siRNA、互補寡聚DNA、PGC-1抑制劑、其制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體涉及W植物siRNA發生器為基礎的PGC-1抑制劑、 其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 過氧化物酶體增殖物激活受體Y協同激活子1 (PGC-1、PGC-1 α或PPARGC1) 在1998年作為PPARY的轉錄輔助激活因子首次在小鼠體內發現，隨后，人類和大鼠的 PGC-1 α基因也分別于1999年和2000年成功被克隆。PGC-1包括PGC-1 α、PGC-1目、PGC-1 相關輔助激活子（PCR)等3個家族成員，在哺乳動物間均具有相對保守的結構特點。
[0003] PGC-1主要分布于必、肝、腎、骨骼肌及蹤色脂肪等組織；必臟中表達最高，其次是 肌肉和肝臟，在腎臟、蹤色脂肪等有高能量需求或適應性產熱作用的組織中表達水平也相 當高。PGC-1與多種核激素受體及其他轉錄因子相互作用，調節其下游核受體控制的祀基因 的轉錄起始、RNA加工等環節，從而多方面介導目的基因的轉錄激活，進而廣泛參與糖代謝、 脂代謝、能量代謝，并參與多種代謝通路的調節活動，如機體適應性產熱、線粒體生物合成、 脂肪酸目氧化、肌肉中葡萄糖轉運、骨骼肌纖維類型轉換、肝糖異生代謝等生理活動。
[0004] 人類PGC-1氨基酸序列與猩猩同源性為99%，與大鼠、小鼠、兔、馬同源性為95%， 由798個氨基酸組成，分子量為91ku。PGC-1基因定位于人染色體4pl5. 1，全長67化，包含 13個外顯子和12個內含子，其開放讀碼框的pen reading化ame，0RF)含2394個核巧酸， 其中，第6號外顯子最小，包含46個核巧酸，8號外顯子最大，包含916個核巧酸。由于尾部 多聚腺巧酸信號的不同，PGC-1存在兩種mRNA轉錄本，長度分別為6. 4化和5. 3化。
[000引 PGC-1包括PGC-1 α、PGC-1目、PGC-1相關輔助激活子（PRC)等3個家族成員， 通常所說的PGC-1是指PGC-lct。PGC-1在斑馬魚、爪耀、哺乳動物間均具有相對保守 的結構特點；其蛋白多膚的N末端為含有LXX化基序的轉錄激活域，及一個雙向核定位 信號度ipartite nuclear localization si即al), LXXIX基序化為亮氨酸，X為其它 氨基酸）可與某些核受體的特定區域結合，調控基因表達；C末端則為RNA加工域，包 括一個RNA識別基序（RNA-binding motif, RMM)和富含絲氨酸/精氨般的SR結構域 (Serine-arginine-rich domain),可與有關祀基因啟動子結合，參與新轉錄的mRNA的加 工處理過程，二者同時存在于一個分子中，是PGC-1的結構特征，在轉錄激活域和RNA加工 域之間存在一個抑制域，含有3個保守的蛋白激酶A(Protein kinase Α,ΡΚΑ)作用的磯 酸化位點，當體內cAMP濃度升高時，它們能被Ρ38ΜΡΚ磯酸化，從而增強PGC-1介導的轉 錄激活作用；此外，PGC-1分子中還存在與PPARY、核呼吸因子（NRF1、2)、線粒體轉錄因子 (mtTFA)、雌激素受體（邸α )及肌細胞增強子（MEF2C)等結合的位點。PGC-1未與轉錄因子 結合前活性很低，結合后，活性可大大提高。
[0006] 影響PGC-1表達的因素有很多，如環境、飲食、鍛煉及膜島素、瘦素等物質。在前 述組織中，PGC-1受不同信號誘導而表達上調，如寒冷刺激能誘導蹤色脂肪組織和骨骼肌中 PGC-1表達增加，禁食可誘導肝臟PGC-1表達上調，而骨骼肌還可能因耐力鍛煉使PGC-1表 達增加。PGC-1表達涉及轉錄及翻譯后調節。PGC-1啟動子及上游區域序列中含有膜島素應 答序列（IRSs)、cAMP應答元件（CR巧及Μ邸2c結合一致序列等結構域，在不同生理條件下， 分別與叉頭轉錄因子（ForWiead homologuein rh油domyosarcoma, FKHR)cAMP應答兀件結 合蛋白（CREB)、肌細胞增強因子2(MEF2c)等轉錄因子結合后，通過不同機制調控PGC-Ια 表達，其中轉錄水平的調控主要有肌細胞增強子2c/組蛋白去己醜酶（MEF2c/HDACs)調節 通路、P13K-P邸-FKHR調節通路和CREB/CRE調節通路。
[0007] PGC-1作為核輔激活因子，基于其核巧酸和氨基酸序列的特點，通過多種機制發 揮作用。根據不同的作用方式，PGC-1與多種核激素受體及其他轉錄因子相互作用，調節 其下游核受體控制的祀基因的轉錄起始、RNA加工等環節，從多方面介導目的基因的轉錄 激活，從而廣泛參與糖代謝、脂代謝、能量代謝W及骨骼肌纖維類型決定等多種代謝通路的 調節活動，如機體適應性產熱、線粒體生物合成、脂肪酸β氧化、肌肉中葡萄糖轉運、骨骼 肌纖維類型轉換、肝糖異生代謝等生理活動；送些作用主要是通過協同激活多種轉錄因子 女口 PPARY、NRF1、MEF2C、（GLUT-4)完成。如PGC-1協同PPARY轉錄因子調控線粒體脂肪 酸氧化過程中關鍵酶的表達，從而調節脂肪酸的目氧化；糖皮質激素受體及肝細胞核因子 (ΗΝΤ4 α )在被PGC-1輔助激活后，可激活糖異生關鍵酶組如PEPCK等，促進肝糖異生導致 肝糖輸出；PGC-1結合并協同刺激MEF2C可使化UT4表達明顯增加，促使葡萄糖轉運能力提 局。
[0008] 在肥胖或者糖尿病等病理狀態下，肝臟PGC-1 α表達異常增高，激活糖異生關鍵 酶，使肝糖輸出增加，空腹血糖升高，在肝臟膜島素抵抗（IR)的形成中發揮重要作用，因 此，在送些病理狀態下，目的性地下調患者的PGC-1表達水平變的十分有必要。
[0009] 小干擾核糖核酸（siRNA)是一類由20多個核巧酸組成的雙鏈RNA分子，可W通過 特異性降解祀基因的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)起到沉默基因表達的作用，送一 過程被稱為RNA干擾（RNA interference, RNAi)，在基因調控和生長發育等方面發揮著重 要作用。
[0010] RNA干擾（RNAi)是一種抗病毒機制。它是由dsRNA介導的序列特異性的同源基因 的轉錄后的基因沉默，在細胞內有效作用方式為siRNA。RNA干擾可W利用siRNA或siRNA 表達載體特異地沉默祀基因，此方式快速、經濟、簡便，且具有高度的序列專一性，可W獲得 功能喪失或減低突變序列特異方式剔除目的基因表達，成為探索基因功能的重要研究手 段。大量實驗證明，RNAi現象廣泛存在于生物界中，是生物抵御病毒侵染和阻斷轉座子的 古老防御機制之一。隨著研究的不斷深入，RNAi的機制正在被逐步闡明，而同時作為功能 基因組和基因治療研究中的有效工具，RNAi也越來越為人們所重視。
[0011] 然而，目前市面上特異性針對PGC-1治療的抑制劑還很少見，并且許多抑制劑的 抑制效果及副作用尚不明確。利用RNAi技術可W針對PGC-1的特定基因序列設計產生特 定的siRNA，用于特異性的抑制PGC-1基因的表達，從而降低PGC-1的表達水平，緩解PGC-1 過表達引起的癥狀。但是一般情況下生產siRNA都處于試驗階段，規模很小，難W用于大規 模的提取和使用。
【發明內容】
[0012] 為有助于理解本發明，下面定義了一些術語。除非另外說明，本文所出現的術語具 有本發明相關領域的普通技術人員通常理解的含義。具體地：
[0013] 除非另外指出，本文中所述的"PGC-1"是指過氧化物酶體增殖物激活受體Y協同 激活子1，也稱PGC-1 α或PPARGC1。
[0014] 除非另外指出，本文中所述的"Α549細胞"是指人肺癌上皮細胞。
[001引除非另外指出，本文中所述的"Α549基因組DNA"是指人肺癌上皮細胞的基因組 DNA，實驗中未使用癌細胞所有基因組的序列進行設計，Α549是人肺腺癌細胞，實驗中設計 的siRNA針對的是癌細胞中PGC-1基因序列，因此只涉及到PGC-1基因序列，PGC-1基因序 列 ACCESSION:AF106698。
[001引除非另外指出，本文中所述的"Oligo DM"即短鏈DNA，寡核巧酸， oligoribonucleotide。
[0017] 針對前述現有技術中存在的問題，本發明人棍奇地發現，利用基因工程植物生產 PGC-1基因的SiRNA抑制劑，其成本低，來源為天然成分，無化學污染，通過植物生產PGC-1 基因的SiRNA抑制劑方法簡便，有利于批量生產和采集。
[001引因此，本發明的的一個目的是提供一種用于抑制PGC-1基因的SiRNA。本發明的 另一個目的是提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的互補寡聚DNA。本發明的另一個目的 是提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的重組表達載體質粒。本發明的另一個目的是提供 用于制備PGC-1基因抑制劑的農桿菌。本發明的另一個目的是提供一種用于制備PGC-1抑 制基因重組真核表達載體質粒的方法。本發明的另一個目的是提供一種用于制備PGC-1基 因抑制劑的脂質體。本發明的另一個目的是提供一種通過植物制備PGC-1基因抑制劑的方 法。本發明的另一個目的是提供一種PGC-1抑制劑。本發明的還一個目的是提供如前所述 的siRNA和/或如前所述的互補寡聚DNA的用途。
[0019] 本發明的上述發明目的是通過W下技術方案實現的：
[0020] -方面，本發明提供一種用于抑制PGC-1基因的SiRNA,所述SiRNA具有如下所示 的核巧酸序列：
[0021] 正義鏈；5'-。邑日州雌邑日11日。日邑日。日邑。44-3';
[0022] 反義鏈；5' -AAgcugaaccuaugucugucg-3'。
[0023] 另一方面，本發明提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的互補寡聚DNA，所述互補 寡聚DNA具有如下（I)或（II)任意之一所示的核巧酸序列：
[0030] 另一方面，本發明提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的互補寡聚DNA，所述互補 寡聚DNA具有如下（III)或（IV)任意之一所示的核巧酸序列：
[0031] 反義祀序列 正義祀序列
[0032] 5' -AGCTgctgaacctatgtctgtc^CAAGAGcgacttggatacagacagcAA-3'〇
[0033] (III)
[0034] 反義祀序列 正義祀序列
[0035] 5' -AGCTgctgaacctatgtctgtcgCTCTTGAcgacttggatacagacagcAA-3'。
[0036] (IV)
[0037] 再一方面，本發明提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的重組表達載體質粒，所 述重組表達載體質粒可W產生如前所述的siRNA，優選地，所述質粒為PBI121。
[0038] 又一方面，本發明提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的農桿菌，所述農桿菌使 用如前所述的重組表達載體質粒直接轉化，優選地，所述農桿菌為根癌農桿菌。
[0039] 再一方面，本發明提供一種用于制備PGC-1抑制基因重組真核表達載體質粒的方 法，所述方法包括如下步驟；
[0040] (1)通過（ΙΠ )或（IV)所述的互補寡聚DNA經兩兩混合、退火，形成雙鏈DNA ;
[0041] (2)將步驟（1)退火得到的雙鏈DNA稀釋后，連接至真核表達質粒載體即制得所述 PGC-1抑制基因重組真核表達載體質粒；優選地，所述重組真核表達載體質粒是通過T4連 接酶與經過化ndlll酶切的PCDNA3. 1質粒室溫連接得到的重組PCDNA3. 1質粒。
[0042] 又一方面，本發明提供一種用于制備PGC-1基因抑制劑的脂質體，所述脂質體使 用如前所述的PGC-1抑制基因重組真核表達載體質粒制備。
[0043] 還一方面，本發明提供一種通過植物制備PGC-1基因抑制劑的方法，所述方法包 括如下步驟：
[0044] (1)針對P