梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌的padlock探針及多重檢測方法

專利名稱：梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌的padlock探針及多重檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測梨火疫病菌CEn^m'fltw^/ovora)和亞洲梨火疫病菌(五nWw'fl /73^/0//ae)的padlock探針以及同時檢測這兩種植物病原菌的多重檢測方法，屬于生 物技術領域。適用于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
(二)
背景技術：
梨火疫菌(五rvW"/a謡—vw"(Buiri11) Winslow"a/.)是薔薇禾斗(及oraceae)， 蘋果亞科(Ma/oW^e)植物火疫病的致病因子。梨火疫病原產自北美，1920在 新西蘭發現該病。1957年英格蘭報道了梨火疫病疫情的發生，自此除葡萄牙外歐 洲大多數栽種感病寄主植物的國家都有了梨火疫病發生的相關報道。到目前為止 梨火疫病已廣泛分布于43個國家(VenderZwet2002)，但南美、大部分非洲、 亞洲國家(除地中海國家)未見有梨火疫病發生的報道，中國也是非疫區。由于 梨火疫病對許多國家的水果產業構成了巨大威脅，所以世界多數國家將其列為檢 疫性有害生物。
自1995年起，在韓國的Chuncheon地區果園的亞洲梨CP_vrws; yn/o//fle)上發 現一種與梨火疫病(五nW"/a"附y/ovora)十分相似的病害。該菌主要侵染亞洲梨 和部分西洋梨(Pymy comm""W品種，對蘋果無致病力。最終在德國所做的分子生 物學鑒定進一步將此病鑒定為一個新種亞洲梨火疫病菌(五n^m力。我 國沒有發生此病害，是我國規定的檢疫性有害生物。該病主要侵染梨樹花序和嫩 枝，引起花腐和枝枯，癥狀與^nw'm'aamy/ovom引起的癥狀十分相似。
梨和蘋果是我國的主要果品，各省均有栽培，也是我國出口創匯的重要農產 品之一。如果梨火疫病或亞洲梨火疫病一旦在我國發生，所遭受的不僅僅是病害 直接引起的損失，最重要的是其他國家的貿易限制而引起的市場損失，對我國果 品出口造成負面影響。因此在我國檢疫是主要的控制此病害的手段，嚴格限制或 禁止從發生此類病害的國家和地區進口梨和苗木等，從其它國家進口的種子必須 進行有關的檢驗。目前梨火疫病和亞洲梨火疫病具體的檢測手段主要是傳統的檢 測技術和分子檢測技術。傳統的檢測技術包括利用半選擇性培養基分離和鑒定病菌、免疫學檢測方法、致病性測定及過敏反應測定、生理生化反應測試等。這些 方法往往需耗費較長時間并且靈敏度和準確性不高，因此常規的檢測方法難以適 應檢疫的需求。
近年來，采用PCR擴增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、質粒DNA 和rDNA轉錄間隔區(ITS)等進行病原菌鑒定、檢測及病害診斷為國際上廣泛使 用。Bereswill等人(1992)利用梨火疫病菌的pEA29質粒上0.9kb的戸rt片段對 梨火疫病菌進行特異性鑒定，特異性擴增梨火疫病菌菌體，檢測靈敏度可達50 個菌體細胞，并在6小時內可得結果。Bereswill等人(1995)利用梨火疫病菌的 "ms基因設計了一對引物，對梨火疫病菌進行特異性檢測，專化性極好，由于^w 基因的拷貝數很低，因此靈敏度只有擴增pEA29質粒PCR技術的l/10(500細胞)。 Merighi等(2000)利用PCR-ELISA技術對梨火疫病進行了檢測，檢測人工接 種的梨枝條，靈敏度達4X10^fWg。 Llop等(2000)在l個封閉的管內同時使用 2套引物進行巢式PCR引物，對梨火疫病菌進行特異性檢測。由于退火溫度上的 差異，基于兩套引物的PCR反應在時間順序上前后連貫。外部引物的序列由 McManus和Jones (1995)設計，內部引物由Llop等(2000)設計。但是這些報 道都是針對五nWm'"cw^/ovora設計的引物，無法將亞洲梨火疫區分開來。目前尚 未有能夠同時檢測梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌技術的報道。
Padlock探針(PLPs)的發明為植物病原菌的高通量分子檢測提供了一條新的 思路。Padlock探針是一條長度為100bp左右的單核苷酸探針(圖4-1)，包括磷酸 化的5'端和羥基化的3，端，這兩端能夠識別特定目標物的DNA序列(Nilsson W "/， 1994)，我們通常稱之為T1端和T2端。在T1端和T2之間，存在著一段通用序 列和一段特異序列，我們稱之為P1、 P2端和ZipCode。在進行反應時，首先將 padlock探針和要檢測的目標DNA進行連接，在TaqDNA連接酶的作用下，探針 的Tl端和T2端通過和特定的檢測靶標物的DNA序列互補而相結合，探針的5' 端和3'端連成環狀。由于7V^DNA連接酶的特性，只有DNA序列和探針的T1 端和T2端完全互補時，探針才能形成環狀，否則，探針以線性存在。采用核酸 外切酶去除沒有形成環狀的探針和錯配的探針，然后采用所有探針的通用端Tl 端和T2端的引物對切除后的產物進行滾環擴增。然后將擴增后的產物與固定在 膜上或者Microarray上的與ZipCode序列互補的核酸序列進行雜交(Shoemaker W1996)。通過膜上的地高辛標記信號或者Microarray上的熒光來判斷檢測樣品
中是否有特定的病原物。由于padlock探針可與Macroarray或者Microairay技術
相結合，因此能夠在檢測的過程中實現高通量(Hardenbole/"/，2003)。 Padlock探
針獨特的設計多與基因芯片相結合應用于病毒性疾病分子的檢測(BatierJ^"/,
2007)和單核苷酸突變檢測當中(BanerJWfl/，2003)。目前尚未有將padlock探針應
用于植物病原菌實際檢測的實例。 參考文獻
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發明內容
技術問題本發明的目的是解決現有技術中對梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌的分子檢 測方法難以實現多重檢測等問題，提供分別用于檢測梨火疫病菌和亞洲梨火疫病 菌的Padlock探針以及同時檢測這兩種病原菌的分子檢測方法，對梨火疫病菌和 亞洲梨火疫病菌進行檢測，靈敏度高、特異性好。
技術方案
本發明的目的意在克服上述現有技術的不足，提供快速、可靠、靈敏度高、 特異性強的檢測梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌的padlock探針以及能夠同時檢測 這兩種病原菌的分子檢測方法。
實現上述目的的技術方案 l)用于檢測梨火疫病菌的padlock探針序列
2) 用于檢測亞洲梨火疫病菌的padlock探針序列
P-e.pyr:TATGGCGTCCCCAAGGGGATTCGAACCCPiP2CCGACTCTAGGATGGTGGATCACTTCGTTACCG(
探針的靶標識別序列(即5'末端和3'末端)取自待測病原菌16S-23S rDNA (ITS)區域特異的核酸序列。探針中間PtP2 (CTCGACCGTTAGCAGCATGACCG AGATGTACCGCTATCGT)為通用引物結合區，加下劃線的堿基序列(即Zipcode 序列)用于識別固定在尼龍膜上的cZipcode探針。
3) Padlock探針是一種長寡核苷酸探針，其兩端的序列可通過核酸間的互補與靶 標DNA結合。通過和耙標DNA的雜交，padlock探針的兩端在連接酶的作用下連 成環狀，具有非常高的特異性。Padlock探針可與Macroarray技術結合進行多重 檢測。Padlock探針結合Macroarray技術檢測方法，包括如下步驟(1 )探針 的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標DNA進行雜交，在 TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測靶標物的DNA序列互 補而相結合，探針的5'末端和3'末端連成環狀。采用核酸外切酶去除沒有形成環 狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴增。采用兩條探針P-e.amy、 P-e.pyr經
地高辛標記的通用引物對連接產物進行擴增。(3) Macroaary多重檢測。將擴 增后的產物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補的探針(cZipcode探針) 進行雜交。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。 有益效果采用上述技術方案，突出的技術進步在于(1)本發明設計了分別適用于梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌檢測的padlock 探針。(2)本發明利用padlock探針結合Macroaary技術，實現了對梨火疫病菌 和亞洲梨火疫病菌的多重檢測，檢測方法可靠、快速、靈敏度高、特異性強。(3) 采用padlock探針作為分子檢測工具，有效地避免傳統PCR檢測方法的假陽性現 象。傳統的基于PCR擴增的分子檢測通常只能檢測單種病原物，熒光定量PCR 的出現在一定程度上解決了這一問題，通過在反應的體系中添加不同熒光染料， 可以同時檢測1種以上的病原物。但是由于熒光染料種類的限制和彼此之間的干 擾，采用這種方法對多種病原物進行檢測時候效果往往不好。采用padlock探針 作為分子檢測工具，結合Macroaary技術彌補了實時定量PCR檢測因受到引物設 計問題、熒光染料的種類和熒光定量PCR儀光源是單一光源等問題而不能同時檢 測非常多的病原物的不足。
(四) 說明書附圖


圖1. Padlock探針結構示意圖及檢測原理。
圖2.梨火疫病菌和亞州梨火疫病菌的多重檢測結果。
A.五nWm'a aw_y/ovora; B. ^y"》/zV3e; C. ^Erw,w'a am_y/ovwa and
/ ynyb//afe; D. Layout of multi-chamber universal tag array on nylon membrane. cZip
control= TATGGTCGGCAATTCCCTGC.
結果表明，利用padlock探針結合Macroaary技術可以成功地對梨火疫病菌和 亞州梨火疫病菌進行多重檢測。
圖3.利用padlock探針對人工接種發病的梨葉片及其檢測結果。 (A)樣品1:人工接種五nWm'a "m_y/ovora發病的梨葉片；樣品2:人工接種￡nW"/a ;^n/o/^e發病的梨葉片；樣品3:接種滅菌水的梨葉片。(B)檢測結果。A:樣品1;B: 樣品2;C:菌株NCPPB1665;D:菌株EP28/96;E:樣品3.
(五)
具體實施例方式
實施例1: 一種利用padlock探針結合Macroaary技術的多重檢測方法，用于同
時檢測梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌。
用于檢測梨火疫病菌的padlock探針序列
用于檢測亞洲梨火疫病菌的padlock探針序列:(1)將發病梨樹葉片表面消毒后切成小段，然后用滅菌水浸泡30min,離心 取上清，以此菌懸液為模板。連接反應液包括20mM Tris-HCL, pH 9.0, 25 mM KCH3COO， 10 mM Mg(CH3COO)2， 10 mM DTT, 1 mM NAD， 0.1% Triton X-100, 2.4UTaqDNA連接酶，lpl菌懸液，100pm探針P-e.amy 、 P-e.pyr。連接的反 應程序為95'C預變性5分鐘；然后進入循環，95'C變性30秒，65'C連接5分鐘， 反應共進行20個循環；然后95t:滅活15分鐘。采用核酸外切酶切除自連和錯連 的探針在連接后的產物中加入2個單位的核酸外切酶I和2個單位的核酸外切 酶III， 37'C反應2個小時，然后將反應后的產物95'C滅活3小時。
(2)采用經地高辛標記的通用引物P1-F (5'-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3，) P2-R(5，-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3，)對連接產物進行PCR擴增，反應液包括 0.5 pMPl-F和P2-R，4種dNTP各50 pM， 2.5 pl 10xPCR反應緩沖液，2 mM Mg2+, 2.5 ^ 1% BSA, 1.25單位Taq酶(TaKaRa)， 3pl經核酸外切酶處理后的連接產物。 反應程序為94'C預變性5 min;然后進入循環，94'C變性30 sec， 60'C退火30 sec， 72"C延伸30sec，共35個循環；最后72'C延伸7 min。
(3 )Macroaary多重檢測。將lpL cZipcode探針點于尼龍膜上，每條cZipcode 探針重復4次，經紫外交聯30s固定。將固定好的膜放入雜交管中，加入預雜交 液(0.02% SDS、 5xSSC、 50%去離子甲酰胺、0.1% N誦laurysarosine、 SOmmol-L-1 磷酸鈉、pH7.0 2%封閉劑)于雜交爐中42'C預雜交lh，棄預雜交液，將擴增產 物沸水浴中變性10min,迅速移至冰上，5分鐘后加入預雜交液中，42'C雜交過夜 后，用大量2XSSC、 0.1% SDS室溫洗膜2次，每次5min，再用0.5XSSC、 0.1% SDS于68'C洗膜2次，每次15min。洗膜后把膜加入洗滌液(0.1 mol七'1馬來 酸、0.15mol丄"NaCl， pH7.5、 0.3%吐溫)中洗膜2min,棄去，用封閉液(1% 封閉劑、0.1 mol丄"馬來酸、0.15mol丄"NaCl， pH7.5)封閉30min后，加入用 封閉液稀釋了 5 000倍的Anti-DIG-AP，輕搖30 min。最后，將結合完抗體的膜 用洗滌液洗膜2次，每次15min，加入檢測液(O.lmol丄'1 Tris-HCl、 0.1 mol-L'1 NaCl、 pH9.5)平衡3 min，再加入NBT/BCIP溶液，黑暗中靜止顯色2h,待觀 察到理想的顯色后，用無菌水浸泡10min終止反應，進行拍照。通過膜上的地 高辛標記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。
實例1從人工接種發病的梨葉片檢測梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌上述梨火疫病菌和亞洲梨火疫病菌的padlock檢測探針及其多重檢測方法用于 檢測人工接種發病的梨葉片，方法包括-
1) 將發病梨葉片表面消毒后切碎，然后用滅菌水浸泡30min，離心取上清，以此
菌懸液為模板。
2) 參照上述技術方案利用padlock檢測探針P-e.amy、 P-e.pyr結合Macroaary檢
測樣品。檢測結果見圖3。證明了上述技術方案能夠應用于梨火疫病菌和亞洲梨 火疫病菌的實際檢測。
權利要求
1.用于檢測梨火疫病菌的padlock探針序列P-e.amyGACTTCGCAGGCGCCTTGCTCATTACTTPIP2ATCGGCCTGTAATCGGATCGACACGGTGTGTCGC。
2. 用于檢測亞洲梨火疫病菌的padlock探針序列P-e.pyr:TATGGCGTCCCCAAGGGGATTC GAACCCP^jCCGACTCTAGGATCGTGGATCACTTCGTTACCGG。
3. 權利要求Padlock探針結合Macroarray技術檢測方法，包括如下步驟(1)探針的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標DNA進行 雜交，在TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測靶標物的DNA 序列互補而相結合，探針的5'末端和3'末端連成環狀。采用核酸外切酶去除沒有 形成環狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴增。采用兩條探針P-e.amy、 P-e.pyr經地高辛標記的通用引物對連接產物進行擴增。(3) Macroaary多重檢測。將 擴增后的產物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補的探針(cZipcode探 針)進行雜交。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。
全文摘要
本發明用于檢測梨火疫病菌和亞州梨火疫病菌的padlock探針及其多重檢測方法屬于農作物防病治病及植物檢疫范疇。用于檢測梨火疫病菌的padlock探針序列P-e.amyGACTTCGCAGGCGCCTTGCTCATTACTTP_IP₂ATCGGCCTGTAATCGGATCGACACGGTGTGTCGC用于檢測亞洲梨火疫病菌的padlock探針序列P-e.pyrTATGGCGTCCCCAAGGGGATTCGAACCCP_IP₂CCGACTCTAGGATCGTGGATCACTTCGTTACCGG.以此探針為基礎結合Macroaary技術能夠同時檢測梨火疫病菌和亞州梨火疫病菌，這種多重檢測方法具較強的特異性、靈敏性及穩定性，為梨火疫病菌和亞州梨火疫病菌的檢測提供了快速、靈敏、特異的技術方法。圖為padlock探針結合Macroaary技術同時檢測梨火疫病菌和亞州梨火疫病菌結果。
文檔編號C12Q1/68GK101608236SQ200910030129
公開日2009年12月23日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者劉鳳權, 王源超, 田艷麗, 胡白石, 鄭小波 申請人:南京農業大學