專利名稱：一種食品中致病菌pcr核酸模板快速提取方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域。涉及一種食品中致病菌PCR核酸模板快速提 取方法，該方法適用于以PCR法、定量PCR法、實時PCR法檢測，快速提取 食品中致病菌。
背景技術：
俗話說民以食為天，可見食品與人類生存和健康密切相關。為保證食品 的安全衛生、防止有毒有害物質通過食品對人體造成危害是至關重要的。
食品在生產、加工、貯存、運輸和銷售等各個環節都有受到環境中各種 因素的影響和污染的可能，微生物污染尤其常見。
食品中致病菌主要是指以食物為載體，導致人類發生疾病的一大類細 菌。(吳清平，范宏英，張菊梅.食源性致病菌免疫及分子檢測新技術研究 進展[J].食品科學，2005， 26 ( 11): 269-273.)包括金黃色葡萄球菌 (6Y邵/ 77ococcw51 ai/rei/51)、沙門氏菌(5"a7M "e77s 、志賀氏菌(5"/wVe7Ja s/ p)、阪崎腸桿菌(^/7teTY 力a"ei-5V3Aa^ah7)、空腸彎曲菌(Ca/z / 7i06acter Je力/ 力、小腸結腸炎耶爾森氏菌(ye7^'m'ae;^eroca^'"'ca)、單核細胞 增生李斯特氏菌aj'We/^胞/ oc7^^e/7")、腸出血性大腸埃希氏菌0157: H7(^)7z^ro力柳orr力^7'c esc力en'c力ia (97<57, #7)、副溶血'性弧菌(f7力n'o / ara/ aeyz o7jtic〃s)、霍舌L弧菌(Kz'Z tm'o c力a/erae)、倉U4另弧菌(Kz'力n'o raJ/7/Zyc"s)、溶藻弧菌(Kz'力n'oa^7'/7o77"c"s)(食品中致病菌檢測方法 實時PCR法》行業標準[SN/T 1870-2007])。食品由于受致病菌污染，造成 各種食源性疾病，甚至死亡。
在我國食品行業，相關的致病菌檢測的傳統檢驗方法有培養基制備、細菌培養、菌落計數和生化指標的檢測。這些方法的優點是直觀且能夠得 到食品樣品中細菌數量和特性等方面的定性及定量結果。不足之處是耗時 費力，獲得結果通常需要幾天的時間，并且要求所要檢測的細菌增殖為可見 菌落。而且增加了實驗室的工作量。(焦振泉，郭云昌，裴曉燕，劉秀梅. 食源性致病菌檢測方法研究進展一 I .傳統檢測方法[M].中國食品衛生雜
志，2007， 19 (1): 58-61.)
近年來，DNA雜交、PCR、定量PCR、實時PCR以及基因芯片法(焦振泉， 郭云昌，裴曉燕，劉秀梅.食源性致病菌檢測方法研究進展一II.分子生物學 檢測方法[M].中國食品衛生雜志，2007， 19 (2): 153-157.)等分子生物學 的檢測方法，克服了傳統檢測方法的不足，并且具有各自的優勢，其中以實 時PCR更為便捷和快速。PCR、定量PCR、實時PCR比DNA雜交需要更少的 樣本量，靈敏度更高；基因芯片法雖然可以同時鑒定多種細菌的混合污染， 但是背景干擾比較大、使用兩種染料與DNA標記時效果不同、從不同細菌中 分離出來的RNA的完整性不同、實驗費用高以及結果分析方法的不一致；實 時PCR比PCR、定量PCR，具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動 化程度高的優勢。
目前，也有使用免疫磁珠提取某種特定細菌的方法再通過實時PCR法結 合檢測食品中致病菌，雖然此方法特異性高，檢測速度快。但是成本較高， 通用性差，而且只能針對一種特定菌種進行富集。
我國質量監督檢驗總局于2007年批準了《食品中致病菌檢測方法實時 PCR法》行業標準[SN/T 1870-2007]。實時PCR法由于具有高靈敏度，操 作簡便易學，結果可靠的優點，解決了傳統方法費時耗力以及其他分子生物 學檢測方法易污染，背景干擾大等無法避免的缺點，現已被食品行業廣泛使 用。
按照[SN/T 1870-2007]標準規定，模板提取步驟包括樣品制備、增菌培養和分離；模板DNA制備等必不可少兩部分，其中
樣品制備、增菌培養和分離步驟需要先稱取樣品lg加入125ml樣品 稀釋瓶中，再加入9倍預熱到45'C滅菌水(1:10稀釋)，37t培養18h-22h。 再移取培養18h-22h的懸液各10ml加入90ml增菌肉湯中，37。C培養 18h-22h。此處37'C， 18h-22h的兩次培養過程不可逾越，也是限制食品工 業當天的生產無法出售的重要原因。
模板DNA制備步驟需將制備樣品的肉湯取lml加到1. 5ml無菌離心管 中，8000r/min離心5min，棄上清液。加入50WDNA提取液，混勻后，沸水 浴5min， 12000r/min離心5min，取上清待檢。
按照[SN/T 1870-2007]標準規定，從樣品制備、增菌培養和分離到模 板DNA制備需要24-49h，檢測結果往往滯后，已不能滿足現代食品工業生 產當天就必須出售的要求。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種實用、有效的食品中致病菌PCR核酸模板 快速提取方法。采用該方法可以解決[SN/T 1870-2007]提取食品中致病菌 PCR核酸模板的操作復雜，培養、增菌時間長且需分離的問題，本發明利用 PCR技術，簡便、快速提取食品中致病菌，能夠滿足現代食品工業生產當天 就出售的要求。
為了實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案 一種用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，其特征在于， 該方法首先將待檢測樣本置入快速生長液中，快速培養食品中的致病菌， 然后用裸磁粒子吸附致病菌，通過煮沸增菌，經磁分離架分離后用快速洗 滌液洗滌后，加入高效裂解液，裂解被吸附的菌液，經煮沸、離心后取上清 做PCR檢測的核酸模板。
上述方法具體的步驟是
61) 取待測樣本適量，加入適量無菌水，混勻，取其中混勻液20ml， 加入100ml的快速生長液中，在37-C條件下，100r/min振蕩培養4h，得到 培養液；
2) 取培養液lml，加入規格為15ml的無菌離心管中，加無菌生理鹽 水至10ml，混勻，得到混合溶液；
3) 將步驟2)得到的混合溶液中加入的裸磁粒子液，混勻，37 'C水浴60min，中間混搖3次，得到混合液；
4) 將步驟3)得到的混合液使用磁分離架分離5min，棄上清，加入洗 滌液2ml洗3次，每次洗滌時間〉5min，保留沉淀；
5) 將步驟4)得到的沉淀中加入裂解液10(￥1，煮沸20min，離心，取 上清做PCR核酸模板。
上述快速生長液的配方為蛋白胨25g，氯化鎂40 g牛肉膏8g，磷酸 氫二鈉10g，氯化鈉20g，檸檬酸鈉5 g，磷酸氫鉀3. 5g，乳糖5g，葡萄糖 1.5g，甘露醇2g，檸檬酸鈉5g，去氧膽酸鈉0.5g，牛肉膏0.8g,蒸餾水 定容1000ml，調pH值至7. 2，于121。C下高壓滅菌20min，保存于4*€冰箱
中備用o
上述裸磁粒子液的主要成份為三氯化鐵和二氯化鐵，以8: 2比例混合
溶于適量蒸餾水中，加入適量的NaOH溶液，使三氯化鐵和二氯化鐵在蒸餾 水中反應生成黑棕色產物，用磁力架回收裸磁粒子，用蒸餾水洗滌至中性備 用。
上述高效裂解液的制作方法是，在每10ml超純水中加入3%的三氯乙酸 lml、 0. 2%的TritonX-100 450W、 2mol/L的KH2P04 900W、 0. Olmol的甘 氨酸80W、 10mg溶菌酶，pH調至7.5，將配制好的高效裂解液置于121°C 下高壓滅菌20min,置于4'C冰箱中備用。
上述快速洗滌液的配方為NaCl: 8.0g, KC1: 0.2g， Na2HP04: 1.0g，
7KH2P04: 0. 24g，用HC1調節PH值至7. 8，加蒸餾水定容至lOOOml。
采用本發明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，能夠把 [SN/T 1870-2007]中致病菌培養步驟的時間縮減至4h，增菌步驟時間也 縮短為lh。加上水浴、樣本處理時間等必需步驟，將食品中致病菌PCR核 酸模板提取時間整體縮短至6. 5h左右。如果配合使用實時熒光定量PCR儀， 則可將全部檢測時間縮短至8h左右。完全可以滿足現代食品工業生產需要 當天出售的要求，實現了技術性飛躍，可大規模推廣。
本發明的方法與食品工業現行常用的行業標準[SN/T 1870-2007]提取 方法相比較，按照后者提取方法，根據菌種不同，其模板提取時間需要 24h 49h左右不等。同時使用本發明方法和國標法提取奶粉中的四種致病菌 PCR核酸模板，并且通過實時熒光定量PCR進行驗證，結果顯示使用兩種 方法均可檢出同一陽性樣本。結果具有一致性、可靠性。
圖l、圖2、圖3、圖4分別圖示了幾種品牌奶粉中待檢測樣本中所含的阪 崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌的擴增曲線。
驗證實驗先按照[SN/T 1870-2007]中的提取模板方法提取一天后，再 使用本發明的快速提取模板方法提取，將兩種方法得到的奶粉中的核酸模 板，同時放入TL988實時熒光定量PCR儀中檢測，得出熒光分析結果。附圖中 "S"曲線即是待測樣本中致病菌的擴增曲線。
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
本發明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，包括細菌快速 培養、制備裸磁粒子，洗滌液，裂解液四部分。
本發明首先提供了一種細菌快速培養液，用于快速培養食品中致病菌的 快速生長，成分為蛋白胨25g，氯化鎂40 g牛肉膏8g，磷酸氫二鈉10g，氯化鈉20g，檸檬酸鈉5 g，磷酸氫鉀3. 5g，乳糖5g，葡萄糖1. 5g，甘露 醇2g，檸檬酸鈉5g，去氧膽酸鈉0.5g，牛肉膏0.8g，調pH至7.2，蒸餾 水定容1000ml，于12rC下高壓滅菌20min,保存于4"C冰箱中備用。
本發明提供了一種自行研發的裸磁粒子，主要用于吸附食品中致病菌。 其主要成份為三氯化鐵和二氯化鐵，以8: 2比例混合溶于適量蒸餾水中， 并加入適量的NaOH溶液，使三氯化鐵和二氯化鐵在蒸餾水中反應生成黑棕 色產物，用磁力架回收裸磁粒子，用蒸餾水洗滌至中性備用。
本發明提供了一種快速洗滌液。該快速洗滌液的配方為NaCl 8.0g; KC1 0.2g; Na2HP04 l.Og; KH2P04 0. 24g;用HC1調節pH值至7. 8，加蒸餾 水定容至1000ml。將配制好的洗滌液放在12rC下高壓滅菌20min，保存于 4-C冰箱中備用。保存期為三個月左右，若底部有明顯沉淀生成，需重新配 制。
本發明提供了一種高效裂解液，該高效裂解液用于高效率裂解食品中致 病菌，釋放核酸。該高效裂解液為每101111超純水中含有3%濃度的三氯乙酸 lml和含量為0.2%的TritonX-100 450W; 2mol/L的KH2P04 900W; O.Olmol的甘氨酸80W; 10mg溶菌酶，pH值調至7.5。將配制好的高效裂 解液置于121。C下高壓滅菌20min，置于4"C冰箱中備用。保存期三個月左 右，若底部有明顯沉淀生成，需重新配制。此裂解液具有保持核酸的完整性 的效果，具有對食品中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌通用性。
本發明的裸磁粒子與通常提到的免疫磁珠法不同，兩者區別在于，免疫 磁珠表面結合了設計好的單克隆抗體，用于特異性吸附某一菌種。其前期抗 體制作過程比裸磁粒子復雜，需要專業設計，以及特殊的儀器，因此造價也 比裸磁粒子高出幾倍。
使用裸磁粒子的技術原理在于使用裸磁粒子富集所有菌體，培養后根 據PCR引物的特異性檢測出特定菌體。而使用免疫磁珠進行檢測的技術原理在于先針對待提取的菌種，設計特定抗體，使用免疫磁珠富集待測菌種， 培養后檢測。因此使用免疫磁珠法檢測的方法又被稱做磁珠分選法，也是目 前文章中通常所指的磁珠法。而使用裸磁粒子提取致病菌模板，解決了免疫 磁珠前期制作復雜，造價高，通用性差的問題。并且只進行一次6. 5h共有 模板的提取，便可以根據PCR引物的特異性，同時進行所有致病菌種的檢測。
按照本發明方法得到的提取模板，可以逾越[SN/T 1870-2007]中兩次 必不可少的培養步驟，有效方便的對食品中致病菌進行6. 5h的模板快速提 取，可以在生產結束當天就完成一批食品的質量監控，解決了 [SN/T 1870-2007]標準中對食品質量控制滯后的問題。
以下是發明人給出的實施例，需要說明的是，這些實施例是一些較佳的 例子，本發明不限于這些實施例。 實施例1:
本實施例以檢測奶粉A中是否含有阪崎腸桿菌為例，同時使用本發明的 提取方法和國標法提取奶粉樣本中PCR模板，再使用實時熒光定量PCR儀驗
證兩種方法提取模板的檢測結果是否具有一致性。
A、采用本發明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，快
速提取阪崎腸桿菌PCR模板步驟
1) 取樣本奶粉10g，加入90ml無菌水，混勻。取其中混勻液20ml，加 入到100ml細菌快速培養液中，37。C條件下，100r/min振蕩培養4h，得到 培養液；
2) 取培養液lml (共取四份，其他三份做以下三種菌的模板待檢)，加 入15ml的無菌離心管中，再加入無菌生理鹽水至10ml，混勻，得到混合溶 液；
3) 將步驟2)得到的混合溶液中加入的裸磁粒子液，混勻，37 'C水浴60min，中間混搖3次，得到混合液；4) 將步驟3)得到的混合液使用磁分離架分離5min，棄上清，加入洗 滌液2ml洗3次(每次洗滌時間〉5min);保留沉淀；
5) 將步驟4)得到的沉淀中加入裂解液10014，煮沸20min，離心，取 上清做PCR核酸模板。同時做陰性及陽性對照管。
按照以上步驟操作，提取PCR核酸模板時間總耗費6小時35分鐘。 B、按進出口檢驗檢疫行業標準[SN1632. 3-2005]規定的方法提取阪崎腸 桿菌模板步驟為
1) 稱取樣品lg加入125ml樣品稀釋瓶中，再加入9倍預熱到45E滅 菌水(1:10稀釋)，37。C培養18h-22h。再移取培養18h-22h的懸液各10ml 加入90ml增菌肉湯中，37。C再培養18h-22h。
2) 將制備樣品的肉湯取lml加到1. 5ml無菌離心管中，8000r/min離 心5min，棄上清液。加入50WDNA提取液，混勻后，沸水浴5min， 12000r/min 離心5min，取上清待檢。
按照以上步驟操作，提取模板時間總耗費44小時20分鐘。 實施例2:
本實施例以檢測奶粉B中是否含有金黃色葡萄球菌為例，同時使用本發 明所述的快速提取方法和國標法提取奶粉樣本中PCR模板，再使用實時熒光 定量PCR儀驗證兩種方法提取模板的檢測結果是否具有一致性。
A、 采用本發明的快速提取PCR模板步驟取實施例1中已制備好PCR 核酸模板lml。
B、 以國標法[GB/T 4789. 10-2003]提取金黃色葡萄球菌模板步驟
1) 按無菌操作取檢樣25g，加入225ml滅菌生理鹽水，吸取5ml上述懸 液，接種于7.5%氯化鈉肉湯501111的培養基內，37。C培養24h，轉種血平板 和Baird-Parker平板，37。C培養24 h。
2) 參考[SN1632. 3-2005]提取阪崎腸桿菌模板步驟2)。按照以上步驟操作，提取模板時間總耗費48小時40分鐘。 實施例3:
本實施例以檢測奶粉C中是否含有志賀氏菌為例，同時使用本發明所述 的快速提取方法和國標法提取奶粉樣本中PCR模板，再使用實時熒光定量 PCR儀驗證兩種方法提取模板的檢測結果是否具有一致性。
A、 采用本發明的快速提取PCR模板步驟取實施例1中已制備好PCR 核酸模板lml。
B、 國標法[GB/T 4789. 5-2003]提取志賀氏菌模板步驟
1) 以無菌操作取檢樣25ml，加入裝有225ml GN增菌液的廣口瓶內， 37。C培養6h-8h。取增菌液劃線接種于HE瓊脂平板及麥康凱瓊脂平板，37 。C培養18h-24h。
2)參考國標法提取阪崎腸桿菌模板步驟2。按照以上步驟操作，提取模 板時間總耗費24小時25分鐘。 實施例4:
本實施例以檢測奶粉D中是否含有沙門氏菌為例，同時使用本發明所述 快速提取方法和國標法提取奶粉樣本中PCR模板，再使用實時熒光定量PCR 儀驗證兩種方法提取模板的檢測結果是否具有一致性。
A) 采用本發明的快速提取PCR模板步驟取實施例1中已制備好PCR 核酸模板lml。。
B) 按照國標法[GB/T 4789.4-2003]提取沙門氏菌模板步驟
1)按無菌操作取檢樣25ml,加入裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml廣 口瓶內，吸取10ml上述懸液，接種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液內，42°C 培養18 h-24 h， 37。C培養18h-24h。
2) 參考國標法提取阪崎腸桿菌模板步驟2)。按照以上步驟操作，提取 模板時間總耗費42小時30分鐘。使用TL988實時熒光定量PCR對以上方法所提模板進行檢測反應體系、 反應步驟、質控標準、結果判定均參照[SN/T 1870-2007]中實時PCR部分。 結果分析
Ct值是實時熒光定量PCR的一個重要概念，C表示循環數，T表示閾值。
它的含義是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。 在40個循環數內，如果樣本曲線均呈顯著"S"型，且Ct值小于35，則判 定為陽性樣本，說明食品中有此項被檢測的致病菌。如果樣本呈直線，Ct值 等于O，則判定為陰性樣本，說明食品中沒有此項被檢測的致病菌。
如果同時使用本發明方法和國標法提取模板，經過實時熒光定量PCR檢 驗，可以得到具有一致性的結果，證明本發明的用于食品中致病菌PCR核 酸模板快速提取方法可行，且優于[SN/T 1807-2007]中提到的致病菌模 板提取方法。
上述實施例選擇阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌四 種菌作為食品中致病菌示例，其中，選擇阪崎腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌 作為革蘭氏陰性菌的代表，選擇金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌的代表。證 明了本發明方法的試劑對于食品中其他致病菌也具有通用性。 1、阪崎腸桿菌
如圖1所示，奶粉A中阪崎腸桿菌擴增曲線樣本曲線均呈顯著"S" 型，指數期呈明顯增長。
其中，B8， B9孔位放置空白對照，BIO， Bll孔位放置陰性對照，Ct值 均為O，圖上顯示為直線，均無擴增；
B12孔位放置陽性對照，Ct值為24.28;
B13， B14， B15孔位放置樣本，均使用本發明的方法提取奶粉A中的阪 崎腸桿菌模板，Ct值分別為24.32， 25.65， 24.26;檢出陽性。
B16， B17孔位放置樣本，均使用進出口檢驗檢疫行業標準
13[SN1632.3-2005]提取奶粉A中的阪崎腸桿菌模板，Ct值分別為22.19， 24.01;檢出陽性。
由此可見，使用本發明方法提取樣本模板與按照[SN1632. 3-2005]提取 模板，均可檢出樣本阪崎腸桿菌陽性。因此使用本發明的用于食品中致病 菌PCR核酸模板快速提取方法所提取的樣本模板，結果可靠。
2、 金黃色葡萄球菌
如圖2所示，奶粉B中金黃色葡萄球菌擴增曲線:樣本曲線均呈顯著"S" 型，指數期呈明顯增長。
其中A2孔位放置空白對照，A3, A4孔位放置陰性對照，Ct值均為O，
圖上顯示為直線，均無擴增；
A5， A6孔位放置陽性對照，Ct值為17. 19， 17.24;
A9， A10孔位放置樣本，均使用本發明方法提取奶粉B中的金黃色葡萄 球菌模板，Ct值分別為17.48， 18.78;
A7， A8孔位放置樣本，均使用國標法[GB/T 4789. 10-2003]提取奶粉B 中的金黃色葡萄球菌模板，Ct值分別為17.32， 17.42;
由此可見，使用本發明的方法提取樣本模板與國標法提取方法，均檢出 樣本金黃色葡萄球菌陽性。因此使用本發明的方法提取樣本模板，結果可靠。
3、 志賀氏菌
如圖3所示，奶粉C中志賀氏菌擴增曲線樣本曲線均呈顯著"S"型，
指數期呈明顯增長。
其中，A2， A3孔位放置空白對照，A4， A5孔位放置陰性對照，Ct值均 為0，圖上顯示為直線，均無擴增；
A6， A7孔位放置陽性對照，Ct值為14.70， 16.09;
AIO， All孔位放置樣本，均使用本發明的方法提取奶粉C中的志賀氏 菌模板，Ct值分別為16.52， 16.55;A8， A9孔位放置樣本，均使用國標法[GB/T 4789. 5-2003]提取奶粉C 中的志賀氏菌模板，Ct值分別為16.35， 16.47;
由此可見，使用本發明方法提取樣本模板與國標法提取方法，均檢出樣 本志賀氏菌陽性，因此使用本發明方法提取樣本模板，結果可靠。
4、沙門氏菌
如圖4所示，奶粉D中沙門氏菌擴增曲線樣本曲線均呈顯著"S"型，
指數期呈明顯增長。
其中A2孔位放置空白對照，A3孔位放置陰性對照，Ct值均為0，圖上 顯示為直線，均無擴增；
A6孔位放置陽性對照，Ct值為13.7; A4， A5孔位放置樣本，均使用本 發明方法提取奶粉D中的沙門氏菌模板，Ct值分別為14.46， 14.53;
A7， A8孔位放置樣本，均使用國標法[GB/T 4789. 4-2003]提取奶粉D 中的沙門氏菌模板，Ct值為14.05。
由此可見，使用本發明方法提取樣本模板與國標法提取方法，均檢出樣 本沙門氏菌陽性，因此本發明方法提取PCR核酸模板，結果可靠。
通過以上驗證，證明了采用本發明的方法對于食品中致病菌PCR核酸模 板快速提取是可行的，且具有通用性和普遍性意義。
綜上所述，本發明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法與 [SN/T 1870-2007]標準中關于提取食品中致病菌PCR核酸模板方法相比， 具有以下優點
1. 使用自行研制的細菌快速生長液，具有通用性，可同時增菌所有致病 菌。將致病菌培養時間縮短至4h。
2. 只進行一次6. 5h共有模板的提取，便可以根據PCR引物的特異性， 同時進行所有致病菌種的檢測。
3. 將食品中致病菌PCR核酸模板的提取中增菌步驟時間大幅縮減，只需lh，即可增菌至所需檢測量。
4.使用自行研究的高效裸磁粒子，吸附食品中致病菌；配合使用自行研 究的高效裂解液，提高了用于PCR檢測的初始模板量。
1權利要求
1、一種用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，其特征在于，該方法首先將待檢測樣本置入快速生長液中，快速培養食品中的致病菌，然后用裸磁粒子吸附致病菌，通過煮沸增菌，經磁分離架分離后用快速洗滌液洗滌后，加入高效裂解液，裂解被吸附的菌液，經煮沸、離心后取上清做PCR檢測的核酸模板。
2、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法具體的步驟是:1) 取待測樣本適量，加入適量無菌水，混勻，取其中混勻液20ml, 加入100ml的快速生長液中，在37'C條件下，100r/min振蕩培養4h，得到 培養液；2) 取培養液lml，加入規格為15ml的無菌離心管中，加無菌生理鹽 水至10ml，混勻，得到混合溶液；3) 將步驟2)得到的混合溶液中加入的裸磁粒子液，混勻，37 "C水浴60min，中間混搖3次，得到混合液；4) 將步驟3)得到的混合液使用磁分離架分離5min，棄上清，加入洗 滌液2ml洗3次，每次洗滌時間〉5min，保留沉淀；5) 將步驟4)得到的沉淀中加入裂解液IOOW，煮沸20min，離心，取 上清做PCR核酸模板。
3、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的快速生長液的 配方為蛋白胨25g，氯化鎂40g，牛肉膏8g，磷酸氫二鈉10g，氯化鈉20g， 檸檬酸鈉5g，磷酸氫鉀3. 5g，乳糖5g，葡萄糖1. 5g，甘露醇2g，檸檬酸 鈉5g，去氧膽酸鈉0.5g，牛肉膏0.8g，蒸餾水定容1000ml，調pH至7.2， 于12rC下高壓滅菌20min，保存于4。C冰箱中備用。
4、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的裸磁粒子液的 主要成份為三氯化鐵和二氯化鐵，以8: 2比例混合溶于適量蒸餾水中，加入適量的NaOH溶液，使三氯化鐵和二氯化鐵在蒸餾水中反應生成黑棕色產 物，用磁力架回收裸磁粒子，用蒸餾水洗滌至中性備用。
5、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高效裂解液為 每10ml超純水中含有3%濃度的三氯乙酸lml、含量為0. 2%的TritonX-100 4501^1、 2mol/L的KH2P04 900^1、 0. Olmol的甘氨酸80Ml、 10mg溶菌酶， pH為7. 5。
6、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的快速洗滌液的 配方為NaCl: 8.0g， KC1: 0.2g， Na2HP04: l.Og， KH2P04: 0.24g，用HC1 調節pH值至7. 8，加蒸餾水定容至lOOOrnl。
全文摘要
本發明公開了一種用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，該方法首先將待檢測樣本置入快速生長液中，快速培養食品中的致病菌，然后用裸磁粒子吸附致病菌，通過煮沸增菌，經磁分離架分離后用快速洗滌液洗滌后，加入高效裂解液，裂解被吸附的菌液，經煮沸、離心后取上清做PCR檢測的核酸模板。該方法提取過程安全、簡便、省時，與免疫磁珠提取模板的技術路線不同，并且只進行一次6.5h共有模板的提取，便可以根據PCR引物的特異性，同時進行所有致病菌種的檢測。解決了按照[SN/T1870-2007]方法提取模板，無法滿足現代食品工業生產當天就必須出售的問題。
文檔編號C12N15/10GK101649316SQ20091002381
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月7日 優先權日2009年9月7日
發明者張建芳, 明 李, 李紅東, 王曉潔 申請人:西安天隆科技有限公司