專利名稱：來自靜止中心的植物干細胞系及其分離方法
技術領域：
本發明涉及來自植物靜止中心的細胞系及其分離方法，具體涉及單細胞來源的來 自靜止中心的同質細胞系及其分離方法，所述單細胞得自植物的靜止中心而沒有進行單獨 的去分化步驟。
背景技術：
過去植物已經被用作食物來源，但其作為食物來源的含義目前擴展到包括用于范 圍廣泛的化學物質的來源，包括藥物、香水、色素、農業化學物質和染料。特別是，由于大多 數來自植物的有用物質具有生理活性，包括抗病毒、抗菌、抗癌和抗氧化活性，植物被認為 是可開發新藥的理想來源，并且正在進行活躍的研究以便闡明許多植物來源物質的化學結 構與活性之間的關系。但是，生理活性物質難以開發成藥物，其主要原因如下。第一，植物中生理活性物 質的含量非常有限。第二，植物的生長速度非常慢。第三，來自植物的生理活性物質僅僅少 量存在于特定的植物器官中。第四，導致自然破壞有關的環境問題。第五，來自植物的生理 活性物質具有非常復雜的化學結構，因此需要多步驟聚合過程，從而引起高生產成本的經 濟問題。由于這些原因，穩定提供來自植物的生理活性物質用于商業化非常困難。同時，植物細胞培養方法，一種生物基因工程技術已經長期被評估為最理想的技 術，其可提供植物來源的有用物質而不會引起環境問題。根據韓國專利公開1995-0000870， 通過植物細胞培養技術生產有用物質提供了許多比直接從植物中提取有用物質的方法更 好的優點。特別是，與現有提取方法不同，植物細胞培養方法已經被認為允許連續生產而不 受外部環境影響以便解決突出問題諸如生態系統破壞的最佳方法。但是，盡管在植物細胞 培養方面存在興趣并付出努力，在植物細胞培養工業化方面成功的例子仍然不足。這是因 為細胞生長中的變異和在大量植物細胞培養中產率仍作為主要問題存在。如果植物細胞在植物表達系統中使用，由植物細胞分化的組織例如葉、莖和種子 稱為其細胞不再分裂(divide)的永久組織。由于這種原因，需要事先進行去分化步驟以便 將組織轉化成具有分裂能力的細胞系。去分化步驟意味著當對植物組織或器官進行培養 時，對已經分化以便執行特定功能的組織或細胞進行去分化。但是，在該去分化步驟中，由 于體細胞無性系變異(somaclonal variation)，可在細胞系中發生劇烈變化。特別是，僅僅當在長期培養期間穩定保持快速細胞生長和高代謝物產量時，通過 植物細胞培養生產有用物質才可被工業化。但是，大多數細胞由于傳代而發生許多變化。因 此，在通過植物細胞培養生產有用物質中克服細胞變異的問題以及開發用于獲得遺傳穩定 的細胞系的方法非常迫切。同時，由于植物必須吸收其生長所需的足夠量的水分或礦物質，根的表面積相當 大。在根尖中，存在根頂端分生組織細胞，它們分裂、膨脹、伸長并分化形成初級根部組 織。根頂端分生組織被保護性根冠覆蓋，根頂端分生組織中心中的細胞被稱為“靜止中 心”(quiescent center)，因為它們分化緩慢。靜止中心被形成初級分生組織的祖細胞覆至
ΓΤΠ ο但是，有關根頂端分生組織的生理特性的研究不足，盡管這些特定在植物的根系 統中非常重要。特別是，由許多研究，其中諸如玉米被用于研究靜止中心的生理特性或者根 頂端分生組織在培養基中培養以形成根，但是其中沒有在根系統的各種組織包括根冠、維 管組織、中柱鞘、內皮、皮層和表皮中僅僅分離靜止中心以建立細胞系的例子。因此，靜止中心是遺傳學上最穩定的組織，其分離使得能夠研究植物的開發和遺 傳來源。因此，需要開發從靜止中心分離同質細胞系的方法。近年來，干細胞生物學領域新 近出現，與干細胞有關的許多實驗，包括有關在發育過程中涉及的信號的研究已經在進行。 但是，在動物的情況下，分離和培養干細胞的方法早已建立，相反，在植物的情況下，有關干 細胞分離的研究很少或者沒有。因此，考慮來自靜止中心的細胞系的誘導和分離可促進干 細胞生物學的發展。因此，本發明的發明人付出了極大的努力來開發分離單細胞來源的來自靜止中心 的細胞系的方法并開發可在植物表達系統中使用而不需要去分化步驟的植物細胞。結果， 本發明的發明人已經分離了來自靜止中心的細胞系，并且發現在長期培養過程中分離的細 胞系發生了很小的變化或者沒有變化，可以穩定地培養，并在低溫儲藏過程中顯示了高度 的細胞存活率(Viability)，由此完成了本發明。
發明內容
發明目的本發明的目的在于提供可穩定培養的來自靜止中心的細胞系。本發明的另一目的在于提供分離來自靜止中心的細胞系而不需要去分化步驟的 方法。技術方案為了實現上述目的，在一個方面，本發明提供了分離來自靜止中心的細胞系的方 法，所述方法包括培養含有靜止中心的植物根部組織，然后從培養組織中收集未分化的白
^iJi/口、 (white tissue)。在另一方面，本發明提供了來自靜止中心的細胞系，所述細胞系來自植物的靜止 中心并具有如下特征(a)在懸浮培養過程中其以單個細胞存在；(b)其顯示細胞核比那些來自靜止中心之外其他組織細胞系的細胞核大的形態學 特征；(c)其被粘液物質圍繞；(d)在長期培養過程中其被穩定保持而沒有形態學變化；以及(e)在低溫儲藏過程中其顯示較高的存活率。在還一方面，本發明提供了保存細胞系的方法，其包括冷凍所述來自植物根部靜 止中心的細胞系。通過下列詳細描述和隨附的權利要求書，本發明的其他特征和方面將是容易想到 的。
圖IA是細胞系的光學顯微照片，其通過培養水稻植物的含有靜止中心的根部組 織誘導，但處于從休眠的根部分離之前的狀態，圖IB是來自靜止中心的細胞系的照片，其 從組織中被分離并培養4周。圖2示出了通過在分別含有2，4-D (A)、CPA⑶、IAA (C)、IBA⑶、NAA (E)和毒莠定 (picloram) (F)的培養基中培養含有靜止中心的水稻植物的根部組織得到的組織的光學顯 微照片。圖3示出了顯示來自水稻植物的靜止中心之外其他根部組織的細胞系(圖3(a)) 和來自靜止中心的細胞系(圖3(b))的形態學觀察的顯微照片。圖4示出了通過在分別含有2，4-D (A)、CPA⑶、IAA (C)、IBA⑶、NAA (E)和毒莠定 (picloram) (F)的培養基中培養玉米植物的含有靜止中心的根部組織得到的組織的光學顯 微照片。圖5顯示了在培養時期來自靜止中心之外其他根部組織的細胞系中發生的形態
學變化。圖6顯示了在培養時期來自靜止中心的細胞系的形態學穩定性。圖7A是來自靜止中心的細胞系的光學顯微照片(400x放大)，圖7B是來自根部組 織的細胞系的光學顯微照片(400x放大)。圖8示出了顯示來自靜止中心之外其他根部組織的細胞系(圖8(a))與來自靜止中心的細胞系(圖8(b))之間的對比光學顯微照片。圖9是顯示來自不同于靜止中心的根部組織的細胞系和來自靜止中心的細胞系 的聚集速度的示意圖。圖10示出了顯示來自靜止中心之外其他根部組織的細胞系(圖8(a))與來自靜 止中心的細胞系(圖8(b))之間的在低溫儲藏之后存活率的對比光學顯微照片。圖11是顯示來自靜止中心之外其他根部組織的細胞系與來自靜止中心的細胞系 之間的在低溫儲藏之后存活率的對比示意圖。
具體實施例方式除非特別限定，這里使用的所有技術和科學術語與本領域普通技術人員通常所理 解的具有相同含義。一般說來，這里使用的各種術語的定義在本領域是公知且常用的。在一個方面，本發明涉及分離來自靜止中心的細胞系的方法，所述方法包括培養 含有靜止中心的植物根部組織，然后從培養組織中收集未分化的白色組織。優選地，在本發明中使用的含有靜止中心的植物根部組織通過使滅菌植物種子發 芽得到，或者其為由來自植物的一部分的愈傷組織分化的根部組織。而且，在培養過程中使 用的培養基可以是本領域技術人員已知的任何細胞系誘導培養基，但組織培養優選在選自 N6培養基、MS培養基、GamborgB5培養基、LS培養基和KAOM培養基中的任意一種培養基中 進行。更優選地，組織培養在含有2，4-D的培養基中進行。此外，在本發明中，來自靜止中 心的細胞系的收集優選在組織培養3-6周之后進行。在本文中，術語“靜止中心”指的是包括定位在根頂端分生組織中央的500-1000 個不活躍細胞的球狀或盤狀單細胞群。該細胞群的細胞已知長期處于細胞周期的Gl期細胞并以大約15-20天的間隔分裂。這些細胞常常以不活躍狀態存在，并且當它們在切割或 者通過輻射處理過程中受到傷害時分裂。特別是，當植物的根穿透到土壤中時，根冠有效地 保護了根頂端分生組織，但是由于保護的不完全，根頂端分生組織在根生長過程中有時會 受到傷害。此時，靜止中心的細胞分裂再次形成頂端分生組織和根冠。而且，當暴露于X射 線中時，細胞停止分裂，但是靜止中心細胞立即開始分裂形成正在分裂的細胞而不受X射 線的影響。換言之，靜止中心是遺傳穩定細胞儲存在其中的位置。靜止中心分化成作為根 部基本分生組織的原形成層、基本分生組織和原表皮層。 靜止中心可從植物的根部得到。優選地，其可從來自滅菌種子發芽小苗的根部得 到，或者可從來自植物的一部分的愈傷組織分化而成的根部組織得到。優選通過從根尖除 去根冠并從切割表面收集大約Imm厚度的部分得到在細胞系誘導培養基中培養的外植體。 在組織培養之前，可根據本領域技術人員已知的一般方法對收集的植物根部組織進行滅菌 步驟。但是，當有滅菌種子發芽小苗的根被使用時，對收集的根部組織不用進行單獨的滅菌 步驟。細胞系誘導培養基可以是本領域技術人員已知的任何培養基，其例子包括N6培養 基(Chu C. C. ，Proc. Symp. Plant Tissue Cult. ，Peking, 43,1978)，MS 培養基(Murashige Τ.和 Skoog F.，Physiol. Plant, 15 :473，1962)，Gamborg B5 培養基(Gamborg 0. L.等 人，Exp.Cell Res. ,50 :151，1968)，LS 培養基(LinsmaierE. M.禾Π Skoog F.，Physiol. Plantarum.，18 :100，1965)，KAO M培養基(Kao K. N.和 Michayluk M. R.，Planta. (Berl.)， 126 105，1975)，但不限于這些培養基。 更優選地是，根部組織在含有生長素的2，4-D培養基中培養。這里，2，4-D以2mg/ L的濃度被包含，更優選2-7mg/L。對于細胞系誘導的特定培養條件、培養周期等給予植物 細胞的種類和性質確定，這些因素的確定對本領域技術人員來說是容易想到的。在組織培養期間，觀察了來自靜止中心以外的根部組織的細胞與來自靜止中心的 細胞之間形態學差異。來自靜止中心以外的根部組織的細胞系為非同質的并且顯示局部分 化，但來自靜止中心的細胞系為同質的并且不顯示局部分化。而且，但視覺觀察時，來自靜 止中心以外的根部組織的細胞系為黃色，而來自靜止中心的細胞系為白色并被粘液物質圍 繞。即，來自靜止中心的細胞系顯示為“未分化的白色組織”。粘液物質被認為是粘蛋白原。 粘蛋白原已知為由根冠周圍的細胞和根部的表皮細胞分泌的復合多糖，包括糖、有機酸、維 生素、酶和氨基酸。因此，基于形態學差異，僅僅來自靜止中心的細胞系可被選擇。圖IA是顯示分離 之前來自靜止中心的細胞系的照片。在圖IA中，紅色圓形部分是來自靜止中心的細胞系。 圖IB是顯示分離后培養4周的來自靜止中心的細胞系的照片。來自靜止中心的細胞系的收集優選在培養3-6周之后進行，更優選在含有靜止中 心的植物根部組織接種在培養基中培養4-5周之后。大約接種之后3-6周，來自靜止中心 的細胞系被誘導，因此其分離變得容易。由于靜止中心是所有植物都具有的組織，本發明的分離來自靜止中心的細胞的 方法可應用于所有植物，因此來自靜止中心的細胞系可得自所有植物。即，在本發明的一 個實施例中，細胞系從水稻和玉米植物的根部組織的靜止中心分離，但對本領域技術人員 來說顯而易見的是，本發明的方法可被應用于具有靜止中心的所有植物。從其得到來自 靜止中心的細胞系的植物的例子可包括但不限于水稻植物、玉米植物、豌豆、燕麥(Avena
6sativa)、洋蔥和擬南芥(Arabidopsis)。其靜止中心的生理學性質已經被研究的植物的 例子可包括玉米植物、擬南芥、洋蔥、燕麥和豌豆等[Maize :Georgina Ponce等人，Plant Cell and Environment,28 719,2005 ；Keni Jiang φ A, Development,130 1429,2003 Arabidopsis :Noriko Kamiya 等人，The Plant Journal, 35 429,2003 ；Peter Doerner, Current Biology,8 :R42,1998 ；AlIium cepa :R. Liso, NewPhyto 1. ，110 -.469,1998 ；Avena sativa :F. A. L. Clowes, New Phytol. ,129,1982 ；Pisum sativum :Peter Doemer, Current Biology,8 :R42，1998]。在另一方面，本發明涉及來自靜止中心的細胞系，其來自植物的靜止中心并具有 如下性質(a)在懸浮培養過程中其以單個細胞存在；(b)其顯示細胞核比那些來自靜止中心之外其他組織細胞系的細胞核大的形態學 特征；(c)其被粘液物質圍繞；(d)在長期培養過程中其被穩定保持而沒有形態學變化；以及(e)在低溫儲藏過程中其顯示較高的存活率。本發明的來自靜止中心的細胞系顯示細胞核相對較大的形態學特征。觀察到細胞 核的尺寸大約為2-4 μ m，大于來自靜止中心之外其他組織的細胞系的細胞核。本發明的來自靜止中心的細胞系還顯示非常穩定的細胞生長而沒有形態學變化， 即便當其被長期培養時也是如此。在本發明的一個例子中，觀察到來自靜止中心的細胞系 被穩定培養而沒有形態學變化，即便當其被培養超過16周以上時也是如此。另一方面，當 來自靜止中心以外的根部組織的細胞系長期培養時，在細胞團(cell aggregation)中觀察 到一些局部分化，特別是，不定根的發育清楚地被顯示。另外，與以單細胞培養的微生物細胞不同，植物細胞以細胞團的形式被培養。這 種細胞團引起細胞團內部與外部之間的環境差異，由此引起細胞生長和有用物質產生的變 化。但是，本發明的來自靜止中心的細胞系不具有這種變化的可能性，因為在懸浮培養過程 中其以單個細胞被培養。根據本發明的來自靜止中心的細胞可在植物表達系統中使用以穩定生產有用物 質。而且，根據本發明的來自靜止中心的細胞可根據植物細胞懸浮培養法進行培養，特定培 養方法可按照本領域已知的那樣進行。在還一方面，本發明涉及保藏植物細胞系的方法，包括冷凍所述來自植物根部的 靜止中心的細胞系。此外，在低溫儲藏過程中植物細胞顯示低存活率，但當其根據常規細胞低溫儲藏 方法進行時，本發明的來自靜止中心的細胞系顯示了超過85%的非常高的存活率。如果細 胞系可被低溫儲藏，則能夠穩定提供原材料并構建非常有價值的主細胞庫(substantial master cell bank)。因此，本發明的來自靜止中心的細胞系可以長期穩定的方式被提供。世界現在正處于保護研究材料(生物資源)的戰爭之中，并且用于開發各種新藥 和改善食物質量的生物資源包括人體組織、植物種子、微生物、細胞和基因的保存和鑒定已 經變成了非常重要的國際性財產(national properties) 0因此，由于保護研究材料導致國際競爭，要求構建細胞系庫用于開發、收集、保藏并分配在生物科學相關領域研究中用作必須材料的細胞系。因此，當所述植物細胞庫被構 建時，研究材料的供應可得到緩解，采用植物細胞系的研究周期可被縮短。實施例此后，將參照實施例進一步詳細描述本發明。對本領域技術人員來說容易想到的 是，這些實施例僅僅用于解釋的目的，而不是用于限制本發明的范圍，因為這些實施例可被 修改成其他各種形式。實施例1 來自水稻植物靜止中心的細胞系的分離1-1 植物材料的制備將水稻種子去殼，使用70%酒精表面滅菌1分鐘，在2%次氯酸鈉溶液中浸泡1小 時，然后使用無菌水洗滌一次或兩次。將洗滌的種子使用無菌水充分洗滌30分鐘，然后干 燥到完全除去濕氣。將干燥的種子接種到N6培養基(CHU MEDIUM, Chu C. C.，Proc. Symp. Plant Tissue Cult.，Peking, 43,1978)中并在25°C下培養5天，使它們發芽。N6培養基的組分在下表1 中顯示。表 權利要求
一種分離來自靜止中心的細胞系的方法，所述方法包括培養含有靜止中心的植物根部組織，然后從培養組織中收集未分化的白色組織，其中所述細胞系來自植物的靜止中心并具有如下特征(a)在懸浮培養過程中其以單個細胞存在；(b)其顯示細胞核比那些來自靜止中心以外的細胞系的細胞核大的形態學特征；(c)其被粘液物質圍繞；(d)在長期培養過程中其被穩定保持而沒有形態學變化；以及(e)在低溫儲藏過程中其顯示較高的存活率。
2.根據權利要求的1所述的分離來自靜止中心的細胞系的方法，其特征在于，所述含 有靜止中心的植物根部組織通過使滅菌的植物種子發芽得到或者來自植物的一部分的愈 傷組織分化的根部組織得到。
3.根據權利要求的1所述的分離來自靜止中心的細胞系的方法，其特征在于，組織培 養在含有2，4-D的培養基中進行。
4.一種來自靜止中心的細胞系，其來自植物靜止中心并具有下列特征(a)在懸浮培養過程中其以單個細胞存在；(b)其顯示細胞核比那些來自靜止中心以外的細胞系的細胞核大的形態學特征；(c)其被粘液物質圍繞；(d)在長期培養過程中其被穩定保持而沒有形態學變化；以及(e)在低溫儲藏過程中其顯示較高的存活率。
5.根據權利要求4所述的來自靜止中心的細胞系，其特征在于，所述植物選自下組，包 括水稻植物、玉米植物、豌豆、燕麥、洋蔥和擬南芥。
6.一種保存植物細胞系的方法，其特征在于，包括冷凍根據權利要求4或5的來自植物 根部靜止中心的細胞系。
全文摘要
本發明涉及來自植物靜止中心的細胞系及其分離方法，具體涉及從靜止中心細胞分離的單細胞來源的同質細胞及其分離方法，所述單細胞得自植物的靜止中心而不需要進行單獨的去分化步驟。
文檔編號C12N5/04GK101939415SQ200880108092
公開日2011年1月5日 申請日期2008年9月22日 優先權日2007年9月21日
發明者俞英美, 李恩景, 洪順美, 陳榮雨 申請人:云火公司