一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒及其使用方法。本發明的試劑盒包括10μmol/L的引物CP1/CP2各1μL；10μmol/L的引物SC1/SC2各1μL、ddH2O7.5μL、Premix12.5μL；其中，CP1序列為5＇－CGGCCCACTAAACTCTTTGT－3＇，CP2序列為5＇－ATTTCAGGGCCTACCGTTTT－3＇SC1序列為5＇－AACGGTGACCCTTCTGGGGC－3＇，SC2序列為5＇－AACGGTGACCGCAAAGGACTC－3＇。本發明克服RAPD穩定性差、重復性差等缺點，同時提高了病害檢測的準確性；本發明可快速準確的對板栗疫病菌進行分子鑒定和板栗疫病的早期診斷，對控制板栗疫病的檢疫及病害的防治具有重要意義。
【專利說明】一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域，尤其涉及的是一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]板栗疫病是世界著名的森林病害之一，是栗樹的毀滅性病害，給生產帶來巨大損失。板栗疫病曾在十九世紀使美洲栗遭到全面滅種的威脅，成為植物病害摧毀自然物種的唯一典型例子。1913年，美國學者ShearC.L首次在中國東部發現板栗疫病，此后陸續在河北、山東、河南、江蘇、浙江、陜西、湖南、廣東、江西等地都有疫病發生。該病由板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica(Murr.)barr)引起。板栗疫病多發于樹干的近地表和主枝基部，幼齡樹當年發病率和枯死率較高，一旦發生防治極其困難。
[0003]板栗在四川省分布面積很廣，全省水平分布東起巫山，南到德昌，西到天全，北至廣元，50多個縣市均有栽培。早期，由于盲目引種及栽培不當，多數栽培區出現了板栗疫病，個別地區由于病害而損失嚴重。為此，亟需建立快速靈敏的檢測方法，為板栗疫病的防治提供依據。
[0004]隨著分子生物學的飛速發展，其應用范圍也越來越廣。近年來分子生物學方法已廣泛應用于植物病原真菌的分類鑒定中。PCR技術及基于PCR的檢測方法因其具有快速、準確、靈敏的特點，使其在植物病害的檢測上發揮著越來越重要的作用。雙重PCR是標準PCR的發展和完善。雙重PCR是指在同一反應體系里加上二對引物，同時擴增出二個核酸片段的PCR反應擴增反應。雙重PCR較普通PCR具有更高的特異性和準確度，不僅具有普通PCR操作簡單、快速、靈敏度高的特點，而且大大減少了因單一基因PCR擴增而出現假陽性或者檢測特異性差的可能性。
[0005]國內外雖然對板栗疫病菌rDNA的ITS區域序列及生物學特性、弱毒菌株、遺傳多樣性、營養體親和性等方面開展了廣泛而深入的研究，但有關C.parasitica分子檢測的國內外檢測報道較少。Popov等開展過巢氏PCR的檢測研究。Marra等用DNA雜交技術設計出栗疫菌交配型特異性引物及配套巢氏引物，用于區分兩種交配型。潘琪等用栗疫菌交配型特異性引物以及配套巢氏引物PCR，用于野生菌株交配型測定。但尚未有針對板栗疫病菌的檢測技術的開發，并且國內外尚未見基于ITS區域和SCAR標記技術對板栗疫病菌進行雙重PCR分子檢測的報道。
[0006]傳統真菌的鑒定主要是通過形態學和生理生化指標。形態學鑒定菌株是普遍采用的方法，但耗時、繁瑣、需要較高的專業技術知識。形態學鑒定必須是在分離培養得到病原物的基礎上才能開展，對有些培養條件特殊及形態結構不易區分的一些種的鑒定上顯得非常困難，且真菌種類繁多、個體多態性明顯，有些真菌在生長的過程中由于受到環境的壓力，其形態特征和生理生化指標發生變化，使得其形態特征復雜化，從而給分類和檢測帶來困難和不準確性。同工酶技術往往受到組織特異性和發育特異性的影響，準確度不高。免疫學技術在檢測植物病原時，也有許多不足之處，主要是抗血清效價不高、特異性不強，因而很難達到實際應用水平。
[0007]rDNA-1TS序列分析技術已是國際上對病原真菌分類鑒定、檢測及病害診斷廣泛使用的技術，通過rDNA-1TS區通用引物的PCR擴增，經克隆測序獲后，與現有的基因庫中已知的菌株序列進行比對，進而確定其分類地位。但其序列的獲得仍需要對菌株進行分離、純化培養、提取DNA、PCR擴增、回收克隆、測序等一系列的繁瑣步驟，仍不能做到病原菌的快速準確檢測和鑒定。有些種屬的真菌rDNA-1TS序列相似度較高僅僅依靠已有的ITS序列設計引物仍很難做到準確鑒定。因此，對有些真菌的檢測僅依靠rDNA-1TS序列分析技術設計引物，可能產生假陽性。若采用雙重PCR技術則可很好地解決這種問題。
[0008]RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA)技術由 Williams 和 Welsh 等人基于PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法。其原理是以隨機引物(一般IObp)對目的基因組DNA進行非定點擴增，然后用凝膠電泳對擴增產物DNA片段進行多態性分析。RAPD對模版DNA所需量少且對設備要求簡單，是廣泛使用的一種分子標記技術，但RAPD易受環境條件的影響，重復性和穩定性不高，因此，通常對目地RAPD、AFLP等片段進行克隆和測序，根據序列設計引物，將其轉化為更穩定的SCAR標記。
【發明內容】
[0009]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術在檢測板栗疫病菌中存在的不足，提供了一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒及其使用方法。
[0010]本發 明的技術方案如下:
[0011]一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒，其特征在于，其包括ΙΟμ mol/L的引物CP1/CP2各 I μ L ；10ymol/L 的引物 SC1/SC2 各 I μ L、ddH207.5 μ L、Premixl2.5μ L ;其中，CPl 序列為 5 ' - CGGCCCACTAAACTCTTTGT - 3 ;，CP2 序列為 5 ; — ATTTCAGGGCCTACCGTTTT —3 ' SCl 序列為 5 ' — AACGGTGACCCTTCTGGGGC — 3 '，SC2 序列為 5 '—AACGGTGACCGCAAAGGACTC — 3 '。
[0012]所述的板栗疫病菌分子檢測試劑盒的使用方法，其步驟如下:
[0013](I)提取純培養菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA ；
[0014](2)所述的反應體系包含:10ymol/L的引物CP1/CP2各lyL,10ymol/L的引物SC1/SC2各 lyL;12.5yL Premix，ddH207.5 μ L ;加(I)中提取的 DNA 提取液 I μ L，組成反應混合液；
[0015](3)PCR 反應條件為:94°C預變性 4min ;94°C變性 40sec，62°C退火 30sec，72°C延伸30sec，共35個循環；72°C延伸7min ；
[0016](4)PCR產物的電泳檢測:取⑶中PCR擴增產物5 μ L，在質量濃度1.5%~2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳緩沖液為1ΧΤΑΕ，100V電壓下電泳20min后，經溴化乙錠染色后在紫外燈下檢測結果；如果存在分子量為285bp和389bp的雙片段，則判定所述菌株中或植株組織樣中存在板栗疫病菌。
[0017]本發明利用RAPD-SCAR標記技術和ITS序列分析技術，設計雙重PCR引物。該方法可以克服RAPD穩定性差、重復性差等缺點，同時提高了病害檢測的準確性，為其它病害的分子檢測提供技術參考，特別對于ITS區同源性高難以區分的種屬真菌的鑒定和檢測提供參考依據。本發明可快速準確的對板栗疫病菌進行分子鑒定和板栗疫病的早期診斷，對控制板栗疫病的檢疫及病害的防治具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為板栗疫病菌雙重PCR檢測技術實現圖。
[0019]圖2為引物S160對板栗疫病菌及其它參試菌株標記結果；圖中，泳道M為標準分子量大小，泳道CK為陰性對照，泳道1-3為板栗疫病菌，泳道4-20為其它參試菌株。
[0020]圖3為雙重PCR引物檢測混合DNA中板栗疫病菌；圖中，泳道M為標準分子量大小，泳道I是引物SC1/SC2和CP1/CP2組合成雙引物對板栗疫病菌DNA溶液PCR擴增，泳道2是引物SC1/SC2對板栗疫病菌DNA溶液PCR擴增，泳道3是引物CP1/CP2板栗疫病菌DNA溶液PCR擴增，CK為陰性對照。
[0021]圖4為雙引物對供試菌株擴增結果；圖中，引物SC1/SC2和CP1/CP2組合成雙引物擴增所有供試菌株特異性結果，泳道M為標準分子量大小，CK為陰性對照，1-3為板栗疫病菌，4-20為其它參試菌株。
[0022]圖5為雙重PCR靈敏度檢測；圖中，泳道M為標準分子量大小，泳道CK為陰性對照，泳道1-8的板栗疫病菌基因組DNA濃度分別為300ng/ μ L, 30ng/ μ L, 3ng/ μ L, 300pg/ μ L,30pg/μ L,3pg/μ L,300fg/μ L,30fg/μ L。 [0023]圖6為板栗疫病菌雙重PCR檢測流程。
[0024]圖7為雙重PCR引物檢測田間發病植株；圖中，泳道M為DL2000Marker，泳道1_3為初期發病植株，泳道4為健康植株，泳道5為具有典型癥狀植株，泳道6為陰性對照。
【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0026]實施例
[0027]所用主要試劑:DNA提取試劑盒及回收試劑盒均購自天根生化科技公司，DH5 α Ε.coli感受態和Premix均購自TaKaRa公司，引物合成及PCR產物測序交由上海生工生物工程公司完成。
[0028]圖1為板栗疫病菌雙重PCR檢測技術實現圖。
[0029]1、板栗疫病菌快速分子檢測的雙重PCR引物的設計
[0030](l)rDNA-1TS區引物:對分離自四川重慶，四川雅安，四川瀘州板栗栽培區的板栗疫病菌進行純化培養，首先將供試菌株接種于PDA培養基上，25°C溫箱內黑暗條件下培養3天，然后從菌落邊緣挑取3~4塊5mm左右菌餅，接種于裝有100mL馬鈴薯-葡萄糖液體(PDB)培養基的三角瓶中，25°C，125轉/分鐘搖床震蕩培養7天。用滅菌紗布過濾，收集菌絲，滅菌蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥后，置于_20°C冰箱中保存備用。真菌基因組DNA提取采用CTAB法或試劑盒提取。以CTAB法實現為例:
[0031]I)取IOOmg左右的新鮮菌絲，置于研缽中用液氮迅速研磨為粉末，裝入1.5mL離心管；
[0032]2)加入經60°C預熱后CTAB溶液900yL和90yL10%的SDS(稱取IOg高純度SDS,加80mL去離子水，68°C溶解，濃鹽酸調節PH至7.2，定容至IOOmL)，充分混勻；
[0033]3) 60°C水浴lh，中間每IOmim上下顛倒混勻一次；[0034]4) 12000rpm 離心 IOmin ；
[0035]5)取上清液加入700μL體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，靜置IOmin ；
[0036]6) 12000rpm 離心 IOmin ；
[0037]7)取上清液置于1.5mL新的離心管，加入等體積氯仿，充分混勻，靜置5min ；
[0038]8) 12000rpm離心8min，取上清置于新的1.5mL離心管中；
[0039]9)加入2ml經預冷的無水乙醇，和0.1ml濃度為3mol/L的NaAC溶液，_20°C沉淀30min ； [0040]10) 12000rpm 離心 5min ；
[0041]11)棄上清，向沉淀部分加入700μ L經_20°C預冷的70%乙醇，充分洗滌后，置于超凈工作臺自然晾干至無酒精味；
[0042]12)加入50-100 μ LlXTE溶液溶解后即得到菌株DNA溶液，紫外分光光度計下檢測DNA濃度。
[0043]利用真菌rDNA 基因 ITS 區通用引物 ITSl (5 ; — TCCGTAGGTGAACCTGCGC - 3 ;)和ITS4 (5 ; - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3 ;)對板栗疫病菌進行PCR擴增，擴增體系和程序如下:
[0044]25 μ L反應體系中:10 μ mol/L的ITSl和ITS4各I μ L，板栗疫病菌DNA溶液I μ L，Premixl2.5 μ L, ddH209.5 μ L。
[0045]PCR 反應程序:94°C 預變性 4min ;94°C 變性 40sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸7min。
[0046]PCR產物送往上海生工生物工程公司進行測序。根據測序結果(上傳序列后獲得GenBank登錄號:KJ528274、KJ528272、KJ528273)在板栗疫病菌ITS保守區內利用軟件Primer Premier6.0設計引物,通過基因庫Blast比對驗證引物的特異性。引物序列如下:
[0047]上游=CPlS'— CGGCCCACTAAACTCTTTGT — 3 ;
[0048]下游:CP25; - ATTTCAGGGCCTACCGTTTT — 3 '，目的片段擴增大小為 285bp。
[0049](2) RAPD-SCAR標記引物:通過對分離自四川地區的重慶，雅安，瀘州栽培區的板栗疫病菌、近緣種及其它真菌共計20株(見表1)。基因組DNA提取參照(I)(同I (I) CTAB法)中方法。
[0050]表1板栗疫病菌及其它參試菌株
[0051]
【權利要求】
1.一種板栗疫病菌分子檢測試劑盒，其特征在于，其包括10 μ mo I/L的引物CP1/CP2各lyL;10ymol/L 的引物 SC1/SC2 各 I μ L、ddH207.5 μ L、Premixl2.5 μ L ;其中，CPl 序列為5 ; — CGGCCCACTAAACTCTTTGT - 3 ;，CP2 序列為 5 ; — ATTTCAGGGCCTACCGTTTT - 3 ; SCl序列為 5 ; — AACGGTGACCCTTCTGGGGC - 3 ;，SC2 序列為 5 ; — AACGGTGACCGCAAAGGACTC —3 ; ο
2.根據權利要求1所述的板栗疫病菌分子檢測試劑盒的使用方法，其特征是，其步驟如下: (1)提取純培養菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA； (2)所述的反應體系包含:10ymol/L的引物CP1/CP2各lyL，10ymol/L的引物SCl/SC2各I μ L ;12.5 μ L Premix, ddH207.5 μ L ;加(I)中提取的DNA提取液I μ L，組成反應混合液； (3)PCR反應條件為:94°C預變性4min ;94°C變性40sec，62°C退火30sec，72°C延伸30sec，共35個循環；72°C延伸7min ； (4)PCR產物的電泳檢測:取(3)中PCR擴增產物5 μ L，在質量濃度1.5%~2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳緩沖液為1ΧΤΑΕ，100V電壓下電泳20min后，經溴化乙錠染色后在紫外燈下檢測結果；如果存在分子量為285bp和389bp的雙片段，則判定所述菌株中或植株組織樣中存在板栗疫 病菌。
【文檔編號】C12Q1/04GK103966324SQ201410181647
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】朱天輝, 麻文建, 朱涵明月, 李姝江, 譙天敏, 張靜, 彭艷, 羅蓉 申請人:四川農業大學