專利名稱：一種能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系及其制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種能包裝重組逆轉錄病毒粒子 的細胞系及其制備方法，應用于逆轉錄酶忠實性機制研究和抗逆轉錄病毒藥物 臨床前研究。
背景技術：
逆轉錄酶的忠實性低(引入突變的頻率高)是導致逆轉錄病毒高頻突變的
主要原因；逆轉錄病毒高突變率，繼而引起治療過程中的耐藥和抗原表位頻繁 變異，給治療和疫苗設計造成困難，因此對逆轉錄酶忠實性的研究非常重要。 目前，逆轉錄酶忠實性的研究體系包括體外和體內兩種。其中，體外的研究方 法雖然能直接反映逆轉錄酶的忠實性，但不能計算各類突變的頻率，如缺失、 重復、移碼；同時，逆轉錄酶引入突變還受到宿主本身的影響，如細胞內dNTP 的濃度、細胞因子等，因而需要體內研究方法全面的了解在細胞水平上逆轉錄 酶的忠實性。
復制單循環法是逆轉錄酶忠實性體內研究的主要方法之一，即通過構建可 產生含報告基因的重組病毒粒子的細胞系，完成病毒的單次復制，感染細胞后 觀察報告基因的突變頻率，以反映逆轉錄酶的忠實性，如圖l。具體實驗方法為 將帶有野生型或突變型逆轉錄酶基因的載體(含gag-pol基因)和篩選質粒共轉
染包裝細胞系(能穩定表達報告基因和包膜蛋白(env))。經過抗生素篩選出能
4包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系。此細胞系包裝出的重組病毒感染293細胞。 通過新霉素篩選成功整合報告基因的細胞抹，計算報告基因失活的頻率。用流 式細胞儀分選GFP失活的細胞抹，測序失活的GFP基因，統計各類突變的頻率。 這種可產生逆轉錄重組病毒粒子的細胞系是通過逆轉錄病毒載體系統完成構建 的。以D17 ( Dog osteosarcoma cells,狗骨肉瘤細胞)細胞通過逆轉錄病毒載體 系統(來源于鼠白血病病毒的逆轉錄病毒載體)構建可產生重組逆轉錄病毒粒 子的細胞系。然而該逆轉錄病毒載體系統未對鼠白血病病毒包膜基因進行改造， 產生的病毒粒子只能感染少數哺乳動物細胞，僅限于在個別細胞內進行研究， 無法廣泛的應用于在不同宿主中逆轉錄酶忠實性的研究和抗病毒藥物篩選；另 外，該細胞系所釆用的鼠白血病病毒載體保留有的鼠白血病病毒本身的包裝信 號，病毒粒子產量低，約是lxl03—4/ml的病毒粒子，給后期病毒粒子感染哺乳 動物細胞后篩選突變型報告基因帶來不便。
發明內容
本發明的目的在于克服上述技術缺陷，提供一種能包裝重組逆轉錄病毒粒 子的細胞系，該細胞系能產生高滴度病毒，且產生的重組病毒可感染多數哺乳 動物細胞。同時本發明提供制備該種能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系的方 法。
為實現本發明的目的，采用如下的技術方案
本發明的一種能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系的制備方法，包括如下 步驟
(1)構建報告細胞系HEKGFP;(2) 構建包裝細胞系HEKGFPEam.;
(3) 構建能產生重組逆轉錄病毒粒子的細胞系HEKGFPEam.GPw。 其中，步驟(1 )中的報告細胞系HEKGFP按以下方法得到 將報告基因克隆到逆轉錄病毒載體pDON - AI - 2 Neo上，與包裝質粒pGp
和包膜質粒pE - Ampho共轉染至293T細胞。收集培養上清，感染293細胞， 用新霉素篩選，得到的抗新霉素的報告細胞系HEKGFP 。報告基因為綠色熒光 蛋白基因GFP。
步驟(2 )中的包裝細胞系HEKGFPEam.按以下方法得到 將包膜質粒pE-Ampho和篩選質粒pPUR共轉染至所述l艮告細胞系 HEKGFP中，用噪呤霉素篩選，得到抗噪呤霉素的包裝細胞系HEKGFPEam., 通過PCR鑒定細胞基因組整合有包膜基因。 PCR鑒定所用的引物為 5， - ATGGCGCGTTCAACGCTC - 3' 5, - GGCTCGTACTCTATAGGCTTCAGCT - 3，。 步驟(3 )中的細胞系HEKGFPEam.GPw按以下方法得到 將包裝質粒pGp和篩選質粒pSV - 2共轉染至所述包裝細胞系HEKGFPEam. 中，用潮霉素篩選，得到細胞系HEKGFPEam.GPw。 PCR鑒定細胞系基因組整 合有逆轉錄酶基因。用PCR鑒定為陽性的細胞的培養上清感染293細胞，48小 時后觀察熒光信號確定可產生重組逆轉錄病毒粒子。 PCR鑒定所用的引物為 5， - ATCAAGCCCCACATACAGAGA - 3， 5， 一 ACGGAGCTCTTAGAGGAGGG — 3,。上述方法得到的細胞系能包裝重組逆轉錄病毒粒子。
本發明的制備方法所采用的逆轉錄病毒載體的包裝信號經過改造后可以產
生比傳統逆轉錄病毒載體高出2-8倍的病毒粒子，使得能夠提供了一種能產生 高滴度病毒的細胞系。同時，系統中的包膜基因經過優化后，包裝出的重組病 毒粒子可感染大多數宿主細胞。此細胞系產生的重組病毒可感染多數哺乳動物 細胞，可廣泛的應用于在不同宿主中逆轉錄酶忠實性的研究和抗病毒藥物篩選。
圖1為復制單循環方法示意圖2為本發明中所使用的逆轉錄病毒載體pDON — AI —2 Neo的結構示意
圖3為本發明的HEKGFPEam.GPw細胞系產生的重組病毒粒子感染293細 胞48小時后，觀察熒光信號的一個優選實施例的結果圖。
具體實施例方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應 理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
選擇經過優化后的逆轉錄病毒載體系統，此載體系統中的逆轉錄病毒載體 pDON - AI - 2 Neo的包裝信號經過改造后可以產生比傳統逆轉錄病毒載體高出 2-8倍的病毒粒子，如圖2,圖2為本發明中逆轉錄病毒載體pDON - AI - 2 Neo 的結構示意圖。載體包含有長末端重復序列(LTR),引物結合位點(PBS),報 告基因(GFP或lacZ)， neo (新霉素抗性基因)，IRES (核糖體起始位點)。同 時，對系統中的包膜基因進行優化后，包裝出的重組病毒粒子可感染的宿主范 圍大大增加。將報告基因GFP克隆到逆轉錄病毒載體(pDON - AI - 2 Neo)上。實施例l:構建報告細胞系HEKGFP
將報告基因GFP克隆到逆轉錄病毒載體pDON - AI - 2 Neo上，與包裝質粒 (pGp)和包膜質粒(pE - Ampho)共轉染至293T細胞，293T能夠更有效地包 裝逆轉錄病毒，可產生較293、 NIH3T3等細胞更高滴度的病毒粒子，48小時后收 集含病毒的培養液。用收集的病毒感染293細胞，72小時后用700ng/mL的新霉素 篩選兩周，得到抗新霉素的細胞克隆。通過96孔板將抗性克隆單克隆化，挑取 有熒光的單細胞克隆擴大培養，即得到報告細胞系HEKGFP。
實施例2:構建包裝細胞系HEKGFPEam.
① 將包膜質粒pE - Ampho和pPUR (篩選質粒)共轉染至上述得到的報告細 胞系HEKGFP中，用50嗎/mL噪呤霉素篩選兩周，得到的抗性細胞克隆用96孔板 單克隆化；
② 鑒定包裝細胞系HEKGFPEam.:待單克隆長滿每孔，擴大培養，提取細 胞DNA。用以下引物鑒定細胞是否穩定整合了包膜基因，PCR陽性的是包裝細 胞系HEKGFPEam.。 PCR鑒定所用的引物為
5， - ATGGCGCGTTCAACGCTC - 3，
5' - GGCTCGTACTCTATAGGCTTCAGCT - 3'
實施例3:構建能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系HEKGFPEam.GPw
①將包裝質粒pGp和pSV-2 (篩選質粒)共轉染至得到的包裝細胞系 HEKGFPEam.中，用30嗎/mL潮霉素篩選兩周，得到的抗性細胞克隆用96孔板單克隆化；
② 鑒定包裝細胞系HEKGFPEam.GPw:待單克隆長滿每孔，擴大培養，提 取細胞DNA。用以下引物鑒定細胞是否穩定整合了Pol基因，PCR養定所用的引 物為
5, - ATCAAGCCCCACATACAGAGA - 3， 5， - ACGGAGCTCTTAGAGGAGGG - 3，
③ 將PCR鑒定陽性的細胞用含10 %FBS的DMEM鋪板，24小時后培養液用 0.45lim的濾膜過濾后，感染293細胞，48小時后觀察熒光，如圖3所示，圖3A是 焚光下觀察感染了重組病毒粒子的293細胞，圖3B是同一視野白光下觀察感染了 重組病毒粒子的293細胞，表明得到了細胞系HEKGFPEam.GPw。此細胞系能包 裝重組逆轉錄病毒粒子。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本 發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
9序列表
<110>中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院 <120>—種能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系及其制備方法 <160> 4
<170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1
atggcgcgtt caacgctc 18
<210> 1 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2
ggctcgtact ctataggctt cagct 25
<210> 1
<211> 21
<212> DNA <213〉人工序列<400> 3
atcaagcccc acatacagag a 21
<210> 1 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4
acggagctct tagaggaggg 20
權利要求
1、一種能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)構建報告細胞系HEKGFP；(2)構建包裝細胞系HEKGFPEam.；(3)構建能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系HEKGFPEam.GPw。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的報 告細胞系HEKGFP 4姿以下方法得到將報告基因克隆到逆轉錄病毒載體pDON - AI - 2 Neo上，與包裝質粒pGp 和包膜質粒pE - Ampho共轉染至293T細胞；收集培養上清，感染293細胞， 用新霉素篩選，得到抗新霉素的報告細胞系HEKGFP 。
3、 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的報告基因為綠色 熒光蛋白基因GFP。
4、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的包 裝細胞系HEKGFPEam.按以下方法得到將包膜質粒pE-Ampho和篩選質粒pPUR共轉染至所述步驟(1)中的報 告細胞系HEKGFP中，用噪呤霉素篩選，得到抗噤呤霉素的包裝細胞系 HEKGFPEam.,通過PCR鑒定細胞基因組整合有包膜基因。
5、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述PCR鑒定所用的引 物如下5、 - ATGGCGCGTTCAACGCTC - 3，；5， - GGCTCGTACTCTATAGGCTTCAGCT - 3，。
6、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的細 胞系HEKGFPEam.GPw 4姿以下方法得到將包裝質粒pGp和篩選質粒pSV-2共轉染至所述步驟(2)中的包裝細胞 系HEKGFPEam.中，用潮霉素篩選，得到細胞系HEKGFPEam.GPw; PCR鑒定 細胞系基因組整合有逆轉錄酶基因；用PCR鑒定為陽性的細胞的培養上清感染 293細胞，48小時后觀察熒光信號。
7、 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述PCR鑒定所用的引 物如下5， - ATCAAGCCCCACATACAGAGA - 3，； 5， 一 ACGGAGCTCTTAGAGGAGGG — 3，。
8、 一種權利要求l-7之一所迷的制備方法得到的細胞系，其特征在于，所 述細胞系能包裝重組逆轉錄病毒粒子。
全文摘要
本發明公開了一種能包裝重組逆轉錄病毒粒子的細胞系的制備方法，將報告基因克隆到載體pDON-AI-2Neo上，與質粒pGp和pE-Ampho共轉染至293T細胞。收集培養上清，感染293細胞，用新霉素篩選得到細胞系HEKGFP。將質粒pE-Ampho和pPUR共轉染至細胞系HEKGFP中，用嘌呤霉素篩選，得到細胞系HEKGFPEam.。將質粒pGp和pSV-2共轉染至細胞系HEKGFPEam.中，用潮霉素篩選，得到細胞系HEKGFPEam.GPw。本發明的制備方法提供了一種能產生高滴度病毒的細胞系，此細胞系產生的重組病毒可感染多數哺乳動物細胞。
文檔編號C12N15/85GK101538585SQ200910036928
公開日2009年9月23日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月23日
發明者榮 周, 張芃偉, 濤 彭 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院;廣州華銀醫藥科技有限公司