鑒定肺病藥物開發的新途徑的制作方法

專利名稱：鑒定肺病藥物開發的新途徑的制作方法
鑒定肺病藥物開發的新途徑與相關申請的交叉參考本申請要求2007年9月19日提交的美國臨時申請No. 60/994，643的優先權，其 全部講述內容在此引為參考。關于聯邦資助的研究的陳述本文描述的工作獲得資助號為Nos. NIH/NCI ROICA124640和NIH/NIEHS U01ES016035的資金支持。美國政府在本發明中具有一定權利。
背景技術：
在美國，吸煙是肺癌的主要病因，據估計占所有病例的90% [1]。但是，由吸煙引 起的傷害不僅僅限于肺，而是在整個呼吸道中構成了“損傷區域”[2-6]。損傷區域假說的一 個重要結果，是從呼吸道區域例如支氣管氣道中收集到的細胞搜集臨床相關信息的能力， 能夠獲取這些細胞的方式與收集肺基本組織的典型方法相比侵入性較低。基于這種方法， 已經開發了在細胞學正常的支氣管氣道上皮中測量的基于基因表達的生物標志物，其可以 區分患有和未患有肺癌的吸煙者[7]。在一組前瞻性試驗中，這種氣道基因表達生物標志 物在預測吸煙者是否具有肺部腫瘤中達到83%的準確率，當與臨床變量協同組合時達到 94%的準確率[7,8] ο除了用作肺癌的早期診斷工具之外，在細胞學正常的氣道上皮細胞中基因表達的 改變，有可能增進我們對肺癌早期階段過程中失調的信號傳導事件的了解。肺癌在人類中 的發展是一個復雜的過程，涉及到多個異常事件，當它們積累時，導致了關鍵細胞功能、包 括細胞存活和增殖的失調控。在從患有肺癌的患者切除的原發腫瘤中，之前已經發現許多 信號傳導途徑失調控，例如p53、RAS和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KK9-11]。此外，在損傷和 區域癌化領域中的研究，已經發現某些據推測是腫瘤發生早期的分子變化，在原發腫瘤附 近和更遠的組織學正常的細胞中也得到了反映。例如，在整個呼吸道中已經鑒定到了特定 染色體區域處的相同的P53突變或雜合性喪失[5，12]。對于來自患有肺癌的吸煙者的細胞學正常的支氣管氣道細胞中致癌途徑失調控 的認識，將幫助闡明向惡性腫瘤的發展中所涉及的機理。此外，理解哪些途徑失調控，可以 產生在肺癌的惡變前階段的治療和化學預防機會。發明概述以前已經證實，細胞學正常的支氣管氣道上皮細胞的基因表達情況分析反映出吸 煙者中的損傷區域，可以用作肺癌的靈敏和特異性的診斷生物標志物。正如本文所描述的， 使用由體外干擾特異性致癌途徑所確定的基因表達特征，在患有肺癌的吸煙者的細胞學正 常的氣道(η = 129)中以及肺腫瘤組織(η = 107)中，鑒定到了磷脂酰肌醇3-激酶(ΡΙ3Κ) 途徑活性的顯著增加。為了評估ΡΙ3Κ活性的增加是否發生在肺癌發生之前，對于具有中 等-嚴重發育異常病變的高風險吸煙者他們氣道中細胞學正常的氣道上皮細胞(η = 14) 進行了表達情況分析，與來自沒有發育異常的健康吸煙者的氣道上皮細胞(η =11)相比， 發現了較高水平的ΡΙ3Κ途徑基因表達。此外，在用化學預防藥劑肌醇治療后發育異常明顯 消退的高風險吸煙者(η=10)的氣道中，ΡΙ3Κ活性降低了。體外稀釋實驗證實肌醇抑制PI3K途徑，這不僅提出了肌醇的作用機制，而且反映出PI3K途徑活性與氣道發育異常的消 退之間潛在的治療關聯。合在一起，這些發現表明，PI3K途徑的失調控，是肺癌發展中的早 期、可測量并可逆的步驟，在吸煙者中進行氣道基因表達情況分析，可能能夠化學預防和治 療的個體化途徑。在一個實施方案中，本發明提供了在患有肺病的個體的細胞學正常的氣道上皮細 胞中活化的致癌途徑的生物標志物。這些生物標志物和途徑可以提供肺病例如肺癌的預后 和/或診斷指示物。此外，這些途徑和生物標志物可以提供用于肺病治療的治療靶，以及用 于評估療效的標志物。一方面，本發明涉及使用基因表達情況分析方法鑒定在肺病例如肺癌中活化的致 癌途徑的基因表達特征。這些基因表達特征可以為肺病例如肺癌提供預后或診斷指示物。 此外，在肺病中活化的致癌途徑可以作為治療干預的靶。在一個實施方案中，致癌途徑可以 是例如PI3K和Np63途徑中的一種或多種。本發明還涉及鑒定肺病風險增加的個體的方法，包括確定來自所述個體的細胞學 正常的氣道上皮細胞中Np63和/或PI3K途徑的活化狀態，其中Np63和/或PI3K途徑的活 化，是所述個體與其中Np63和/或PI3K途徑沒有活化的個體相比處于肺病增加的風險下 的指征。在具體實施方案中，個體是吸煙者或非吸煙者。在其他實施方案中，肺病是肺癌。在一個實施方案中，PI3K途徑的活化狀態使用PI3K途徑的一種或多種生物標志 物的基因表達數據來確定。例如，在某些實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至少 一個是在PI3K活化后增加的基因，在其他實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至 少一個是在PI3K活化后降低的基因。也可以使用在PI3K活化后增加和降低的生物標志物 的組合。在具體實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至少一個是PI3K活化上游的 基因，而在其他實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至少一個是PI3K活化下游的 基因。在具體實施方案中，所述PI3K途徑的一種或多種生物標志物的表達數據使用寡 核苷酸微陣列來獲得。在其他實施方案中，PI3K途徑的活化狀態使用PI3K途徑的一種或 多種生物標志物的一種或多種基因表達產物來確定。所述基因表達產物可以是核苷酸或氨 基酸產物，并可以使用本技術領域已知的方法來檢測。在本發明的某些實施方案中，PI3K途徑的活化狀態通過評估IGFlR的活化來確 定，其中IGFlR的活化是PI3K途徑活化的指示。在本發明的其他實施方案中，PI3K途徑的 活化狀態通過評估PKC的活化來確定，其中PKC的活化是PI3K途徑活化的指示。本發明還涉及肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學 正常的氣道上皮細胞中PKC的活化狀態，其中PKC的活化表明所述個體與其中PKC沒有活 化的個體相比，肺病的風險增加。本發明還涉及肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學 正常的氣道上皮細胞中IGFlR的活化狀態，其中IGFlR的活化表明所述個體與其中IGFlR 沒有活化的個體相比，肺病的風險增加。在其他實施方案中，本發明提供了寡核苷酸陣列，其上固定有一種或者多種用于 PI3K途徑的一種或多種生物標志物的探針，并且其中所述陣列上沒有固定有用于其他生物 標志物的探針。在優選實施方案中，所述PI3K途徑的一種或多種生物標志物選自IGF1R、PKC、在[29]中公開的生物標志物，以及它們的組合。本發明還涉及在個體中降低肺病風險的方法，包括向具有肺病風險的個體施用一 種或多種抑制PI3K途徑的藥劑(例如一種或多種藥劑、治療方案或療法或其組合)。在具 體實施方案中，在施用所述一種或多種藥劑之前，所述個體中的PI3K途徑被活化。在一個 實施方案中，肺病是肺癌。在另一個實施方案中，在肺病發展之前預防性地向所述個體施用 所述一種或多種藥劑。在另一個實施方案中，本發明涉及對細胞學正常的測試氣道上皮細胞進行差異分 類的方法，包括在正常氣道上皮細胞中鑒定與目標生物學途徑的活化有關的基因表達特 征；評估差異分類的氣道上皮細胞中的基因表達，以便在氣道上皮細胞的分類與目標生物 學途徑的活化之間鑒定一種或多種關聯性；以及在細胞學正常的測試氣道上皮細胞中評估 基因表達，其中待分類的細胞學正常的氣道上皮細胞的基因表達情況表明了目標生物學途 徑是否被活化，因此對細胞進行了差異分類。在具體實施方案中，目標生物學途徑是致癌途徑。在某些實施方案中，差異分類是 疾病風險的增加與疾病風險的降低，而在其他實施方案中，差異分類是對治療的響應與對 治療的無響應。在一個實施方案中，本發明提供了在患有肺病例如肺癌或具有肺病例如肺癌風險 的哺乳動物中鑒定致癌途徑的活化的方法。方法可以包括；(a)提供生物學樣品，例如來自 哺乳動物氣道通道的生物學樣品，其中生物學樣品含有來自表明所述途徑的活化的至少一 個基因的基因表達產物(例如mRNA或蛋白)，以及(b)檢測所述基因的表達。例如，途徑可 以是下列的一種或者多種1^8，1^(3』2卩3，β-聯蛋白，Src，Np63，PI3K及其組合。哺乳動 物可以是例如人類。生物學樣品可以從例如支氣管、鼻或口腔上皮提供，或來自活檢組織樣 品。在一個實施方案中，基因表達的檢測使用寡核苷酸陣列來完成，所述陣列上固定有一種 或者多種用于相關基因的探針的核苷酸序列或其片段。致癌途徑活化的鑒定，可表明哺乳 動物是進行治療以抑制所述途徑活化的候選者，或進行另外的或更頻繁的篩查以鑒定疾病 例如癌癥的發展的候選者。在另一個實施方案中，本發明提供了可用于治療肺病、例如肺癌的候選治療性藥 劑的篩選方法。例如，可以針對它們調節(例如抑制)通過本文描述的方法鑒定到的與肺病 相關的致癌途徑的活化的能力，來篩選候選藥劑。藥劑調節途徑活化的能力，可以通過例如 它將致癌途徑的基因表達特征，從與疾病相關的特征改變為與疾病無關、例如正常的特征， 來進行評估。可選地，候選治療藥劑，可以針對其調節所述途徑的特異性功能效應或輸出結 果的能力，來進行評估。被鑒定為有能力抑制與肺病相關的活化的致癌途徑的藥劑，可能適 合于在哺乳動物中治療肺病。此外，治療方案的效果，可以通過在治療過程中的不同時間點處評估哺乳動物的 基因表達特征來進行評價。致癌途徑的基因表達特征從與疾病相關的特征向與疾病無關的 特征、例如正常特征的轉變，表明了治療的有效性。同樣地，不存在基因表達特征向正常特 征的轉變，表明治療是無效的，并表明了可能需要替代治療方案。附圖簡述

圖1A-1C顯示了 PI3K和Δ Np63在患有肺癌的吸煙者中差異活化。使用在體外基 因表達特征上訓練過的二元回歸模型，計算了從細胞學正常的氣道獲得的樣品中的途徑活化概率。途徑水平使用加框圖區概括，其中橫線表示中值，框表示從第25到第75百分率的 數據點的范圍，須線表示其余第1和第4個四分之一部分的范圍。正如在圖IA中所示，當 通過肺癌狀態(藍色表示無肺癌，紅色表示肺癌)對活化水平進行分組時，發現在隨機排列 試驗后兩種途徑是有統計學差異的ΡΙ3Κ(ρ < 0.001)，ΔΝρ63(ρ < 0.001)。為了說明可 能對在患有肺癌的吸煙者的氣道中看到的途徑活化中觀察到的差異造成混淆的變量，對于 健康的從不吸煙(綠色)、以前吸煙(棕色)和當前吸煙者(灰色)(圖1Β)，以及患有(橙 色)或未患(灰色)慢性阻塞性肺病(COPD)(圖1C)的當前吸煙者，也計算了途徑活化概 率。沒有可能造成混淆的變量在途徑活化中顯示出統計學顯著的差異。圖2顯示了肺腫瘤和鄰近的正常組織中的致癌途徑活性。對于肺腺癌和鄰近的正 常組織的數據組[32]計算了致癌途徑活性。當將鄰近的正常組織與其配對的腫瘤樣品進 行比較時，觀察到了 ΡΙ3Κ(ρ < 0. 001)和ΔΝρ63(ρ = 0. 002)的增加。在Myc和E2F3中也 看見了增加，在Src中存在降低。誤差須線被報告為SEM。圖3Α-3Β顯示了在前瞻性收集的氣道樣品中PI3Κ活性的生物化學驗證。從Boston 和Utah的懷疑患有肺癌的患者前瞻性收集氣道刷取物。正如在圖3A中所示，激酶分析被用 于測量PI3K途徑活性的體內水平。患有肺癌的患者一般具有比未患肺癌個體更高的PI3K 活性水平。Boston組群中的一個亞組，有額外的樣品在微陣列上運行，以便可以將計算預 測的PI3K活性與體內活性相關聯。在具有額外樣品的患者下方，顯示了途徑活性的概率。 計算預測的PI3K活性與生物化學測量的活性之間的皮爾遜(Pearson)相關性是0.48。如 圖3B中所示，對質詢PI3K上游和下游蛋白的Western印跡進行了定量，然后與圖3A中測 量的PI3K激酶水平相關聯。相關性以熱圖的方式顯示，其中藍色表示負相關性，紅色表示 正相關性。相關性分析也被分解成所有樣品、只有患有肺癌的樣品和只有對照樣品。在患 有肺癌的患者中，P-IGFlR和p-PKC 二者都與PI3K活性正相關，表明在患有肺癌的吸煙者 的氣道中，可能存在驅動PI3K途徑活性增加的子途徑。圖4證實了患有發育異常的吸煙者具有增加的PI3K途徑的活化。通過體外干擾 確定的當PI3K途徑活化時增加的基因，被顯示在熱圖中。藍色表示基因的低表達，而紅色 表示基因的較高表達。當對患有發育異常的吸煙者和健康吸煙者的細胞學正常的支氣管氣 道中這些基因的表達水平進行比較時，在患有發育異常的吸煙者中觀察到了 PI3K途徑活 化的增加。GSEA被用于定量該基因組群的富集(ρ < 0. 00LFDR Q < 0. 001)。使用考慮發 育異常狀態、每年吸煙的盒數以及說明批次效應的隨機變量的線性模型，根據GSEA對基因 進行了評級。圖5A-5C顯示了肌醇在體外抑制PI3K途徑。使用胰島素在三種不同細胞系中活化 PI3K途徑(圖5A) BEAS-2B (支氣管氣道細胞系)，(圖5B) BT549 (乳腺癌細胞系)和(圖 5C)HEK293(人類胚胎腎細胞系)。然后將細胞系用不同劑量的肌醇和LY-294002處理。測 量了 PIP3水平以定量PI3K途徑的活化水平(y-軸)。在每種測試的細胞系中，在用肌醇 或LY-294002(—種已知的PI3K抑制劑)處理后，PIP3水平發生降低，表明肌醇在體外抑 制PI3K途徑。這些實驗的重復產生了相似的結果。發明詳述根據襯于整個呼吸道的上皮細胞中基因組的改變反映了宿主對吸煙的響應和來 自吸煙的損傷這一概念，可以通過在患有肺癌或具有肺癌風險的吸煙者的氣道中鑒定哪些途徑失調控，來獲得對于導致腫瘤發生的早期事件的更好的理解。一種評估途徑活性的方 法使用了基因表達數據來聯系分離的信號傳導途徑的體外活化，以預測患者樣品中該途徑 的狀態。該方法已經成功地用于在初始事件已知的細胞系和腫瘤中預測途徑的狀態[13]。 體外確定途徑特征的力量在于，它們能夠在基因表達水平上鑒定途徑活性，允許使用單一 微陣列實驗測量多個途徑。此外，已經發現，基于基因表達的途徑活性預測，與靶向特定途 徑的藥物顯著相關[13-20]。大量研究也已發現了預測的途徑狀態與使用靶向療法的臨床 試驗中治療響應的關聯性[22-25]。本文描述的工作利用了通過體外干擾發展出的表達特征。訓練了多基因表達譜模 型，以在患有和未患有肺癌的吸煙者的細胞學正常的氣道上皮細胞中比較致癌途徑活性。 正如本文描述的，使用上述基于基因表達的途徑方法，數據顯示出，在患有肺癌的吸煙者的 細胞學正常的支氣管氣道細胞中PI3K途徑具有增加的活性水平，以及在肺腫瘤組織本身 中也具有較高水平。在從患有和未患有肺癌的患者前瞻性收集的氣道樣品組群中測量體內 PI3K活性的生物化學分析，驗證了計算預測值。來自在其氣道中具有發育異常病變的高危 吸煙者的細胞學正常的氣道的表達情況研究，也顯示了 PI3K活性的增加。因為發育異常被 認為是腫瘤前事件，因此這表明PI3K水平在肺癌發生之前增加。提供了與該結果可能的治 療關聯性的是，對化學預防藥劑肌醇有響應的高危對象，顯示出PI3K活性的顯著降低和發 育異常病變的消退。肌醇與PI3K之間的關系，通過顯示出肌醇在體外抑制PI3K而得到了 進一步的闡明。合在一起，這些結果證實，在肺癌發生之前，細胞學正常的氣道上皮細胞中的PI3K 途徑被活化，該途徑的水平與對使用肌醇的化學預防療法的響應相關。更廣義來說，這些發 現表明，氣道基因表達反映出吸煙者特定致癌途徑的干擾，潛在地允許化學預防和治療的 個體化方法。在患有肺癌的吸煙者的正常氣道中，PI3K和ΔΝρ63途徑活化增加(圖1Α)。這 是一個激起興趣的發現，因為先驗地沒有期望細胞學正常的細胞顯示出致癌途徑失調控的 跡象。此外，重要的是注意到如本文所述使用的非肺癌對照，具有也可能影響ΡΙ3Κ途徑的 廣泛的可選病理，并且不僅僅是健康的志愿者。但是，增加的活性與吸煙狀態或COPD無關 (圖 1B，1C)。在具有發育異常的氣道病變的高危吸煙者的細胞學正常的氣道中，與健康吸煙者 相比，也觀察到了腫瘤前PI3K途徑的增加。這支持了 PI3K活性在肺腫瘤發生之前被誘導 的假說。此外，在肺腫瘤中，與鄰近的正常組織相比，存在較高水平的PI3K活性(圖2)，表 明當細胞轉化時PI3K活性進一步增加。以前使用肺腺癌的小鼠模型的研究已經顯示，PI3K為肺癌惡性發展所需，抑制該 途徑阻斷了腫瘤發生[40]。在許多不同癌癥，包括肺癌中，以前也已經觀察到了 PI3K途徑 的增加的活性[41]。在腫瘤中賦予了構成性活化的失調控的一些共同原因，包括EGFR的酪 氨酸激酶結構域中的突變；腫瘤阻抑子PTEN的突變、缺失或阻抑；增加的PI3K基因拷貝數 [42]或？口冗的催化亞基？丨^^中的突變[41]。在本文描述的研究中，肺癌患者正常氣道上皮細胞中的PI3K活性，與IGFlR(上 游)和PKC (下游)的活化正相關，與HER2 (上游)和AKT (下游)不是正相關(圖3)。這些 結果表明特異性信號級聯放大在這些細胞中引起了 PI3K活化和隨后的下游效應。在某些研究中，已經將IGF信號傳導的增加的水平與肺癌相關聯。此外，現有的IGF途徑的抑制劑 已被發現在肺癌患者中具有顯著響應。PKC是PI3K下游的激酶，并且以前已經在發育異常 的病變和肺癌中被發現具有增加的水平[33，34]。合在一起，本文描述的結果暗示IGFRl/ PI3K/PKC途徑是肺癌發生的核心，即使在惡變前狀態中。臨床上重要的是，在肺癌發生之前降低PI3K水平是否將提供任何治療潛力。市場 上現有的PI3K途徑抑制劑，例如西羅莫司，具有有害的副作用，阻止了它們用作長期預防 選擇。為了幫助應對這個關鍵問題，對已經經歷了用稱為肌醇的肺癌化學預防藥劑治療的 高危組群進行了研究，肌醇以前已被發現在口服治療2-3個月后減少了氣道中的發育異常 病變[35]。與西羅莫司相反，肌醇具有被長期口服的可能性，因為它引起的副作用非常小。 在來自該組群的由其氣道中的發育異常消退所證明的對肌醇有響應的患者中，觀察到了反 映出PI3K活性降低的基因表達樣式。因為該研究的樣品數量相對有限(η = 10)，因此進行 了體外研究，并發現肌醇直接抑制ΡΙ3Κ活性，表明了該化合物的可能的作用機制(圖5)。 如果肌醇的化學預防性質在較大的臨床試驗中得到證實，在氣道中ΡΙ3Κ活性受干擾的高 危吸煙者中使用這種化合物，將能降低肺癌的發病率。對這些對象在治療后進行氣道基因 表達情況分析，也可以幫助鑒定將會從長期療法中獲益的患者的亞組。更廣泛來說，這些結 果表明，吸煙者的氣道基因表達樣式反映出特定致癌途徑的干擾，潛在地允許個體化的化 學預防和治療方法。原則上說，有多種假說可以解釋細胞學正常的氣道上皮細胞中致癌途徑的活性增 加。重要的是，這些概念不是互相排斥的，并可能以協同的方式作用以促進疾病。首先，失 調控可以由對肺癌的遺傳體質、例如致癌的種系突變引起。其次，在損傷區域假說后，吸煙 將整個呼吸道暴露于損傷，并且損傷、例如體細胞突變，可能是氣道中致癌活性的來源。對 損傷的易感性將部分取決于宿主對吸煙的反應，它受到致癌種系突變的影響。最后，賦予了 生長優勢的體細胞突變由于克隆擴增可能引起氣道中致癌活性增加。合在一起，這些研究成功地使用了計算方法來鑒定驅動肺癌腫瘤發生的信號傳導 途徑，并鑒定了可能在高危人群中預防癌癥發生的合理的定向治療方法。此外，我們的生物 化學測量值與患者樣品中的計算分析相關，突出了這種方法的特異性和靈敏性。在結合肌 醇治療以抑制ΡΙ3Κ途徑的體外和體內研究中，也看到了確證的途徑活化。這表明，ΡΙ3Κ途 徑的失調控，是肺癌發生中的早期、可測量并可逆的步驟，可用于在高危吸煙者中指導化學 預防方法。因此，本發明提供了在氣道的細胞學正常的細胞中鑒定途徑狀態(即致癌途徑狀 態)的通用方法，其可用作肺病的早期預測器，和/或可以提供用于治療性干預(例如早期 干預)的靶。根據該方法，在體外，在細胞(例如人類上皮細胞，人類原代上皮細胞培養物) 中活化了目標致癌或其他途徑，以鑒定與途徑活化相關的基因表達特征或樣式。例如，可 以使用表達目標途徑的活化或必需組分的腺病毒(例如表達Piio或其他適合因子的腺病 毒)來干擾細胞。然后可以對差異分類的樣品(例如來自肺癌患者的樣品與來自未患肺癌 個體的樣品，來自對治療有響應的患者的樣品與來自對治療無響應的患者的樣品等)進行 評估，以鑒定與指示途徑活化的基因表達情況的類別相關性。也就是說，將途徑狀態(例如 活化)與表型(例如疾病狀態，治療響應等)相關聯。然后可以測試組織學正常的氣道細 胞，以鑒定與特定途徑的活化相關的基因表達樣式，并基于途徑狀態與表型之間的關聯性，可以預測從其獲得細胞樣品的個體的表型(例如疾病狀態例如癌或非癌)。通過這種方式， 可以鑒定疾病狀態與途徑狀態(由基因表達所表明)之間的關聯性，這些關聯性可以作為 治療和診斷應用中的調節手段。同樣地，可以通過監測與所述途徑相關的基因表達，來評估 候選藥劑和治療方案對一種或多種途徑的活化的影響，以鑒定具有所需效應的藥劑和/或 治療方案。本發明還涉及肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括在來自所述個體的細胞學正 常的氣道上皮細胞中確定致癌途徑例如Np63和/或PI3K途徑的活化狀態。例如Np63和 /或PI3K途徑的活化表明所述個體與其中Np63和/或PI3K途徑沒有活化的個體相比，處 于肺病風險的增加中。在具體實施方案中，個體是吸煙者或非吸煙者。在其他實施方案中， 肺病是肺癌。在某些實施方案中，對多個途徑(例如致癌途徑)的活化狀態同時進行評估。在一個實施方案中，PI3K途徑的活化狀態使用PI3K途徑的一種或多種(即1、2、 3、4、5種或5種以上)生物標志物的基因表達數據來確定。例如，在某些實施方案中，所述 一種或多種生物標志物中的至少一種是在PI3K活化后增加的基因，在其他實施方案中，所 述一種或多種生物標志物中的至少一種是在PI3K活化后減少的基因。也可以使用在PI3K 活化后增加和降低的生物標志物的組合。在具體實施方案中，所述一種或多種生物標志物 中的至少一種是PI3K活化上游的基因，而在其他實施方案中，所述一種或多種生物標志物 中的至少一種是PI3K活化下游的基因。在本發明的一個實施方案中，分離的核酸從細胞學正常的氣道上皮細胞獲得，并 用于使用本技術領域任何已知的用于測量基因表達的方法來評估基因或多個基因的表達， 包括mRNA轉錄本分析以及DNA甲基化分析。用于評估mRNA水平的方法對于本技術領域的專業人員來說是熟知的。在一個優 選實施方案中，可以通過檢測RNA轉錄本、例如通過Northern印跡方法來確定基因表達，例 如，其中將RNA制備物在變性瓊脂糖凝膠上跑膠，并轉移到適合的支持物，例如活化的纖維 素、硝酸纖維素或玻璃或尼龍膜上。然后將標記的(例如放射性標記的)cDNA或RNA與制 備物雜交，清洗，并使用本技術領域熟知的方法例如放射自顯影術進行分析。RNA轉錄本的檢測還可以使用已知的擴增方法來實現。例如，將mRNA反轉錄 成cDNA然后進行聚合酶鏈反應(RT-PCR)；或使用單一酶進行這兩個步驟，如在美國專 利No. 5，322，770中描述的，或者將mRNA反轉錄成cDNA然后進行對稱間隙連接酶鏈反應 (RT-AGLCR)，如在 R. L.Marshall 等，PCR Methods and Applications 4:80-84(1994)中所 描述的，均在本發明的范圍內。其他可以在本文中利用的已知擴增方法包括但不限于所謂的“NASBA”或“3SR” 技術，它們描述在 PNAS USA 87 1874-1878 (1990)中并還描述在 Nature 350 (No. 6313) 91-92(1991)中；Q-β擴增，如已公布的歐洲專利申請(EPA)No. 4544610中的描述；鏈置換 擴增(如G. Τ. Walker等，Clin. Chem. 42 :9_13(1996)和歐洲專利申請No. 684315中的描述； 以及靶介導的擴增，如PCT公布WO 9322461中的描述。也可以使用原位雜交顯影，其中將放射活性標記的反義RNA探針與活組織檢查樣 品的薄片雜交，清洗，用RNase切開，并暴露于靈敏的乳劑中進行放射自顯影。樣品可以用 蘇木精染色以證實樣品的組織學成分，使用合適的濾光片進行暗視野成像，顯示出顯色的 乳劑。也可以使用非放射性標記物例如洋地黃毒甙。
可選地，RNA表達，包括mRNA表達，可以在DNA陣列、芯片或微陣列上檢測。將 對應于目標基因的寡核苷酸固定化在芯片上，然后與從患者獲得的測試樣品的標記核 酸雜交。用含有目標基因的轉錄本的樣品獲得陽性雜交信號。制備DNA陣列的方法及 其使用在本技術領域中是公知的(參見例如美國專利Nos =6,618,6796 ；6, 379,897 ； 6，664，377 ；6，451，536 ；548，257 ；U. S. 20030157485，以及 Schena 等，1995Science 20 467-470 ;Gerhold 等，1999 Trends in Biochem. Sci. 24，168-173 ；和 Lennon 等，2000 Drug discovery Today 5 :59_65，它們在此以其全文引為參考)。也可以進行基因表達的系列分 析(SAGE)(參見例如美國專利申請20030215858)。在某些優選實施方案中，本發明的方法可以使用固體基質，包括陣列。可用于 聚合物陣列合成的方法和技術已經描述在美國系列號09/536，841，WO 00/58516，美國專 利 Nos. 5，143，854，5，242，974，5，252，743，5，324，633，5，384，261,5, 405，783，5，424，186，
5，451，683, 5，482，867,5，491，074,5，527，681,5，550，215，5，571，639，5，578，832，5，593，839，5，599，695，5，624，711,5,631，734, 5，795，716，5，831，070，5，837，832，5，856，101，5，858，659，5，936，324, 5，968，740,5，974，164，5，981，185，5，981，956，
6，025，601，6，033，860，6，040，193，6，090，555，6，136，269，6，269，846 和 6,428,752，以及 PCT 申請Nos. PCT/US99/00730(國際申請號 WO 99/36760)和 PCT/US01/04285 中，全部都在 此為所有目的以其全文引為參考。在具體實施方案中描述了合成技術的專利包括美國專利Nos. 5，412，087， 6，147，205，6，262，216，6，310，189，5，889，165 和 5，959，098。可用于本發明的核酸陣列包括但不限于可以從Affymetrix (SantaClara，Calif.) 在商標名GeneChip7下商購的。示例的陣列顯示在affymetrix. com網站上。本發明還考慮到了與固體基質連接的聚合物的許多應用。這些應用包括基因表 達監測、序型分析、文庫篩選、基因分型和診斷。基因表達監測和序型分析方法的例子顯 示在美國專禾|J Nos. 5，800，992，6，013，449，6，020，135，6，033，860，6，040，138，6，177，248 和6，309，822中。基因分型及其應用的例子顯示在美國系列號60/319，253，10/013，598， 和美國專利 Nos. 5，856，092，6，300，063，5，858，659，6，284，460，6，361，947，6，368，799 和 6，333，179中。應用的其他例子體現在美國專利Nos. 5，871，928，5，902，723，6，045，996， 5，541，061 和 6，197，506 中。例如，為了監測mRNA水平，將mRNA從待測的生物學樣品中提取出來，反轉錄，并產 生熒光標記的cDNA探針。然后將能夠與目標基因雜交的微陣列，用標記的cDNA探針探測， 對玻片進行掃描并測量熒光強度。該強度與雜交強度和表達水平相關。在一個優選實施方案中，使用定量實時PCR測量基因表達。定量實時PCR是在擴 增過程中隨著時間進行監測，通常是通過熒光，以測量與特定序列的擴增程度相關的參數 的聚合酶鏈反應。在擴增循環過程中釋放的熒光的量，與每個PCR循環中擴增的產物量成 比例。在某些優選實施方案中，本發明還考慮到了樣品制備方法。在表達分析之前或同 時，核酸樣品可以通過各種不同機制進行擴增，其中某些可以使用PCR。參見例如《PCR技 術用于 DNA 擴增的原理和應用》(H. A. Erlich 主編，Freeman Press, NY, N. Y.，1992)；《PCR 方案方法與應用指導》(PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications) (Innis等主編，Academic Press, San Diego, Calif. , 1990) ；Mattila 等，Nucleic Acids Res. 19, 4967(1991) ；Eckert 等，PCR Methods andApplications 1，17(1991) ；PCR(McPherson 等主 編，IRL Press, Oxford)；以及美國專利 Nos. 4，683，202，4，683，195，4，800，159，4，965，188 和5，333，675，它們每個為所有目的在此以其全文引為參考。樣品可以在陣列上擴增。參見 例如美國專利No 6，300，070和美國專利申請系列號No. 09/513，300，它們在此引為參考。其他適合的擴增方法包括連接酶鏈反應(LCR)(例如Wu和Wallace， Genomics 4,560(1989) ；Landegren 等，Science 241, 1077(1988)禾口 Barringer 等， Gene 89 117 (1990))，轉錄擴增(Kwoh 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,1173(1989)和 W088/10315),自主序列復制(Guatelli 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA,87,1874(1990)和 W090/06995)，靶多核苷酸序列的選擇性擴增(美國專利No. 6，410，276)，保守序列引發的 聚合酶鏈反應(CP-PCR)(美國專利No. 4，437，975)，任意引發的聚合酶鏈反應(AP-PCR) (美國專利Nos. 5，413，909，5，861，245)和基于核酸的序列擴增(NABSA)(參見美國專利 Nos. 5，409，818，5，554，517和6，063，603，每個在此引為參考)。其他可以使用的擴增方法 描述在美國專利 Nos. 5，242，794,5, 494，810,4, 988，617 和美國系列號 No. 09/854，317 中， 每個在此引為參考。其他樣品制備方法和用于降低核酸樣品復雜性的技術描述在例如Dong等，Genome Research 11，1418 (2001)，美國專利 Nos. 6，361，947，6，391，592，以及美國專利申請系列號 Nos.09/916，135,09/920, 491,09/910, 292 和 10/013，598。用于進行多核苷酸雜交分析的方法在本技術領域中已經發展成熟。雜交分析 的步驟和條件依賴于應用而變，根據已知的通用結合方法進行選擇，通用結合方法包括 Maniatis等的《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual)(第二版， Cold SpringHarbor,N. Y. , 1989) ；Berger禾口Kimmel,Methods in Enzymology,Vol. 152,《分 子克隆技術指導》(Guide to Molecular Cloning Techniques) (Academic Press, Inc.，San Diego, Calif. , 1987) ；Young 和 Davism，P. N. A. S，80 :1194 (1983)中提到的方法。用于執行 重復和受控雜交反應的方法和裝置已經描述在例如美國專利Nos. 5，871，928，5，874，219， 6，045，996和6，386，749,6, 391，623中，每個在此引為參考。在某些優選實施方案中，本發明還考慮到了配體之間的雜交信號檢測。參見例 如美國專利 Nos. 5，143，854，5，578，832 ；5，631，734 ；5，834，758 ；5，936，324 ；5，981，956 ； 6，025，601 ；6，141，096 ；6，185，030 ；6，201，639 ；6，218，803 ；和 6，225，625，在臨時的美國 專利申請60/364，731中，以及在PCT申請PCT/US99/06097中(作為W099/47964公布)，每 個也為所有目的在此以其全文引為參考。用于信號檢測和強度數據處理的方法和裝置的例子，公開在例如美國專利 Nos. 5，143，854，5，547，839，5，578，832，5，631，734，5，800，992，5，834，758 ；5，856，092， 5，902，723,5，936，324,5，981，956,6，025，601,6，090，555,6，141，096,6，185，030, 6，201，639 ；6, 218，803 ；和6，225，625中，在美國專利申請60/364，731中，以及在PCT申請 PCT/US99/06097中(作為W099/47964公布)，其中每個也為所有目的在此以其全文引為參 考。本發明的實踐也可以使用常規的生物學方法、軟件和系統。本發明的計算機軟件產品典型包括計算機可讀介質，其中帶有用于執行本發明的方法的邏輯步驟的計算機可執行指令。適合的計算機可讀介質包括軟盤，CD-R0M/DVD/DVD-R0M,硬盤驅動器，閃 存，R0M/RAM，磁帶等。計算機可執行指令可以用適合的計算機語言或幾種語言的組合編 寫。基本的計算生物學方法描述在例如Setubal和Meidanis等，《計算生物學方法介紹》 (Introduction to Computational Biology Methods) (PffS Publishing Company,Boston, 1997) ；Salzberg，Searles，Kasif 主編的《分子生物學計算方法》(Computational Methods in MolecularBiology) (Elsevier, Amsterdam, 1998) ；Rashidi 禾口 Buehler，《生物信息學基 礎在生物科學和醫學中的應用》(Bioinformatics Basics Application in Biological Science and Medicine) (CRC Press, London，2000)，以及 Ouelette 和 Bzevansi，《生物信 息學基因與蛋白分析實用指南》(Bioinformatics :A Practical Guide for Analysis of Gene andProteins) (Wiley & Sons, Inc.,第二版，2001)中。本發明還利用了用于各種目的的各種不同的計算機程序產品和軟件，例如用于 探針設計、數據管理、分析和儀器操作。參見例如美國專利Nos. 5，593，839，5，795，716， 5，733，729,5，974，164,6，066，454,6，090，555,6，185，561,6，188，783,6，223，127, 6，229，911 和 6，308，170。此外，本發明可以具有優選實施方案，其中包括了在網絡例如英特網上提供遺傳 信息的方法，顯示在例如美國專利申請系列號No. 10/063，559,60/349, 546，60/376，003， 60/394，574,60/403, 381 中。在整個本申請書中，本發明的各種不同方面以范圍的格式表述。應該理解，以范圍 格式描述僅僅是為了方便和簡捷，不應該被解釋為對本發明的范圍的硬性限制。因此，范圍 的描述應該被認為已經具體地公開了該范圍內所有可能的子范圍以及每個數值。例如，例 如從1到6的范圍描述，應該被認為已經具體地公開了該范圍內的子范圍，例如從1到3，從 1到4，從1到5，從2到4，從2到6，從3到6等，以及該范圍內的個體數值，例如1、2、3、4、 5和6。這適用于無論多寬的范圍。此外，分數范圍也包含在所描述的示例量中。因此，例 如，1-3之間的范圍包括了分數例如1. 1、1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6等。在其他實施方案中，PI3K途徑的活化狀態使用PI3K途徑的一種或多種生物標志 物的一種或多種基因表達產物來確定。所述基因表達產物可以是核苷酸或氨基酸產物，可 以使用本技術領域已知的方法來檢測。在本發明的某些實施方案中，PI3K途徑的活化狀態通過評估IGFlR的活化來確 定，其中IGFlR的活化表明了 PI3K途徑的活化。在本發明的其他實施方案中，PI3K途徑的 活化狀態通過評估PKC的活化來確定，其中PKC的活化表明了 PI3K途徑的活化。在本發明 的某些實施方案中，PI3K途徑的活化狀態，通過評估在[29]中公開的PI3K途徑的一種或 多種生物標志物的表達來確定，該文獻的講述內容在此引為參考。在一個實施方案中，Np63途徑的活化狀態使用Np63途徑的一種或多種生物標志 物的基因表達數據來確定。例如，在某些實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至少 一種是在Np63活化后增加的基因，在其他實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至 少一種是在Np63活化后降低的基因。也可以使用在Np63活化后增加和降低的生物標志物 的組合。在具體實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至少一種是Np63活化上游的 基因，而在其他實施方案中，所述一種或多種生物標志物中的至少一種是Np63活化下游的 基因。
在具體實施方案中，所述Np63途徑的一種或多種生物標志物的表達數據使用寡 核苷酸微陣列獲得。在其他實施方案中，Np63途徑的活化狀態使用Np63途徑的一種或多 種生物標志物的一種或多種基因表達產物來確定。所述基因表達產物可以是核苷酸或氨基 酸產物，可以使用本技術領域已知的方法來檢測。本發明還涉及肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學 正常的氣道上皮細胞中PKC的活化狀態，其中PKC的活化表明所述個體與PKC沒有活化的 個體相比，處于肺病風險增加中。本發明還涉及肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學 正常的氣道上皮細胞中IGFlR的活化狀態，其中IGFlR的活化表明所述個體與IGFlR沒有 活化的個體相比，處于肺病風險增加中。在其他實施方案中，本發明提供了寡核苷酸陣列，其上固定有一種或者多種用于 PI3K途徑的一種或多種生物標志物的探針，其中所述陣列在其上沒有固定有用于其他生物 標志物的探針。在優選實施方案中，所述PI3K途徑的一種或多種生物標志物選自IGF1R、 PKC、在[29]中公開的生物標志物，以及它們的組合。本發明還涉及在個體中降低肺病風險的方法，包括向具有肺病風險的個體施用一 種或多種抑制PI3K途徑的藥劑(例如一種或多種藥劑、治療方案或療法或其組合)。在具 體實施方案中，在施用所述一種或多種藥劑之前，所述個體中的PI3K途徑被活化。在一個 實施方案中，肺病是肺癌。在另一個實施方案中，在肺病發生之前預防性地向所述個體施用 所述一種或多種藥劑。除非另外指明，否則本發明的實踐將使用本技術領域的專業人員熟知的分子生 物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學的常規技術。 這樣的技術在文獻中進行了詳盡解釋，例如《分子克隆實驗指南》(第二版)(Molecular Cloning =ALaboratory Manual, second edition) (Sambrook等，1989)，以及《分子克隆實驗 指南》(第三版)(Molecular Cloning :A Laboratory Manual, third edition) (Sambrook禾口 Russel，2001)(在本文中合稱為“Sambrook”)；《分子生物學現代方法》(Current Protocols inMolecular Biology) (F. Μ. Ausubel 等主編，1987，包括到 2001 年的增補)；《PCR 聚合 酶鏈反應》(PCR :The Polymerase Chain Reaction) (Mullis 等主編，1994) ；Harlow 和 Lane (1988)《抗體實驗指南》(Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Publications, New York，Harlow 和 Lane (1999)《使用抗體實驗指南》(UsingAntibodies A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(在本文中合稱為“Harlow和Lane”)；以及Beaucage等主編，《核酸化學現代方法》 (Current Protocols in NucleicAcid Chemistry), John Wiley & Sons, Inc. , New York, 2000。本文引用的所有參考文獻和網站的講述內容，在此以其全文引為參考。下面將通 過非限制性的示例性實施方案對本發明進行進一步描述。示例性實施方案方法患者群體從懷疑患有肺癌的、正進行診斷性纖維支氣管鏡檢查的當前和以前吸煙者收集了氣道上皮細胞刷取物，他們來自于4個機構波士頓大學醫學中心(Boston University Medical Center),波士頓退伍軍人管理局(Boston Veterans Administration), Lahey 診 所(Lahey Clinic)和 St. James 醫院(St. James ' s Hospital)(以前在[7]中描述過， 對于本研究中使用的樣品參見表1中人口統計數據)。其他刷取物從志愿的健康的當前、 以前和從不吸煙者，以及正進行支氣管鏡檢查的患有COPD的吸煙者收集(某些以前已經 在[31]中發表過，參見表1和2中的人口統計數據)。來自患有氣道發育異常的當前和以 前吸煙者的細胞學正常的支氣管氣道的刷取物，在大不列顛哥倫比亞大學(University of BritishColumbia)從志愿者收集，志愿者在40-74歲之間，具有≥30包-年的累計吸煙史， 在自身熒光支氣管鏡檢上有一個或多個支氣管發育異常位點(參見表2中的人口統計數 據)。這些志愿者中的一個亞組用肌醇治療了 2-3個月，在治療結束時，當使用自身熒光支 氣管鏡檢和支氣管內活組織檢查來檢測發育異常的改變時，從細胞學正常的氣道上皮又收 集了刷取物(η = 20個樣品，10個個體)[35]。用于生物化學驗證的前瞻性樣品在波士頓大學醫學中心(BostonUniversity Medical Center)和猶他大學醫院(University of UtahHospital)兩處收集。細胞學正常 的支氣管氣道刷取物在由于臨床懷疑肺癌而進行支氣管鏡檢查的受試者上收集(參見表 3)。在支氣管鏡檢查后對受試者進行跟蹤，直到作出最終的診斷或肺癌或另外的肺病。研究得到了所有參加機構的機構審查委員會的批準，所有受試者提供了書面知情 同意書。樣品收集和處理收集了來自患有或未患有癌癥的吸煙者(n = 129，GSE4115)，當前、以前和從不吸 煙者(n = 104，GSE7895)，以及患有(η = 127)和未患有(η = 20) COPD的吸煙者(GSE4115, GSE7895和GSEYYYY的亞組)的細胞學正常的氣道上皮細胞樣品，并按照以前的描述在 Affymetrix HG-U133A微陣列上雜交[7，31]。對于肺腫瘤和鄰近的正常組織研究來說，使 用了 GSE10072[32]。在使用肌醇進行2-3個月的治療之前和之后，從大不列顛哥倫比亞大學 (University of British Columbia)具有發育異常氣道病變的患者收集了細胞學正常的 氣道上皮細胞樣品(η = 20，10個患者，每人兩個樣品)，并且在使用肌醇治療之前收集了 6 個附加樣品作為劑量響應研究的一部分。在該研究中，使用直徑1. 7mm的支氣管細胞刷，在 三個分開的第6-8節支氣管氣道中進行了支氣管刷取(Hobbs Medical, StaffordSprings, CT)。撤回刷子并立即浸泡在RNALater中，在-80°C保持冷凍直到進行分析。代表性的支氣 管刷取樣品的上皮細胞含量，已經通過細胞沉淀物的細胞離心(ThermoShandon Cytospin, Pittsburgh, PA)和用細胞角蛋白抗體(Signet，Dedham ΜΑ)染色進行了定量。支氣管刷 中的細胞含有>90%的支氣管上皮細胞。隨后，按照制造商的說明書，將至少Iyg每種 樣品與Affymetrix人類外顯子ST微陣列雜交。來自外顯子陣列的數據使用Affymetrix Expression Console 軟件中的 RMA-sketch 進行歸一化。將用于生物化學驗證的前瞻性收集的氣道樣品在液氮中快速冷凍。對于一部分患 者來說，收集的附加的刷子，并與Affymetrix HGU133A 2. 0芯片雜交。微陣列在Affymetrix Expression Console 中進行 MAS5. 0 歸一化。用于本研究的所有新的表達數據可以在登記號GSEYYYY下在GEO處下載得到。
致癌途徑活化概率計算利用了來自以前研究的致癌途徑，并按照以前的詳細描述進行計算[13]。簡單來 說，對原代乳房上皮細胞進行培養，并允許其生長至靜止狀態。然后將細胞培養物以用于特 定途徑的關鍵成員(例如pllO，PI3K的催化亞基)的腺病毒構建物進行感染，以便活化目 標途徑。在感染后18小時，對來自干擾的和正常的細胞培養物的樣品進行處理，并平行地 (每種途徑大約10個樣品)在Affymetrix微陣列上進行雜交。在統計學分析之前，根據 低表達或低變異對探針組進行過濾(每種除去最低的25% )。根據與類別變量(例如干擾 的相對于GFP對照)的相關性選擇200個探針組，來定義每個途徑的基因特征。多基因表 達譜模型的訓練使用干擾的和GFP對照樣品來進行，首先在訓練數據中使用來自奇異值分 解(SVD)的最顯著的分量來歸納途徑特征，然后使用概率回歸模型的貝耶斯(Bayesian)擬 合。對于每個途徑進行了這樣的操作，并將每個模型應用于目標樣品。將獲得的途徑概率 在0和1之間標度。為了確定致癌途徑是否差異活化，首先進行秩和檢驗，對于小于0.05 的P-值，進行隨機排列分析。在隨機排列過程中，將目標數據組(例如支氣管氣道)中的 基因標識符隨機化，計算了來自Wilcoxon秩和檢驗的ρ-值以度量類型變量(例如肺癌對 非肺癌)之間的差異活化。這被重復1000次。微陣列數據首先通過RMA歸一化進行預處理，然后使用DWD校正批次效應[43]。 具體來說，為了在多基因表達譜模型的建立中標準化表達數據，運用DWD以校正致癌途徑 特征微陣列樣品與支氣管氣道微陣列樣品之間的批次效應。在微陣列上運行以便比較預測的PI3K活性與生物化學測量值的前瞻性系列中的 樣品，由于樣品尺寸下(n = 4)而通過mas5進行歸一化。使用了 U133A 2.0芯片。途徑活 性使用MAS5. 0歸一化的致癌途徑特征進行計算，沒有使用DWD標準化。在該未刊稿件中使用的多基因表達譜模型與原始框架之間的差異如下。首先，為 了用目標樣品標準化訓練數據庫，在所有樣品中分析了奇異值分解，在模型中使用了兩個 最顯著的分量。第一個分量一般解釋了由特征數據組與目標數據組之間的批次效應引起的 差異，而第二個分量解釋了目標途徑。為了從模型中除去標準化，也為了除去在訓練模型時 測試數據組的影響，事先進行了批次校正(例如使用DWD)，并將SVD分別應用于訓練和測試 數據組(一次用于訓練組以訓練模型，第二次用于目標數據組以適用于模型)。GSEA使用GSEA v2計算了基因組群富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis) [30]。構 成PI3K致癌途徑特征的基因被用于定義PI3K基因組群。重要的是，產生了兩個基因組群， 一組含有在PI3K活化后增加的基因，另一組含有在PI3K活化后降低的基因。使用GSEA進 行了三個不同的分析，其中兩個使用了來自Affymetrix外顯子陣列的微陣列數據。首先， 將健康的當前吸煙者(η = 11)與具有發育異常的吸煙者(η = 14)進行比較。使用下面的 線性模型對基因進行排等級(計算成R)Y= β 0+β !+β 2+b+ ε其中Y是基因的表達，β ^是截距，β工度量肺癌風險(樣品是否具有發育異常)， β 2是每個人的累積吸煙暴露量(包-年)，b是校正批次差異的隨機影響，ε是誤差項。系 數β工用于對進行GSEA的基因排序。其次，為了對肌醇治療之前和之后進行比較，使用配對 Wilcoxon秩和檢驗對樣品進行排等級。在U133A氣道數據組中進行的GSEA分析使用了缺省的信噪比等級。使用了 100個基因組群排列來計算FDR。激酶分析將80%合生的BEAS-2B、BT549或HEK293細胞分別在BEBM、RPMI或DMEM培養基 (Clonetics, GibcoBRL)中饑餓。該培養基含有用于BEAS-2B細胞的0. 添加補充劑、或用 于BT549和HEK293細胞的0. 胎牛血清24小時。然后將細胞用增加濃度的肌醇(Sigma) 或LY294002(Sigma)，在37°C預處理16小時。在刺激前，將細胞用新鮮藥物再處理30分 鐘，然后在37°C加入500 μ M胰島素(SIGMA) 15分鐘。將細胞在含有0. ImM原釩酸鈉、2mM PMSFU00 μ M 蛋白酶抑制劑(Sigma)的 RIPA 緩沖液(20mM TRIS (pH 7. 4), 150mM NaCl, 1% NP-40，0. 5%脫氧膽酸鈉，ImM EDTA，0. 1% SDS)中裂解。將裂解液在4°C下以HOOOrpm離 心20分鐘，與單克隆抗p85PI3K(Santa Cruz)抗體在4°C溫育1小時。結合的蛋白用50 μ 1 50%的蛋白G S印harose漿液(Sigma)沉淀，用裂解緩沖液洗滌3次，用含有0. ImM Tris (pH 7. 4)、5mM LiCl、0. ImM原釩酸鈉的緩沖液洗滌 3 次，用含有 IOmM Tris (pH7. 4) U50mM NaCl、 5mM EDTA、0. ImM原釩酸鈉的緩沖液洗滌兩次。將珠子在含有20 μ M冷ATP (Sigma)的激酶 緩沖液(50mM Tris (ρΗ7· 4)，IOmM MgCl2)中清洗，在45 μ 1含有5 μ 1 L_a_磷酯酰肌醇_4， 5-二磷酸(Avanti Polar Lipids) (lmg/ml)和 20 μ Ci ATP (32-Ρ)的激酶緩沖液中，在室溫 重新懸浮20分鐘。通過加入100 μ 1 IN HCl終止反應，使用160 μ 1 CHC13/Me0H(l 1) 抽提脂類。磷酸化的產物通過TLC，在草酸鉀預處理的Silica 60板上，在CHCl3/MeOH/NH4 溶液(45 35 1.5)中進行分離。PIP3的產生通過放射自顯影評估，通過顯像密度測定 分析和閃爍分析進行定量。對于每種細胞系的所有實驗被重復至少獲得同樣結果的兩次。Western 印跡分析患者的組織樣品通過支氣管鏡檢查收集，并立即速凍在液氮中。來自支氣管鏡 刷的細胞提取物通過加入200 μ 1 RIPA緩沖液來制備。為了便于從刷子上脫離細胞，將 試管渦旋3次，每次5秒。將細胞和支氣管鏡刷提取物二者在4°C下以HOOOrpm離心20 分鐘，將沉淀丟棄。蛋白收率通過Bradford分析方法進行定量，將等量的蛋白上樣到7% SDS-PAGE凝膠上。將膜在阻斷緩沖液(含有0. 1 % Tween 20和2. 5 % BSA的Tris緩 沖鹽水，或含有0. Tween 20和5 %低脂奶粉的Tris緩沖鹽水)中阻斷1小時，并放 置在第一抗體(含有0. Tween 20和2. 5% BSA、0. 02%疊氮化鈉的Tris緩沖鹽水) 中，4°C過夜。在本研究中使用的第一抗體如下兔磷酸化PKC(pan) (β II Ser660)，比率 為 1 100 (CellSignaling Techn.)；兔磷酸化-IGF-I 受體 β (Tyrll31) / 胰島素受體 β (Tyrll46)，比率為 1 100 (Cell Signaling Techn.)；兔磷酸化-PLC γ 1 (Tyr783)，比 率為 1 500 (Cell Signaling Techn.)；兔磷酸化-AKT (Ser473)，比率為 1 100 (Cell Signaling Techn.)；山羊 PI3-激酶 pllO α (C17)，比率為 1 50 (Santa Cruz)，兔磷酸 化-ERK，比率為 1 100 (Cell Signaling)，兔 GAPDH，比率為 1 1000 (AbCam)。將硝酸 纖維素在含有0. 1 % Tween20和/或0. 1 % NP-40的Tris緩沖鹽水中洗滌3次。使用辣 根過氧化物酶偶聯的第二抗體檢測第一抗體，并使用ECL Plus Western印跡檢測系統(GE Healthcare) Htj^0結果患有肺癌的吸煙者細胞學正常的支氣管氣道上皮細胞中PI3K途徑的活化從懷疑患有肺癌的、正進行纖維支氣管鏡檢查的當前和以前吸煙者獲得了細胞學正常的支氣管氣道上皮細胞刷取物，并按照以前的描述與DNA微陣列雜交[7] (η = 129，參 見表1中的患者人口統計表)。為了幫助闡明這些細胞中致癌途徑信號傳導的改變，我們利 用了以前發表的基因表達數據組和計算方法[13，26-28]。經在原代人類上皮細胞中特定 癌基因的表達來活化途徑，用實驗推動了致癌途徑特征[13]。然后通過鑒定哪些基因在途 經活化后改變，定義了基因表達特征，并用其在其他體內樣品中預測途徑活性。使用這種方 法，對于懷疑患有肺癌的當前和以前吸煙者的支氣管氣道上皮細胞，計算了 7條信號傳導 途徑(Ras,Myc,E2F3,Src, β-聯蛋白，Δ Νρ63和磷脂酰肌醇3 ‘激酶(ΡΙ3Κ))的致癌途徑 活化概率[7]。重要的是指出，盡管這些患者中大約一半最終被診斷出患有原發肺癌(其余 患者被發現患有其他肺病)，但從近主干支氣管(即不鄰近腫瘤或肺病變)收集的刷取物是 細胞學正常的，> 90%是上皮細胞。因此，根據以前的經驗，人們將不會預計到在患有肺癌 的吸煙者正常氣道中致癌途徑活性不同。在7條測試的途徑中，在隨機排列分析后，只發現兩條途徑在患有肺癌的吸煙者 的氣道中與患有其他肺病的對照相比被明顯和差異地活化ΔΝρ63和ΡΙ3Κ(ρ < 0. 001， 圖1Α)。此外，使用基因組群富集分析[30]，也發現在肺癌患者中，那些已被發現在磷脂酰 肌醇信號傳導系統途徑中發揮作用的基因[29，其講述內容在此引為參考]被顯著上調了 (GSEA，p = 0. 034，FDR q = 0. 099)。PI3K的上調不限于具體的癌細胞類型、腫瘤位置或腫 瘤階段(數據未顯示)。PI3K活化與累積煙草暴露量或COPD沒有顯著相關性接下來，我們試圖確定PI3K途徑活性的增加是由于肺中存在癌癥引起的，還是由 其他混淆性因素例如累積吸煙暴露量的差異(患有癌癥的患者具有較高的累積暴露量，參 見表1)或其他肺病造成的。首先，利用累積吸煙暴露量作為協變量，檢驗了患有和未患肺 癌的患者之間的差異性途徑活化。在解決了煙草暴露量差異的可能的混淆影響后，PI3K(P =2. 08x10-8)仍保持顯著的差異活化。其次，使用從當前(η = 52)、以前(η = 31)和從 不(η = 21)吸煙的健康者收集的支氣管氣道上皮細胞的全基因組基因表達數據組[31]，我 們使用與以前描述相同的方法計算了所有7條途徑的途徑活化概率。盡管在健康的當前、 從不和以前吸煙者之間7條途徑沒有一條被差異活化，但是當對從不和當前吸煙者進行比 較時，ΔΝρ63途徑傾向于被顯著活化(ρ = 0. 09，圖1Β)。最后，使用從患有(η = 17)和未 患有(η = 20)慢性阻塞性肺病(COPD)的吸煙者獲得的支氣管氣道基因表達數據組，Ras 是唯一差異活化的途徑(P < 0. 001，數據未顯示)(圖1C)。這賦予了正常支氣管氣道中致 癌途徑ΡΙ3Κ的顯著差異活化對于患有肺癌個體是特異性的證據，盡管差異活化的機制尚 不了解。由于已知的Ρ53相關途徑(例如ΔΝρ63)對環境應激物作出響應而失調控，以及 ρ53/ρ63途徑缺乏任何已知的治療性調節劑，所以在所有的進一步研究中我們選擇了聚焦 于ΡΙ3Κ途徑。ΡΙ3Κ在肺癌組織中被活化在患有肺癌的患者的細胞學正常的氣道上皮細胞中ΡΙ3Κ的失調控，導致我們檢 查肺癌組織中的ΡΙ3Κ活性。我們預計，在肺癌發生過程中對于腫瘤生長和存活必需的致癌 途徑將顯著增加。對于該分析來說，我們使用了已發表的包含肺腺癌和匹配的鄰近非腫瘤 組織的數據組(η= 107) [32]。使用上面詳述的同樣的基因組方法預測了途徑狀態。正如 圖2中所示，與鄰近的非腫瘤組織相比，惡性肺腫瘤的ΡΙ3Κ活性高度顯著(ρ < 0. 001)增加。Δ Np63途徑在腫瘤細胞中也較小程度地增加(ρ = 0. 002)。該結果突出了 PI3K途徑在 細胞的惡性發展中的中心作用，支持了我們關于PI3K活化對于肺癌腫瘤發生重要的假說。 在肺腫瘤中，也觀察到了 Myc、E2F3和Src途徑的顯著增加，證實了它們在肺腫瘤生長和發 生中的作用。因為肺腫瘤含有分裂中的細胞，具有比正常組織更高水平的增殖，因此我們在 本分析中預計到參與細胞生長的途徑(Myc，E2F3，Src)也將增加。支氣管氣道中PI3K途徑活性的生物化學分析為了驗證我們的基因表達發現，我們在來自臨床懷疑患有肺癌而進行支氣管鏡檢 查的對象前瞻性收集的細胞學正常的氣道上皮細胞樣品組群中，測量了 PI3K酶活性。樣品 在2007年10月到2008年6月之間，從波士頓大學醫學中心(Boston University Medical Center)和猶他大學醫院(University of Utah Hospital)獨立地獲得。在支氣管鏡檢查 后對對象進行了跟蹤，直到做出肺癌或其他肺病的最終診斷。重要的是，未患肺癌的對象具 有一系列其他疾病，包括非肺起源的轉移性癌癥，類肉瘤，膿毒性栓子和肺炎。在從氣道刷 取物提取蛋白后，進行了 PI3K激酶分析。基于我們的基因組預測，我們預計大部分來自癌 癥患者的樣品將具有高的PI3K活性，只有少部分來自其他疾病患者的樣品具有高的PI3K 活性正如在圖3A中看到的，與未患肺癌的患者相比(30% )，PI3K在大部分肺癌患者 中顯示出增加的活化(基因組分析中70%的肺癌樣品處于PI3K活性的前一半中)。具體 來說，對于兩個組群來說，我們在PI3K活性與肺癌狀態之間觀察到了高度相關性(波士頓 R = O. 499，猶他R = 0. 389)。對于這些樣品的一部分(η = 4)，我們能夠收集到另外的支 氣管上皮細胞，以進行微陣列分析，并使用與原始數據組使用的相同的方法來預測ΡΙ3Κ活 性。預測的ΡΙ3Κ活性與在同樣個體中生物化學測量的ΡΙ3Κ水平具有相關性(R = 0. 48)。 合在一起，這些結果支持了下述結論，即在患有肺癌的患者的正常氣道中ΡΙ3Κ活性增加， 并驗證了我們從基因表達數據計算的ΡΙ3Κ活性的計算預測值。當考慮到對照患者中的各 種疾病也可能影響ΡΙ3Κ的活性時，這些結果甚至更加顯著。為了試圖進一步確定ΡΙ3Κ活性升高的原因和結果，我們對ΡΙ3Κ途徑的關鍵成分 的磷酸化狀態進行了 Western印跡分析。IGF1R(波士頓R = 0. 91，猶他R = 0. 34)，而不 是HER2(波士頓R =-0.61，猶他=R =-0.41)的磷酸化，與PI3K激酶活性正相關(圖3B)， 表明該受體是患有肺癌的患者的正常氣道上皮組織中PI3K活化的上游效應子。在患有肺 癌的患者中，生物化學測量的PI3K活性與IGFlR之間的關聯顯示出高度的正相關，進一步 支持了 IGFlR活化與PI3K活性之間的可能的關系(波士頓R = 0. 98，猶他R = 0. 90)(圖 3B)。接下來，測量了 PI3K的主要下游效應子Akt和PKC的測量到的磷酸化。在患有肺癌 的患者中，PKC與生物化學測量的PI3K活性具有較高的關聯性，而對于Akt來說沒有觀察 到顯著的關聯性(圖3B)，再一次突出了肺癌患者中特異性的PI3K途徑活化。合在一起，這 些結果支持了我們的基因組發現，即患有肺癌的患者與患有其他疾病的患者相比，PI3K活 性在正常肺細胞中富集了，并且IGFlR的活化是這種活性的可能的機制[33，34]。患有發育異常的高危吸煙者中PI3K途徑的活化為了評估PI3K的活化增加是肺癌發生中的早期事件這一假說，我們比較了來自 一組健康吸煙者(η = 11)與一組具有中等-嚴重的氣道發育異常的吸煙者(η = 14，來 自[35])的細胞學正常的氣道上皮細胞中的基因表達(參見表2)。因為發育異常被認為是腫瘤前事件，因此這個組群代表了發生肺癌的可能性增加的“高危”吸煙者[36，37]。如 果具有發育異常的高危吸煙者與健康吸煙者相比具有較高水平的PI3K，它將表明氣道上 皮細胞中活性的增加發生在肺癌發生之前。將高危組群以及健康的當前吸煙者的組群，與 Affymetrix人類外顯子陣列雜交。由于與致癌途徑特征的平臺不同，我們不能使用多基因 表達譜模型計算途徑活性。而是使用了 GSEA來比較兩個組之間的PI3K活性，由體外實驗 確定的PI3K基因特征，根據基因隨著PI3K活化是上調還是下調分成了兩個基因組群(PI3K 上調，PI3K下調)。由于在兩個組之間存在累積煙草暴露量的顯著差異，使用了結合批次效 應和每年吸煙包數在內的線性模型來對GSEA中使用的基因進行排等級。在患有發育異常 的對象的細胞學正常的氣道中，發現了 PI3K活性的顯著增加(對于PI3K上調和PI3K下調 基因組群來說，分別為P < 0. 001，FDR Q = O. 022和ρ < 0. 001，Q < 0. 001)(圖4)。患有 發育異常的人的氣道中ΡΙ3Κ的活性增加，表明ΡΙ3Κ的失調控是肺癌腫瘤發生中的早期事 件。在用肌醇治療的高危吸煙者中ΡΙ3Κ活性的可逆性由于在高危吸煙者以及患有肺癌的吸煙者二者中ΡΙ3Κ活性都增加，因此接下來 我們想要確定ΡΙ3Κ活性的降低是否與發育異常病變的消退相關。由Lam等發表的最近的 1期臨床研究[35]，研究了肌醇作為高危吸煙者中肺癌的化學預防性藥劑。在該研究中，使 用自身熒光支氣管鏡檢查術，篩選了具有>每年30包煙的吸煙史的煙民志愿者在他們的 氣道中發育異常的存在。然后，對內部支氣管活組織檢查證實患有中等-嚴重的發育異常 的10位當前和以前吸煙者，口服給藥肌醇2-3個月，并通過在該位點重復內部支氣管活組 織檢查，再一次測量了他們的發育異常病變的狀態。當與使用安慰劑治療的對照患者相比 時，發現肌醇顯著增加了發育異常消退的速率。在治療之前和之后，也收集了細胞學正常的 支氣管上皮細胞的氣道刷取物，并進行了基因表達情況分析(參見表2中的人口統計表)。再一次使用了 GSEA分析來測量ΡΙ3Κ途徑中基因表達的變化。當將肌醇治療前與 治療后進行比較時，對治療有響應的對象(η = 6，12個樣品)顯示出ΡΙ3Κ下調基因組群中 的基因的表達增加(P = 0. 04,FDRQ = 0. 177)，表明了用肌醇治療后ΡΙ3Κ水平的降低。對 治療沒有響應的對象(η = 3，6個樣品)，ΡΙ3Κ基因組群的水平沒有變化。在對肌醇有響應 的患者中觀察到的氣道ΡΙ3Κ活性的降低，證明了發育異常的消退與該途徑的活性水平相 關。肌醇作為ΡΙ3Κ抑制劑對肌醇有響應的患者中ΡΙ3Κ活性的降低以及他們氣道中發育異常的消退，加強 了升高的ΡΙ3Κ活性水平與存在腫瘤前氣道病變之間的關聯性。但是，肌醇的作用機制尚不 清楚，并且研究受限于相對小的樣品量。為了進一步研究肌醇與ΡΙ3Κ活性之間的關系，我 們測試了肌醇在體外抑制ΡΙ3Κ的能力。在用胰島素處理細胞活化ΡΙ3Κ后，將細胞用增加 劑量的肌醇或LY-294002(已知的ΡΙ3Κ抑制劑)處理。然后使用標準的激酶分析規程，通 過測量PIP3的水平來定量PI3K活性[38，39]。對于本實驗來說，平行分析了三個不同細胞 系BEAS-2B(氣道)，BT549(乳腺癌)和HEK293(胚胎腎)。在所有三個細胞系中，肌醇以 劑量依賴性方式抑制PI3K活性水平(圖5)。因此，肌醇是PI3K的抑制劑，并具有與氣道上 皮細胞中發育異常的消退相關的化學預防性質。
權利要求
肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學正常的氣道上皮細胞中PI3K途徑的活化狀態，其中PI3K途徑的活化，是所述個體與其中PI3K途徑沒有活化的個體相比處于增加的肺病風險的指示。
2.權利要求1的方法，其中個體是吸煙者。
3.權利要求1的方法，其中個體是非吸煙者。
4.權利要求1的方法，其中肺病是肺癌。
5.權利要求1的方法，其中PI3K途徑的活化狀態使用PI3K途徑的一種或多種生物標 志物的基因表達數據來確定。
6.權利要求5的方法，其中所述一種或多種生物標志物中的至少一個是在PI3K活化后 增加的基因。
7.權利要求5的方法，其中所述一種或多種生物標志物中的至少一個是在PI3K活化后 降低的基因。
8.權利要求5的方法，其中所述一種或多種生物標志物中的至少一個是PI3K活化上游 的基因。
9.權利要求5的方法，其中所述PI3K途徑的一種或多種生物標志物的基因表達數據使 用寡核苷酸微陣列來獲得。
10.權利要求1的方法，其中PI3K途徑的活化狀態使用PI3K途徑的一種或多種生物標 志物的一種或多種基因表達產物來確定。
11.權利要求1的方法，其中PI3K途徑的活化狀態通過評估IGFlR的活化來確定，其中 IGFlR的活化是PI3K途徑活化的指示。
12.權利要求1的方法，其中PI3K途徑的活化狀態通過評估PKC的活化來確定，其中 PKC的活化是PI3K途徑活化的指示。
13.肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學正常的氣道上 皮細胞中PKC的活化狀態，其中PKC的活化指示所述個體與其中PKC沒有活化的個體相比， 具有增加的肺病風險。
14.肺病風險增加的個體的鑒定方法，包括確定來自所述個體的細胞學正常的氣道上 皮細胞中IGFlR的活化狀態，其中IGFlR的活化指示所述個體與其中IGFlR沒有活化的個 體相比，具有增加的肺病風險。
15.寡核苷酸陣列，其上固定有一種或者多種用于PI3K途徑的一種或多種生物標志物 的探針，并且其中所述陣列在其上沒有固定有用于其他生物標志物的探針。
16.權利要求15的寡核苷酸陣列，其中所述PI3K途徑的一種或多種生物標志物選自 IGF1R、PKC及其組合。
17.在個體中降低肺病風險的方法，包括向肺病風險的個體施用一種或多種抑制PI3K 途徑的藥劑。
18.權利要求17的方法，其中在所述個體中，PI3K途徑在施用所述一種或多種藥劑之 前被活化。
19.權利要求17的方法，其中肺病是肺癌。
20.權利要求17的方法，其中在肺病發生之前預防性地向所述個體施用所述一種或多 種藥劑。
21.對細胞學正常的測試氣道上皮細胞進行差異分類的方法，包括在正常氣道上皮細胞中鑒定與目標生物學途徑的活化有關的基因表達特征； 評估被差異分類的氣道上皮細胞中的基因表達，以便在氣道上皮細胞的分類與目標生 物學途徑的活化之間鑒定一種或多種關聯性；以及在細胞學正常的測試氣道上皮細胞中評估基因表達，其中待分類的細胞學正常的氣道上皮細胞的基因表達情況指示目標生物學途徑是否 被活化，并因此對細胞進行差異分類。
22.權利要求21的方法，其中所述目標生物學途徑是致癌途徑。
23.權利要求21的方法，其中所述差異分類是疾病風險的增加與疾病風險的降低。
24.權利要求21的方法，其中所述差異分類是對治療的響應與對治療的無響應。
全文摘要
本發明提供了在患有肺病或有肺病風險的個體的細胞學正常的氣道細胞中活化的致癌途徑的鑒定，以及與途徑活化有關的特異性基因表達樣式(生物標志物)的鑒定。這些生物標志物和途徑可以在肺病例如肺癌中提供預后和/或診斷指示物。此外，這些途徑和生物標志物可以提供用于肺病治療的治療性靶，以及用于評估療效的標志物。
文檔編號C12Q1/68GK101990577SQ200880114795
公開日2011年3月23日 申請日期2008年9月19日 優先權日2007年9月19日
發明者亞當·古斯塔夫森, 安德烈·比爾德, 杰羅姆·布羅迪, 阿夫魯穆·斯皮拉 申請人:波士頓大學理事會;猶他州立大學研究基金會