專利名稱：：一種過氧化物酶固定化效果的評價方法
技術領域：
：本發明涉及酶工程，具體涉及一種過氧化物酶固定化效果的評價方法。
背景技術：
：固定化酶，就是將酶分子結合在特定的支持物上且不影響酶的功能。用于固定酶的底物有瓊脂糖、丙烯酰胺、藻酸鈉等。固定化酶技術的應用，實現了酶制劑的循環反復使用。目前，評價酶固定化效果的方法大多采用直接測定方法，如光度法。這種方法大多是通過檢測酶催化反應得到的有色物質的多少，來反映固定化酶酶活的高低。然而，由于酶固定化載體大多為多孔性物質，對有色物質有吸附作用，所以使用這種方法對固定化酶固定化效果進行評價的結果不準確。
發明內容本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種過氧化物酶固定化效果的評價方法。本發明的過氧化物酶固定化效果的評價方法包括下列步驟-1)過氧化物酶固定化取過氧化物酶酶液，將其固定于固定化載體上，固定化反應完成后，檢測未固定上的殘留酶液的過氧化物酶總酶活；2)取與步驟1)來源相同的過氧化物酶酶液，以相同體積的該過氧化物酶酶液作為參比，除不使用固定化載體外，與步驟1)采用完全相同的固定化反應條件同步進行固定化反應，在與步驟1)經歷相同的固定化反應時間后，檢測參比的過氧化物酶總酶活；3)計算步驟1)獲得的殘留酶液的總酶活與步驟2)獲得的參比的總酶活的比例得到殘余酶活比例。所述固定化載體可為各種常規的固定化載體，如強酸性陽離子樹脂、弱酸性陽離子樹脂、強堿性陰離子樹脂、弱堿性陰離子樹脂等。所述步驟l)中的殘留酶液是指固定化反應完成后的酶液。所述固定化反應條件可為各種固定化反應條件，如將過氧化物酶酶液與固定化載體按3ml:lg的比例混合，在30。C及緩沖液存在的條件下；一起攪拌固定65min。步驟2)與步驟l)采用完全相同的固定化反應條件是指固定化反應的溫度、攪拌速度、固定時間及緩沖液的選取等除不添加固定化載體外，兩者的步驟完全一致。步驟l)和2)中，過氧化物酶總酶活的檢測方法為在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，以仏02和鄰苯二胺為底物，檢測加入一定體積的酶液后，在430nm波長下，混合物OD值隨時間的增加，以每分鐘0D變化1定義為一個酶活力單位，以下列公式計算獲得過氧化物酶酶活其中，E:過氧化物酶活力，D二酶液的稀釋倍數，K^反應時間為橫坐標作出的OD與時間曲線最初的直線部分的斜率K，VHt測5反應中加入的酶液體積。具體的，可采用以下體系在比色皿中加2.7ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入0.lml鄰苯二胺——乙醇溶液和0.2mlH202溶液，預熱分光光度計，以此為空白調零。放樣品的比色皿中加2.6ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其他同空白，加入0.1ml酶液，攪拌均勻。在430nm波長下，測定混合物OD值隨時間的增加，每分鐘OD變化1定義為一個酶活力單位。以OD為縱坐標，反應時間為橫坐標作出的OD與時間曲線最初的直線部分的斜率K，根據公式^^^T("^)可計算出過氧化物酶的活力，E:過氧化物酶活力(U/ml)，D二酶液的稀釋倍數，K-反應時間為橫坐標作出的OD與時間曲線最初的直線部分的斜率K，1)=國際酶活單位(l(T6mol/min)。步驟3)中，殘余酶活比例越小，固定化效果越好。反之，固定化效果差。本發明的方法可用于篩選過氧化物酶固定化的優化條件。進一步的，篩選獲得的H型陽離子交換樹脂固定過氧化物酶的最優條件為PH4.8;以檸檬酸-檸檬酸三鈉為緩沖液；緩沖液離子強度0.24;固定時酶液酶活14U/ml;固定時樹脂與酶液比例為1g:3ml。本發明的評價方法為間接方法，測定固定化過程中剩余的酶液酶活，以及與固定化過程經歷相同過程，且與固定化過程中相同體積的過氧化物酶粗酶液的酶活(總酶活)，利用計算固定化后上層的剩余酶液酶活和做為參比的總酶液的酶活比例來評價固定化酶固定化效果，該比例小者說明固定到載體上的酶液量多即固定化效果好；反之，固定化效果差。本發明的方法必須保證測定過氧化物酶酶液酶活的準確性，以及作為參比的酶液要與固定化用酶液經歷相同的過程，以便排除干擾，減小誤差。從而保證該評價方法的準確性、可靠性。本發明的有益效果是本發明的方法克服了由于直接測定固定化酶酶活，產物大多為有色物質，易被固定化載體吸附的缺點，結果的可靠性更高，適用于對固定化酶固定化效果進行評價。具體實施例方式以下列舉具體實例以進一步闡述本發明，應理解，實例并非用于限制本發明的保護范圍。本發明適用于固定化過氧化物酶效果的評價方法，其特點是利用計算固定化后未固定上的剩余酶液酶活與做為參比的總酶酶液活比例。具體評價方法為1、酶液的提取本實施例中蔬菜(巻心菜)原料按1:1的比例加入pH中性的緩沖液，進行組織破碎、定性濾紙過濾分離得過氧化物酶粗酶液；2、酶的固定化及固定化效果評價將過濾分離得到的過氧化物酶粗酶液與預處理好的H型陽離子交換樹脂一起磁力攪拌固定65min后，分別測定固定化后未固定上的剩余酶液酶活和做為參比的總酶液，并計算上述兩種酶活比例。固定完并測定出上層殘留酶液后用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于保護液中待用。實施例1:稱取預處理過的C150S樹脂質量3倍的巻心菜過氧化物酶粗酶液(10U/ml)，分別置于兩個125ml廣口瓶中。其中一個用于固定化，其內裝有預處理過的樹脂；另一個作為參比，兩個廣口瓶中過氧化物酶粗酶液經歷相同的過程。其具體操作條件如下固定時溫度溫度30°C;固定時水浴搖床轉數150r/min;固定緩沖pH5.00.025M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；固定化時間65min固定完后，準確測定固定化后殘余酶液酶活及做參比用總酶活，計算出兩種酶活比例。改變其中固定化條件，其他條件不變，同樣方法計算固定化后殘余酶活比例，則殘留酶活比例較低者固定化效果較好，認為為巻心菜過氧化物酶的最優固定化條件。分別選取不同的PH、緩沖離子強度、緩沖種類、固定時酶液酶活、固定時酶液與樹脂比例(ml:g)固定，固定完后分別測定殘余過氧化物酶酶活以及作為參比的總酶活，求得殘余酶活比例。測定巻心菜過氧化物酶酶活方法在比色皿中加2.7ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入0.1ml鄰苯二胺——乙醇溶液和0.2mlH202溶液，預熱分光光度計，以此為空白調零。放樣品的比色皿中加2.6ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其他同空白，加入O.lml酶液，攪拌均勻。在430nm波長下，測定混合物OD值隨時間的增加。按以上方法進行巻心菜過氧化物酶酶活測定，并求得殘余酶活比例，選取殘余酶活比例小者為最優固定化條件(結果如下表所示)，最優固定化條件為PH4.8;緩沖種類檸檬酸-檸檬酸三鈉；緩沖液離子強度0.24;固定時酶液酶活14U/ml;固定時樹脂與酶液比例(g:ml)1:3。過氧化物酶固定化條件的優化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>固定時酶液酶活10U14U18U殘余酶活比例0.05630.01420.0383注以上表中除選定因素外，其他因素條件保持一致10權利要求1、一種過氧化物酶固定化效果的評價方法包括下列步驟a、過氧化物酶固定化取過氧化物酶酶液，將其固定于固定化載體上，固定化反應完成后，檢測未固定上的殘留酶液的過氧化物酶總酶活；b、取與步驟a來源相同的過氧化物酶酶液，以相同體積的該過氧化物酶酶液作為參比，除不使用固定化載體外，與步驟a采用完全相同的固定化反應條件同步進行固定化反應，在與步驟a經歷相同的固定化反應時間后，檢測參比的過氧化物酶總酶活；c、計算步驟a獲得的殘留酶液的總酶活與步驟b獲得的參比的總酶活的比例得到殘余酶活比例。2、如權利要求1所述過氧化物酶固定化效果的評價方法，其特征在于，步驟a和b中，過氧化物酶總酶活的檢測方法為在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，以&02和鄰苯二胺為底物，檢測加入一定體積的酶液后，在430nm波長下，混合物OD值隨時間的增加，以每分鐘OD變化1定義為一個酶活力單位，以下列公式計算獲得過氧化物酶酶活其中，E為過氧化物酶活力，D為酶液的稀釋倍數，K為反應時間為橫坐標作出的OD與時間曲線最初的直線部分的斜率K，V為檢測反應中加入的酶液的體積。3、如權利要求1或2所述過氧化物酶固定化效果的評價方法，其特征在于，以步驟c中，殘余酶活比例越小，固定化效果越好。4、如權利要求1-3所述任一過氧化物酶固定化效果的評價方法用于篩選過氧化物酶固定化的優化條件。全文摘要本發明公開了一種過氧化物酶固定化效果的評價方法，該評價方法為間接方法，通過測定固定完后上層殘留酶液與作為參比的總酶活的比例對酶固定化效果進行評價，從而克服了直接測定過氧化物酶催化產物，由于過氧化物酶催化的產物大多為有色物質，易被固定化載體吸附而造成結果的不準確的缺點，結果的可靠性更高，適用于對固定化酶固定化效果進行評價。文檔編號C12Q1/28GK101603074SQ20091005473公開日2009年12月16日申請日期2009年7月14日優先權日2009年7月14日發明者斐徐,李學輝,李思超,章海鵬申請人:上海理工大學