專利名稱：生物發光檢測特種致病菌使用的檢測方法和檢測用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物發光檢測特種致病菌使用的檢測方法和檢測用試劑盒，更確切地說本發明利用生物發光法快速檢測微生物總量或者特定微生物數量的方法及檢測試劑盒，屬于微生物檢測領域。
背景技術：
快速檢測和識別致病菌不管是在臨床診斷方面，還是在食源性致病菌監測方面， 甚至生物武器防察方面都是當今社會的一個重要議題。食源性致病微生物種類繁多，缺乏靈敏、便捷、特異的快速檢測技術，是食品安全和人民健康無法得到有效保障的主要原因之一。由于缺乏有力的監測技術，據WHO報告，世界各國食源性疾病報告的發病率不到實際發病率的10%。因此開發針對致病菌的快速、靈敏、可靠的檢測方法和現場、便攜的檢測儀器和配套試劑，是食品安全、人民健康和國家安全保障的迫切需要。水和食品中細菌的檢測，特別是致病性細菌的檢測，對于控制傳染病、保護環境衛生和人民群眾身體健康都有著重要的意義。目前水體菌落總數測定采用國標平板計數法即 37°C恒溫培養Mh，因為這種方法結果可靠，被視為微生物檢測的金標準。但是，傳統的微生物培養法耗時長、步驟繁瑣、需要多種培養基和試劑，無法滿足當今社會一些突發事件對微生物現場快速檢測的迫切需求。ATP生物發光法是近年來發展最快的定量微生物檢測分析技術之一，具有快速、簡便、靈敏等特點，主要是通過間接測定活菌總數來監測樣品清潔度或衛生狀況。生物發光計數法利用ATP與蟲熒光素-熒光素酶(Luciferin-Luciferase)復合物的反應來測定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。熒光素酶在鎂離子存在的條件下，與還原熒光素和ATP結合形成熒光素酶-熒光素-單磷酸腺苷的復合物，該復合物與氧結合時發出熒光D-Luciferln + ATP + Oz^Oxy-Lncifeiin 4 AMP + ppi + H2O + hw實質上，蟲熒光素酶促進的生物發光反應，使用了 ATP分子內的化學能，激發了熒光素氧化脫羧作用，然后產生發光。螢火蟲熒光素酶幾乎唯一以ATP為特異的底物，來自自然界其它核苷的影響可被忽略發光試劑于飽和量下，每一 ATP分子能釋放出一個光子，因此光子的數量與ATP含量成正比。發出的光及ATP含量可使用相對發光強度(RLUs)來衡量，這些單位均可直接使用，而不必計算具體的ATP量或菌落形成單位(CFUs)。光子的數量可采用ATP熒光儀進行測量。ATP生物發光法存在的首要問題是靈敏度有時達不到衛生學要求。從靈敏度角度講，ATP生物發光法要求樣品中細菌濃度最低不少于1000CFU/ml，但這種靈敏度有時達不到衛生學要求，需要一定時間的預培養。而免疫磁分離技術是一種行之有效的濃縮方法，可以將細菌數濃度提高10倍甚至100倍，從而節省了預培養的時間，大大縮短檢測時間。因此將ATP生物發光法與免疫磁分離技術結合起來，檢測大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌，將具有快速、特異性好、靈敏度高等特點，在食品、環境、化工、醫藥等領域將有廣闊的發展前景。本發明針對目前飲用水和食品監測和控制中缺乏快速、靈敏、可靠檢測致病菌的現狀，本發明擬采用生物發光法結合免疫磁分離技術實現快速檢測總菌和目標致病菌，為后期開發的便攜式生物傳感器提供配套的試劑。
發明內容
本發明的目的是提供生物發光檢測特種致病菌使用的檢測方法和檢測用試劑盒， 本發明提供了一種快速檢測特定食源性致病菌數量的方法，建立特異性的生物發光檢測試劑盒，為衛生監督和食品安全提供可靠保障。本發明提供的快速檢測微生物數量的試劑盒，包括包被抗體的免疫磁珠、微生物裂解液、熒光素酶及保護劑、檢測緩沖液等試劑。檢測方法是利用生物發光法結合免疫磁珠識別特種致病菌，具體是利用免疫磁珠上的單克隆抗體或者多克隆抗體，通過抗原抗體反應捕獲菌懸液或者樣品中的特異性致病菌，然后加入裂解液釋放細菌內的三磷酸腺苷 (ATP)，最后通過熒光素(D-Luciferin)-熒光素酶(Luciferase)檢測ATP含量來判斷樣品中是否存在特定致病菌，并通過ATP標準曲線的測定來推測含有特定致病菌的數量。(1)本發明提供的生物發光檢測特種致病菌使用的檢測方法的檢測步驟是a)先制作標準ATP曲線，即對ATP標準品進行等比稀釋，濃度范圍在10_12-10_7mol/ 1。加入生物發光劑進行檢測，得到ATP標準品濃度與其發光值之間的關系曲線。b)然后參照國標方法對樣品進行預處理，制備成體積為0. 2-10ml的樣品溶液。c)將一定量的免疫磁珠加入到樣品溶液中，共孵育30-100min，充分反應后，磁分離除去上清液。然后加入少許檢測緩沖液洗滌，磁分離除去上清液，重復一次，得到濃縮的目標微生物溶液。d)在上述濃縮的溶液中加入少量的微生物裂解液(10-100μ 1)，室溫作用 l_5min。e)加入檢測緩沖液(50-200 μ 1)，在避光的條件下加入生物發光試劑 (50-100 μ 1)，然后立即置發光檢測儀中測定發光值。f)樣品中相應致病菌ATP含量的計算根據測定的發光值和a)中所得的標準曲線，推算樣品中相應的ATP濃度和致病菌數量。(2)本發明所述的快速檢測微生物數量試劑盒，具體由包被抗體的免疫磁珠 (0. l-5ml)、ATP標準品(50-500 μ 1)、微生物裂解液(I-IOOml)、生物發光試劑(l_50ml)、檢測緩沖液(10-500ml)等試劑組成。其中包被抗體的免疫磁珠按照Iml計，含有1-100 μ g的單克隆抗體或者多克隆抗體、 0. I-Img的聚合物修飾的超順磁狗304或者γ -Fe2O3納米顆粒，含有I-IOmg牛血清白蛋白和吐溫80的緩沖液；ATP 標準品含有 1 X l(T7mol/l ATP ；微生物裂解液按照體積百分比計，含有0. 5-5%的三氯乙酸(TCA)、十二烷基三甲基溴化銨、曲拉通(Triton X-100)、二甲亞砜(DMSO)、苯甲烷胺中至少一種裂解試劑；檢測緩沖液包含l_20mM可溶性無機鎂鹽和三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖液 (pH = 7. 6-7. 8)
生物發光劑按照Iml計，含有0. 01-5mg的熒光素、0. OOl-Img的熒光素酶、 0. 5-10mg的牛血清白蛋白、0. 5-10mg海藻糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(pH = 7. 6-7. 8)本發明提供的特定致病菌快速檢測方法，無需增菌或者過濾，大大縮短了檢測時間，在2小時內可完成檢測，與國家標準規定中采用的平板計數法相比，具有快速、操作簡便、靈敏度高，特異性強等優點，有利于構建簡單、快速、靈敏、使用界面友好的分析系統，適合于食品、環境樣品的現場快速檢測及基層普及應用。
圖1生物發光快速檢測特種致病菌的流程圖。圖2生物發光法ATP標準曲線的測定。
具體實施例方式下面通過具體實施例的介紹，進一步闡明本發明實質性特點和顯著的進步，但本發明決非僅局限于實施例。實施例1 生物發光法快速檢測E. coli0157:H7試劑盒的構建生物發光法快速檢測E. coli0157:H7試劑盒包括包被抗體的免疫磁珠5瓶，每瓶 100 μ 1 ；標準ATP溶液(1 X 10_7mOl/l) 1瓶，每瓶100 μ 1 ；微生物裂解液1瓶IOml ；檢測緩沖液5瓶，每瓶20ml ；生物發光試劑5瓶，每瓶1ml。其中，①試劑的配制包括a)免疫磁珠取500 μ g羧基磁珠于1. 5ml離心管中，加入Iml清洗緩沖液，混合均勻并超聲15min，磁分離洗滌兩遍后，重懸在250 μ 1 2_(Ν_嗎啉基)乙磺酸(MES)中，再分別加入500 μ gl-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和750 μ gN-羥基琥珀酰亞胺(MB)，37°C活化磁珠表面的羧基15min，然后用MES清洗兩次，重懸后加入50ug的抗體，室溫反應池，將抗體偶聯于磁珠表面，得到免疫磁珠。用PBS洗滌偶聯后磁珠2遍，加入50ul含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，保存于4°C冰箱。b)標準ATP試劑用檢測緩沖液10倍倍比稀釋ATP標準樣(1 X I(TmoVl)，獲得不同濃度的ATP標準品。c)微生物裂解液采用三氯乙酸作為ATP提取劑，濃度為0. 5% 2%，經過高壓滅菌處理(12rC，30min)后在4°C下保存。d)檢測緩沖液以Tris-Acetate作為緩沖液。稱取一定量的Tris堿，使定容后的濃度為0. 1M，定容前需要先調節pH值。將pH計插入Tris溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值為7. 75，然后定容，經過高壓滅菌處理(12rC，30min)后在4°C下保存。e)生物發光試劑取5mg的牛血清白蛋白和5mg海藻糖溶解于0. IM的Tris-HAc 緩沖液(PH = 7. 6-7. 8)，然后加入Img的熒光素、0. 5mg的熒光素酶，輕輕搖晃(不能振蕩) 使其溶解。使用前在室溫下放置1小時，使其溫度恢復到室溫，不用時避光儲存于-20°C的冰箱中。實施例2 采用生物生物發光法快速檢測特種致病菌試劑盒檢測食品中的大腸桿菌 0157:H7采用實施例1中的檢測試劑盒用于實施例2的檢測CN 102183648 A
說明書
4/4頁檢測流程示意圖如圖1所示。具體步驟如下a)先制作標準ATP曲線，即對ATP標準品進行等比稀釋，濃度范圍在10-12-l(T7mOl/ 1。加入生物發光劑進行檢測，得到ATP標準品濃度與其發光值之間的關系。b)然后對樣品進行預處理，制備成合適的樣品溶液。c)將免疫磁珠加入到樣品溶液中，共孵育，充分結合后除去上清液。d)加入少量的微生物裂解液，室溫作用lmin。e)加入檢測緩沖液lOOul，加入生物發光試劑50ul，然后立即置發光檢測儀中測
定發光值。f)樣品中相應致病菌ATP含量的計算根據測定的發光值和a)中所得的標準曲線，推算樣品中相應的ATP濃度和致病菌數量。結果表明該方法檢測限可達IO2CFU · πιΓ1.
權利要求
1.一種生物發光快速檢測特種致病菌使用的檢測方法，其特征在于利用免疫磁珠上的單克隆抗體或者多克隆抗體，通過抗原抗體反應捕獲菌懸液或者待測試樣中的致病菌，然后加入微生物裂解液釋放細菌內的三磷酸腺苷，最后通過熒光素-熒光素酶檢測ATP含量， 以判斷樣品中是否存在特定致病菌，并通過ATP標準曲線的測定來推測含有特定致病菌的數量。
2.根據權利要求1所述的方法，特征在于按照下述步驟進行(1)標準ATP曲線的制作對ATP標準品進行等比稀釋，濃度范圍在10_12 10_7mol/L，加入生物發光劑進行檢測， 獲得ATP標準品濃度與其發光值之間的關系曲線；(2)待測樣品的預處理按照不同樣品的性質參照國標對待測樣品進行相應的預處理，制備成體積為0. 2-10ml 的樣品溶液；(3)特異性致病菌的磁珠富集將免疫磁珠加入到待測樣品溶液中，共孵育30-100min，充分反應后，磁分離除去上清液；(4)致病菌裂解在步驟(3)所述的待測樣品中加入10-100 μ 1微生物裂解液，室溫作用l-5min。(5)ATP生物發光測試在步驟(4)所述的溶液中加入檢測緩沖液50-200 μ 1，加入生物發光試劑50-100μ 1， 然后立即置發光檢測儀中測定發光值；(6)試樣中相應致病菌ATP含量的計算根據步驟(5)測定的發光值和步驟⑴中所得的標準曲線，推算樣品中相應的ATP濃度和致病菌數量。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于包被抗體的免疫磁珠按照Iml計，含有1-100 μ g的單克隆抗體或者多克隆抗體、0. I-Img的聚合物修飾的超順磁!^e3O4或者 Y -Fe2O3納米顆粒和含有I-IOmg牛血清白蛋白和吐溫80的緩沖液。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的微生物裂解液按照體積百分比計，含有0. 5-5%的三氯乙酸、十二烷基三甲基溴化銨、曲拉通、二甲亞砜、苯甲烷胺中至少一種。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于檢測緩沖液包含l_20mM可溶性無機鎂鹽和三羥甲基氨基甲烷，緩沖液的PH = 7. 6-7. 8。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于生物發光劑按照Iml計，含有0.01-5mg 的熒光素、0. OOl-Img的熒光素酶、0. 5-10mg的牛血清白蛋白、0. 5-10mg海藻糖和pH為 7. 6-7. 8的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
7.由權利要求1_3、5或6中任一項所述的方法配套構建的試劑盒，其特征在于具體由包被抗體的免疫磁珠0. l-5ml、ATP標準品500-500 μ m、微生物裂解液I-IOOml、生物發光試劑1-50ml、檢測緩沖液10-500ml組成。
8.按權利要求7所述的試劑盒，其特征在于用于快速檢測E.coli0157:H7試劑盒包括包被抗體的免疫磁珠5瓶，每瓶100 μ 1 ；標準ATP溶液(1 X 10_7mol/l) 1瓶，每瓶100 μ 1 ；微生物裂解液1瓶IOml ；檢測緩沖液5瓶，每瓶20ml ；熒光素酶及保護劑5瓶，每瓶Iml ；其中①免疫磁珠取500μ g羧基磁珠于1. 5ml離心管中，加入Iml清洗緩沖液，混合均勻并超聲15min，磁分離洗滌兩遍后，重懸在250 μ 1 2-(N-嗎啉基)乙磺酸中，再分別加入 500 μ gl-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和750 μ g N-羥基琥珀酰亞胺，37°C條件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2- (N-嗎啉基)乙磺酸清洗兩次，重懸后加入50ug 的抗體，室溫反應池，將抗體偶聯于磁珠表面，得到免疫磁珠。用PBS洗滌偶聯后磁珠2遍， 加入50 μ 1磷酸鹽緩沖液中，保存于4°C冰箱。②標準ATP試劑用檢測緩沖液10倍的倍比稀釋ATP標準樣，獲得10-12-10-7mol/L 濃度的ATP標準品；③微生物裂解液采用三氯乙酸作為ATP提取劑，濃度為0.5% 2%，經過高壓滅菌處理后在4°C下保存；④檢測緩沖液以Tris-Acetate作為緩沖液，配制方法是稱取一定量的Tris堿，使定容后的濃度為0. 1M，定容前需要先調節pH值；將pH計插入Tris溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值為7. 75，然后定容，經過高壓滅菌處理后在4°C下保存；⑤生物發光試劑取5mg的牛血清白蛋白和5mg海藻糖溶解于0.IM的pH為7. 6-7. 8 的Tris-HAc緩沖液，然后加入Img的熒光素、0. 5mg的熒光素酶，輕輕搖晃使其溶解，避光儲存于-20°C的冰箱中。
9.按權利要求8所述的試劑盒，其特征在于a)①中磷酸鹽緩沖液含有0.牛血清蛋白；b)③和④中滅菌處理條件下121°C、30min；c)⑤中所述的搖晃不能振蕩；d)⑤中所述的生物發光試劑使用前從-20°C的冰箱中取出后，在室溫下放置1小時，使溫度恢復到室溫。
10.按權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于檢測時無需增菌或過濾，在2小時內完成檢測食品中大腸桿菌0157:H7，檢測限可達IO2CFU · πιΓ1。
全文摘要
本發明涉及一種利用生物發光法結合免疫磁珠識別檢測特種致病菌的方法及檢測用試劑盒。本方法利用免疫磁珠上的單克隆抗體或者多克隆抗體，通過抗原抗體反應捕獲菌懸液或者樣品中的細菌，然后加入裂解液釋放細菌內的三磷酸腺苷(ATP)，最后通過熒光素(D-Luciferin)-熒光素酶(Luciferase)檢測ATP含量來判斷樣品中是否存在特定微生物，并通過ATP標準曲線的測定來推測含有特定微生物的數量。本發明提供的試劑盒，包括包被抗體的免疫磁珠、微生物裂解液、熒光素酶及保護劑、檢測緩沖液等試劑。通過本發明能夠大大縮短檢測時間(2小時以內)，無需增菌或者過濾，操作簡便，靈敏度高，特異性強，適合于食品、環境樣品的現場快速檢測及基層普及應用。
文檔編號G01N33/577GK102183648SQ20111002994
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者周洪波, 葛玉卿, 趙建龍, 金慶輝 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所