，或者它們用于免疫或疫苗的衍生物；等等。其他目的蛋白可包括但不限于，白細胞介素如IL-1到IL-24、IL-26和IL-27中的一個或多個、細胞因子、促紅細胞生成素(EP0)、胰島素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它們的組合，干擾素(例如干擾素a、干擾素|3、干擾素Y)、凝血因子(如因子VIII、因子IX或tPAhGH)、受體、受體激動劑、抗體、神經多肽、胰島素、疫苗，生長因子(例如但不限于表皮生長因子、角質細胞生長因子、轉化生長因子)、生長調節劑、抗原、自身抗原、它們的片段，或它們的組合。如果所述目的核苷酸序列編碼對所述植物直接或間接有毒的產物，那么通過使用本發明的方法，可通過瞬時表達所述目的基因而在整個所述植物中下降這種毒性。如在以下實施例中詳細描述的，目的蛋白例如但不限于具有修飾N-糖基化的抗體C5-l，在瞬時共表達GalT(SEQIDNO:14;Figurelb)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17;Figurelc)的植物中被合成。如本文所述，瞬時表達方法的優點為用于抗體瞬時表達的農桿菌株的數目被最小化，這降低了費用、簡化了操作并提高了系統的堅固性。由Giritchetal.(2006)提出的瞬時表達倚賴兩個非競爭性病毒載體上的抗體的輕鏈和重鏈的表達。該系統還需要用于表達provector組件、重組酶和兩種病毒復制酶的6種不同農桿菌培養物的共浸潤。從商業前景上來說，6種接種物的同時制備代表在設備和驗證時間上以及擴大經營的高額費用。此外，增加細菌載體的數量可影響倚賴多種轉基因協同表達的表達系統的堅固性。通過比較，本文提出的系統只需要兩種不同農桿菌培養物的共浸潤。通過將編碼沉默抑制子如HcPro或任何其他調節所述目標蛋白的序列加入與所述抗體表達盒相同的質粒中，農桿菌培養菌的數目可減少到一個。序列表序列SEQIDN0:序列SEQIDN0:XmaI-pPlas.c1GNT-GalT(氨基酸)18SacI_ATG_pPlas.r2質體藍素啟動子和5'UTR19SacI-PlasTer.c3質體藍素3'UTR和終止子20EcoRI-PlasTer.r4GNT1的CTS結構域(核苷酸)2119<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例實施例1:表達盒R610、R612、R514(圖1)、R621和R622(圖5)的裝配所有操作都是使用SambrookandRussel(2001)中的常規分子生物方案完成的。所用的寡核苷酸引物如下Xmal-pPlas.c:SEQIDNO:15'-AGTTCCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTC-3'SEQIDNO:1SacI-ATG-pPlas.r:SEQIDNO:25'-AATAGAGCTCCATTTTCTCTCAAGATGATTAATTAATTAATTAGTC-3'SEQIDNO:2SacI-PlasTer.c:SEQIDNO:35'-AATAGAGCTCGTTAAAATGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGG-3,SEQIDNO:3EcoRI-PlasTer.r:SEQIDNO:45'-TTACGAATTCTCCTTCCTAATTGGTGTACTATCATTTATCAAAGGGGA-3'SEQIDNO:4Plasto-443c:SEQIDNO:55'-GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC-3'SEQIDNO:5Plas+LC-C51.r:SEQIDNO:65'-ATCTGAGGTGTGAAAACCATTTTCTCTCAAGATG-3,SEQIDNO:6LC-C51.c:SEQIDNO:75'-ATGGTTTTCACACCTCAGATACTTGG-3'SEQIDNO:7LC-C51XhoSac.r:SEQIDNO:85'-ATATGAGCTCCTCGAGCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3，SEQIDNO:8Plas+HC-C51.r:SEQIDNO:95'-CAAGGTCCACACCCAAGCCATTTTCTCTCAAGATG-3,SEQIDNO:9HC-C51.c:SEQIDNO:105'-ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC-3'SEQIDNO:10HC-C51XhoSac.r:SEQIDNO:115'-ATAAGAGCTCCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3'SEQIDNO:11HC-C51KDEL(SacI).r:SEQIDNO:125'-ATAAGAGCTCTCAAAGTTCATCCTTTTTACCAGGAGAGTGGG-3'SEQIDNO:12XhoTEV.c:SEQIDNO:235'-TTTGGAGAGGACCTCGAGAAATAACAAATCTCAACAC-3'SEQIDNO:23TEV+LC-C5-1.r:SEQIDNO:245'-ATCTGAGGTGTGAAACCATTGCTATCGTTCGTAAATGGTG-3'SEQIDNO:24LC-C5-1.c:SEQIDNO:255'-ATGGTTTTCACACCTCAGATACTTGG-3'SEQIDNO:125LC-C5-lSphSac.r:SEQIDNO;265'-ATATGAGCTGCGATGCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3，SEQIDNO:26第一個克隆步驟包括裝配含有苜蓿質體藍素基因的上游和下游調控元件的受體質粒。用寡核苷酸引物XmaI-pPlas.c(SEQIDN0:1)和SacI-ATG-pPlas.r(SEQIDNO:2)從苜蓿基因組DNA中擴增質體藍素啟動子(US專利7，125，978，其以引用的方式納入本文中)和5'UTR序列。用Xmal和Sacl消化獲得的擴增產物并連接到預先用相同酶消化的pCAMBIA2300中，以生成pCAMBIA-PromoPlasto。類似地，用如下引物:SacI-PlasTer.c(SEQIDNO:3)和EcoRI-PlasTer.r(SEQIDNO:4)從苜蓿基因組DNA中擴增質體藍素基因的3，UTR序列和終止子(圖lc;SEQIDNO:20的1-399位核苷酸)，并用Sacl和EcoRI消化所得產物，再插入pCAMBIA-PromoPlasto的相同位點中以生成pCAMBIAPlasto。制備質粒R610和R612以使得含有處于苜蓿的質體藍素啟動子調控下的C5_l輕鏈和C5-l重鏈編碼序列，作為串聯構建體；R610被設計為允許裝配的IgG滯留在內質網上，并包含與C5-l的重鏈融合的KDEL序列，而R612被設計為允許分泌。C5-l表達盒的裝配是用Darveauetal.(1995)所述的PCR介導的連接方法進行。為將所述輕鏈編碼序列裝配到所述質體藍素啟動子的下游，第一步包括用pCAMBIAPlasto為模板并用如下引物Plasto-443c(SEQIDN0:5)和Plas+LC-C51.r(SEQIDN0:6，重疊部分以下劃線標出)通過PCR擴增起始ATG下游的D'Aoust等人(US專利7，125，978，其以引用的方式納入本文中)描述的苜蓿質體藍素啟動子的前443個堿基對(bp)(圖lb或SEQIDNO:19的556-999位核苷酸)。并行地，用如下引物LC-C51.C(SEQIDNO:7)和LC_C51XhoSac.r.(SEQIDNO:8，重疊部分以下劃線標出)從質粒pGA643-ka卯a(Khoudietal.，1999)中PCR擴增所述輕鏈編碼序列。將所獲得的兩個擴增產物混合在一起并在以Plasto-443c(SEQIDNO:5)和LC-C51XhoSac.r(SEQIDNO:8)為引物的第三個PCR反應中用作模板。用于第一個反應的引物Plas+LC-C51.r(SEQID)NO:6)和LC-C51.C(SEQIDNO:7)之間的重疊部分導致在第三個反應中所述擴增產物的裝配。用DraIII和Sacl消化從第三個PCR反應中獲得的裝配產物并將其連接到用DraIII和Sacl消化的pCAMBIAPlasto中以生成質粒R540。通過用如下引物:Plasto-443c(SEQIDNO:5)和Plas+HC-C51.r(SEQIDNO:9;重疊部分以下劃線標出)以pCAMBIAPlasto為模板通過PCR擴增質體藍素的起始ATG上游的443bp(圖lb和SEQIDNO:19的556-999位核苷酸)，將所述重鏈編碼序列與質體藍素上游調控元件融合。將這些反應的產物混合并使用引物Plasto-443c(SEQIDNO:5)和HC-C51XhoSac.r(SEQIDNO:11)在第三個PCR反應中裝配。用DraIII和Sacl消化獲得的片段并連接到pCAMBIAPlasto的DraIII和Sacl位點之間。將獲得的質粒命名為R541。以質粒R541為模板用引物Plasto-443c(SEQIDNO:5)和HC-C51KDEL(Sacl)r(SEQIDNO:12)通過PCR擴增將KDEL標簽加入所述重鏈編碼區的C末端。用DraIII和Sacl消化獲得的片段并將其克隆到pCAMBIAPlasto的相同位點上，生成質粒R550。將輕鏈和重鏈表達盒裝配在同一個二元質粒上的步驟如下用EcoRI消化R541和R550、鈍化、用HindIII消化并將其連接到R540的HindIII和Smal位點上以生成R610(帶有KDEL)和R612(不帶KDEL;參見圖1)。R514(圖5a)所用的其他寡核苷酸引物如下Tev+HC-C51.2:SEQIDNO:165'-CAAGGTCCACACCCAAGCCATTGCTATCGTTCGTAAATGGTG-3,SEQIDNO:16HC-C51SphSac.rSEQIDNO:325'-ATAAGAGCTCGCATGCTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3，SEQIDNO:32全長C5-l輕鏈和重鏈基因(LC和HC)由H6ma-Qu6bec提供并使用Darveau(1995)所述的聚合酶鏈式反應(PCR)介導的方法將其克隆到植物二元表達載體的表達框架中。所述煙草蝕紋病毒(TEV)增強子首先用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和TEV+LC-C51(SEQIDNO:24)通過對TEV基因組RNA(Acc.No.NC001555)的RT-PCR進行擴增。并行地，使用LC引物LC-C51.C(SEQIDNO:25)和LC_C51XhoSac.r.(SEQIDNO:26)從質粒pGA643(Khoudietal.，1999)中通過PCR擴增C5_l輕鏈編碼序列。將TEV和輕鏈擴增片段混合并使用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和LC_C51XhoSac.r(SEQIDNO:26)通過另一輪PCR反應裝配。然后將所獲得的TEV/C5-1LC片段純化并以Xhol-Sacl消化的形式克隆到一個中間載體上2X35S啟動子和NOS終止子之間的位置。圖Id示出了所用的2X35S啟動子(以粗體表示；SEQIDNO:33)和NOS終止子(以斜體表示；SEQIDNO:34)的序列以及所述限制位點的位置(以下劃線示出)。然后將此表達盒以HindIII-EcoRI片段的形式轉移到所述pCAMBIA2300二元質粒中以生成質粒R512。為生成pR513，通過用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和TEV+LC-C51.r(SEQIDNO:16)對TEV基因組RNA(Acc.No.NC001555)的RT-PCR來擴增TEV增強子。并行地，用引物HC-C51.c(SEQIDNO:10)和HC_C51SphSac.r(SEQIDNO:32)通過PCR來擴增所述抗體的重鏈編碼序列。將獲得的TEV和重鏈擴增片段混合并用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和HC-C51XhoSac.r(SEQIDNO:32)通過PCR裝配。然后將所獲得的TEV/C5-1HC片段純化、用Xhol和Sacl消化并克隆到中間載體上2X35S啟動子和NOS終止子之間的相同位點。圖Id示出了所用的2X35S啟動子(SEQIDNO:33)和NOS終止子(SEQIDNO:34)的序列以及所述限制位點的位置。然后將所獲得的含有2X35S/TEV/C5-1HC/NOS片段的質粒用EcoRI消化，用Klenow片段聚合酶鈍化末端，然后再用HindIII消化。然后將此HindIII-EcoRI(鈍化)片段連接到HindIII-SmaI消化的R512中以生成質粒R514。R621和R622(圖5a)——所用的寡核苷酸引物如下FgalTSEQIDNO:275'-GACTCTAGAGCGGGAAGATGAGGCTTCGGGAGCCGCTC-3，SEQIDNO:27RgalTFlagStuSEQIDNO:285'-AAGGCCTACGCTACTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCGCACGGTGTCCCGAAGTCCAC-3'SEQIDNO:28FGNTSEQIDNO:295'-ATCGAAATCGCACGATGAGAGGGAACAAGTTTTGC-3，SEQIDNO:29RGNTSpeSEQIDNO:305'-CGGGATCCACTAGTCTGACGCTTCATTTGTTCTTC-3'SEQIDNO:30FgalTSpeSEQIDNO:315'-GGACTAGTGCACTGTCGCTGCCCGCCTGC-3，SEQIDNO:31從pBLTI121裝配了用于GalT和GNTlGalT表達的質粒(Pagnyetal.，2003)。通過用EcoRI消化從pUC19-hGalT(Watzeleetal.，1991)中分離人P(1，4)-半乳糖基轉移酶(hGalT)基因(UDP-半乳糖13-N-乙酰葡萄糖胺P_(1，4)-半乳糖基轉移酶；EC2.4.1.22)。Klenow處理后，將1.2kb的hGalT片段克隆到pBLTI221的Smal位點上，生成質粒pBLTI221hGalT。然后用引物FGalT(SEQIDNO:27)和RGalTFlagStu(SEQIDNO:28)通過PCR擴增將flag標簽融合到所述編碼區的C末端。然后通過將此Xbal-Stul片段克隆到二元載體pBLTI121中生成R622。用FGNT(SEQIDNO:29)和RGNTSpe(SEQIDNO:30)為引物并用編碼N-GNTI的普通煙草(N.tobacum)cDNA為模板，通過PCR擴增對應于所述跨膜結構域的N-乙酰葡萄糖胺轉移酶I(GNTI)的前77個氨基酸。首先將所得擴增產物克隆到PGEM-T載體中，再用Apal和BamHI消化獲得的質粒，然后將其連接到pBLTI221中生成名為pBLTI221-GNTI的質粒。通過用引物FGalTSpe(SEQIDNO:31)和RgalTFlagStu(SEQIDNO:28)對pBLTI221hGalT的PCR擴增來獲得hGalT的催化結構域，并分別在5'和3'末端形成Spel和Stul位點。然后用相同位點(Spel和Stul)將所述Spel/StulhGalT片段克隆到pBLTI221-GNTI中，生成pBLTI221-GNTIGalT。最后，用XbaI和Stul消化pBLTI221-GNTIGalT，分離GNTIGalT編碼片段，然后將此片段克隆到所述二元載體pBLTI121中生成R621。將所有克隆測序以確認所述構建體的完整性。按照E.coli轉化的方法(W.S.Dower，Electroporationofbacteria,In"GeneticEngineering〃，Volume12，PlenumPress,NewYork,1990，J.K.Setloweds.)使用GenePulserII裝置(Biorad，Hercules,CA，USA)通過電穿孔法(H6fgenandWillmitzer,1988)用所述質粒轉化根癌農桿菌(Agrobacteiumt聽faciens)(AGL1;ATCC，Manassas,VA20108，USA)。通過限制酶圖譜確認全部根癌農桿菌株的完整性。按Hamiltonetal.(2002)所述制備HcPro構建體。輔你l2纖物薩燃、辭亂她辦織驗在裝滿商品化泥煤苔基質的平板中將本氏煙草的種子培養成植株。所述植株可在16/8的光照時間和白天25t:/夜晚2(rC的溫度范圍內的溫室中生長。播種之后3周，挑出單個植株，移植到盆中并使其在相同環境條件的溫室中再生長3周。轉化前，在下述各個時間通過從植株上摘心或通過化學處理所述植株來去除頂芽和腋芽。在添加有10mM2-[N-2嗎啉代]乙磺酸(MES)、20yM乙酰丁香酮、50yg/ml卡那霉素和25iig/ml羧節青霉素，pH5.6的YEB培養基中培養農桿菌株R612、R610、R621、R622或35SHcPro至0D6。。達到0.6_1.6。用前將農桿菌懸浮液離心并在浸潤培養基(10mMMgC12和10mMMES，pH5.6)中重懸浮。按Liu禾口Lomonossoff(2002，JournalofVirologicalMethods,105:343-348)所述進行注射器浸潤。對真空浸潤，將根癌農桿菌懸浮液離心，在所述浸潤培養基中重懸浮，并貯存在fC下過夜。浸潤當天，將培養物批次稀釋2.5倍并可在用前加熱。將本氏煙草的整個植株倒置在真空度為20-40Torr的密封不銹鋼箱中的細菌懸浮液中2分鐘。注射器或真空浸潤后，將植株轉移回溫室培養4-5天至收獲。葉采樣和總蛋白提取培養后，收獲植物的空中部分，在-S(TC下冷凍，壓碎并分成1.5或7.5g的子樣品。通過將冷凍壓碎的植物材料的全部子樣品在3倍體積的冷的50mMTrispH7.4、0.15MNaC1、0.1%TritonX-100、lmM苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride)和lOiiM胰凝乳蛋白酶抑制劑(chymostatin)中勻漿來提取總可溶性蛋白。勻漿后，將漿料在4t:下以20000g離心20分鐘，并保存這些澄清的粗提取物(上清液)以待分析。用牛血清白蛋白作為參考標準，通過Bradford法(Bio-Rad，Hercules，CA)測定澄清的粗提取物中的總蛋白含量。實施例3:蛋白質分析、免疫印跡和ELISAC5-l是一種抗人小鼠IgG，因此其檢測和定量可通過其與人IgG的特征性親和力(活性印跡)或者通過其與抗小鼠IgG的免疫反應活性來進行。通過SDS-PAGE分離總粗提取物中的蛋白或純化抗體，并用考馬斯亮藍R-250或G-250染色或者將其電轉化到聚偏氟乙烯膜(RocheDiagnosticsCorporation,Indian即olis，IN)上以進行免疫檢測。免疫印跡之前，在4t:下用含有5%脫脂牛奶和0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液(TBS-T)封閉所述膜16-18小時。通過用如下抗體孵育進行免疫印跡過氧化物酶綴合的羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA，Cat#l15-035-146)(在含2^脫脂牛奶的TBS-T中為0.04iig/ml)、過氧化物酶綴合的人IgG抗體Gam騰xBayerCorp.，Elkhart，IN)(在含2^脫脂牛奶的TBS-T中為0.2iig/ml)或多克隆羊抗小鼠IgG抗體(重鏈特異的)(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO)(在含2%脫脂牛奶的TBS-T中為0.25yg/ml)。用過氧化物酶綴合的驢抗山羊IgG抗體(JacksonlmmunoResearch)(在含2%脫脂牛奶的TBS-T中為0.04g/ml)作為用所述重鏈特異性抗體處理的膜的第二抗體。通過用魯米諾(luminol)(RocheDiagnosticsCorporation)做為底物的化學發光來檢測免疫反應復合物。人IgG抗體和辣根過氧化物酶的綴合是通過使用EZ-LinkPlusActivatedPeroxidase綴合試劑盒(Pierce,Rockford，IU進行。EIISA定量檢測法在4。C下用含有2.5iig/ml對IgGl重鏈特異的山羊抗小鼠抗體(SigmaM8770)的50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.0)包覆多孔板(Immulon2HB，ThermoLabSystem,Franklin,MA)16-18小時。然后通過在37。C下在含有1%酪蛋白的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(PierceBiotechnology,Rockford,II)中孵育1小時來阻斷多孔板。用純化的小鼠IgGl對照(SigmaM9269)的稀釋液獲得標準曲線。當進行所述免疫檢測時，全部稀釋液(對照和樣品)都在來自被浸潤植物組織的植物提取物中進行并用模擬接種物孵育，從而消除任何基體效應。在37t:下用蛋白樣品和標準曲線稀釋物孵育板1小時。用含有O.1%Tween-20的PBS(PBS-T)洗滌3次后，在37t:下用過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(在阻斷溶液中為0.04iig/ml)(JacksonImmunoResearch115-035-146)孵育所述板1小時。重復用PBS-T洗滌并用3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)SureBlue過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)孵育所述板。所述反應通過加入INHCl終止并在450nm處讀取吸光度。將每個樣品都重復檢測3次，并在所述標準曲線的直線部分通過插值求得濃度。實施例4:IgG純化從葉材料中純化C5-l包括取出冷凍的本氏煙草葉(100-150g)，加入含20mM磷酸鈉、150mMNaCl和2mM焦亞硫酸納，pH5.8_6.0的溶液中，并在室溫下用商品化混合器混合2-3分鐘。通過在MiraclothTM(Calbiochem，SanDiego，CA)上粗過濾去除不溶性纖維并在濾出液中加入10mM苯甲基磺酰氟(PMSF)。用1MHC1將提取物的pH調節至4.8±0.1并通過在2-8t:下以18000g離心15分鐘使其澄清。用2MTRIS將上清液的pH調節至8.0±0.l，通過在2-8"下以18000g離心15分鐘再次使其澄清，然后在依次0.8和0.2ym的膜(PallCorporation,Canada)上過濾。用0.2ft2有效面積的截留量為100kDa分子量的超濾膜(GEHealthcareBiosciences,Canada)通過切向流過濾濃縮濾過的材料，以使澄清材料的體積降低到原來的1/10到1/5。然后將所濃縮的樣品加到5mmx5cm(lmL柱體積)的重組蛋白G-S印haroseFastFlow柱(Sigma-Aldrich，St-Louis，M0，Cat.#P4691)上。用5倍柱體積的含20mMTRIS-HC1，150mMNaClpH7.5洗滌所述柱。用pH2.9-3.0的lOOmM甘氨酸洗脫所述抗體，并收集到含有計算體積的1MTRIS-HClpH7.5的試管中以立即達到中性PH。將收集的洗脫抗體級分在2-『C下以21000g離心15分鐘并貯存在-S(TC下至分析。純化后，清洗所述親和柱并按照廠商說明書貯存。相同的色譜填料可重復用于若干次純化而不發生純化性能的明顯改變(檢測最多至10次循環)。實施例5:N-糖基化分析將含有C5-l(50iig)的樣品在15%SDS/PAGE上電泳。用考馬斯亮藍顯示重鏈和輕鏈，切下對應于所述重鏈的蛋白條帶并切成小的片段。將片段用600yL0.1MNH4HC03/CH3CN(1/1)溶液洗滌3次，每次15分鐘，然后干燥。通過在56。C下將所述凝膠片段置于600iiL含有O.1MDTT的0.1M朋03溶液中孵育45分鐘將二硫鍵還原。通過在室溫下加入600yL含有55mM碘乙酰胺的0.1MNH4HC03溶液進行烷基化30分鐘。丟棄上清液，再次在NH4HC030.1M/CH3CN(1/1)中洗滌聚丙烯酰胺片段。然后在37。C下在600iiL的0.05MNH4HC03溶液中用7.5yg胰蛋白酶(Promega)消化蛋白16小時。加入200iiLCH3CN并收集上清液。然后先用200yL0.1M朋03，再用200yLCH3CN，最后用200yL5%甲酸洗滌凝膠片段。將所有上清液集中并凍干。用線性梯度的含0.1%TFA的CH3CN在C18反相柱(4.5x250mm)上進行HPLC來分離肽。收集餾分并凍干，在裝有337-nm氮激光器的VoyagerDE-ProMALDI-TOF儀(AppliedBiosystems，USA)上通過MALDI-TOF-MS進行分析。用a-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma-Aldrich)作為基質，以延時提取反射模式進行質譜分析。輔你l6:她辦靴勺站鵬口忡麵IgG表汰說歸為檢測基于質體藍素的強表達盒是否能驅動完整裝配的IgG的高度積聚，將一種小鼠抗人IgG(Khoudietel1997)C5-1輕鏈和重鏈的編碼區裝配在串聯構建體中質體藍素啟動子和5'非翻譯序列的下游，側面為pCambia二元質粒的相同T-DNA片段上的質體藍素3'非翻譯區和轉錄終止序列，如實施例1所述和圖1所示。在R612和R610表達盒(參見實施例1)中，所述輕鏈和重鏈編碼序列都含有C5-l的天然信號肽(Khoudietal.1999)，但在R610中，KDEL肽的編碼序列被加在所述重鏈的C末端以阻止所裝配的IgG到高爾基體的移動。在克隆步驟和將質粒轉到根癌農桿菌(AGL1)中之后，用被R612、R610或R514轉化的農桿菌株(圖1)注射器浸潤三株本氏煙草植物的每片葉子，在溫室條件下培養6天后按實施例2所述進行分析。在孵育期后，將每株植株的葉片冷凍、研磨，并且將冷凍的粉末混合以產生同質的樣品，從所述通知樣品中取2份均1.5克的子樣品用于進行提取(來自每株植株，參見實施例3)。通過用一種多克隆山羊抗小鼠IgGl重鏈捕獲并用一種過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)檢測，利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)對每個樣品的總蛋白提取物中C5-l的含量進行定量(參見實施例3)。如圖2A所示，在無沉默抑制子(HcPro)時，R610或R612(都含有所述質體藍素啟動子)的浸潤與R514相比造成較高水平的蛋白積聚。在存在HcPro時，對R610和R612都觀察到了表達水平的極大提高。如圖2B所示，R612的農桿菌浸潤導致每kg鮮重106mg抗體的積聚，而所述抗體的內質網滯留形式(R610)在相同條件下達到211mg/kgFW。由于已發現轉錄后基因沉默(PTGS)限制農桿菌浸潤的本氏煙草植物中的轉基因的表達，以及馬鈴薯病毒Y的沉默抑制子(HcPro)的共表達減少轉基因mRNA的特異性降解(Brignetietal.，1998)，因此檢測了一種HcPro構建體(Hamiltonetal.,2002)的共浸潤對C5-l表達增加的影響。R612和R610與HcPro的共表達與無HcPro時相比分別使抗體積聚水平增加5.3倍和3.6倍。在存在HcPro時，質體藍素控制的C5_l表達在用R612浸潤時達到558mg/kgFW的平均值、在用R610浸潤時達到757mg/kgFW的平均值(圖2A)。在R612和R610浸潤的葉子的某些提取物中，最大C5-l表達水平都超過1.5g/kgFW(總可溶性蛋白的25%)。為了評估農桿菌浸潤表達系統的可擴展性，在實施從K即ilaetal.(1997)改編的真空浸潤法后對C5-1的積聚進行定量。在此系列實驗中，整個植物的地上部分是用R612+HcPro或R610+HcPro真空浸潤的，并在轉移回溫室6天后收獲。為努力提供代表大規模生成系統的數據時，將來自若干植株的大約250g葉/葉柄的批量冷凍、研磨成均勻樣品，并在每批中收集3個7.5g的子樣品用于分析。如由ELISA定量所示的，C5-1的平均積聚水平對于R612和R610浸潤分別達到了238和328mg/kgFW(圖2B)。修剪的作用在用被合適質粒轉化的農桿菌株真空浸潤所述葉子之前1、2或3天，通過摘心從植物上機械地去除或者用乙烯利、B-nine(500卯m)或A-rest(4卯m)化學修剪3株本氏煙草植株的頂芽和腋芽。然后用流感抗原(構建體312，圖1)、人IgG(構建體935，圖1)浸潤植物，并將所述植物在溫室中培養6天后按實施例2所述進行分析。對照植物不進行修剪。所述培養時間后，將每株植物的葉子(生物量約20g)冷凍、研磨，并將得到的冷凍粉末混合以得到均勻樣品，再從所述樣品中取出2個1.5g的子樣品用于提取(對于每株植物；參見實施例3)。通過用一種多克隆山羊抗小鼠IgGl重鏈捕獲并用一種過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)檢測，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)對每個樣品的總蛋白提取物中的C5-1的含量進行定量(參見實施例3)。如圖7A所述，在312(流感抗原)浸潤前12小時機械修剪以去除頂芽和腋芽，導致與所述對照處理(不修剪)相比抗原積聚增加(150%)。在312浸潤后，在用若干已知的抑制頂端優勢的生長調節劑(乙烯利，500卯m;B-nine，2500卯m或A-rest，4.0卯m)處理，然后進行512農桿菌浸潤的化學修剪的植物中也觀察到了表達水平多至200%的增加。當在通過真空浸潤(圖7B)或注射器浸潤(圖7C)進行農桿菌浸潤后12小時對植物進行機械修剪時，所述機械修剪也會導致免疫球蛋白935(hlgG，圖1)的表達水平的增加。在農桿菌浸潤前1-3天修剪植物導致如圖8(機械修剪的植物)所示的蛋白(流感抗原；312圖1)積聚的額外增加。當在浸潤前1-2天對植物進行機械修剪時，觀察到表達的顯著增加。在浸潤前3或7天進行化學修剪，也發現蛋白積聚比不修剪的植物增加。如圖9所示，當目的編碼區被光合啟動子質體藍素(啟動子)驅動并且與修剪(真空浸潤前12小時的機械修剪)及沉默抑制子的共表達相結合時，觀察到抗體(935，圖1)浸潤后表達水平的增加。修剪后935與沉默抑制子HcPro的共表達導致抗體積聚水平與無HcPro時相比增加3-8倍。當修剪后與HcPro共表達時，質體藍素(啟動子)控制的表達達到280mg/kgFW的平均值。實施例7:所產生抗體的表征使用蛋白印跡分析(參見實施例3)揭示了，在注射器和真空浸潤實驗之后，在產生所述蛋白的分泌(R612)和內質網滯留(R610)形式的植物中C5-lIgG的裝配和片段化的水平。用H+L過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG作為探針的免疫印跡首先用于突現最大量的抗體片段的存在，而不管它們在C5-1分子上的來源。如圖3A所示，所有蛋白提取物都含有相似分子大小和相似相對豐度的片段，而不管所用的亞細胞定位方法或浸潤方法。在每例中，觀察到對應完整抗體的在約150kDa處的主帶(>85%)，以及在約135kDa和約lOOkDa處的兩個小帶，說明所積聚的抗體只要以其完全裝配的形式(H2L2)存在。有趣的是，相似電泳遷移率的片段也存在于從小鼠腫瘤細胞系(MOPC-21;Sigma#M9269)純化的對照IgGl中，表明植物和哺乳動物細胞系中產生的片段化是相似的，并且很可能是由共同的蛋白酶活性導致的。使用檢測用抗小鼠重鏈特異性抗體也獲得了相似的結果。為檢測所述提取物中存在的抗體片段的同一性，使用了活性印跡，其中用過氧化物酶綴合的人IgGl，即C5-l的抗原作為探針檢測所印跡的蛋白。約150kDa的完全裝配的抗體的同一性可見于圖3B。此外，除了一條100kDa的條帶以外，在蛋白質印跡中觀察到的片段化模式(見圖3A)，在所述活性印跡中也可見(圖3B)。并非希望受理論約束，此結果表明該100kDA的片段不含有所述C5-l抗體的Fab區，并且可能，至少部分地，由重鏈的二聚體——一種抗體裝配的中間體構成。輔你l8:碰艦禾口戸應網勿白條ffi使用單ProteinG親和色譜步驟從所述生物質中純化所述抗體，并且通過SDS-PAGE對所得抗體進行分析(參見實施例4)。圖4A中考馬斯染色的凝膠示出了所述ProteinG的洗脫餾分中一條150kDa的主帶。這條帶在分泌和內質網滯留形式中都代表超過85%的純化產物，并且對于這兩種形式雜質成分是相同的(圖4A，泳道4和5)。用多克隆抗小鼠IgG作為探針的蛋白質印跡分析顯示所述小鼠IgG來自所述純化C5-l級分中的主要雜質。在還原條件下，在分別對應輕鏈和重鏈分子量的約26kDa和約55kDa處檢測到兩種主要產物(圖4B，泳道2)。所述內質網滯留抗體的重鏈顯示了比質外抗體的重鏈(圖4B，泳道3)更高的電泳遷移率，這被解釋為位于C末端的附加KDEL氨基酸和由于內質網中滯留導致的N-糖基化差異的綜合結果。圖4C顯示，所純化抗體(150kDa)與人IgGl結合，75、90、100和120kDa雜質片段也與人IgGl結合，突顯了在這些片段中至少存在一個Fab節段。100kDa片段中存在Fab與粗提取物分析的結果相反，在粗提取物分析中該100kDa帶不與人IgG結合。這被假設為在粗提取物中遷移至100kDa的含有Fab的片段的量太低以致用這種活性印跡檢測不到；或者遷移至100kDa的片段由兩種不同的分子組成，其中一種為重鏈二聚體(無Fab)而另一種含有抗原結合區。將2個不同浸潤批次和每批中3個不同純化組的純化產物一起比較來評估這種抗體生產系統的重復性。所述純化各組的考馬斯染色SDS-PAGE分析顯示了在所有組中都存在相同的帶，并且相對豐度高度相似(圖4D)。實施例9:通過人半乳糖基轉移酶的共表達對抗體N-糖基化的修飾為研究瞬時共表達是否能用于在瞬時表達過程中控制新生蛋白的糖基化，制備了包含天然人P-l，4-半乳糖基轉移酶(GalT)的35S基表達盒。R622包含GalT(圖5B)，R621包含與N-乙酰葡萄糖胺轉移酶(GNTI)的CTS結構域融合的GalT催化結構域(GNTlGalT;圖5A)。選擇N-乙酰葡萄糖胺轉移酶(GNTI)的CTS結構域作為人GalT催化結構域的膜固著點，是因為GNTl在內質網和順面高爾基體中的復合N-聚糖合成的早期階段起作用(Saint-Jore-Dupasetal.，2006)。不希望被理論限制，GalT在蛋白成熟早期階段的鰲合28活性可導致將13-1，4_半乳糖加在正在成熟的聚糖上并有效抑制核心的巖藻糖基化和木糖基化。這些構建體與C5-l共浸潤到植物中。在HcPro的存在下用R612(C5-1的分泌形式)、R612+R621(GNTlGalT)或R612+R622(GalT)浸潤本氏煙草植株。圖6示出了對從這些生物質樣品中純化的C5_l的免疫學分析。通過用與P-l，4-半乳糖特異性結合的雞冠剌桐凝集素(Erythrinacristagaliagglutinin,ECA)進行的親和檢測評估了所述抗體的半乳糖苷化。不出所料，當C5_l單獨表達時沒有檢測到半乳糖(R612;圖6)。在從R512+R622(GalT)的共浸潤物中純化的C5_l中觀察到了半乳糖苷化，但在從R612+R621(GNTlGalT，圖6)的共浸潤物中純化的C5_l中沒有觀察到半乳糖苷化。用抗a-l，3-巖藻糖抗體進行的蛋白質印跡顯示了在無半乳糖基轉移酶時表達的對照C5-l上的N-聚糖的巖藻糖基化。不管用哪種浸潤方法，在與GNTlGalT共表達的抗體上都沒有檢測到N-聚糖的巖藻糖基化，盡管與天然GalT的共表達并沒有導致所述抗體的巖藻糖基化發生可檢測的減少(圖6)。用抗13-1，2-木糖特異性抗體獲得了相似的結果在與GNTlGalT共表達的C5-l上完全不存在木糖特異性免疫信號，而當C5-l與GalT共表達時存在這種信號。對相同的提取物進行了用于直接肉眼評估完全裝配的IgG的考馬斯染色凝膠電泳，以及蛋白質印跡和活性印跡。基于這一數據，所述抗體表達系列達到1.5g/kg鮮重的產量，在粗產物中超過85%的產物由約150kDa的全長四聚體IgG組成。在所述重鏈的C末端加上KDEL肽已被前人用于通過介導所述抗體從高爾基體回到內質網的反演來增加抗體積聚(2-10X)(Schillbergetal.，2003)。用本文所述的表達系統，當不使用HcPro沉默抑制子時，在C5-l的重鏈上加上KDEL肽使C5-1的產量加倍。當使用HcPro以降低沉默時，存在或不存在KDEL時的C5-l的產量的差別明顯減小。內質網滯留不影響產物質量，因為在產生內質網滯留和分泌形式的所述抗體的植物的粗提取物中觀察到的片段在大小和相對豐度上是相同的。所有引文都以引用的形式納入本文中。已參照在一或多個實施方案對本發明進行了描述。然而，本領域技術人員應明了，可對本發明進行多種變化和改進而不偏離如權利要求所限定的本發明的范圍或精神。參考文獻Bakker，H.etal.Anantibodyproducedintobaccoexpressingahybridbeta-l，4一galactosyltransferaseisessentiallydevoidofplantcarbohydrate印itopes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，7577—7582(2006)Boisson，M，etal.ArabidopsisglucosidaseImutantsrevealacriticalroleofN-glycantrimminginseeddevelopment.EMB0J.20，1010—1019(2001).Brigneti，G.etal.ViralpathogenicitydeterminantsaresuppressorsoftransgenesilencinginNicotianabenth咖iana.EMB0J.17，6739-6746(1998).Chua，Y丄，Watson，L.A.，&Gray,J.C.Thetranscriptionalenhancerofthepeaplastocyaningeneassociateswiththenuclearmatrixandregulatesgeneexpressionthroughhistoneacetylation.PlantCell15,1468-1479(2003).Cox，K.M.，etal.GlycanoptimizationofahumanmonoclonalantibodyintheaquaticplantLemnaminor.Nat.Biotechnol.24，1591-1597(2006).D'Aoust，M.A.etal.Efficientandreliableproductionofpharmaceuticalsinalfalfa.MolecularFarming,pp1_12.RainerFischerandStefanSchillberg(eds.)，Wiley-VCH，Weinheim，Germany(2004).Darvean，A.，Pelletier，A.&Perreault，J.PCR-mediatedsynthesisofchimericmolecules.MethodsNeurosc.26，77-85(1995).Elmayan，T.&Vaucheret，H.Expressionofsinglecopiesofastronglyexpressed35Stransgenecanbesilencedpost_transcriptionally.PlantJ.9,787-797(1996).Fischer,R.etal.Towardsmolecularfarminginthefuture:transientproteinexpressioninplants.Biotechnol.Appl.Biochem.30，113-116(1999a)，Fischer,R.，Drossard，J.，Commandeur,U.，Schillberg,S.&Emans，N.Towardsmolecularfarminginthefuture:movingfromdiagnosticproteinandantibodyproductioninmicrobestoplants.Biotechnol.Appl.Biochem.30，101-108(1999b).Giritch，A.etal.Rapidhigh-yieldexpressionoffull-sizeIgGantibodiesinplantscoinfectedwithnoncompetingviralvectors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，14701-14706(2006).Gomord，V.，Chamberlain,P.，Jefferis，R.&Faye，L.Biopharmaceuticalproductioni叩lants:problems，solutionsandopportunities.TrendsBiotechnol.23，559-565(2005).Hamilton,A.，Voi皿et，0.，Chappell，L.&Baulcombe，D.TwoclassesofshortinterferingRNAinRNAsilencing.EMB0J.21，4671-4679(2002).Hiatt，A.，Cafferkey，R.&Bowdish，K.Productionofantibodiesintransgenicplants.Nature342,76-78(1989).Hiatt，A.&Pauly，M.Monoclonalantibodiesfromplants:anewspeedrecord.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，14645-14646(2006).Hibino，Y.，0hzeki，H.，Sugano，N.&Hiraga，K.Transcriptionmodulationbyaratnuclearscaffoldprotein,P130，andarathighlyrepetitiveDNAcomponentorvarioustypesofanimalandplantmatrixorscaffoldattachmentregions.Biochem.Biophys.Res.Co匪n.279，282-287(2000).H6f接eiUR.&Willmitzer,L.StorageofcompetentcellsforAgrobacteriumtransformation.NucleicAcidRes.16,9877(1988).Hull，A.K.etal.Human-derived,plant-producedmonoclonalantibodyforthetreatmentofanthrax.Vaccine23，2082-2086(2005).Kapila，J.，DeRycke，R.，VanMontagu,M.&Angenon，G.AnAgrobacterium—mediatedtransientgeneexpressionsystemforintactleaves.PlantSci.122,101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之一編碼一個沉默抑制子。18.權利要求17的方法，其中所述沉默抑制子是HcPro。19.權利要求10的方法，其中所述目的蛋白為抗體、抗原或疫苗。20.—種在植物或植物的一部分中合成目的蛋白的方法，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以獲得經修剪的植物或所述植物的經修剪部分，ii)以瞬時方式引入一個或多個編碼目的蛋白的核酸序列，所述序列與在所述植物或所述植物的一部分中有活性的來自光合基因的調控區可操作地連接，禾口iii)將所述經修剪的植物或所述植物的經修剪部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。全文摘要本發明提供一種在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法。所述方法包括以瞬時方式引入一個或多個與在所述植物中有活性的來自光合基因的調控區可操作地連接的編碼目的蛋白的核酸序列。然后將所述植物或所述植物的一部分保持在允許編碼所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表達的條件下。可在引入一個或多個核酸序列之前對所述植物進行修剪。文檔編號C12N15/82GK101778943SQ200880102410公開日2010年7月14日申請日期2008年6月13日優先權日2007年6月15日發明者J·貝勒斯-依斯勒斯,L-P·韋齊納,M·馬泰爾,M-A·達奧斯特,N·貝克托爾德,P-O·拉瓦申請人:麥迪卡格公司