專利名稱：負載干細胞的心包膜、及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種醫用材料，尤其涉及一種用于盆底重建及腹壁疝氣修補的負載干細胞的脫細胞心包膜、及其制備方法和應用。
背景技術：
盆底損傷及功能退化造成的女性盆底器官脫垂(Pelvic Organ ftx)lapSe，P0P)和壓カ性尿失禁(Stress Urinary Incontinence, SUI)嚴重影響女性生活質量，并已成為較為突出的社會生活問題。造成女性盆底器官脫垂的原因包括產傷、神經肌肉的損傷、環境因素及遺傳因素等。治療盆底器官脫垂，除了功能訓練外，手術重建是主要的治療方法。傳統的外科治療行陰道前后壁修補和子宮切除術，兩者均不能提高組織本身的強度，未能達到盆底解剖結構重建的目的，故術后復發率高。近年來，合成網片材料在盆底重建手術中得到了廣泛應用，隨機對照試驗表明應用網片的盆底重建手術的術后復發率明顯低于傳統盆底修補木。盆底重建手術中使用的合成網片材料多為聚丙烯、聚乙烯網片，其孔隙率較高，組織融合較佳，具有良好的生物力學性能。如楊蘋等在《聚丙烯網片在治療女性盆底障礙性疾病手術中的應用研究》(河北醫藥， 2010年第18期)一文中公開了使用人工合成聚丙烯網片進行盆底修補和重建，具有經濟， 微創，盆底整體修復可保留子宮，并發癥少，術后復發率低等優點，近期效果肯定；李懷芳等在《聚丙烯網片在女性全盆底功能重建中的應用》(中國實用婦科與產科雜志，2007年第8 期)一文中探討了聚丙烯網片在保留子宮的同時進行盆底重建的可行性和有效性，中、短期療效穩定。但是人工合成網片仍存在較多并發癥，如侵蝕(Erosion)、暴露(Exposure)、感染(Infection)、疼痛(Pain)、性交不適(Dyspareunia)等影響患者術后生活質量。Daniel Altman等人對比分析了傳統外科手術和使用聚乙烯補片手術的兩種患者，結果，使用聚乙烯補片與傳統修補術相比，短期改善效果更好，但是有更多的術后并發癥和返エ修補的需要。從目前盆底修復和重建外科的發展趨勢來看，網片修補比傳統修補術有更好的應用前景，網片的材質也在不斷的經歷嘗試和革新，但是仍需要制備具有更高改善率和更少并發癥的網片，因此，制備新的盆底重建醫用材料是盆底重建領域的重要研究內容。
發明內容
針對目前盆底重建材料存在的缺陷，本發明提供了一種用于盆底重建的新的材料、以及所述材料的制備方法，以脫細胞心包膜為基材，負載干細胞，制成一種負載干細胞的心包膜補片。本發明的第一個目的是提供一種制備所述負載干細胞心包膜的方法，步驟包括 步驟1，將心包膜進行脫細胞、化學交聯改性制備脫細胞心包膜；
步驟2，將脫細胞心包膜與干細胞共培養，得到負載干細胞脫的細胞心包膜。
其中，所述干細胞選自脂肪干細胞、骨髄間充質干細胞、羊膜干細胞。其中，所述心包膜可以是牛心包膜、羊心包膜、豬心包膜。本發明所述的制備負載干細胞的心包膜的方法，步驟2中所述共培養方法包括: 干細胞的分離和培養；消化收集培養后的干細胞接種于脫細胞心包膜上，然后進行培養。其中，干細胞接種于脫細胞心包膜時的接種濃度優選為IX IO4個/cm2。其中，所述消化收集的培養后的干細胞優選為第4代干細胞。其中，所述培養溫度為優選為35 38 °C，更優選為37で。本發明的第二個目的是提供ー種上述方法制備的負載干細胞的心包膜。本發明的第三個目的是提供ー種上述負載干細胞的心包膜的應用，所述負載干細胞的心包膜用于制備盆底重建及腹壁疝氣修補材料。優選地，所述盆底重建材料為負載干細胞的心包膜補片。所述負載干細胞的心包膜補片厚度優選為(0. 5士0. 2)mm。本發明制備的負載干細胞的心包膜補片，干細胞與心包膜粘附性良好，細胞分泌基質旺盛，通過增殖檢測，干細胞在心包膜上增值速度快，說明具有良好的生物相容性。本發明所述負載干細胞的心包膜補片，可用于臨床盆底重建及腹壁疝氣修補外科，能夠制作成一種新的重建材料，為減少重建術后并發癥提供有意義的參考。
圖1為HE染色觀察脫細胞牛心包膜照片； 圖2為掃描電鏡觀察脫細胞牛心包膜照片；
圖3為兔脂肪干細胞原代培養第二天倒置相差顯微鏡照片； 圖4為熒光倒置相差顯微鏡觀察兔脂肪干細胞在脫細胞牛心包膜； 圖5為掃描電鏡觀察兔脂肪干細胞在脫細胞牛心包膜上粘附生長情況照片； 圖6為兔脂肪干細胞牛心包膜體外復合培養增殖曲線圖。
具體實施例方式本發明提供了一種負載干細胞的心包膜、所述負載干細胞心包膜的制備方法和應用，利用化學交聯的脫細胞心包膜與干細胞共培養，最終獲得負載干細胞的脫細胞心包膜。下面通過具體實施了對本發明負載干細胞的心包膜、及其制備方法和應用進行詳細的介紹和描述，以使更好地理解本發明內容，但是應當理解的是，下述實施例并不限制本發明范圍。實施例1
步驟1，將牛心包膜進行脫細胞、化學交聯改性制備脫細胞牛心包膜牛心包膜從正常小牛壁層心包膜中獲取，經過脫細胞、清洗、抗病毒和環氧乙烷化學交聯改性處理后，凍干，電子束消毒備用。成品脫細胞牛心包膜材料為瓷白色膜狀物，柔軟，富有弾性。圖1為HE (蘇木精-伊紅)染色脫細胞牛心包膜在200倍放大倒置相差顯微鏡下觀察的照片，從圖中可以看出，脫細胞牛心包膜由呈波浪狀、染成紅色的膠原纖維組成，光滑面纖維排列緊密，粗糙面纖維排列疏松，無細胞殘留。
掃描電鏡100倍放大觀察脫細胞牛心包膜，電鏡照片見圖2，可見脫細胞牛心包膜纖維排列致密且方向較一致，纖維保存完好，無細胞殘留。步驟2，將脫細胞牛心包膜與干細胞共培養，得到負載干細胞脫細胞牛心包膜 2. 1.兔脂肪干細胞(rADSCs)的分離和培養
取兔腹股溝部皮下脂肪組織2. (Γ3. Og,充分剪碎后，加入0. 1% I型膠原酶溶液20mL， 在37°C恒溫搖床消化60min后，2000r/min離心lOmin，除去上清液并獲得高密度的細胞沉淀物，加入培養液使細胞重懸，此即為脂肪干細胞。按IO6個/mL的細胞密度接種于培養皿內，加入培養液至8mL。將接種好細胞的培養皿置于37°C、體積分數為5%C02、100%飽和濕度的條件下，培養4 后首次換液。倒100倍放大置相差顯微鏡下觀察見大量的細胞貼壁和漂浮的血細胞(圖3)，細胞伸展呈成纖維細胞樣，生長有方向性。用PBS反復輕輕沖洗去除漂浮的細胞，加入培養液。隔天換液，細胞融合至80%傳代。本實施例中選用第4代rADSCs進行實驗。2. 2. Dio標記的rADSCs接種于脫細胞牛心包膜材料
消化收集第4代rADSCs后，用無血清的LG-DMEM調整細胞濃度至5 X IO5個/mL。每毫升細胞懸液加5μ 的DiO染液，混合均勻。放入培養箱孵育20min，1500r/min離心5min，棄上清。用含10%FBS的LG-DMEM液清洗2次后把標記好的rADSCs按1 X IO4個/cm2接種在大小為IOmmX IOmmXO. 5mm的脫細胞牛心包膜材料上，置于37°C培養箱培養4小時后加GM 液，以剛沒過材料為宜，繼續培養，隔天換液。倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態，掃面電鏡觀察細胞的生長狀態。100倍倒置熒光顯微鏡觀察(圖4和圖5) :DiO標記的兔脂肪干細胞-脫細胞牛心包復合物體外培養5d吋，可見帶綠色熒光的細胞均勻黏附于脫細胞牛心包膜材料上；細胞形態呈纖維樣或卵圓形，以卵圓形為主(圖4)。100倍掃描電鏡觀察兔脂肪干細胞-脫細胞牛心包膜復合物體外培養5d時，細胞與材料黏附良好，細胞分泌基質較旺盛，與脫細胞牛心包膜材料連成一體(圖5)。收集第4代rADSCs重懸后，以1 X IO4個/cm2的密度接種于脫細胞牛心包膜支架材料上，置37°C培養箱培養4小時后加培養液，以剛沒過材料為宜，繼續培養，隔天換液。接種后1，2，3，4，5，6，7，8天取樣本做DNA含量檢測各復合物碾碎后分別放入EP管中，加入 500 μ L蛋白酶K (0. 5mg/mL)溶液56°C水浴過夜，12000g離心10分鐘，收集上清液。各待測樣本40 μ L加入黑色96孔板，各孔加入160 μ L Hoechest 33258工作液，37°C避光孵育 20min,輕彈板孔后，酶標儀測定熒光強度，激發波長為360nm，發射波長465nm，通過DNA含量計算細胞數量。兔脂肪干細胞-脫細胞牛心包膜復合物的體外増殖檢測(圖6)兔脂肪干細胞在脫細胞牛心包上増殖良好，3、d時增勢速度最快，6d時兔脂肪干細胞在脫細胞牛心包上增殖達到頂峰，以后増殖基本趨緩，說明rADSCs與牛心包膜具有良好的生物相容性。實施例2
參照實施例1所述方法，采用豬心包膜作為基材，將小鼠骨髄間充質干細胞接種于脫細胞豬心包膜上共培養，DNA定量法測定顯示小鼠骨髄間充質干細胞在交聯脫細胞豬心包膜上増殖良好，DIO染色標記跟蹤小鼠骨髄間充質干細胞在交聯脫細胞豬心包膜上生長良好，掃描電鏡觀察示小鼠骨髄間充質干細胞在交聯脫細胞豬心包膜上的形態正常，分泌細胞基質旺盛。將本發明上述實施例制備的負載干細胞的心包膜制成用于盆底重建的補片，動物實驗表明，相比于人工合成網片(聚乙烯和聚丙烯)，幾乎不會出現新的壓カ性尿失禁，并且沒有出現并發癥；此外還可以用于腹壁疝氣修補。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
權利要求
1.一種制備負載干細胞的心包膜的方法，其特征在干，步驟包括 步驟1，將心包膜進行脫細胞、化學交聯改性制備脫細胞心包膜；步驟2，將脫細胞心包膜與干細胞共培養，得到負載干細胞脫細胞心包膜。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在干，所述干細胞選自脂肪干細胞、骨髄間充質干細胞、羊膜干細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在干，步驟2中所述共培養方法包括干細胞的分離和培養；消化收集培養后的干細胞接種于脫細胞心包膜上，然后進行共iロ養。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在干，所述心包膜選自牛心包膜、羊心包膜、豬心包膜。
5.ー種上述任意一項權利要求所述方法制備的負載干細胞的心包膜。
6.ー種包括權利要求5所述的負載干細胞的心包膜應用，其特征在干，所述負載干細胞的心包膜用于制備盆底重建材料及腹壁疝氣修補材料。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在干，所述盆底重建及腹壁疝氣修材料為負載干細胞的心包膜補片。
全文摘要
本發明提供了一種負載干細胞的心包膜的制備方法、將干細胞接種于脫細胞的心包膜上，制備出一種負載干細胞的心包膜、以及負載干細胞的心包膜補片。干細胞與脫細胞心包膜之間具有良好的生物相容性，制作過程簡單易行，不涉及任何有毒有害試劑，所制備的負載干細胞的心包膜及其補片可用于臨床盆底重建及腹壁疝修補外科。
文檔編號A61L27/38GK102552997SQ20121000570
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者馮潔, 吳氫凱, 崔磊, 楊軍, 滕銀成, 程慧 申請人:上海市第六人民醫院