專利名稱：莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體及其表達方法和應用的制作方法
莫洛尼氏鼠白血病絲逆^^效錄其^ii^r棘應用
a^域
本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶 突變體及其表達方法和應用。
背f^
逆轉錄是逆轉錄病毒基因組RNA復制時，病毒RNA在逆轉錄酶催化下合 成DNA并整合到宿主細胞基因組中的過程。逆轉錄酶是此類病毒特有的酶類。 它行使了以下功能①依賴RNA或DNA為模板的DNA聚合作用；②鏈轉 換作用；③降解RNA - DNA雜合體中RNA的RNase H功能。因此逆轉錄酶 常用于cDNA文庫的構建。市場上莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus ,簡稱MMLV )逆轉錄酶的改造主要是針對酶的RNaseH部位 進行改造，以達到弱化對DNA-RNA雜和體中RNA的降解的功能。經過改 造后，這種酶可以逆轉錄出更長的單鏈DNA產物。由于MMLV逆轉錄酶在 合成DNA時會摻入錯誤堿基，造成了病毒基因組復制過程中的高突變率，因 此需要獲得具有保真功能的逆轉錄酶。對逆轉錄酶進行改造需要保證的是需 要其行使功能的活性部位保持原有的活性和特性，需要弱化的活性部位在改造 的同時確保不影響其它功能的實行。理論上，天然酶存在很大的可變性及存在 著改進的潛力，如 一個由IOO個氨基酸組成的酶，擁有20100次方不同序列 的可能性，顯然自然界是不可能存在所有序列相應的酶。同時，以如此龐大的 序列上的差異相應地必然會產生性質不同于現存的酶，也必然會存在某些方面的性質優越于天然的酶的新酶，這種序列上的可變性必然會體現在結構和功能 上。在了解催化機制的基礎上，人為的提高酶的催化效率是分子酶學工程的主
要目標，并由此創造出高催化效率的經濟實用的酶。過去20年，用定點突變 的技術，工程酶已經取得很大成績，幾乎所有結構與功能關系清楚的酶都被該 技術改進了。這是由于突變的定向性與取代殘基的可選擇性，對高級結構的干 擾性不影響或影響較小，檢驗手段的可靠性。這種方法可以明確指出酶分子中 的某個氨基酸殘基是否參與底物結合和催化，把從其它方法得出的候選活性部 位的可疑氨基酸殘基進一步驗證，得出可信的結論。
目前現有的MMLV逆轉錄酶晶體結構包括非催化狀態下含有DNA的全 長逆轉錄酶的晶體結構和催化狀態下不含DNA的逆轉錄酶N端的晶體結構， 因此在基于結構和機制的酶改造方面有一定的困難。HIV-1逆轉錄酶的結構 研究較多，已有催化狀態下含模板/引物、dNTP三重復合體的晶體結構。
發明內容
本發明的目的在于克服上述技術缺陷，提供一種莫洛尼氏鼠白血病病毒逆 轉錄酶的突變體，同時提供了該突變體的制備方法及其應用。 為實現本發明的目的，采用如下技術方案
將莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶的自N端第196位脯氨酸殘基取代為丙 氨酸的蛋白質。
所述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體具有如SEQ ID N0:1所述的 氨基酸序列。
本發明提供的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體的編碼基因具有如 SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。本發明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體的方法是將含莫洛尼氏 鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼基因的表達載體轉化到大腸桿菌中，培養陽
性克隆，表達得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體。
上述含有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼基因的表達載體為
具有如SEQ ID NO: 2所述的核苷酸序列的質粒pET-28a。 所述大腸桿菌為_Escfc7'c/z/a co// BL21 。
本發明還保護含有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼基因的表 達載體及莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼基因的宿主菌。
上述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體可應用在RNA合成中。 本發明的另 一個目的是提供一種表達莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶的 突變體的方法。
本發明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶改造所得到的逆轉錄酶的突變 體具有保真功能。
圖1為^fe^^的錯摻實驗結果圖； 圖2為##^@交的4賴^延伸實1^吉果圖。
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應 理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例l:活性狀態下含有模板-引物、 的MMLV逆轉錄酶結構模 型的構建及其結構分析構建含模板/引物及dNTP的結構模型目前現有的MMLV晶體結構包括含有 DNA的MMLV全長的晶體結構，此DNA遠離催化位點，以及催化狀態下不含 DNA的MMLV逆轉錄酶N端的晶體結構，因此在基于結構的酶功能改造方面有一 定的困難。HIV- l逆轉錄酶的結構研究較多，已有催化狀態下含模板/引物、dNTP 三重復合體的晶體結構。MMLV逆轉錄酶和HIV-l逆轉錄酶的結構高度同源， 我們結合fflV - l逆轉錄酶三重復合體(包括酶、模板-引物、dNTP)的晶體結 構(PDB (protein data bank)號lrtd)和催化狀態下MMLV逆轉錄酶N端的晶 體結構(PDB (protein data bank)號lmml)構建了活性狀態下含有模板 - 引 物、dNTP的MMLV逆轉錄酶結構模型。具體方法如下將HIV-l逆轉錄酶的第 6、 9和10條(3折疊以及第E和F條a螺旋的Ca原子與MMLV逆轉錄酶的第7、 lO和ll 條(3折疊以及第H和I條a螺旋的Ca原子重疊。通過GROMOS 96進行能量最小化， 使HIV - l逆轉錄酶的Ca原子的催化羧基與MMLV逆轉錄酶對應位置羧基的均 方才艮(root mean square,簡稱r.m.s )偏離小于0.3A。采用Swiss-PdbViwer和Insight II分子模擬軟件針對引物結合位點進行分析，模擬各類突變型逆轉錄酶，通過 AMBER 99力場分析進4亍迭代的最小化(iterative minimizations)直到能量變化 小于O.OOOl kcal/mol per A，預測第196位點氨基酸與MMLV逆轉錄酶保真性相 關。
實施例2:定存、^MMLV逆轉錄酶的196位脯氨酸(P)為丙氨酸(A) 定點突變MMLV逆轉錄酶(Genebank: AF033811 )的196位脯氨酸(P)
為丙氨酸(A)。采用融合PCR的方法進行。首先設計MMLV逆轉錄酶基因的
上下游引物RTUp和RTDown:
RTUp: 5， ATGCATATGACATGGCTGTCTGATTTT 3'RTDown: 5'ATTACTCGAGTTAGAGGAGGGTAGAGGTGTCTGGAGTC 3， 以及在突變位點設計引物196Up和196Down:
196Up 5 ，CCA CAG GGT TTC AAA AAC AGT GCC ACC CTG TTT 3' 196Down 5, AAA CAG GGT GGC ACT GTT TTT GAA ACC CTG TGG 3'
以RTUp和196Down作為引物，MMLV逆轉錄酶基因片段為模板擴增N 端DNA片段。然后以RTDown和196Up為引物擴增C端DNA片段。將PCR 擴增的N端和C端DNA片段分別回收后共同作為模板，同時利用RTup和 RTDown外向引物擴增突變的全長MMLV逆轉錄酶。
實施例3: MMLV逆轉錄酶突變體的表ii^化
克隆將MMLV突變型逆轉錄酶基因(P196A)純化后用Nde I/Xho I酶 切后克隆到pET-28a載體中，使得MMLV逆轉錄酶基因后加入His標簽，產 生pET-28a-RTP196A表達質粒。重組表達質粒經過測序鑒定正確。表達重 組表達質粒轉化至在E co/z'BL21。挑取單菌落37 。C培養至OD600值為0.6 時，用0.2mMIPTG誘導3小時，4200 rpm離心35分鐘，收集菌液，- 80 。C保存。純化用含10 mM咪唑的緩沖液I ( 50 mM NaH2P04 (pH 7.8)， 5% 甘油，0.3MNaCl)懸浮菌液，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml,冰上孵育30分鐘 裂解。裂解菌液35,000 rpm離心40分鐘。上清過鎳柱(Ni-NTA columns),用 含20 mM咪唑的緩沖液I洗柱兩次。再用含250 mM咪唑的緩沖液I洗脫蛋白， 收集蛋白，用濾器Amicon 30 centricons將緩沖液I更換成緩沖液II ( 200 mM NaCl， 50%甘油)。用Bradford法測定蛋白濃度。
實施例4: MMLV逆轉錄酶突變體的忠實性l定確定酶活性單位以poly(rA)-(dT)18為模板-引物，32P標記的dTTP為 底物進行反應。反應體系總體積為6pL,包括50 mM Tris HC1 (pH 8.0), 100 ^g/mL BSA， 5 mM MgCl2， 1 mM DTT， 50 mM KC1, 100nM模板-引物，100|tiM dTTP， 10 nM MMLV突變型逆轉錄酶和50pM 32P標記的dTTP (0.4 (iCi/nmol)。 反應在37 °C下孵育15min，加入6^iL上樣緩沖液終止反應，反應物在90。C 加熱5分鐘后進行1.4°/。瓊脂糖凝膠電泳，用X光片曝光。
單核苷酸的錯摻以24bp的單鏈DNA, 5' GCA CCG GCG CTC GAA CAGGGA CTG 3，，為模板；以"P標記的21bp的單鏈DNA， 3' GGC CGC GAG CTTGTC CCT GAC5'，為引物，進行單核苷酸的錯摻實驗。反應體系為2.5 nM 才莫4反/引物，50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1 mM DTT, 0.01% BSA， 60 mM KC1， 5 mMMgCl2，和500pMdATP，至總體積5pL。反應在25。C進行30 min后，加 入5pl上樣緩沖液終止反應。反應物通過12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后， 用X光片曝光。圖1為單核苷酸的錯摻的實驗結果圖，由圖l可見，196突變 酶和野生型酶摻入錯誤堿基的能力相似。
3，單核香酸的錯配后延伸以24bp的單鏈DNA， 5，GCACCG GCG CTC GAACAG GGA CTG 3，，為模板；以32P標記的21bp的單鏈DNA， 3,CGC CGC GAGCTTGTCCCTGAC5，為引物，進行單核苷酸的錯配后延伸實驗。反應體 系為2.5 nM模板/引物，50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1 mM DTT, 0.01% BSA, 60 mM KC1， 5 mM MgCl2，和500 pM dATP或dTTP,至總體積5 pL。反應在25°C 進行30min后，加入5pl上樣緩沖液終止反應。反應物通過12%的變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳后，用X光片曝光。圖2顯示為單核苷酸錯配后延伸的實驗結 果圖，圖2中，1、 2為野生型酶，3、 4為193突變酶，5、 6為196突變酶。以dATP為底物進行反應(1、 3、 5、)，或以觀察dTTP為底物進行反應產物 (2、 4、 6、)。可以觀察到錯配后野生型酶可以一定程度延伸；193突變酶可 以繼續延伸，因而可以在才莫板上插入突變；196突變酶幾乎不能延伸，較難在 模板上插入突變。由此看來196突變酶比野生型具有更高的保真性。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本 發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發明技術方案的實質和范圍。序列表
<120> 莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體及其表達方法和應用 < 170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 672 <212〉 PRT
<213 > Moloney Murine Leukemia Virus <400> 1
Thr Leu Asn lie Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu 15 10 15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gin Ala 20 25 30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gin Ala Pro Leu
35 40 45
lie lie Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser lie Lys Gin Tyr
50 55 60
Pro Met Ser Gin Glu Ala Arg Leu Gly He Lys Pro His lie Gin Arg 65 70 75 80
Leu Leu Asp Gin Gly lie Leu Val Pro Cys Gin Ser Pro Trp Asn Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val 100 105 110
Gin Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp lie His Pro Thr115 120 125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gin
130 135 140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu 145 150 155 160
His Pro Thr Ser Gin Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly lie Ser Gly Gin Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gin Gly Phe 180 185 190
Lys Asn Ser Ala Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
195 200 205
Asp Phe Arg lie Gin His Pro Asp Leu lie Leu Leu Gin Tyr Val Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gin Gin Gly Thr 225 230 235 240
Arg Ala Leu Leu Gin Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Ala Gin lie Cys Gin Lys Gin Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu 260 265 270
Leu Lys Glu Gly Gin Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val
275 280 285
Met Gly Gin Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gin Leu Arg Glu Phe Leu 290 295 300Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp lie Pro Gly Phe Ala Glu Met
305 310 315 320
Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp
325 330 335
Gly Pro Asp Gin Gin Lys Ala Tyr Gin Glu lie Lys Gin Ala Leu Leu 340 345 350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
355 360 365
Phe Val Asp Glu Lys Gin Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gin Lys
370 375 380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp 385 390 395 400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala lie
405 410 415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gin Pro Leu 420 425 430
Val lie Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gin Pro Pro
435 440 445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gin Ala Leu Leu
450 455 460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gin Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro 465 470 475 480
Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gin His Asn Cys Leu485 4卯 495
Asp lie Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gin 500 505 510
Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Tip Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Leu
515 520 525
Leu Gin Glu Gly Gin Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr
530 535 540
Glu Val lie Tip Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gin Arg 545 550 555 560
Ala Glu Leu lie Ala Leu Thr Gin Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys
565 570 575
Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His 580 585 590
lie His Gly Glu lie Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
595 600 605
Lys Glu lie Lys Asn Lys Asp Glu lie Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
610 615 620
Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser lie lie His Cys Pro Gly His Gin Lys 625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gin Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala lie Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu lie
660 665 670<120> 莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體及其表達方法和應用
< 170〉 Patentln version 3.2
<210> 2
<211> 2016
<212> DNA
<213> Moloney Murine Leukemia Virus
<400> 2
accctaaata tagaagatga gcatcggcta catgagacct caaaagagcc agatgtttct60
ctagggtcca catggctgtc tgattttcct caggcctggg cggaaaccgg gggcatggga120
ctggcsgttc gccaagctcc tctgatcata cctctg犯ag caacctctac ccccgtgtcc180
ataaaacaat accccatgtc acaagaagcc agactgggga tcaagcccca catacagaga240
ctgttggacc agggaatect ggtaccctgc cagtccccct ggaacEicgcc cctgcteccc300
gttaagaaac cagggactaa tgattatagg cctgtccagg atctgagaga agtcaacaag360
cgggtggaag acatccaccc caccgtgccc sacccttaca acctcttgag cgggctccca420
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caccccacca gtcagcctct cttcgccttt gagtggagag atccagagat gggaatctca540
ggacaattga cctggaccag actcccacag ggtttcaaaa acagtgccac cctgtttgat600
gaggcactgc acagagacct agcagacttc cggatccagc acccagactt gatcctgcta660
cagtacgtgg atgacttact gctggccgcc acttctgagc tagactgcca acaaggtact720
cgggccctgt tacaaaccct agggaacctc gggtatcggg cctcggccaa gaaagcccaa780
atttgccaga aacaggtcaa gtatctgggg tatcttctaa aagagggtca gagatggctg840
actgaggcca gaaaagagac tgtgatgggg cagcctactc cgaagacccc tcgacaacta卯Oagggagttcc tagggacggc aggcttctgt cgcctctgga tccctgggtt tgcagaaatg 960
gcagccccct tgtaccctct caccaaaacg gggactctgt ttaattgggg cccagaccaa 1020
caaaaggcct atcaagaaat caagcaagct cttctaactg ccccagccct ggggttgcca 1080
gatttgacta agccctttga actctttgtc gacgagaagc agggctacgc caaaggtgtc 1140
ctaacgcaaa aactgggacc ttggcgtcgg ccggtggcct acctgtccaa aaagctagac 1200
ccagtagcag ctgggtggcc cccttgccta cggatggtag cagccattgc cgtactgaca 1260
aaggatgcag gcaagctaac catgggacag ccactagtca ttctggcccc ccatgcagta 1320
gaggcactag tcaaacaacc ccccgaccgc tggctttcca acgcccggat gactcactat 1380
caggccttgc ttttggacac ggaccgggtc cagttcggac cggtggtagc cctgaacccg 1440 gctacgctgc tcccactgcc tgaggaaggg ctgcaacaca actgccttga tatcctggcc 1500 g￡iagcccacg gaacccgacc cgacctaacg gaccagccgc tcccagacgc cgaccacacc 1560
tggtacacgg atggaagcag tctcttacaa gagggacagc gtaaggcggg agctgcggtg 1620 accaccgaga ccgaggtaat ctgggctaaa gccctgccag ccgggacatc cgctcagcgg 1680
gctgaactga tagcactcac ccaggcccta aagatggcag aaggtaagaa gctaaatgtt 1740
tatactgata gccgttatgc ttttgctact gcccatatcc atggagaaat atacagaagg 1800 cgtgggttgc tcacatcaga aggcaaagag atcaaaaata aagacgagat cttggcccta 1860 ctaaaagccc tctttctgcc caaaagactt agcataatcc attgtccagg acatcaaaag 1920 ggacacagcg ccgaggctag aggc犯ccgg atggctgacc aagcggcccg犯aggcagcc 1980 atcacagaga ctccagacac ctctaccctc ctcatEi 201權利要求
1、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體，其特征在于，是將莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶的自N端第196位脯氨酸殘基取代為丙氨酸的蛋白質。
2、 根據權利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體，其特征 在于，所述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體具有如SEQ ID NO:l所述的 氨基 酸序列。
3、 權利要求1或2所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體的編碼基因。
4、 根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于，所述的編碼基因具有如 SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。
5、 一種表達權利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體的方 法，其特征在于，將含有權利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突 變體編碼基因的表達載體轉化到大腸桿菌中，培養陽性克隆，表達得到莫洛尼 氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有權利要求l所述的 莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼基因的表達載體為具有如SEQ ID NO: 2所述的核苷酸序列的質粒pET-28a。
7、 根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為Esc/2en'cWa co// BL21。
8、 含有權利要求3或4所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼 基因的表達載體。
9、 含有權利要求3或4所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼 基因的宿主菌。
10、 權利要求1或2所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體在合成 RNA中的應用。
全文摘要
本發明提供一種莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶的突變體及其制備方法和應用。該突變體為將莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶的自N端第196位脯氨酸殘基取代為丙氨酸的蛋白質。本發明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體的方法是將含莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體編碼基因的表達載體轉化到大腸桿菌中，培養陽性克隆，表達得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體。該突變體可應用在RNA合成中。本發明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶改造所得到的逆轉錄酶的突變體具有保真功能。
文檔編號C12N9/00GK101613680SQ200910036929
公開日2009年12月30日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月23日
發明者榮 周, 張芃偉, 濤 彭 申請人:廣州華銀醫藥科技有限公司;中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院