專利名稱：耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌的培養方法，特別是一種耐鹽性膠質芽孢桿菌 的篩選培養方法。
背景技術：
膠質芽孢桿菌(^3W77"S M^7銀i/70m^是生產有機肥料的重要菌種， 能夠應用于微生物鉀肥的生產，促進經濟作物的生長。但該菌的耐鹽行較差， 在較高鹽濃度的培養基中生長受到顯著抑制。因此在鹽堿性土壤中生長活性 較差。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種方法簡單、 可操作性強的耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，該方法能培養得到耐鹽 性高的膠質芽孢桿菌。
本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是 一種耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其特點是，其步驟如下
(1) 將膠質芽孢桿菌(AaCi'Ui^ M/C27a^7'力OS775^在無氮培養基上活化后， 轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中培養至對數生長期，離心收集菌
體；
(2) 用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋至103 105萬個/ml,得菌體懸浮液，將菌體懸浮液用輻射誘變或者化學誘變方法 進行誘變，將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體； (3)取誘變菌體進行篩選、復篩，獲得耐鹽性菌株；方法如下
1) 用篩選培養基懸浮誘變菌體，調整誘變菌體濃度至102 103萬個/1111， 充分搖勻后，分裝于96孔培養板中，每孔100 200ri;
2) 25 32'C培養5 7天，用分光光度計檢測96孔培養板中的誘變菌吸 光值，選取96孔培養板中的吸光值為0. 2 0. 5的誘變菌體進行復篩；
3) 將吸光值為0.2 0. 5的誘變菌體稀釋至102 103萬個/1111，取100 200W誘變菌體稀釋液涂布于復篩培養基平板上，25 32。C培養3 5天，重 復3 5次，出現黃色暈圈菌落為目標菌落，將目標菌落在復篩培養平板上進 行2 3次單菌落純化后獲得耐鹽性膠質芽孢桿菌。
在本發明技術方案中所涉及的各培養基如下
1、 無氮培養基
甘露醇5. 0 10. 0g ; K2HP040 . 5 2. 0g; MgS04 7H20 0 . 2 0. 5g ;瓊脂 粉15. 0 20. 0g ;蒸餾水1000ml; pH為7.0 7. 5。
2、 抑制莢膜生長的液體培養基
麥芽糖10. 0 20. 0g; (NH4)2S04 0. 5 2. 0g;酵母粉0. 1 1. 0g;MgS04 ■ 0. 2 1.0g; K2HP040. 5 2, 0g;蒸餾水1000ml， pH為7.0 7.5。
3、 篩選培養基
蔗糖5. 0 10. 0g，稀釋后的海水或者含鉀鹵水1000ml， pH為7. 0 7. 5。
4、 復篩培養基
蔗糖5.0 10.0g，瓊脂粉15.0 20.0g;溴酚藍或甲基紅指示劑0.002 0. 005g L-1，稀釋后的海水或者含鉀鹵水1000ml ， pH7. 0 7. 5。
本發明步驟(2)所述的輻射誘變或者化學誘變的誘變方法可以采用常規 的誘變方法。
本發明還可以按照上述步驟(2)、 (3)循環進行四 五級誘變、篩選、 復篩，獲得在不同濃度的海水或者含鉀鹵水中保持活力的耐鹽性膠質芽孢桿 菌；其中
一級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或
者含鉀鹵水蒸餾水=1: 100;
二級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀齒水蒸餾水=1: 25;
三級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸熘水=1: 10;
四級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀^水蒸餾水=1: 5;
五級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 1。
本發明將上述通過一級誘變、二級誘變、三級誘變、四級誘變、五級誘 變等5級誘變產生的耐鹽性膠質芽孢桿菌分別命名為HLS-1、 HLS-2、 HLS-3、 HLS-4、 HLS-5。
本發明方法采用海水或者鹵水制備的培養基結合化學誘變或輻射誘變， 能夠定向誘變出可以適應一定濃度的海水和含鉀鹵水的耐鹽性膠質芽孢桿 菌，可以有效的利用海水鹵水作為鉀鹽資源，并可以適應普通土壤或者鹽堿性土壤，從而可以用于開發一種新型生物有機鉀肥的生產菌種。本發明的耐 鹽性膠質芽孢桿菌可以按常規方法用于生產有機鉀肥。
具體實施例方式
以下進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一 步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。
實施例l。 一種耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其步驟如下
(1) 將膠質芽孢桿菌(5ac^/7M M/ci7a^'/7os"W在無氮培養基上活化后，
轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中培養至對數生長期，離心收集菌
體；
(2) 用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋至103 105 萬個/ml，得菌體懸浮液，將菌體懸浮液用輻射誘變或者化學誘變方法 進行誘變，將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體；
(3) 取誘變菌體進行篩選、復篩，獲得耐鹽性菌株；方法如下
1) 用篩選培養基懸浮誘變菌體，調整誘變菌體濃度至102 103萬個/1111， 充分搖勻后，分裝于96孔培養板中，每孔200W;
2) 32'C培養7天，用分光光度計檢測96孔培養板中的誘變菌吸光值， 選取96孔培養板中的吸光值為0. 2 0. 5的誘變菌體進行復篩；
3) 將吸光值為0.2 0.5的誘變菌體稀釋至102 103萬個/1111，取200IL11 誘變菌體稀釋液涂布于復篩培養基平板上，32'C培養5天，重復5次，出現 黃色暈圈菌落為目標菌落，將目標菌落在復篩培養平板上進行3次單菌落純 化后獲得耐鹽性膠質芽孢桿菌。
實施例2。 一種耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其步驟如下(1) 將膠質芽孢桿菌(5aciW^ M/cWa^^os￡/sJ在無氮培養基上活化后，
轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中培養至對數生長期，離心收集菌
體；
(2) 用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋至103 105 萬個/ml，得菌體懸浮液，將菌體懸浮液用輻射誘變或者化學誘變方法 進行誘變，將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體；
(3) 取誘變菌體進行篩選、復篩，獲得耐鹽性菌株；方法如下
1) 用篩選培養基懸浮誘變菌體，調整誘變菌體濃度至102 103萬個/1111， 充分搖勻后，分裝于96孔培養板中，每孔150W;
2) 28-C培養6天，用分光光度計檢測96孔培養板中的誘變菌吸光值， 選取96孔培養板中的吸光值為0. 2 0. 5的誘變菌體進行復篩；
3) 將吸光值為0.2 0.5的誘變菌體稀釋至102 103萬個/1111，取 誘變菌體稀釋液涂布于復篩培養基平板上，28'C培養4天，重復4次，出現 黃色暈圈菌落為目標菌落，將目標菌落在復篩培養平板上進行2次單菌落純 化后獲得耐鹽性膠質芽孢桿菌。
實施例3。實施例1或2所述的耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法中， 按照步驟(2)、 (3)循環進行四 五級誘變、篩選、復篩，獲得在不同濃度 的海水或者含鉀鹵水中保持活力的耐鹽性膠質芽孢桿菌；其中
一級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 100;
二級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 25;三級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 10;
四級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 5;
五級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 1。
實施例4。實施例1或2或3所述的耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法 中，步驟(3)的l)中所述的篩選培養基為蔗糖5.0 10.0g，稀釋后的海
水或者含鉀鹵水1000ml， pH為7.0 7.5;步驟(3)的3)中所述的復篩培 養基為蔗糖5.0 10.0g，瓊脂粉15.0 20.0g;溴酚藍或甲基紅指示劑 0. 002 0. 005g L-l，稀釋后的海水或者含鉀卣水1000ml， pH 7. 0 7. 5。
實施例5。應用輻射誘導膠質芽孢桿菌變異，篩選獲得耐鹽性為1: 100 1: 1 (海水或者含鉀鹵水蒸餾水)的突變菌株。
具體方法如下在無氮培養基上活化膠質芽孢桿菌，25。C培養36小時后，
轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中。25'C培養18小時后，離心收集菌體， 用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋為103 105萬個 /ml，將菌體懸浮液用Co6o誘變，誘變劑量為5kGy，將誘變后的菌體離心收集 后，用液體篩選培養基懸浮，稀釋濃度為102 103萬個/1111，充分搖勻后，分 裝于96孔培養板中，每孔100W， 25r培養5天，用分光光度計，檢測96孔 培養板中的誘變菌吸光值，將96孔培養板中的吸光值為0. 2 0. 5的誘變菌 體進行復篩。
將96孔培養板中的吸光值為0.2 0.5的誘變菌體稀釋至102 103萬個/ml，取100W誘變菌體稀釋液涂布于復篩培養平板上。25'C培養5天，取出 現黃色暈圈的菌落在復篩培養平板上進行3次單菌落純化后獲得耐鹽性菌株。
將耐鹽性菌株接種于液體復篩培養基中，在25r、 200轉/min條件下搖 床培養3天，將培養液離心，用原子吸收光譜法測定培養液上清中的鉀含量， 其中培養液上清中鉀含量減少15.0%以上的菌株為高效耐鹽突變菌株。取該 突變菌株進行下一級誘導突變。
按照上述步驟循環進行4級誘變，獲得能夠耐受l: 5的海水或者含鉀卣 水的高效耐鹽突變菌株。命名為HLS-4。
所用培養基配方分別如下
無氮培養基
甘露醇5, Og， K2HP04 1, Og， MgS04 7H20 0. 2g，瓊脂粉15. 0g蒸餾水 1000ml， pH7.5。
擬制莢膜生長的液體培養基配方
麥芽糖10.0g， (NH4) 2S04 l.Og，酵母粉0. 5g， MgS04'7H20 0 . 5. 0g， K2HP041.0g，蒸餾水1000ml， pH7. 5。 篩選培養基
蔗糖5.0g，稀釋后的海水或者含鉀鹵水lOOOml， pH7.0 7.5。 復篩培養基
蔗糖5.0g，瓊脂粉15.0g;溴酚藍或甲基紅指示劑0.002g'L-1，稀釋后 的海水或者含鉀鹵水1000ml， pH7. 0 7. 5。
實施例6。應用化學誘導方法誘導膠質芽孢桿 變異，篩選獲得耐鹽性為 1: 100 1: 1 (海水或者含鉀鹵水蒸餾水)的突變菌株。其具體方法如下在無氮培養基上活化膠質芽孢桿菌，25T:培養36小時 后，轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中。25'C培養18小時后，離心收集菌 體，用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋為103 105 萬個/ml，將菌體懸浮液進行化學誘變誘變的方法為a、紫外線照射3 8分 鐘，再用日光照射3 8分鐘；b、以濃度為0. 2 2mg/ml的亞硝基胍處理28 30分鐘；c、以1.0 1.2%的硫酸二乙酯處理30 35分鐘；d、硫酸二乙加 紫外線處理，紫外線處理5分鐘以后，加硫酸二乙酯(1%)處理15 20分 鐘。
將誘變后的菌體離心收集后，用液體篩選培養基懸浮，稀釋濃度為102 103萬個/ml，充分搖勻后，分裝于96孔培養板中，每孔IOOW， 25匸培養5 天，用分光光度計，檢測96孔培養板中的誘變菌吸光值，將96孔培養板中 的吸光值為0. 2 0. 5的誘變菌體進行復篩。
將96孔培養板中的吸光值為0.2 0.5的誘變菌體稀釋至102 103萬個 /ml，取誘變菌體稀釋液涂布于復篩培養平板上。25。C培養5天，取出 現黃色暈圈的菌落在復篩培養平板上進行3次單菌落純化后獲得耐鹽性菌株。
將耐鹽性菌株接種于液體復篩培養基中，在25。C、 200轉/min條件下搖 床培養3天，將培養液離心，用原子吸收光譜法測定培養液上清中的鉀含量， 其中培養液上清中鉀含量減少15.0%以上的菌株為高效耐鹽突變菌株。取該 突變菌株進行下一級誘導突變。
按照上述步驟循環進行5級誘變，獲得能夠耐受l: l的海水或者含鉀齒 水的高效耐鹽突變菌株。命名為HLS-5。
所用培養基配方分別如下甘露醇5. 0g， K2HP04 1. 0g， MgS04 7H20 0. 2g，瓊脂粉15. 0g蒸餾水 lOOOml， pH7. 5。
擬制莢膜生長的液體培養基配方
麥芽糖lO,Og， (NH4) 2S04 l.Og，酵母粉0. 5g， MgS04'7H20 0. 5. Og， K2HP041.0g，蒸餾水1000ml， pH7. 5。 篩選培養基
蔗糖5.0g，稀釋后的海水或者含鉀鹵水1000ml， pH7.0 7.5。 復篩培養基
蔗糖5.0g，瓊脂粉15.0g;溴酚藍或甲基紅指示劑0.002g'L-l，稀釋后 的海水或者含鉀鹵水lOOOml， pH7. 0 7. 5。
權利要求
1、一種耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其特征在于，其步驟如下(1)將膠質芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)在無氮培養基上活化后，轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中培養至對數生長期，離心收集菌體；(2)用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋至103～105萬個/ml，得菌體懸浮液，將菌體懸浮液用輻射誘變或者化學誘變方法進行誘變，將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體；(3)取誘變菌體進行篩選、復篩，獲得耐鹽性菌株；方法如下1)用篩選培養基懸浮誘變菌體，調整誘變菌體濃度至102～103萬個/ml，充分搖勻后，分裝于96孔培養板中，每孔100～200μl；2)25～32℃培養5～7天，用分光光度計檢測96孔培養板中的誘變菌吸光值，選取96孔培養板中的吸光值為0.2～0.5的誘變菌體進行復篩；3)將吸光值為0.2～0.5的誘變菌體稀釋至102～103萬個/ml，取100～200μl誘變菌體稀釋液涂布于復篩培養基平板上，25～32℃培養3～5天，重復3～5次，出現黃色暈圈菌落為目標菌落，將目標菌落在復篩培養平板上進行2～3次單菌落純化后獲得耐鹽性膠質芽孢桿菌。
2、 根據權利要求1所述的耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其特征在 于，其步驟如下按照步驟(2)、 (3)循環進行四 五級誘變、篩選、 復篩，獲得在不同濃度的海水或者含鉀鹵水中保持活力的耐鹽性膠質芽 孢桿菌；其中一級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 100;二級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 25;三級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 10;四級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水=1: 5;五級誘變時懸浮菌體所用的稀釋后的海水或者含鉀鹵水濃度為海水或 者含鉀鹵水蒸餾水二l: 1。
3、 根據權利要求1或2所述的耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其特 征在于，步驟(3)的1)中所述的篩選培養基為蔗糖5.0 10.0g，稀釋后的海水或者含鉀鹵水1000ml， pH為7. 0 7. 5;步驟(3)的3) 中所述的復篩培養基為蔗糖5.0 10.0g，瓊脂粉15. 0 20. 0g;溴酚 藍或甲基紅指示劑0.002 0.005g L-l，稀釋后的海水或者含鉀鹵水 1000ml， pH 7. 0 7. 5。
全文摘要
本發明是一種耐鹽性膠質芽孢桿菌的篩選培養方法，其特征在于，其步驟如下將膠質芽孢桿菌在無氮培養基上活化后，轉接于抑制莢膜生長的液體培養基中培養至對數生長期，離心收集菌體；用稀釋后的海水或者含鉀鹵水懸浮菌體，并將菌體濃度稀釋至10<sup>3</sup>～10<sup>5</sup>萬個/ml，得菌體懸浮液，將菌體懸浮液用輻射誘變或者化學誘變方法進行誘變，將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體；取誘變菌體進行篩選、復篩，獲得耐鹽性菌株。本發明方法能夠定向誘變出可以適應一定濃度的海水和含鉀鹵水的耐鹽性膠質芽孢桿菌，可以有效的利用海水鹵水作為鉀鹽資源，并可以適應普通土壤或者鹽堿性土壤，從而可以用于開發一種新型生物有機鉀肥的生產菌種。
文檔編號C12N15/01GK101613695SQ20091003169
公開日2009年12月30日 申請日期2009年6月24日 優先權日2009年6月24日
發明者溫扶輝, 程昌林, 君 肖 申請人:君 肖