具有改變的特性的α-淀粉酶變體的制作方法

專利名稱：具有改變的特性的α-淀粉酶變體的制作方法
具有改變的特性的α-淀粉酶變體序列表本文附帶包含SEQ ID NO :1_31的序列表，其中所述每個序列通過引用的方式完整 并入本文。本公開的領域本公開涉及新的α -淀粉酶。特別地，它涉及某些α _淀粉酶變體活性，以及其與 一種或多種其他酶如植酸酶的摻合物。
背景技術：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)構成一組催化淀粉 及相關的線型或分支1，4_糖苷寡糖和多糖水解的酶。α -淀粉酶可以用于各種目的。例如，α -淀粉酶商業地用于淀粉加工的初始階段 (例如，液化)中；濕磨工藝中；和從糖類生產醇中。它們也用作洗滌劑基質中的清潔劑或 輔料，在紡織工業中用于淀粉退漿；用在焙烘用途中；用于飲料工業；用于油田的鉆井工藝 中；用于再循環過程，例如用于紙張脫墨，和用于動物飼料中。已經試圖構建具有針對特定用途如淀粉液化和紡織品退漿的改良特性的α -淀 粉酶變體。需要創造和改善這樣的淀粉酶，所述淀粉酶例如為包括谷物商業加工(例如液 化過程)在內的多種用途提供了優于工業標準酶(例如來自地衣芽孢桿菌(Bacillus Iicheniformis))的制造和/或性能優點。也需要包含改良的淀粉酶和額外的酶如植酸酶 的組合物。發明概述在一個方面，本公開尤其涉及親本α -淀粉酶(如AmyS樣α -淀粉酶)的新α -淀 粉分解酶變體，特別是展示在工業加工淀粉(淀粉液化、糖化等)方面有利的改變特性的變 體。例如，與親本AmyS樣α -淀粉酶或參考α -淀粉酶相比較，該變體在以下一個或 多個特性方面改變凈電荷、底物特異性、底物切割、底物結合、熱穩定性、在一個或多個PH 處的活性、在一個或多個PH處的穩定性[如在特定ρΗ(例如低(例如ρΗ ( 6，尤其ρΗ ( 5) 或高(例如ρΗ > 9)ρΗ值)處提高的穩定性]、氧化條件下的穩定性、金屬離子需求[例如 Ca2+依賴性或Ca2+需求]、比活性、催化速率、催化效率、在植酸或另一種植酸鹽存在下的活 性(即對于植酸鹽抑制的易感性)、在植酸或植酸鹽存在下的熱或PH穩定性、在液化試驗中 影響峰粘度的能力、在液化試驗中影響終末粘度的能力和其他目的特性。例如，一個或多個 改變可以產生這樣的變體，其與親本α-淀粉酶(如AmyS樣α _淀粉酶)相比較具有降低 的Ca2+依賴性和/或改變的pH/活性特征和/或改變的熱穩定性。在一個方面，本公開涉及變體α-淀粉酶，其包含與親本AmyS樣α-淀粉酶的氨 基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨基酸 位置處具有替換，并且還包含一項或多項以下對其氨基酸序列的修飾a) 一個或多個在如下位置處的替換在第349氨基酸位置處的半胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處的谷氨酸、在第97位置處的精氨酸、在第319位置處的 谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、在第358位置處的谷氨酸、在第358位置處的精氨酸、在 第443位置處的谷氨酸或在第443位置處的精氨酸；b)在與第97、319、349、358、428或443氨基酸位置相對應的一個或多個氨基酸位 置處的其他序列修飾；c)在？178、1 179、6180、1181、6182或1(183位置或其成對位置處的一個或多個氨
基酸的缺失；d)在第178、179、180、181、182或183氨基酸位置的一個或多個位置處的其他序列 修飾；e)N193F或V416G或這兩者的替換；f)在第193、416或這兩者位置處的其他序列修飾；g)用丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸殘基替換在經修飾的 α-淀粉酶變體的部分中存在的一個或多個脯氨酸殘基；h)用另一種天然存在的氨基酸殘基替換在經修飾的α -淀粉酶變體的部分中存 在的一個或多個脯氨酸殘基；i)用絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸殘基替換在親本α -淀粉 酶中存在的一個或多個半胱氨酸殘基；j)用另一種天然存在的氨基酸殘基替換在親本α -淀粉酶中存在的一個或多個 半胱氨酸殘基；k)在SEQ ID NO 7是用于編號的參考淀粉酶的情況下，任意的以下突變M15T， L、M15X、V128E、V128X、H133Y、H133X、N188S, Τ, P、Ν188Χ、Μ197Τ, L、M197X、A209V、A209X、 M197T/W138F、M197T/138Y、M15T/H133Y/N188S、M15N128E/H133Y/N188S、E119C/S130C、 D124C/R127C、H133Y/T149I、G475R、H133Y/S187D 或 H133Y/A209V ；1)在 SEQ ID NO 7 是參考淀粉酶的情況下，在 M15、V128、A111、H133、W138、T149、 M197、附88、A209、A210、H405、T412位置的一個或多個位置處的其他修飾；m)在親本α -淀粉酶包含SEQ ID NO 7的情況下，當SEQ ID NO 2是參考淀粉酶 時，位于任意的 Μ8、Μ9、Μ96、Μ200、Μ206、Μ284、Μ307、Μ311、Μ316 和 Μ438 位置處的一個或多 個半胱氨酸殘基(C363)或一個或多個甲硫氨酸殘基的缺失或替換；η)在 SEQ ID NO :1 或 2 是參考淀粉酶的情況下，與 Ρ17、D19、Τ21、Ν28、S51、G72、 V74、Α82、Q86、Q89、Α93、G95、Q97、W115、D117、Ρ123、S124、D125、Ν127、1130、G132、Q135、 P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、R179、G180、I181、G182、K183、W187、P209、 N224、S242、P245、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、 K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、 G474或R483相對應的一個或多個氨基酸殘基的修飾；或o)a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、 Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的成組替換。在目前優選的實施方案中，該α -淀粉酶變體是S242A、S242D、S242E、S242F、 S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。
該α-淀粉酶變體優選地從包含任一SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16 的親本AmyS樣α-淀粉酶衍生。在某些實施方案中，用于氨基酸殘基編號的參考α -淀粉 酶優選地是SEQ ID NO :1或2。在一個實施方案中，該變體的氨基酸序列與親本AmyS樣α -淀粉酶的氨基酸序列 至少98%同一。也提供了包含編碼序列的核酸，即多核苷酸，其中所述的編碼序列編碼a)本文中 所述變體的氨基酸序列；或 b)任一 SEQ ID NO :3、4、16、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。 也提供了載體及包含所述多核苷酸或載體的宿主細胞。在多個實施方案中，宿主細胞是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢 桿菌(B. licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌 (B. amyIoliquefaciens)、凝結芽抱桿菌(B. coagulans)、環狀芽抱桿菌(B. circulans)、 燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)、變鉛青鏈霉菌 (Streptomyces lividans)、鼠灰鏈霉菌(S. murinus)；大腸桿菌(Escherichia coli)或假 單胞菌屬的物種(Pseudomonas spp.)。在另一方面，在本文中提供了親本嗜熱脂肪土芽孢桿菌 (Geobaci 1 lusstearothermophiIus) α -淀粉酶的變體，其中該變體具有與親本嗜熱脂肪土 芽孢桿菌α “淀粉酶具有至少95%同源性并包含第242位氨基酸替換的氨基酸序列，其中 肽序列中的氨基酸位置相對于SEQ ID NO :1或2進行編號，并且其中該變體具有α _淀粉 酶活性。在另一方面，提供了組合物，其包含a)如本文中提供的α -淀粉酶變體，和b)至少一種額外的酶。在一個實施方案中，該組合物是一種包含a)至少一種變體淀粉酶和b)至少一種 額外的酶的組合物，其中所述的變體淀粉酶包含與親本AmyS樣α _淀粉酶的氨基酸序列至 少95%同一的氨基酸序列，并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有 替換，所述變體具有可檢測的α-淀粉酶活性。額外的酶優選地是植酸酶。該組合物中的α -淀粉酶變體優選地是S242A、S242D、 S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。在一個實施方案中，該α -淀粉酶變體還在與參考α -淀粉酶第97、179、180、193、 319、349、358、416、428或443氨基酸位置相對應的一個或多個氨基酸位置處包含序列修 飾。該α-淀粉酶變體也可以包含一個或多個在如下位置處的替換在第349位置處的半 胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處的谷氨酸、在第97位置處的精氨酸、在 第319位置處的谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、在第358位置處的谷氨酸、在第358位 置處的精氨酸、在第443位置處的谷氨酸或在第443位置處的精氨酸。在一個實施方案中，該α-淀粉酶變體包含附93或V416或這二者的替換，例如， N193F或V416G或這二者的替換。在其他實施方案中，該α -淀粉酶變體包含第179和180位氨基酸的缺失。在一 個實施方案中，組合物包含這樣的α-淀粉酶變體，其與SEQ ID NO :2具有至少95%同源性并且相對于包含氨基酸序列SEQ ID N0:1的參考α-淀粉酶中的編號而言包含第242位氨 基酸替換。如同上文，親本AmyS樣α-淀粉酶優選地是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、 12,15 或 16。在一個方面，本公開涉及利用α -淀粉酶(AA)活性和植酸鹽水解酶(FTU)水解可 溶性淀粉底物。例如，其中AAU FTU的比率是從約1 15至約15 1，優選地是從1 10 至約10 1。在一個實施方案中，AAU FTU的比率是從1 4至3 1。在又一個實施 方案中AAU FTU的比率是1 1。在一個當前優選的組合物中，植酸酶具有SEQ ID NO 31的序列。更具體地，提供了用于處理淀粉漿液的方法，包括步驟a)添加至少一種植酸酶和 至少一種α -淀粉酶至淀粉漿液；其中在相同時間或大致相同時間或以任意順序分別添加 植酸酶和α-淀粉酶，并且其中該α-淀粉酶是這樣的變體淀粉酶，其包含與親本AmyS樣 α -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相 對應的氨基酸位置處具有替換，所述變體具有可檢測的α-淀粉酶活性；和b)在允許植酸 酶及α-淀粉酶活性的條件下溫育該淀粉漿液。用于該方法中的α -淀粉酶變體優選地是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T變體。在一個實施方案中，該α -淀粉酶變體 還在與參考α -淀粉酶第97、179、180、193、319、349、358、416、428或443氨基酸位置相對 應的一個或多個氨基酸位置處包含序列修飾。該α-淀粉酶變體可以包含一個或多個在如 下位置處的替換在第349位置處的半胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處 的谷氨酸、在第97位置處的精氨酸、在第319位置處的谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、 在第358位置處的谷氨酸、在第358位置處的精氨酸、在第443位置處的谷氨酸或在第443 位置處的精氨酸。在一個實施方案中，該α-淀粉酶變體包含附93或V416或這二者的替 換，例如，N193F或V416G或這二者的替換。在其他實施方案中，該α-淀粉酶變體的特征 是第179和180位氨基酸的缺失。在該方法的一個實施方案中，親本AmyS樣α-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、 9、10、11、12、15 或 16。植酸酶可以在α -淀粉酶變體之前或之后添加。可以在添加植酸酶之后并且在添 加α-淀粉酶變體之前預溫育淀粉漿液。在一個實施方案中，植酸酶的納入相對于不包括 淀粉漿液與植酸酶接觸的可比較方法而言引起α-淀粉酶變體的熱穩定性提高。在該方 法的一個實施方案中，植酸酶和α “淀粉酶變體在添加至淀粉漿液之前存在于單一摻合物 中。在另一個實施方案中，植酸酶具有SEQ ID NO :31的氨基酸序列。在又一方面，本公開涉及用于在包含底物的漿液中液化淀粉的方法，所述底物包 括植物材料如來自干磨法或濕磨法的顆粒淀粉，該方法包括初級和/或次級液化步驟，所 述方法包括在初級和/或次級液化步驟中同時或分別地以任意順序添加至少一種植酸水 解酶和至少一種α-淀粉酶的組合至漿液。該方法可以還包括糖化液化的淀粉以獲得可發 酵糖；并且回收可發酵糖。在一些實施方案中，該方法還包括在合適的發酵條件下發酵可發 酵糖以獲得終產物如醇。在一些實施方案中，酶組合物含有至少一種α-淀粉酶和植酸酶。 在一些實施方案中，酶組合物為摻合物形式。在又一方面，本公開涉及用于發酵淀粉底物的 方法，該方法包括以任意順序添加單一或分批量的α-淀粉酶和植酸酶的組合。在另一方面，將處理的淀粉底物發酵成乙醇。在該方法的多個實施方案中，參考α-淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2，并且α-淀 粉酶變體是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T α -淀粉酶變體。在另一方面是獲得可發酵底物的方法，所述方法為通過使含有顆粒淀粉的磨碎 谷物漿液與植酸水解酶在比淀粉凝膠化溫度低約0°c至約30°C的溫度接觸，使該漿液與 α-淀粉酶接觸，升高溫度高于顆粒淀粉凝膠化溫度以引起淀粉凝膠化，通過使凝膠化的淀 粉與α “淀粉酶接觸足以水解該淀粉的時間而水解凝膠化的淀粉，并且獲得可發酵底物。 植酸水解酶可以是細菌或真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉屬(Aspergillus)植酸酶或 布丘氏菌屬(Buttiauxella)植酸酶。在一些實施方案中，細菌植酸酶來自大腸桿菌。隨后，提供了從包含磨碎谷物的含淀粉漿液產生可發酵底物的方法，該方法包括 步驟a)將含淀粉漿液與足以從淀粉產生可發酵底物的量的至少一種植酸酶和至少一 種α“淀粉酶接觸；其中在相同時間或大致相同時間或以任意順序分別啟動與植酸酶和α-淀粉酶 的接觸，并且其中該α-淀粉酶是這樣的變體淀粉酶，其包含與親本AmyS樣α _淀粉酶的 氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨基酸 位置處具有替換，所述變體具有可檢測的α-淀粉酶活性；和b)在允許植酸酶及α -淀粉酶活性的條件下溫育該淀粉漿液一段引起可發酵底 物產生的時間；其中與植酸酶的接觸在該淀粉酶之前啟動時，漿液在比該漿液與所述淀粉 酶接觸之前的凝膠化溫度低0-30°C的溫度溫育，此后升高溫度高于凝膠化溫度，持續時間 為有效水解淀粉的時間。在一個實施方案中，參考α -淀粉酶是SEQ ID NO 1或2，并且親本AmyS樣α -淀 粉酶包含任一 SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16。α-淀粉酶變體優選地是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T α -淀粉 酶變體。在一個實施方案中，該方法包括使用至少一種額外的酶，所述額外的酶是植酸酶、 纖維素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精葡 聚糖轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡 糖苷酶、β “葡糖苷酶、鹵過氧化物酶、轉化酶、異構酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、 果膠酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、核酸酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚 糖酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、角叉菜聚糖酶或兩種或更多種前述酶的組合。該方法優選地是淀粉降解、液化、發酵工藝、醇生產、甜味料生產、可發酵底物生 產、清潔、洗滌、污漬去除或焙烘過程等過程的一部分。在另一方面，本公開涉及用于產生可發酵糖的方法，包括a)將含有磨碎淀粉的材 料與水和稀釜餾物混合，其中稀釜餾物占10至70% v/v，并且獲得包含淀粉及具有20至
干固體(ds)含量的漿液，b)用植酸酶在液化淀粉之前或與之同時處理該漿液，c) 液化該淀粉，d)在步驟b)期間和/或與液化步驟同時添加α -淀粉酶至所述淀粉和e)糖 化液化的淀粉以獲得可發酵糖，其中在步驟a)、b)、c)、d)或e)的任意步驟期間不調節pH。在一些實施方案中，將可發酵糖回收和純化或異構化。在其他實施方案中，在液化步驟之前 添加植酸酶。在其他實施方案中，α-淀粉酶隨植酸酶一起添加。又在其他實施方案中，在 液化步驟期間添加第二份α-淀粉酶劑量。本文中也提供了用淀粉酶處理含淀粉材料或淀粉的方法。所述方法包括步驟將 含淀粉材料或淀粉與包含本文中所公開的至少一種α-淀粉酶變體的組合物在足以允許 α-淀粉酶的可檢測活性的條件下接觸；其中該變體淀粉酶是本文中公開的任意變體；并 且其中該淀粉至少部分地被該變體淀粉酶降解。在優選的實施方案中，該α-淀粉酶變體 是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體 α-淀粉酶。所述方法方便地用作淀粉降解、液化、發酵工藝、醇生產、甜味料生產、可發酵底 物生產、清潔、洗滌、污漬去除或焙烘過程等過程的一部分。附圖簡述

圖1顯示用于本文中的幾種候選親本α _淀粉酶(AmyS樣淀粉酶)之間氨基酸序 列的比對結果。可以輕易地確定與來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的淀粉酶(SEQ ID Ν0:1)的 任意氨基酸位置(例如1至520)相對應的位置。SEQID NO :1，來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌 “BSG”的α -淀粉酶；SEQ ID NO :2，來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的截短淀粉酶(AmyS，SPEZYME XTRA) ；SEQID NO :3，嗜熱脂肪土芽孢桿菌(S242A變體淀粉酶)；SEQ ID NO :4，嗜熱脂肪土 芽孢桿菌(S242Q變體淀粉酶)；SEQ ID NO :5，嗜熱脂肪土芽孢桿菌(S242E變體淀粉酶)； SEQ ID NO 6, Yamane 707 淀粉酶；SEQ ID NO :7，成熟的 LAT 淀粉酶；SEQ ID N0:8，地衣 芽孢桿菌野生型淀粉酶[TERMAMYL(NOVOZYMES) =TO 02/10355A2 中的 SEQ ID NO 8]； SEQ ID NO :9，解淀粉芽孢桿菌淀粉酶，BAN ；SEQ ID NO :10，STAINZYME =作為 WO 0060060 中 SEQ ID NO :2 或 US 6，528，298 中 SEQID NO 24 的 AA560 ；SEQ ID NO :11，鹽敏芽孢桿菌 (B. halmapalus)淀粉酶(NATALASE) ；SEQ ID NO 12，KSM-1378 (KAO CORP.，EPl 199356 中的 SEQ ID NO 3) ；SEQ ID NO :13，芽孢桿菌屬物種 KSM-K38 (KA0C0RP.，US 6，403，355B1 中的 SEQ ID NO 4) ；SEQ ID NO 14，芽孢桿菌屬物種 KSM-K36 (KAO CORP. , US 6，403，355B1 中的 SEQ ID NO 2) ； SEQ ID NO 15，LIQUOZYME SC (N0V0ZYMES) ； SEQ ID NO :16，親本 α -淀粉酶 共有序列#1。圖 2 顯示 pHPLT-AmyS 質粒。圖3顯示S242變體在95°C熱應激30分鐘后的殘余活性百分數。還顯示了具有羧 基端截短29個氨基酸的Δ 179-180的嗜熱脂肪土芽孢桿菌陽性對照(即SEQ ID NO 2)。 線指示在野生型酶的殘余活性百分數的標準差之上2倍和3倍。S242A和S242Q清晰地顯 示比野生型更高的殘余活性。圖4 圖4Α、B、C、D、Ε、F、G、H和I分別顯示來自圖1的幾個序列的逐對比對結果 和共有序列及特征，分別顯示共有序列2、3、4、5、6、7、8、9和10或SEQ ID NO :22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30。圖5顯示在沒有鈣添加的情況下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點。圖6顯示在2mM添加的鈣存在下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點。圖7顯示Spezyme Xtra和兩種變體相對于Liquozyme SC在4、10和20分鐘的活 性斷面圖。圖8顯示4種變體相對于S242Q變體在3個時間點的活性斷面圖。
圖 9 顯示因 30 μ g 劑量的 α -淀粉酶 Liquozyme SC、Spezyme Ethyl 或 Spezyme Xtra的作用所致的谷物粉粘度降低。圖10顯示因30 μ g劑量的α -淀粉酶Liquozyme SC或Spezyme Xtra或兩種變 體(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。圖11顯示因20 μ g劑量的α -淀粉酶Liquozyme SC或Spezyme Xtra或兩種變 體(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。圖 12 顯示用 Liquozyme SC、Spezyme Xtra 或兩種變體(S242A 和 S242Q)之一經 過時間(0、30、60和90分鐘)處理的全磨谷物的DE進展。噴射之前和之后的液化酶投放 量表示為“Χ+Υ”，其中-X和Y分別代表噴射之前和之后添加的酶單位數。圖 13 顯示用 Liquozyme SC、Spezyme Xtra 或兩種變體(S242A 和 S242Q)之一經 過時間(0、30、60和90分鐘)處理的全磨谷物的噴射之后粘度。X和Y如圖12所示。圖14顯示用植酸酶和淀粉酶(Spezyme Xtra或S242Q變體)經過時間(0、30、60 和90分鐘)處理的全磨谷物的DE進展。MAXALIQ是從Danisco分公司Genencor可獲得的 植酸酶/淀粉酶摻合物。在全磨谷物(含有30%稀釜餾物的32% ds.谷物)、無噴射蒸煮 的低pH(5. 2)液化工藝中，在使用242Q AA的初級液化期間觀察到植酸酶作用，參考實施例 8。圖15顯示用植酸酶和淀粉酶(例如，Spezyme Xtra或S242Q變體)經過時間(O、 30,60和90分鐘)處理的全磨谷物的噴射之后粘度。條件如圖14中那樣。參考實施例8。圖16顯示用S242Q變體和植酸酶處理的全磨谷物的DE進展。條件包括含有 30%稀釜餾物，pH 5. 2的32%全磨谷物。在30分鐘預溫育期間，以O (對照)、1、2、4、6、9 和12FTU添加BP-17植酸酶，隨后進行初級液化。初級液化期間使用的酶242Q 4AAU/gm ds谷物，溫育時間是在70°C 45分鐘。次級液化是在90°C 90分鐘。參考實施例9。圖17顯示用S242Q變體和植酸酶處理的全磨谷物的噴射之后粘度。觀察到移除 植酸鹽對于在90°C，pH 5. 2分批液化全磨谷物期間粘度降低的影響。與植酸酶的預溫育如 圖16中那樣。參考實施例9。圖18顯示植酸酶處理全磨谷物對提高S242Q變體的熱穩定性和低pH穩定性的影 響。觀察到低PH對全磨谷物(含有30%稀釜餾物的32% ds.谷物)液化過程的影響。三 角形，pH 5. 2 ；正方形，pH 4. 8 ；菱形，pH 4. 5 ；和圓形，pH 4. 2。參考實施例9。圖19顯示在全磨谷物初級液化期間添加植酸酶對噴射蒸煮后粘度降低的影響。 條件如圖18中那樣。白色，pH 5. 2 ；黑色，pH 4. 8 ；點劃線，pH 4. 5 ；并且虛線，pH 4. 2。參 考實施例9。圖20是這樣的圖，該圖顯示觀察到BP-17濃度全磨谷物于pH 5. 2被S242Q變體 AA(4AAU/gds谷物)初級液化期間在90°C對DE進展速率的影響。測量了 DE進展的速率 (正方形)和植酸作為IP6的降低百分數(菱形)。圖21是顯示S242Q α -淀粉酶變體對常規加工條件下DE進展的影響的圖。觀察 了 PH對伴有噴射蒸煮的液化(32%03，30%稀釜餾物，10分鐘，漿液在851+1071噴射+3 分鐘停留時間+在85°C次級分批液化90分鐘)中S242Q性能的影響。正方形，pH 5. 8 ；菱 形，pH 5. 5。參考實施例8。圖22是這樣的圖，其描述使用S242Q組合電荷文庫，在20°C于2倍Tide中清潔稻淀粉微量樣品時，S242Q(實心圓圈)及其變體(空心圓)在北美洗衣條件下稻淀粉微量樣 品測定法中作為電荷之函數的性能。參考實施例16。圖23是這樣的圖，該圖描述了使用TS23t組合電荷文庫，在40°C于Persi 1中清潔 稻淀粉微量樣品時，具有以下突變Q98R、M201L、S243Q、R309A、Q320R、Q359E和K444E的芽 孢桿菌屬物種截短TS-23淀粉酶(實心圓)及其電荷變體(空心圓)(見2008年6月6日 提交的共同待決美國專利申請號PCT/US2008/007103)在西歐洗衣條件下稻淀粉微量樣品 測定法中作為電荷之函數的性能。參考實施例16。圖24是這樣的圖，該圖描述S242Q(實心圓)及其變體(空心圓)在BODIPY-淀粉 測定法中作為電荷之函數的性能。S242Q組合電荷文庫(CCL)、對BODIPY-淀粉的比活性、 標準測試條件參考實施例16。圖25A是描述作為相對振搖管表達之函數的相對BODIPY-淀粉水解作用(即，相 對BODIPY-淀粉水解與相對振搖管表達)的圖。圖25B是描述作為相對振搖管表達之函數 的相對微量樣品_淀粉水解作用(即，相對微量樣品_淀粉水解作用與相對振搖管表達) 的圖。參考實施例19。圖26A是描述作為電荷之函數的相對振搖管表達的圖。圖26B是描述作為電荷之 函數的相對BODIPY-淀粉水解作用的圖。參考實施例19。圖27A是描述作為電荷之函數的相對振搖管表達的圖。圖27B是描述作為電荷之 函數的相對微量樣品清潔活性的圖。參考實施例19。發明詳述1.定義和縮寫根據該公開，以下縮寫和定義適用。應當指出如本文中所用，單數形式“一個”、“一 種”和“該”包括復數稱謂，除非上下文另外清楚地說明。因此，例如，對“一種多肽”的提及 包括多種此類多肽，并且對“該制劑”的提及包括對本領域技術人員已知的一種或多種制劑 和其等同物的提及等。除非另外定義，本文中所用的全部技術及科學術語具有與本領域普通技術人員通 常所理解的相同意義。下文提供了以下術語。1.1. _旨寫
除非另外說明，使用以下縮寫
AATCC美國紡織化學師與印染師協會
ADff自動餐具洗滌；
AE脂肪醇乙氧基化物；
AEO脂肪醇乙氧基化物；
AEOS乙氧基化脂肪醇醚硫酸鹽；
AES氧基化脂肪醇醚硫酸鹽；
AFAU酸性真菌α-淀粉酶單位；
AGU葡糖淀粉酶活性單位；
AOSα-烯基磺酸鹽；
AS醇硫酸鹽；
BAA細菌α-淀粉酶；0105]V攝氏度；0106]CCL組合電荷文庫；0107]cDNA互補性DNA ；0108]CMC羧甲基纖維素；0109]dE如CIE-LAB顏色空間所定義的總色差；0110]dH20去離子水；0111]dIH20Milli-Q過濾去離子水；0112]DE右旋糖等同物；0113]DNA脫氧核糖核酸；0114]dNTP三磷酸脫氧核糖核苷酸；0115]DO溶解氧；0116]DP3具有3個亞單元的聚合程度；0117]DPn具有η個亞單元的聚合程度；0118]DS (或ds)干固體含量；0119]DSC差示掃描量熱法；0120]DTMPA二乙三胺五乙酸；0121]EC酶分類酶學委員會；0122]EDTA乙二胺四乙酸；0123]EDTMPA乙二胺四甲叉膦酸；0124]EO環氧乙烷；0125]eq、l/. ga. 白里；0126]ETOH乙醇；0127]F&HC織物和家居用品護理0128]FTU“植酸酶(fitase) ”單位，植酸鹽水解單位；0129]g (或gm)克；0130]GAU葡糖淀粉酶單位；0131]gpg格令/加侖；0132]g/1克/升；0133]Genencor Danisco US Inc，Genencor Division,Palo Alto, CA0134]H2O水；0135]HDG重垢顆粒洗滌劑；0136]HDL重垢液體洗滌劑；0137]HFCS高果糖玉米糖漿；0138]HFSS基于高果糖淀粉的糖漿；0139]HPAEC-PAD具有脈沖安培檢測的高效陰離子交換色譜；0140]hr小時；0141]IKA北卡萊羅納州威爾明頓SE North Chase公園大街26350142]IKA Works Inc ；0143]IPTG異丙基β-D-硫代半乳糖苷；
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
0191]
0192]
0193]
0194]
0195]
0196]
0197]
0198]
0199]
0200] 0201]
百分污漬去除指數； 同時糖化和發酵； 四乙酰乙二胺；
DSC曲線的熱中點或蛋白質的熔融溫度；
三硝基苯磺酸； 微克；
% SRI SSF TAED T
1 m
TNBS μ g
μ 1，(yL)微升；
μ Nm 微牛頓米； μ m微米；
μM微摩爾；
U單位；
V/V體積比體積；
WE西歐；
wt % 重量百分數； w/v (或W/V)重量/體積； w/v (或ff/w)重量/重量； Wt野生型。
1.2.定義
在一些方面，本公開依賴于遺傳工程和分子生物學中使用的常規技術和方法。以 下資源包括對根據本文中所公開內容有用的一般方法學的描述=Sambrook等人，MOLECULAR CLONING :A LAB0RAT0RYMANUAL (第二版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER ANDEXPRESSION ； A LABORATORY MANUAL (1990)和 AusubeI 等人，編著.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。這些通用參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。除非本文另外定 義，本文中所用的全部術語及科學術語具有與本公開所屬領域的技術人員通常理解的相同 意義。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROB10L0GY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wileyand Sons, New York(1994)禾口 Hale 與 Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向技術人員提供了本公開中所使用的眾多術語的通 用字典。“分離的”意指分離的物質(例如一種化合物或序列)借助人工相對于如自然界中 存在的該化合物或序列而言被修飾。例如，分離的序列至少部分地不含或甚至基本上不含 如自然界中存在的與該序列天然關聯的至少一種其他組分。當用來描述材料或物質時，“純化的”意指該材料或物質處于相對純的狀態，例如， 至少約90%純度，至少約95%純度、至少約98%純度或至少約99%純度。如本文中所用，術語“淀粉”指包含復雜多糖的任意糖組合物，其包含具有式 (C6H10O5) x的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉，其中X可以是任意數字。優選地，淀粉指在包括但不 限于谷粒、牧草、根狀莖或根的植物中天然存在并且更具體來自小麥、大麥、谷物、燕麥、稻、 高粱、木薯(cassava)、谷子、馬鈴薯、甘薯和木薯的任意碳水化合物。淀粉也可以指合成性 淀粉或改性淀粉，如用作酶測定法的可檢測底物的化學改性淀粉或者旨在改善一種或多種使用特性的化學改性或酶改性淀粉。如本文中所用，“植酸”(或肌醇六磷酸(IP6))是磷在多種植物組織如麩、種子等 中的主要貯藏形式。植酸在本文中也稱作“植酸鹽”，尤其處于鹽形式時。多種其他肌醇磷 酸如肌醇五磷酸(IP5)、肌醇四磷酸(IP4)和肌醇三磷酸(IP3)在本文中也稱作植酸鹽。植 酸鹽通常是人和大多數單胃動物可消化的。降解植酸鹽的酶在本文中稱作“植酸酶”或“植酸酶(fytase)，，并且一般是六 磷酸肌醇磷酸水解酶。植酸酶活性定義為植酸酶單位(FTU或U)，其中一個FTU定義為 在pH 5.5和37°0每分鐘從0.0015!1101/1植酸鈉中釋放1微摩爾無機磷的酶量。該定義 提供了對植酸酶活性量的有用測量并代表一種簡單的基準度量。已經鑒定并表征了酵母 (例如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、異常畢赤酵(Pichia anomala)、 Arxulaadeninivorans)、革蘭氏陰性細菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli)、假單胞菌 屬的物種(Pseudomonas spp.)、克雷伯菌屬某些物種(Klebsiella spp.))和革蘭氏陽性 (例如芽孢桿菌屬的某些物種(Bacillus spp.))的植酸鹽降解酶。來自許多植物和來自 絲狀真菌如青霉屬某些物種(Penicillium spp.)、曲霉屬某些物種(Aspergillus spp·)、 木霉屬某些物種(Trichoderma spp.)、梨形毛霉(Mucor piriformis)和枝孢霉屬某些物 種(Cladosporium spp.)的植酸酶也是已知的。已經根據啟動水解的位點表征了 3-植酸 酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。另外，植酸酶已經基于它們的“最適pH” 表征為酸性(最適PH約5)或堿性(最適pH約9)。多種商業植酸酶是可獲得的，包括 ROVABIO(Genencor International)。“淀粉酶”指能夠催化淀粉底物的切割，從而導致淀粉降解或部分降解的 酶。淀粉酶通常是切割淀粉中糖苷鍵的水解酶。如本文中所用，淀粉酶包括任意的葡 糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶，例如芽孢桿菌屬的某些物種、尤其地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)的野生型 α -淀粉酶。通常，α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1 ； α _D_(1 —4)-葡 聚糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機方式切割淀粉分子內部—4)0-糖苷鍵的內切 作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如β-淀粉酶(EC 3.2. 1.2;和a-D-(l —4)-葡聚糖 麥芽糖水解酶)和一些產物特異性淀粉酶如生麥芽糖α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 133)從非 還原末端切割底物淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 20 ； a-D-葡糖苷葡 萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ;a -D-(1 — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和產物特 異性淀粉酶可以從淀粉產生特定長度的麥芽低聚糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的野生型α -淀粉酶或“AmyS”淀粉酶在本文中有時候稱作XTRA或 SPEZYME XTRA，它們是來自 GenencorInternational 的商業 AmyS 產物。如本文中所用，“AmyS樣α -淀粉酶”用作本文中的親本淀粉酶。AmyS樣α-淀 粉酶基于它們之間存在的實質同源性而構成本文中的一類α-淀粉酶。“AmyS樣α _淀粉 酶”意圖指在氨基酸水平針對本文中具有SEQ ID NO :2中所示氨基酸序列的α-淀粉酶顯 示實質同一性的α-淀粉酶類，特別地指芽孢桿菌屬α-淀粉酶，尤其指嗜熱脂肪土芽孢桿 菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus) ct-淀粉酶。從 Genencor 分公司 Danisco US Inc 可商業地獲得Spezyme Xtra0嗜熱脂肪土芽孢桿菌已經在文獻中稱作嗜熱脂肪芽孢桿菌 并且這二者可以在本文中互換地使用。具有本文中分別作為SEQ IDNO :1、6、7、8、9、10、11、 12、15和16所提供的氨基酸序列的全部α-淀粉酶視為AmyS樣α-淀粉酶并且因而適合作為親本α -淀粉酶。AmyS樣α -淀粉酶也包括這樣α _淀粉酶，其i)具有與SEQ ID NO :1、6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示氨基酸序列至少之一具有至少60%同源性(同一 性),如至少70 %、至少75 %或至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少 97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列和/或ii)由這樣的DNA序列編碼，其中 所述DNA序列與編碼以上所述任意α-淀粉酶的DNA序列或明顯來自WO 06/002643的SEQ ID NO 9 (BAN)、5 (BSG)、3 (SP722)、1 (SP690)、7 (LAT)、11 (AA560)中或本說明書的那些 DNA 序列雜交，其編碼本文分別在SEQ ID NO :1、6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示的任意氨基 酸序列。用作AmyS樣α-淀粉酶并因而用作產生本文變體的親本酶的其他同源α -淀粉 酶還包括由ΕΡ0252666中描述的地衣芽孢桿菌菌株產生的α -淀粉酶；在WO 91/00353和 WO 94/18314中鑒定的(ATCC 27811)和α -淀粉酶。商業AmyS樣α-淀粉酶包含于按以 下商品名稱出售的產品中Spezyme AA 和 ULTRAPHL0W(從 Danisco US Inc, Genencor Division 可獲得)和 Keistase (從 Daiwa 可獲得)和 LIQUEZYME SC (從丹麥 Novozymes 可獲得)。本文以下1.5部分提供了關于AmyS樣α-淀粉酶的進一步信息。其中的表A 提供了幾種有用AmyS樣α -淀粉酶的名單以及比較彼此之間氨基酸序列同一性的便利方 法。技術人員會理解可以對其他α-淀粉酶構建相似表格以確定它們作為親本酶在本文中 的適用性。如本文中所用，“分光光度酸性蛋白酶單位”(“SAPU”)是蛋白酶酶活性的單位，其 中ISAPU是在測定法的條件下每分鐘從酪蛋白底物中釋放1微摩爾酪氨酸的蛋白酶酶活性的量。“葡糖淀粉酶單位”(“GAU”)是解淀粉活性的度量，其定義為在ρΗ 4. 2和60°C每 小時將從可溶性淀粉底物產生Ig還原性糖(計算為葡萄糖)的酶活性的量。本文中所用，術語“變體”可以與術語“突變體”互換地使用。“變體”可以指多肽或 核酸。變體包括一個或多個序列“修飾”，其中如在本文中所用，所述的序列修飾包括相對于 參考序列在一個或多個位置處的替換、插入、缺失、截短、顛換和/或倒位。每種修飾可以包 括相對于參考序列導致序列中一個或多個氨基酸殘基或核苷酸改變的變化。變體核酸包括 與能夠同本文中所呈現核苷酸序列雜交的序列互補的序列。例如，本文的變體核酸序列可 以與能夠同本文中所呈現核苷酸序列在嚴格條件(例如50°C和0. 2XSSC(1X SSC = 0. 15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，ρΗ 7.0))下雜交的序列互補。更優選地，術語“變體”包括與能夠 在高度嚴格條件(例如65°C和0. 1XSSC)下同本文中所呈現核苷酸序列雜交的序列互補的 序列。當用來描述酶時，“熱穩定的”意指該酶比參考酶更為熱穩定。在本申請中，如果 α -淀粉酶變體在相同實驗條件(例如相同的溫度、底物濃度等)下特定時間間隔后具有相 對更高的酶活性，則該變體比野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶更為熱穩定。備選地，與參考 酶相比，更為熱穩定的酶具有由差示掃描量熱法確定的更高熱容量。多肽的“熔融溫度”(Tm)是該多肽的構象發生可測量的溫度依賴性變化的溫度。蛋 白質構象和Tm可以例如通過圓二色譜法(一種最通用和最基礎的研究蛋白質折疊的工具) 分析。圓二色譜測量圓偏振光的吸收。在蛋白質中，結構如α螺旋和β折疊通常具有手 性并且因而吸收圓偏振光。光吸收作用提供了蛋白質折疊程度的度量。這種吸收作用的變 化作為溫度或變性劑濃度的函數可以用來研究蛋白質的平衡解折疊過程。這種類型的光譜學也可以與裝置如截流混合儀(stopped flow mixer)組合來測量蛋白質折疊/解折疊的 動力學。“鈣依賴的”意指特定酶需要鈣以實質地展示出催化活性。一般如本文中所用，”韓 依賴的”包括嚴格要求雙價金屬離子以展示催化活性的任何酶的特性并且也包括在鈣或另 一種雙價陽離子存在下實質(例如超過20% )提高其催化活性的酶。如本文中所用，”pH穩定的”就酶而言可以涉及酶活性或酶的蛋白質構象。在第一 種意義下，“PH穩定的”意指酶在特定pH或在特定pH范圍內保留催化活性。在第二種意義 下，酶可以視為在該蛋白質沒有不可逆變性的PH處是“穩定的”。在這種情況下，該酶在回 轉至能夠支持催化活性的PH時會變得有催化活性。pH穩定性也可以以相對或比較性方式 使用，如相對于參考酶。在本申請中，α-淀粉酶變體可以比野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉 酶更為PH穩定，當該變體比野生型具有相對更高的活性時，例如當維持在給定的pH處或在 包括PH在內的相同條件下分析時。最感興趣的pH—般是實際使用的條件或是處在或接近 該酶保持催化活性的天然能力的界限或極限處的ΡΗ。“pH范圍”意指pH值的范圍，例如，從更酸至更堿或反之亦然。就酶活性而言，pH 范圍表明該酶展示特定活性水平(例如最小活性、特定百分數的最大活性或特定水平的底 物轉化或產物形成)的PH值上限和下限。當涉及細胞、核酸、蛋白質或載體使用時，“重組”是導入異源序列或改變天然序列 的結果或已經因導入異源序列或改變天然序列而被修飾的細胞、核酸、蛋白質或載體，或細 胞從如此修飾或改變的細胞衍生。因而，例如，重組細胞可以表達在該細胞的天然(非重 組)形式中不存在的基因或可以表達本來差異性表達(例如不足表達或過量表達)、異常表 達或根本不表達的天然基因。如本文中所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指兩個或更多個核苷酸、核糖核苷酸 等或其衍生物的任意序列。核苷酸序列包括寡核苷酸和多核苷酸序列，以及其變體、片段、 同源物和衍生物。核苷酸序列可以是單鏈、雙鏈或多鏈的。核苷酸序列可以來自任何來源 或起源，例如是基因組的、合成的或重組的，并且包括基因組DNA，cDNA、合成DNA和RNA等 以及其雜合體。核苷酸序列可以包含一個或多個密碼子并且可以編碼一種或多種多肽。核 苷酸序列可以偏好地采取一種或多種能量優選的三維結構。“載體”指經常用于體外實驗用途或用于將核酸導入一種或多種細胞類型的核苷 酸序列。載體包括克隆載體、體內或體外表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體顆
粒、盒等ο如本文中所用的“表達載體”意指包含與適宜調控序列有效連接的DNA序列的DNA 構建體，其中所述的調控序列能夠引起該DNA在合適宿主中的表達。此類調控序列可以包 括實施轉錄的啟動子、控制轉錄的任選操縱基因序列、編碼mRNA上的合適核糖體結合位點 的序列、增強子和控制轉錄及翻譯終止的序列。多核苷酸或多肽與另一個序列具有某個序列同一性百分數(例如至少約80%、 85%、90%、95%或99% )意指當比對時，在比較的這兩個序列中堿基或氨基酸殘基是相 同的時的百分數。可以使用本領域已知的任意合適軟件程序例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. Μ.等人(編著)1987，附錄30，第7. 7. 18部分)中描述的那些軟 件程序確定這種比對結果和同源性或同一性百分數。此類程序可以包括GCGPileup程序、FASTA(Pearson 等人(1988)Proc. Natl，Acad. Sci USA 85 2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf. , Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda，Md.和 Altschul 等人，(1997) NAR 25:3389-3402)。另一種比對程序是使用默認 參數的 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)。可使用的另一種序列 軟件程序是在序列軟件包6. O版(Sequence Software PackageVersion 6. 0)(威斯康星州 麥迪遜威斯康辛大學Genetics Computer Group)中可獲得的TFASTA數據搜索程序。本領域技術人員會認識到由本公開包括的序列也可以通過嚴格條件下與所例舉 的amyS序列(例如WO 06/002643的SEQ ID NO 5)雜交的能力進行定義。當單鏈形式的 核酸可以在適宜的溫度和溶液離子強度條件下與另一種核酸復性時，則該核酸可與另一種 核酸序列雜交。雜交和洗滌條件是本領域熟知的(見，例如上文的Sambrook (1989)，尤其第 9和11章)。在一些實施方案中，嚴格條件對應于65°C的Tm和0. 1XSSC，0. 1% SDS0“基因”指參與產生多肽并包括在編碼區之前及之后的區域以及各個編碼區段(外 顯子)之間間插序列(內含子)的DNA區段。就多核苷酸或蛋白質而言，“異源的”指不天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋 白質。在一些實施方案中，該蛋白質是商業重要的工業用蛋白質。該術語意圖包括由天然存 在基因、突變基因和編碼異源蛋白質如融合蛋白質的核酸和/或合成基因編碼的蛋白質。就多核苷酸或蛋白質而言，“內源的”指天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋白 質。如本文中所用，術語“轉化的”、“穩定轉化的”和“轉基因的”就細胞而言使用時， 意指該細胞包含至少一種非天然(例如異源的)核酸序列。穩定轉化的細胞包含至少一種 這樣的核酸序列，所述核酸序列整合到細胞的基因組或整合在經多個世代仍保留的附加型 質粒中。如本文中所用，“表達”指基于基因的核酸序列產生多肽的過程。該過程包括轉錄 和翻譯。“信號序列”意指與蛋白質的氨基端部分共價結合的氨基酸序列，所述氨基酸序列 促進該蛋白質的運輸，例如促進該蛋白質的成熟形式分泌到細胞外。信號序列的定義是功 能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少(例如在分泌過程期間)被切除的信號序列。如本文中所用，術語“衍生的”包括術語“源自”、“從......獲得”或“從......可
獲得”和“從......分離”。術語“蛋白質”和“多肽”在本文可互換地使用。本文中使用氨基酸殘基的常規單 字母或三字母代碼。“啟動子”是參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的調節序列。啟動子可以是誘導 型啟動子或組成型啟動子。例如，可以在本文中使用來自里氏木霉(Trichoderma reesei) 的一種誘導型啟動子cbhl。“有效連接的”指這樣的接近，其中諸元件處在允許它們功能性地聯系的排列中， 甚至沒有緊密的物理靠近。例如，如果一個啟動子能夠控制編碼序列并且在對于該序列為 允許或誘導的條件下控制該序列轉錄，則該啟動子與此編碼序列有效連接。“選擇標記”指這樣的基因，該基因能夠在宿主中表達并允許選擇表達該標記基因 的那些宿主。選擇標記的例子包括但不限于提供對抗微生物物質(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)抗性改變的基因和/或賦予宿主細胞代謝選擇性如營養優勢(如在作為唯一碳 水化合物來源的特定底物上生長)的基因。在核酸序列插入細胞的上下文中，“導入”意指“轉染”、“轉化”或“轉導”并且包 括對核酸序列摻入真核或原核細胞的談及，其中所述核酸序列可以摻入該細胞的基因組 (例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，被轉化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的 mRNA)ο“宿主”、“宿主菌株”或“宿主細胞”意指在其中安置包含多核苷酸(例如編碼變 體α-淀粉酶的多核苷酸)的表達載體或DNA構建體的合適細胞。宿主菌株優選地是細菌 細胞。在一個優選的實施方案中，“宿主細胞”意指從微生物株(例如芽孢桿菌屬的某些物 種)的細胞產生的細胞和/或原生質體。術語“培養”指在合適的條件下在能夠支持這種生長的培養基中培育微生物細胞 群體。在一個實施方案中，培養指將含有顆粒淀粉的淀粉底物發酵性生物轉化成終產物 (一般在容器或反應器中)。“發酵”由微生物分解有機物質以產生更簡單的有機化合物。盡管發酵一般在主要 厭氧的條件下進行，然而意圖該術語應當不限于嚴格厭氧條件，因為發酵也在氧存在下發 生。術語“酶轉化”一般指通過酶作用修飾底物。如本文中所用的該術語也指通過酶 的作用修飾淀粉底物。如本文中所用，術語“糖化”指淀粉經酶轉化成葡萄糖。術語“凝膠化”意指至少部分地增溶淀粉顆粒或分子，例如通過蒸煮以形成粘性混懸液。術語“液化”通常指淀粉轉化期間淀粉至少部分地水解以產生低分子量產物例如 可溶性糊精的階段。術語“聚合程度(DP) ”指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單元的數目(n)。DPI的例子是 單糖類，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖類，如麥芽糖和蔗糖。DP > 3指具有大于3的 聚合程度的聚合物。技術人員會理解具有更大DE的化合物是更為聚合的。“終產物”或“所需終產物”指酶反應的任意預期產物，例如從淀粉底物以酶方式轉 化而來的淀粉衍生分子。如本文中所用，“干固體含量” (ds)指基于干重量的以％表示的漿液總固體。術語 “漿液”指含有不溶性固體的含水混合物。術語“殘余淀粉”指含淀粉的底物發酵后組合物中留下的任何殘留(可溶性或不 可溶性)淀粉。“再循環步驟”指糖化醪組分的再循環，所述的糖化醪組分可以包括殘余淀粉、發 酵包含淀粉的酶和/或微生物。術語“糖化醪(mash) ”指水中用來產生發酵產物如醇的可發酵碳源(碳水化合物) 的混合物。在一些實施方案中，術語“發酵醪(beer)”和“糖化醪”可互換地使用。“釜餾物”意指未發酵的固體與水的混合物，如從發酵的糖化醪去除醇后的殘余 物。術語“蒸餾器干酒糟(DDG) ”和“具有可溶物的蒸餾器干酒糟(DDGS) ”指谷物發酵的有用副產物。如本文中所用，“產乙醇微生物”指具有將糖(例如單糖、二糖、低聚糖或多糖)轉 化成乙醇的能力的微生物。產乙醇微生物因其表達單獨地或共同將糖轉化成乙醇的一種或 多種酶的能力而具有產乙醇性。如本文中所用，“乙醇生產者”或“產乙醇生微生物”指能夠從己糖或戊糖產生乙醇 的任何生物或細胞。通常，產乙醇細胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產乙醇微生物的例 子包括真菌性微生物如酵母。如本文中所用，“比活性”意指一種酶單位，其定義為在特定條件下每單位時間由 酶制劑轉換成產物的底物的摩爾數。比活性表示為單位(U)/單位重量的蛋白質，一般是U/ mg蛋白質。“產量”指使用本公開的方法所產生的終產物或所需終產物的量。在一些實施方案 中，該產量大于使用本領域已知方法所產生的產量。在一些實施方案中，該術語指終產物的 體積，并且在其他實施方案中，該術語指終產物的濃度。如本文中所用，“生物學活性的”指對生物系統例如細胞、器官或生物具有可測量 的影響的化合物或序列。“ATCC”指位于弗吉尼亞州Manassas 20108的美國典型培養物保藏中心(ATCC)。“NRRL”指美國伊利諾伊州皮奧里亞縣，國家農業應用研究中心，農業研究培養物 保藏中心(并且以前稱為USDA北部地區研究實驗室)。本文中所用，“食物”意指向包括人在內的動物提供營養價值的任意成分、組分或 組合物。如本文中所用，按慣例，當描述蛋白質和編碼它們的基因時，用于該基因的術語一 般用斜體(例如，編碼amyL(地衣芽孢桿菌AA)的基因可以表示為amyL)。用于蛋白質的術 語一般不用斜體并且首字母通常大寫(例如，由amyL基因編碼的蛋白質可以表示為AmyL 或amyL)。除非另外說明，分別將核酸序列從左至右以5’至3’方向顯示并將氨基酸序列從 左至右以氨基至羧基方向顯示。如本文中所用術語“包含”及其關聯詞以其包含......在內的意義使用；即，等同
于術語“包括”及其對應的關聯詞。數字范圍包括定義該范圍的數字在內。本文中提供的標題不限制所公開的多個方面或實施方案。盡管可以在實施或檢驗所公開的內容中使用與本文中所述的那些方法和材料相 似或等同的任意方法和材料，然而描述了某些當前優選的方法和材料而不意圖使實施者限 于所描述的任何具體方法、方案和試劑，因而這些可以變動。通過引用的方式明確并入本文 中所參考的全部專利和出版物，包括此類專利和出版物中公開的全部序列。2.命名在本說明書和權利要求書中，使用氨基酸殘基的常規單字母或三字母代碼。出于 引用方便，α-淀粉酶變體通常地由以下命名描述原始氨基酸位置替換的氨基酸根據這種命名，例如將第242位置處用丙氨酸替換絲氨酸顯示為Ser242Ala 或 S242A將第30位置處的丙氨酸缺失顯示為
Ala30*或 A30*或 ΔΑ30并且將額外氨基酸殘基如賴氨酸的插入顯示為
Ala30AlaLys 或 A30AK。氨基酸殘基連續區段(如氨基酸殘基30-33)的缺失顯示為(30-33) *或 Δ (Α30-Ν33)。在特定α-淀粉酶與其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在該位置內產生插入 的情況下，對于在第36位置插入天冬氨酸而言，這表示為* 36Asp 或 * 36D多個突變由加號隔開，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位置中將丙氨酸和谷氨酸分別替換為天冬氨酸和絲氨酸的突變。當可以在給定位置插入一個或多個備選氨基酸殘基時，它表示為A30N, E 或備選地，A30N 或 A30E。另外，當本文中鑒定到適合修飾的位置而不指出任何具體的修飾時，應當理解任 意氨基酸殘基可以替換該位置內存在的氨基酸殘基。因而，例如，當提到修飾在第30位置 處的丙氨酸，但不具體說明時，應當理解該丙氨酸可以缺失或替換為任何其他氨基酸，即， 以下任一氨基酸R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另夕卜，“Α30Χ”意指以下的任一替換A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或簡寫為A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。如果用于編號的親本酶已經在該位置處具有建議替換的所討論氨基酸殘基，則在 例如N或V之一存在于野生型中的情況下使用以下命名“X30N”或“X30N，V”。這表明其他相應的親本酶在位置30被替換成“Asn”或“Val”。3.氨基酸殘基的特征帶電荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His帶負電荷的氨基酸(負電荷最多的殘基排在首位)Asp、Glu帶正電荷的氨基酸(正荷最多的殘基排在首位)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水性氨基酸殘基(疏水性最強的殘基排在最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，親水性氨基酸(親水性最強的殘基排在最后)Thr、Ser、Cys、Gin、Asn04. α-淀粉酶和AmyS樣淀粉酶4. 1多種α -淀粉酶的氨基酸同一性
由芽孢桿菌屬某些物種產生的多種α -淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一) 的并且可以用作本文中的親本酶。可以在下表A中找到多種已知芽孢桿菌α-淀粉酶相互 之間的同一性百分數(基于氨基酸序列)。表A 幾種已知芽孢桿菌α -淀粉酶的氨基酸序列同一性 技術人員將理解可以從文獻或通過本文中公開的或本領域已知的任意方法確定 同一性百分數。例如，已經發現地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(LAT) (SEQ ID NO 7)與解淀 粉芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 9)約81 %同源并且與嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀 粉酶(BSG) (SEQ ID NO :1)約65%同源。其他同源α -淀粉酶包括WO 95/26397中公開 的 SP690 禾口 SP722，以及由 Tsukamoto 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988)，第25-31頁描述的從芽孢桿菌屬某些物種衍生的#707 α -淀 粉酶(SEQ ID NO 6)。KSM ΑΡ1378 α -淀粉酶在W 97/00324中公開(來自KAO公司)。4. 2親本α -淀粉酶如上文定義的AmyS樣α -淀粉酶可以作為親本α -淀粉酶使用。在一個優選的實 施方案中，親本α -淀粉酶從嗜熱脂肪土芽孢桿菌(例如上文引用的那些嗜熱脂肪土芽孢 桿菌之一)衍生，如具有SEQ ID NO :1或2中所示氨基酸序列的嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀 粉酶。4. 3親本雜合α -淀粉酶親本α -淀粉酶(即主鏈α -淀粉酶)也可以是雜合α -淀粉酶，即包含從至少 兩種α-淀粉酶衍生的部分氨基酸序列的組合的α-淀粉酶。親本雜合α-淀粉酶可以是一種這樣的α-淀粉酶，其中可以基于(如上文所定 義的)氨基酸同源性(同一性)和/或DNA雜交確定所述α -淀粉酶屬于上文描述的AmyS 樣α-淀粉酶家族。在這種情況下，雜合α-淀粉酶一般由AmyS樣α-淀粉酶的至少一個 部分和選自微生物(細菌或真菌)和/或哺乳動物來源的AmyS樣α -淀粉酶或非AmyS樣α-淀粉酶的一種或多種其他α-淀粉酶的部分組成。因而，親本雜合α -淀粉酶可以包含從至少兩種AmyS樣α -淀粉酶或從至少一種 AmyS樣和至少一種非AmyS樣細菌α -淀粉酶或從至少一種AmyS樣和至少一種真菌α-淀 粉酶衍生的部分氨基酸序列的組合。衍生部分氨基酸序列的AmyS樣α-淀粉酶可以是本 文中所引用的任意的特定AmyS樣α-淀粉酶。例如，親本α-淀粉酶可以包含從地衣芽孢桿菌菌株衍生的α-淀粉酶的羧基端 部分和從嗜熱脂肪土芽孢桿菌菌株或從嗜熱脂肪土芽孢桿菌(BSG)菌株衍生的α _淀粉酶 的氨基端部分。5.同源性(同一性)同源性可以作為兩個序列之間的同一性程度確定，表示彼此之間的關系，例如，第 一序列從第二序列衍生或反之亦然。同源性可以通過視檢或手工計算確定，不過更便利地 借助本領域已知的計算機程序如在(上文描述的)GCG程序包中提供的一種程序GAP確定。 因而，可以使用Gap GCGvS，例如采用同一性的默認評分矩陣和以下默認參數對于核酸序 列比較而言，空位創建罰分5. 0和空位延伸罰分0. 3，并且對于蛋白質序列比較而言，空位 創建罰分 3.0 和空位延伸罰分 0. 1。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch，(1970), J. Mol. Biol. 48 443-453的方法以產生比對結果并計算同一性。在Spezyme Xtra(SEQ ID NO 2)與例如另一種α -淀粉酶之間的結構性比對結果 可以用來鑒定其他AmyS樣α-淀粉酶中的等同/對應位置。獲得所述結構性比對結果的 一種方法將是使用來自GCG軟件包的Pile Up程序，利用空位罰分的默認值，S卩，空位創建 罰分3. 0和空位延伸罰分0. 1。其他結構性比對方法包括疏水簇分析法(Gaboriaud等人， FEBS Lett. 224 149-155，1987)和反向穿線法(reverse threading) (Huber,T ；Torda,AE, Protein Sci. 7(1) 142-149，1998)。6.雜交在表征以上AmyS樣α -淀粉酶中使用的寡核苷酸探針可以基于所討論α -淀粉 酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列適宜地制備。評估雜交的合適條件涉及在5Χ SSC中預浸泡并在40°C于20%甲酰胺，5Χ Denhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH 6. 8和50mg超聲處理的變性小牛胸腺DNA的溶液中預雜 交1小時，隨后在40°C于補充有IOOmMATP的相同溶液中雜交18小時，隨后在40°C (低 嚴格性)、優選地在50°C (中等嚴格性)、更優選地在65°C (高嚴格性)、甚至更優選地在 750C (非常高嚴格性)于2X SSC，0.2% SDS中洗滌濾膜3次，30分鐘。關于雜交方法的 更多細節可以在 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory ManuaL，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989 中找到。在本上下文中，“從......衍生”不僅意圖指由所討論的生物菌株產生或可產生
的α "淀粉酶，還指由分離自該菌株的DNA序列編碼并在用所述DNA序列轉化的宿主生物 中產生的α-淀粉酶。最后，該術語意圖指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼并具有 所討論α-淀粉酶的鑒別性特征的α-淀粉酶。該術語意圖表明親本α-淀粉酶可以是天 然存在α-淀粉酶的變體，即這樣的變體，它是修飾(插入、替換、缺失)天然存在α-淀粉 酶的一個或多個氨基酸殘基的結果。7.變體α -淀粉酶中的一般突變
在一個實施方案中，除了上文概述的那些修飾之外，本文中所述的變體還可以包 含一個或多個修飾。因而，可能有利的是將被修飾的α-淀粉酶變體的部分中存在的一個 或多個脯氨酸殘基(Pro)替換為非脯氨酸殘基，其中所述的非脯氨酸殘基可以是可能的、 天然存在的非脯氨酸殘基中的任一氨基酸殘基，并且優選地是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、纈氨酸或亮氨酸。類似地，在一個實施方案中，可以將親本α-淀粉酶中存在的一個或多個半胱氨 酸殘基替換為非半胱氨酸殘基，如絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸。應當理解所述變體可以摻入兩個或更多個上文所概述的修飾。另外，可能有利的是在一個或多個以下位置(使用SEQ ID NO 7用于編號)導入 突變M15、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、A209、A210、H405、T412，尤其以下 的單一、二重、三重或多重突變M15X，尤其 M15T，L ；V128X，尤其 V128E ；H133X，尤其 H133Y ；N188X，尤其 N188S，T，P ；M197X,尤其 M197T, L ；A209X，尤其 A209V ；M197T/W138F ；M197T/138Y ；M15T/H133Y/N188S ；M15N128E/H133Y/N188S ；E119C/S130C ；D124C/R127C ；H133Y/T149I ；G475R, H133Y/S187D ；H133Y/A209V。在親本α-淀粉酶具有SEQ ID No. 7中所示氨基酸序列的情況下，可以被缺失 或替換以改善氧化穩定性的相關氨基酸殘基包括SEQ ID NO :2中的單一半胱氨酸殘基 (C363)和位于] 8、]\19、]\196、]\1200、]\1206、]\1284、]\007、]\011、]\016 和 Μ438 位置內的甲硫氨酸殘基。就提高α -淀粉酶變體相對于其親本α _淀粉酶的熱穩定性而言，似乎特別希望 在SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列中缺失至少一個并且優選地缺失2個或甚至3個以下 氨基酸殘基F178、R179、G180、1181、G182 和 K183。特別感興趣地，這種類型的成對缺失是R179 * +G180 * ；和1181 * +G182 * (分別是 SEQ ID No. 16或15)(或在滿足本公開上下文中親本α -淀粉酶要求的另一個α -淀粉酶 中這些成對缺失的等同物)。其他目的殘基包括SEQ ID No. 2中所示氨基酸序列的N193F和V416G。8.變體的改變特性8. 1 概述以下部分描述突變之間的關系，其中所述突變存在于本文中所述的變體中并且是 可以從其產生(相對于親本AmyS樣α-淀粉酶的那些特性而言)想要的特性改變。本文中描述了具有改變特性的AmyS樣α -淀粉酶。本文中具體構思的親本α -淀 粉酶是AmyS樣α -淀粉酶和親本雜合AmyS樣α -淀粉酶。在一個實施方案中，使用嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 2)作為起點，但是在其他實施方案中，可以使用SP722、BLA、BAN、AA560、SP690、KSM AP1378、#707和 其他芽孢桿菌屬α-淀粉酶。據此輕易地確定與SEQ ID NO :2中的位置相對應的氨基酸位置。技術人員會了解盡管出于編號/鑒定特定變體中已修飾及待修飾的氨基酸殘基 的目的，可能使用任意親本α-淀粉酶作為參考淀粉酶，然而SEQID Ν0:1是目前為此目的 優選序列，因為它是本文目前可獲得的最長嗜熱脂肪芽孢桿菌序列。在一個方面，本公開涉及了具有改變特性(例如，如上所述特性)的變體。在其幾個方面之一，本公開提供了親本嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀粉酶的變體， 該變體在選自(使用例如SEQ ID Ν0:1用于氨基酸編號的)以下位置的一個或多個位置處 包含改變P17、D19、T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、 S124、D125、N127、I130、G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、 P209、N224、S242、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、 K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、 G474、R483，其中(a)所述改變獨立地是在占據該位置的氨基酸下游插入氨基酸；(ii)缺失占據該 位置的氨基酸；或(iii)用不同的氨基酸替換占據該位置的氨基酸，(b)該變體具有α -淀粉酶活性，并且(c)每個位置對應于親本淀粉酶(例如嗜熱脂肪土芽孢桿菌α -淀粉酶(例如具 有SEQ ID Ν0:2中所示的氨基酸序列))的氨基酸序列的位置，所述親本淀粉酶例如是作為 來自Genencor的SPEZYME XTRA可商業獲得的截短α -淀粉酶。本文中具體構思了 S242A、S242Q、S242N和S242E變體。額外地，選擇殘基R179、G180、1181、G182和Κ183以探索鈣-鈉結合區中突變的 作用并且因為在α -螺旋中央的脯氨酸是不尋常的，故選擇Ρ245。可以通過如上所述的比對，例如，如與圖4中比對結果中所示的那些序列比對找 到其他親本AmyS樣α-淀粉酶中的對應位置。因而，本文中構思了在以上列舉的位置(使 用例如SEQ ID NO :1用于比較性氨基酸編號)處包含改變的親本AmyS樣α -淀粉酶的變 體。8. 2改變的特性穩定性在本文中所述變體的上下文中，就實現改變的穩定性、尤其改善的穩定性(即更 高或更低)，在尤其高的溫度(即約70-120°C )和/或極端pH(即低或高pH，即分別是pH 4-6或pH 8-11)，尤其在低于60ppm的游離(即未結合的，因而溶液中的)鈣濃度而言，重 要的突變(包括氨基酸替換和缺失)包括在“改變的特性”部分中所列出的任意突變。可 以如下文“方法”部分中所述確定穩定性。8. 3改變的特性Ca2+穩定性改變的Ca2+穩定性意指已經相對于親本酶而改善酶在Ca2+耗竭下的穩定性，S卩，更 高或更低的穩定性。在本文中所述變體的上下文中，就實現改變的Ca2+穩定性、尤其改善的 Ca2+穩定性，S卩，更高或更低的穩定性，尤其在高pH(即pH 8-10.5)而言，重要的突變(包括氨基酸替換和缺失)包括在“改變的特性”部分中所列出的任意突變。8. 4改變的特性比活性在又一方面，就獲得變體而言，重要的突變(包括氨基酸替換和缺失)包括在“改 變的特性”部分中所列出的任意突變，其中所述的變體展示改變的比活性，尤其提高或降低 的比活性，尤其在10-60°C的溫度、優選20-50°C、尤其30-40°C。可以如下文“方法”部分中 所述確定比活性。8. 5改變的特性氧化穩定性與親本α-淀粉酶相比，所描述的變體可以具有改變的氧化穩定性，尤其是更高 的氧化穩定性。提高的氧化穩定性在例如洗滌劑組合物中是有利的，并且降低的氧化穩定 性可能在意圖用于淀粉液化的組合物中是有利的。可以如下文“方法”部分中所述確定氧 化穩定性。8. 6改變的特性改變的ρΗ譜就獲得變體而言，重要的位置和突變包括靠近活性中心殘基存在的氨基酸殘基的 突變，其中所述變體具有改變的PH譜，特別地在尤其高的ρΗ(即ρΗ 8-10. 5)或低的ρΗ(即 PH 4-6)時改善的活性。優選的特定突變/替換包括上文在“改變的特性”部分中對所討論位置列出的那 些突變/替換。在下文“方法”部分中描述合適的測定法。8. 7改變的特性洗滌性能就獲得變體而言，重要的位置和突變包括上文在“改變的特性”部分中對所討論位 置列出的特定突變/替換，其中所述變體在尤其高的ΡΗ(即ρΗ8. 5-11)時具有改善的洗滌 性能。可以如下文“方法”部分中所述測試洗滌性能。9.制備α-淀粉酶變體的方法如用于α -淀粉酶編碼性DNA序列的克隆方法那樣，用于導入突變至基因中的方 法是本領域已知的。將在下文討論此類方法，包括用于在α-淀粉酶編碼序列內部特定位 點處產生突變的方法。9. 1克隆編碼α -淀粉酶的DNA序列編碼親本α -淀粉酶的DNA序列可以使用本領域熟知的各種方法從產生所討論 α-淀粉酶的任意細胞或微生物分離。首先，應當使用來自產生待研究α-淀粉酶的生物的 染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果該α -淀粉酶的氨基酸序列 是已知的，則可以合成并使用同源的標記寡核苷酸探針以從基因組文庫鑒定編碼α-淀粉 酶的克隆，其中所述的基因組文庫從所討論生物制備。備選地，可以使用含有與已知α-淀 粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針作為探針來鑒定編碼α-淀粉酶的克隆，例如使 用低嚴格性的雜交和洗滌條件。用于鑒定編碼α _淀粉酶的克隆的另一種方法是基于將基因組DNA片段插入表達 載體如質粒，用所得基因組DNA文庫轉化α -淀粉酶陰性細菌并將轉化的細菌涂布在含有 α -淀粉酶底物的瓊脂上，因而允許輕易地鑒定表達α -淀粉酶的克隆。備選地，編碼所述酶的DNA序列可以通過已建立的標準方法合成地制備，例如 S. L. Beaucage 禾口 Μ. H. Caruthers,Tetrahedron Letters 22 1859-1869 (1981)描述的亞磷 酰胺法或Matthes等人，EMBO J. 3 :801_895 (1984)描述的方法。在亞磷酰胺方法中，將寡核苷酸合成，例如在自動DNA合成儀中，純化、復性、連接和在適宜載體中克隆。最后，DNA序列可以是混合來源的，包含例如根據標準技術，通過連接合成的、基因 組的或cDNA來源的片段(根據需要，與整個DNA序列的多個部分相對應的片段)制備的基 因組序列和合成序列、合成序列和cDNA序列或基因組序列和cDNA序列。DNA序列也可以通 過使用特異性引物的聚合酶鏈反應(PCR)，例如在美國專利號4，683，202或R. K. Saiki等人 EMBO J. 3 =801-895(1988)中所述的 PCR 制備。9. 2位點定向誘變—旦已經分離編碼α -淀粉酶的DNA序列并鑒定了用于突變的所需位點，則可以 使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸含有分布在所需突變位點側翼的核苷酸序 列；將突變核苷酸在寡核苷酸合成期間插入。在一個具體方法中，在攜帶α-淀粉酶基因 的載體中產生跨接編碼α-淀粉酶的序列的DNA單鏈缺口。隨后，攜帶所需突變的合成性 核苷酸與單鏈DNA的同源部分復性。剩余缺口隨后用DNA聚合酶1(克列諾片段)補平 并使用Τ4連接酶連接構建體。這種方法的具體例子在Morinaga等人Biotechnology 2 636-639(1984)中描述。美國專利號4，760，025公開了通過表達盒的微小改變而導入編碼 多重突變的寡核苷酸。然而，可以通過Morinaga方法在任一時間導入甚至更多種類的突 變，原因在于可以導入長度各異的許多寡核苷酸。在Nelson 和 Long, AnalyticalBiochem.，180 147-151 (1989)中描述了將突變導 入編碼α-淀粉酶的DNA序列的另一種方法。該方法涉及含有所需突變的PCR片段的3-步 驟生成，其中所需突變通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中的引物之一導入。攜帶 突變的DNA片段可以從PCR生成的片段通過用限制性核酸內切酶切割進行分離并重新插入 表達質粒。技術人員會了解許多備選方法可用于提供或獲得本文中的變體。例如，基因改 組，例如，如 WO 95/22625 (來自 Affymax Technologies N. V.)或 WO 96/00343 (來自 Novo Nordisk A/S)中所述，或產生包含所討論突變例如替換和/或缺失的雜合酶的其他相應技 術。9.3α-淀粉酶變體的表達可以使用表達載體以酶形式表達編碼由上文所述方法或由本領域已知的任意備 選方法產生的變體的DNA序列，其中所述表達載體一般包括編碼啟動子、操縱基因、核糖體 結合位點、翻譯起始信號和任選地阻遏基因或多種激活基因的調控序列。攜帶編碼用于本文中的α -淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以任意載 體，其可以便利地經歷重組DNA過程，并且載體的選擇經常取決于待導入該載體的宿主細 胞。因而，載體可以是自主復制型載體，即作為其復制不依賴染色體復制的染色體外實體存 在的載體，例如，質粒、噬菌體、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。備選地，載體可以 整合到宿主細胞基因組中并隨已經整合有該載體的染色體一起復制。在載體中，所述DNA序列應當有效連接于合適的啟動子序列。該啟動子可以是在 所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任意DNA序列并可以從編碼與該宿主細胞同源或異源的 蛋白質的基因衍生。用于指導編碼用于本文中的α-淀粉酶變體的DNA序列轉錄、尤其在 細菌宿主中轉錄的合適啟動子的例子是大腸桿菌Iac操縱子的啟動子、天藍色鏈霉菌瓊脂 糖酶基因dagA的啟動子、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪土芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶(amyQ)的啟動子、 枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。對于真菌宿主中的轉錄，有用啟動子的例子 是從編碼稻曲霉(A.oryZae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白 酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米 黑根毛霉脂肪酶、稻曲霉堿性蛋白酶、稻曲霉磷酸三糖異構酶或構巢曲霉(A.nidulans)乙 酰胺酶的基因衍生的那些啟動子。用于本文中的表達載體也可以包含合適的轉錄終止子和在真核生物中與編碼 α -淀粉酶變體的DNA序列有效連接的多腺苷酸化序列。終止序列和多腺苷酸化序列可以 適宜地從與啟動子相同的來源衍生。載體可以還包含能夠使該載體在所討論的宿主細胞中復制的DNA序列。此類序列 的例子是質粒 pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl 和 pIJ702 的復制起點。載體也可以包含選擇標記，例如其產物彌補宿主細胞中缺陷的基因，如來自枯草 芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素 或四環素抗性的基因。另外，該載體可以包含曲霉屬選擇標記如amdS、argB、niaD和sC、產 生潮霉素抗性的標記，或可以通過共轉化實現選擇，例如，如WO 91/17243中所述。盡管胞內表達可以在一些方面是有利的，例如當使用某些細菌作為宿主細胞時， 然而通常優選表達是胞外的。通常，本文中提到的芽孢桿菌屬α-淀粉酶包含允許所表達 的蛋白酶分泌到培養基中的前區域。根據需要，這種前區域可以被不同的前區域或信號序 列替換，便利地通過替換編碼各自前區域的DNA序列實現。本領域技術人員熟知用來連接分別編碼α -淀粉酶變體、啟動子、終止子和其他 元件的DNA構建體并將這些DNA構建體插入含有復制必需信息的合適載體的方法(參參 見例如 Sambrook 等人，MOLECULARCLONING :A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor,1989)。用于本文中的細胞，例如包含如上文定義的DNA構建體或表達載體的細胞，可以 在α-淀粉酶變體的重組產生中用作宿主細胞。細胞可以用編碼變體的DNA構建體轉化， 便利地通過在宿主染色體中整合(一個或多個拷貝的)DNA構建體。通常認為這種整合是 有利的，因為DNA序列更有可能穩定地維持于細胞中。可以根據常規方法例如通過同源或 異源重組將DNA構建體整合到宿主染色體中。備選地，細胞可以用與不同類型宿主細胞有 關的如上所述表達載體轉化。用于本文中的細胞可以是高等生物如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選地是微生物 細胞，例如細菌細胞或真菌(包括酵母)細胞。合適細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿 菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪土芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環 形芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌或變 鉛青鏈霉菌或鼠灰色鏈霉菌；或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。細菌的轉化可以例如通過原 生質體轉化或通過使用感受態細胞以本身已知的方式實施。在被用于表達的情況下，酵母可以有利地選自酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵 母屬(Schizosaccharomyces)物種，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。絲狀真菌 可以有利地選自曲霉屬物種，例如稻曲霉或黑曲霉。真菌細胞可以通過涉及原生質體形成和原生質體轉化隨后細胞壁再生的方法以本身已知的方式轉化。用于轉化曲霉屬宿主細胞 的合適方法在EP238023中描述。在又一方面，本公開涉及產生α-淀粉酶變體的方法，所述方法包括在促進變體 產生的條件下培育如上文所述的宿主細胞并從細胞和/或培養基回收該變體。用來培育細胞的培養基可以是適于生長所討論的宿主細胞并獲得α -淀粉酶變 體表達的任何常規培養基。合適的培養基是從商業供應商可獲得的或可以根據公開(例 如，如ATCC目錄中所述)的配方制備。從宿主細胞分泌的α -淀粉酶變體可以通過已知方法從培養基回收，所述的已知 方法包括通過離心或過濾將細胞與培養基分離并借助鹽(如硫酸銨)析出培養基的蛋白質 組分，隨后使用層析方法如離子交換層析、親和層析等。9. 4用于表征和篩選變體的方法9. 4. 1濾紙篩選測定法以下測定法可以用來篩選在高或低ρΗ和/或在Ca2+耗竭條件下與親本酶和AmyS 樣α-淀粉酶相比具有改變的穩定性的AmyS樣α _淀粉酶變體。9. 4. 2高ρΗ濾紙測定法將芽孢桿菌文庫涂布在含10yg/ml卡那霉素的TY瓊脂平板上的乙酸纖維素 濾紙(OE 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德國)和硝化纖維素濾紙(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dassel，德國)的夾層上，在37°C持續至少21小時。乙酸纖維素層 位于TY瓊脂平板上面。在涂布后，但在溫育前，用針專門標記每個濾紙夾層，目的在于能夠定位濾紙上的 陽性變體，并將硝化纖維素濾紙連同結合的變體轉移至具有PH 8. 6-10. 6甘氨酸-NaOH緩 沖液的容器并在室溫(可以從10-60°C變化)溫育15分鐘。將帶有菌落的乙酸纖維素濾紙 在室溫貯存于TY-平板上，直至使用。溫育后，在ρΗ 8. 6-10. 6甘氨酸-NaOH緩沖液中含有
瓊脂糖，0. 2%淀粉的平板上檢測殘余活性。將帶有硝化纖維素濾紙的測試平板以與濾 紙夾層相同的方式標記并在室溫溫育2小時。在取出濾紙后，測試平板用10%路戈爾碘液 染色。檢測到淀粉降解變體作為深藍色背景上的白點并且隨后在貯存平板上鑒定它們。陽 性變體在與第一次篩選相同的條件下重新篩選2次。9. 4. 3低鈣濾紙測定法將芽孢桿菌文庫涂布在含相關抗生素例如卡那霉素或氯霉素的TY瓊脂平板 上的乙酸纖維素濾紙(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德國)和硝化纖維素濾紙 (Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)的夾層上，在 37°C持續至少 21 小時。 乙酸纖維素層位于TY瓊脂平板上面。在涂布后，但在溫育前，用針專門標記每個濾紙夾層，目的在于能夠定位濾紙上的 陽性變體，并將硝化纖維素濾紙連同結合的變體轉移至具有PH 8. 5-10并具有不同EDTA濃 度(0. OOlmM-IOOmM)的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液的容器。濾紙在室溫溫育1小時。將帶有 菌落的乙酸纖維素濾紙在室溫貯存于TY-平板上，直至使用。溫育后，在ρΗ 8. 5-10碳酸鹽 /碳酸氫鹽緩沖液中含有瓊脂糖，0.2%淀粉的平板上檢測殘余活性。將帶有硝化纖維 素濾紙的測試平板以與濾紙夾層相同的方式標記并在室溫溫育2小時。在取出濾紙后，測 試平板用10 %路戈爾碘液染色。檢測到淀粉降解變體作為深藍色背景上的白點并且隨后在貯存平板上鑒定它們。陽性變體在與第一次篩選相同的條件下重新篩選2次。9. 4.4低pH濾紙測定法將芽孢桿菌文庫涂布在含10微克/ml氯霉素的TY瓊脂平板上的乙酸纖維素 濾紙(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德國)和硝化纖維素濾紙(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dasseli，德國)的夾層上，在37°C持續至少21小時。乙酸纖維素層 位于TY瓊脂平板上面。在涂布后，但在溫育前，用針專門標記每個濾紙夾層，目的在于能夠定位濾紙上的 陽性變體，并將硝化纖維素濾紙連同結合的變體轉移至具有檸檬酸鹽緩沖液，PH4. 5的容器 并在80°C溫育20分鐘(當篩選野生型主鏈中的變體時)或在85°C溫育60分鐘(當篩選 親本α _淀粉酶的變體時)。將帶有菌落的乙酸纖維素濾紙在室溫貯存于TY-平板上，直至 使用。溫育后，在PH 6.0檸檬酸鹽中含有瓊脂糖，0.2%淀粉的測試平板上檢測殘余活 性。將帶有硝化纖維素濾紙的測試平板以與濾紙夾層相同的方式標記并在50°C溫育2小 時。在取出濾紙后，測試平板用10%路戈爾碘液染色。檢測到淀粉降解變體作為深藍色背 景上的白點并且隨后在貯存平板上鑒定它們。陽性變體在與第一次篩選相同的條件下再篩 選2次。9. 4. 5 次篩選在重新篩選后，將陽性轉化體從貯存平板挑出并在二次平板測定法中測試。陽性 轉化體在37°C于5mL LB+氯霉素中生長22小時。在90°C于pH 4. 5檸檬酸鹽緩沖液中溫 育每個陽性轉化體和作為對照的表達相應主鏈的克隆的芽孢桿菌培養物并且在0、10、20、 30,40,60和80分鐘取得樣品。將3 μ L樣品滴在測試平板上。測試平板用10%路戈爾碘 液染色。改良變體視為比主鏈具有更高殘余活性的變體(檢測為測試平板上的暈圈)。通 過核苷酸測序確定改良的變體。9. 4. 6未純化變體的穩定性測定法變體的穩定性可以如下測試將表達待分析變體的芽孢桿菌培養物在37°C于含 有氯霉素的IOmL LB中生長21小時。將800微升培養物與200微升pH 4. 5檸檬酸鹽緩沖 液混合。在PCR管中制得與樣品時間點編號相對應的許多70 μ L等份試樣并在PCR儀中在 70°C或90°C溫育多個時間段(一般5、10、15、20、25和30分鐘)。0分鐘樣品不在高溫上 溫育。如下文“ α -淀粉酶活性測定法”中所述，通過轉移20微升至200微升α -淀粉酶 PNP-G7底物MPR3((Boehringer Mannheim目錄號1660730)測量樣品中的活性。結果作為 活性(相對于0時間點)百分數對時間作圖或表述為溫育某段時間后的殘余活性百分數。9.4.7α-淀粉酶變體的發酵和純化攜帶相關表達質粒的枯草芽孢桿菌菌株可以如下發酵和純化將菌株從-80°C貯 藏物劃線于含有 ο μ g/ml卡那霉素的LB-瓊脂平板上并在37°C過夜生長。將菌落轉移至 500mL搖瓶中補充有10 μ g/ml氯霉素的IOOmLPS-I 培養基。PS-I培養基的組成珍珠糖100g/l大豆粕40g/lNa2HPO4,12H2010g/l
Pluronic PE 6100 0. lg/1CaCO35g/l培養物在37 °C以270轉/分鐘振搖5日。通過以4500轉/分鐘離心20-25分鐘從發酵肉湯除去細胞和細胞碎片。此后，過 濾上清液以獲得完全清亮的溶液。將濾液濃縮并在UF-濾器(10000截止值膜)上洗滌并 且將緩沖液換成20mM乙酸鹽pH 5.5。在S-SEPHAR0SE F. F.上施加UF-濾液并通過逐步洗 脫法用相同緩沖液中的0. 2M NaCl實施洗脫。洗脫液對pH 9. 0的IOmM Tris透析并施加 在Q-SEPHAR0SE F. F.上并且用從0-0. 3M NaCl的線型梯度經6個柱體積洗脫。匯集含有 (由PHADEBAS測定法測量的)活性的級分，將pH調節至pH 7. 5并且通過用0. 5% w/v活 性碳處理5分鐘除去剩余顏色。9. 4. 8比活性測定使用PHADEBAS 測定法(Magle Life Sciences)，測定比活性為活性/mg 酶。遵循制造商說明實施(也見下文“α-淀粉酶活性測定法”)。9. 4. 9等電點的確定pi 由等點聚焦法(例如，Pharmacia, Ampholine, pH 3. 5-9. 3)確定。9.4. 10穩定性的確定可以使用如下方法測量淀粉酶穩定性在相關條件下溫育酶。樣品在各個時間點取得，例如在0、5、10、15和30分鐘后， 并在測試緩沖液(50mM Britton緩沖液，pH 7.3)中稀釋25倍(相同稀釋度用于全部取得 的樣品)并使用PHADEBAS測定法(MagleLife Sciences)在標準條件pH 7. 3，37°C下測量活性。使用在溫育前(0分鐘)測量的活性作為參考(100% )。將下降百分數計算為溫 育時間的函數。表顯示了在例如溫育30分鐘后的殘余活性。9. 4. Ila-淀粉酶活性測定法1. PHADEBAS 測定法a -淀粉酶活性由使用PHADEBAS 小片作為底物的方法確定。PHADEBAS小 片(PHADEBAS 淀粉酶試驗，由Magle Life Sciences供應)含有交聯的不溶性藍 顏色淀粉聚合物，該聚合物已經與牛血清白蛋白和緩沖物質混合并造片。對于每個單一測量，將一個小片懸浮在含有5mL的50mMBritton-Robinson緩沖 液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0. ImMCaCl2,用NaOH調節pH至目的值)的管中。試 驗在目的溫度的水浴中進行。在50mM Britton-Robinson緩沖液中稀釋待測試的α -淀粉 酶。將1毫升這種α -淀粉酶溶液添加至5mL的50mM Britton-Robinson緩沖液。淀粉被 α -淀粉酶水解，產生可溶性藍色片段。以分光光度方式在620nm測量的所得藍色溶液的吸 光度是α-淀粉酶活性的函數。重要的是在溫育10或15分鐘(測試時間)后測量的620nm吸光度在620nm處 的0. 2至2. 0吸光度單位范圍內。在這個吸光度范圍內，活性與吸光度之間存在線性關系 (Lambert-Beer定律)。因而必須調整的酶的稀釋度以符合這個標準。在指定的條件集合 (溫度、pH、反應時間、緩沖液條件)下，Img給定的α-淀粉酶會水解某個量的底物，并且藍 顏色會產生。在620nm測量顏色強度。測量的吸光度與給定條件集合下所討論的α -淀粉酶的比活性(活性/mg純α -淀粉酶蛋白)直接成比例。2.備選方法α -淀粉酶活性由使用PNP-G7底物的方法確定。作為對硝基苯基- α，D-麥芽 庚糖苷縮寫的PNP-G7是可以被內切淀粉酶切割的嵌段低聚糖。切割后，該試劑盒中包含 的α-葡糖苷酶消化此底物以釋放具有黃顏色并因而可以通過可見光分光光度法在λ = 405nm (400-420nm)測量的游離PNP分子。含有PNP-G7底物和α -葡糖苷酶的試劑盒由 Boehringer-Mannheim 制造(目錄號 1054635)。為制備試劑溶液，如制造商推薦，將IOmL底物/緩沖液添加至50mL酶/緩沖液。 通過轉移20微升樣品至96孔微量滴定平板并在25°C溫育實施該測定法。添加預平衡至 250C的200 μ L試劑溶液。將溶液混合并預溫育1分鐘并且在ELISA讀數儀中在OD 405nm 在4分鐘范圍內每隔30秒測量吸收。時間依賴性吸收曲線的斜率與給定條件集合下所討論的α -淀粉酶的活性直接 成比例。9. 4. 12LAS敏感性的確定變體在40°C與不同濃度的LAS (直鏈烷基苯磺酸鹽；Nansa 1169/P)溫育10分鐘。使用PHADEBAS 測定法或利用PNP-G7底物的備選方法確定殘余活性。在0. IM磷酸鹽緩沖液pH 7. 5中稀釋LAS。使用以下濃度500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm 和 IOppm 直至無 LAS。將變體在不同LAS緩沖液中稀釋成IOmL總體積中的0. 01_5mg/l濃度并在溫控水 浴中溫育10分鐘。通過轉移小等份試樣至冷的測試緩沖液中停止溫育。重要的是在活性測 量期間，LAS濃度低于lppm，目的是不影響活性測量。使用上文提及的PHADEBAS 測 定法或備選方法一式兩份確定殘余活性。在扣除空白后測量活性。無LAS的活性是100%。10.使用淀粉酶變體的方法工業應用本文中呈現的α -淀粉酶變體具有允許多種工業應用的有價值特性。本文中所述 的一種或多種變體酶或組合物也可以如上所述在洗滌劑、尤其衣物洗滌劑組合物和餐具洗 滌劑組合物、硬表面清潔組合物中使用并在用于紡織品、織物或服裝退漿的組合物、用于紙 漿和紙張生產、發酵醪制備、乙醇生產和淀粉轉化工藝的組合物中使用。一種或多種具有改變特性的變體可以用于淀粉加工，尤其淀粉轉化，尤其淀粉的 液化(參見例如美國專利號3，912，590,EP專利申請號252，730和63，909,WO 99/19467和 WO 96/28567，全部參考文獻在此引入作為參考)。也構思了用于淀粉轉化目的組合物，所述 組合物也可以包含葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶和/或其他α -淀粉酶。另外，一種或多種變體特別用于從淀粉或完整谷物產生甜味料和乙醇(參見例如 在此引入作為參考的美國專利號5，231，017)，如燃料用、飲用和工業用乙醇。本文中的變體也可以用于紡織品、織物或服裝退漿(參見例如在此引入作為參考 的TO 95/21247、美國專利號4，643，736、EP 119，920)、發酵醪制備或釀造、以及用于紙漿 和紙張生產或相關工藝中。10. 1天然淀粉的預處理天然淀粉由室溫下在水中不溶解的微小顆粒組成。當加熱含水淀粉漿液時，所述顆粒溶脹并最終破裂，淀粉分子分散在溶液中。在這個“凝膠化”過程期間，存在粘度的劇 烈增加。由于在常見工業過程中固體水平是30-40%，故不得不將淀粉稀薄化或“液化”，從 而可以適當地加工它。這種粘度降低在現行商業實踐中主要由酶降解達到。10. 2淀粉轉化例如在美國專利號3，912，590和EP專利
發明者A·肖, B·保爾森, D·沃德, J·K·舍蒂, J·T·凱利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉, S·D·鮑爾, S·拉默, V·夏爾馬 申請人:丹尼斯科美國公司