專利名稱：：獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法及其專用引物。
背景技術：
：牡丹屬于芍藥屬的木本類群，是中國特有的傳統名花，素有"花王"之稱。傳統的雜交育種法周期長，無法早期篩選目標性狀，嚴重限制了培育新品種的速度。分子標記技術能夠將標記與植物性狀相聯系，為牡丹育種提供了一種新手段。利用DNA標記輔助選擇育種將給傳統的雜交育種帶來革命性的變化。傳統的育種選擇是對表型性狀的變異進行選擇，但有些重要性狀(如花色、花型等與觀賞品質密切相關的性狀)無法在早期檢測出來，分子標記技術就可以利用種子以及幼苗進行DNA多態性檢測，根據與目的基因相關的標記進行選擇，能提高選擇的準確度，縮短育種周期，提高育種效率和選擇的可靠性，相當簡便。簡單重復序列(simplesequencer印eat，SSR)標記是目前最常用的微衛星標記之一。SSR標記具有重復性好、多態性高、呈共顯性遺傳、數量豐富和遍布整個基因組等優點，廣泛應用于植物的遺傳圖譜構建、基因標定、標記輔助育種、品種鑒定、遺傳多樣性研究方面。為了有效利用牡丹的豐富資源，需要建立牡丹的SSR分子標記技術體系，并尋找牡丹的觀賞性狀與標記的關聯。
發明內容本發明涉及獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法及其專用引物。本發明提供了獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的專用引物，包括如下引物對甲序列表的序列1所示的DNA序列和序列表的序列3所示的DNA序列。所述專用引物還可包括如下引物對乙和/或引物對丙和/或引物對丁弓l物對乙序列表的序列2所示的DNA序列和序列表的序列3所示的DNA序列；弓l物對丙:序列表的序列1所示的DNA序列和序列表的序列4所示的DNA序列。弓l物對丁:序列表的序列2所示的DNA序列和序列表的序列4所示的DNA序列。本發明提供的獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法，可包括如下步驟1)提取牡丹的基因組咖A;2)以基因組DNA為模板，利用所述專用引物進行PCR擴增；3)將PCR擴增產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據電泳帶型確定與待測牡丹花型性狀相關的分子標記。步驟l)中，所述牡丹的基因組DNA可來自牡丹的任何器官，優選來自葉片，最優選來自幼嫩葉片。步驟2)中，所述PCR擴增中，退火溫度為53.5-57.4°C，循環數個數為32-36。步驟3)中，電泳采用4-6.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠。4-6.5%指的是凝膠濃度7X%),即凝膠溶液中單體丙烯酰胺和交聯劑^#^-亞甲基雙丙烯酰胺的總質量濃度。應用所述方法得到的分子標記也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護一種獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的試劑盒，含有所述專用引物。所述試劑盒還包括PCR反應的常規試劑、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的常規試劑和銀染的常規試劑；所述試劑盒優選包括聚丙烯酰胺、DNA聚合酶和Mg2+離子。所述專用引物或所述試劑盒在獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記中的應用也屬于本發明的保護范圍。應用本發明的專用引物對牡丹基因組進行PCR擴增，得到的電泳圖帶型清晰且具有多態性，在該位點得到ll個等位基因。使用單因素方差分析和相關分析，與牡丹花型有關的B類基因的第7個等位基因(375bp處)和花型關聯。單因素方差分析中P=0.027(顯著性水平小于0.05)。相關分析中的相關系數是0.296，P=0.027(顯著性水平小于0.05)。本發明提供的分子標記可以用于檢測牡丹的花型性狀，可以提高牡丹選擇育種的準確性和效率，縮短育種周期，為牡丹針對花型的育種提供了一種有效的方法。本發明通過一系列的優化步驟建立了牡丹的SSR分子標記技術體系，獲得了一個花型性狀和標記的關聯，為牡丹花型的育種提供了一種有效的方法，并且為牡丹連鎖遺傳圖譜構建、基因標定、品種鑒定、分子標記輔助育種奠定了技術基礎。圖1為1%瓊脂糖凝膠電泳圖a。牡丹樣本從左至右依次是卵葉牡丹、黃牡丹、紫牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹、狹葉牡丹、鳳丹、大花黃牡丹、'皇嘉門，、'太陽，、'島錦，、'海黃，、'金閣，、'白王獅子，、'芳紀，、'金島，、'寒桜獅子，、'初烏，、'紅冠玉配，、'中川粉，、'花和尚，、'火焰，、'藕斷絲連，、'喜慶，、'大瓣粉，、'輕羅，、'鳳丹，、'墊單2，、'墊重3，；M是100bpplusDNAladdermarker,從上到下依次為5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，購自北京全式金生物技術有限公司。圖2為1%瓊脂糖凝膠電泳圖b。牡丹樣本從左至右依次是'彭州太平紅'、'胭脂圖，、'雪蓮，、'黑花魁，、'琉璃貫珠，、'小葉紫，、'冠世墨玉，、'湖藍，、'富貴紅，、'青龍戲桃花，、'藍月，、'秀群芳，、'紅荷，、'水晶白，、'古城春色，、'少女裙，、'青龍鎮寶，、'黃麗，、'葵花紅，、'絲絨紅，、'五彩蝶，、'洛陽紅，、'首案紅，、'豆綠，、'姚黃，、'二喬，、'錦袍紅，；M是100bpplusDNAladdermarker,從上到下依次為5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，購自北京全式金生物技術有限公司。圖3為1%瓊脂糖凝膠電泳-大花黃牡丹、'海黃'。牡丹樣本從左至右依次是大花黃牡丹(引物對丙)、'海黃，(引物對丁)；M是100bpplusDNAladdermarker,購自北京全式金生物技術有限公司。圖4為1%瓊脂糖凝膠電泳-黃牡丹、'藕斷絲連'。牡丹樣本從左至右依次是黃牡丹(引物對乙)、黃牡丹(所用引物對丁)、'藕斷絲連，(引物對乙)、'藕斷絲連，(引物對丁)；M是100bpplusDNAladdermarker,購自北京全式金生物技術有限公司。圖5為56個牡丹樣本的電泳圖。牡丹樣本從左至右依次是'葵花紅'、'黃麗，、'青龍鎮寶，、'少女裙，、'古城春色，、'水晶白，、'紅荷，、'秀群芳，、'藍月，、'青龍戲桃花，、'富貴紅，、"湖藍，、'錦袍紅，、'二喬，、'姚黃'、<豆綠，、'首案紅，、'洛陽紅，、'五彩蝶，、'絲絨紅，、'冠世墨玉，、'小葉紫，、'琉璃貫珠，、'黑花魁，、'雪蓮，、'胭脂圖'、'彭州太平紅，、'墊重3號，、'墊單2號，、'鳳丹'、'輕羅'、'大瓣粉，、'喜慶，、'藕斷絲連，、'火焰，、'花和尚'、'中川粉，、'紅冠玉配，、'初烏，、'寒桜獅子，、'金島，、'芳紀，、'白王獅子，、'金閣，、'海黃，、'島錦，、'太陽，、'皇嘉門，、大花黃牡丹、楊山牡丹、狹葉牡丹、紫斑牡丹、矮牡丹、紫牡丹、黃牡丹、卵葉牡丹；M是pBR322DNA/ife/7marker(DNA片段從上到下依次是622bp，527bp，404bp，309bp，242bp,238bp,217bp，201bp，190bp，180bp，160bp，147bp，123bp，110bp，90bp，76bp，67bp，34bp，26bp)，購自天根生化科技(北京)有限公司。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。56個牡丹樣本為'葵花紅，、'黃麗，、'青龍鎮寶，、'少女裙，、'古城春色，、'水晶白，、'紅荷，、'秀群芳，、'藍月，、'青龍戲桃花，、'富貴紅，、"湖藍，、'錦袍紅'、'二喬，、'姚黃，、'豆綠，、'首案紅，、'洛陽紅，、'五彩蝶，、'絲絨紅，、'冠世墨玉，、'小葉紫，、'琉璃貫珠'、'黑花魁，、'雪蓮，、'胭脂圖，、'彭州太平紅，、'墊重3號，、'墊單2號，、'鳳丹，、'輕羅，、'大瓣粉，、'喜慶，、'藕斷絲連，、'火焰，、'花和尚，、'中川粉，、'紅冠玉配，、'初烏，、'寒桜獅子，、'金島，、'芳紀，、'白王獅子，、'金閣，、'海黃，、'島錦，、'太陽'、'皇嘉門，、大花黃牡丹、楊山牡丹、狹葉牡丹、紫斑牡丹、矮牡丹、紫牡丹、黃牡丹、卵葉牡丹。以上材料來自中國科學院植物研究所，以上牡丹種或品種在《中國牡丹品種圖志》(王蓮英主編，中國林業出版社出版，1997)或《中國牡丹品種圖志(西北、西南、江南巻)》(李嘉玨主編，中國林業出版社出版，2005)中均有記載。實施例l、與牡丹花型性狀相關的SSR標記的獲得一、候選引物的設計本發明人所在實驗室根據牡丹的B類MAD-box基因的DNA序列開發了如下引物正向引物l(序列表的序列l):CAAGAAGGTCAACAATAAAC;正向引物2(序列表的序列2):CAAGGAGGTCAACAATAAAC;反向引物l(序列表的序列3):CACAGAAGCCTCCATATTTT;反向引物2(序列表的序列4):CACAGAAGCCTCCATTTTTT。以上四條引物共有四種組合，所以定義四組引物對如下引物對甲正向引物l和反向引物l;引物對乙正向引物2和反向引物1;引物對丙正向引物l和反向引物2;引物對丁正向引物2和反向引物2。二、引物對的篩選在植株生長旺盛期將幼嫩葉片采下，自來水沖洗干凈，拭干備用提取總DNA。按照XiaoyanHanetal.(Biochem.Genet.2008，46:162-179)中的方法提取牡丹嫩葉中的總DNA。①使用引物對甲擴增56個牡丹樣本PCR反應體系(20PL):3PLDNA模板(10-50ng)、1PL正向引物(IOuM)、1叱反向引物(IOuM)、IO叱2XEasyTaqPCRSuperMix(不含染料)(購自北京全式金生物技術有限公司)、5.0叱ddH20。PCR的反應程序94。C進行5min，94。C進行30s，55.4。C進行30s，72。C進行lmin，共35個循環；72°(3進行10min;12。C終止反應。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖1和圖2。黃牡丹、大花黃牡丹、'海黃'、'藕斷絲連，擴增結果不理想，其它52個樣本都有比較理想的擴增產物。②使用其它引物對擴增牡丹樣本對步驟①中不能擴增出產物的牡丹樣本，分別選擇引物對乙、引物對丙、弓l物對丁進行擴增，反應體系同步驟①，反應程序同步驟①。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖3和圖4。大花黃牡丹用引物對丙，'海黃'用引物對丁，黃牡丹用引物對乙或引物對丁，'藕斷絲連'用引物對乙或引物對丁可以擴增出理想的產物。三、牡丹花型與標記的關聯在植株生長旺盛期將幼嫩葉片采下，自來水沖洗干凈，拭干備用提取總DNA。按照XiaoyanHanetal.(Biochem.Genet.2008，46:162-179)中的方法提取牡丹嫩葉中的總DNA。56個牡丹樣本進行PCR擴增，反應體系同步驟二的①，反應程序同步驟二的①。其中，黃牡丹、'海黃，和'藕斷絲連'在PCR擴增時所用的引物對為引物對丁；大花黃牡丹在PCR擴增時所用的引物對為引物對丙；其余52個樣本在PCR時所用引物對是引物對甲。擴增產物使用Bassam銀染法進行染色，具體步驟如下①將附著膠的長板放入固定液中，搖床上搖40min;②蒸餾水洗滌膠2-3次，每次2min，然后豎起控水15s;7③將膠板放入染色液中染色30min;④將染色后的膠板放入蒸餾水中洗2-3s，迅速撈出控水；④放入顯影液中，充分搖動，約3min后會出現帶；⑥撈出膠板放入終止液中，10min后取出；⑦放到蒸餾水中清洗，撈出膠板自然晾干。固定液(也是終止液)配方200ml的冰乙酸加到1.8L蒸餾水中，混勻。染色液配方2g硝酸銀溶于2L蒸餾水中，用時加入37。/。甲醛3ml，現用現配。顯影液配方160g十水碳酸鈉(或60g無水碳酸鈉)溶于2L蒸餾水中，提前配制，放入-2(TC冰箱待用。臨用前加入3ml的37y。甲醛和400ul的10mg/ml硫代硫酸鈉(現用現配)。實驗藥品來源冰乙酸購自北京化工廠，37%甲醛購自北京益利精細化學品有限公司，無水硫酸鈉和硫代硫酸鈉購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。附著在玻板上的膠晾干后，將膠板放在發出白色燈光的燈箱上，用數碼相機拍照，并進行條帶的統計。SSR分子量標記選用pBR322DNA/Jfep/。共計出現ll個等位基因。首先將質量性狀數量化，依據傳統的經典分類法，本實驗中的56個牡丹樣本分別屬于8個花型，根據花型從簡單到復雜的等級，分別賦值，見表l。然后根據帶型的有無，將56個樣本劃分到組1，組0。第7個等位基因(375bp條帶)的分析數據見表2，將表2的數據輸入SPSS中，進行單因素方差分析(One-WayANOVA)和相關分析(Bivariate)。表1牡丹花型賦值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2用于SPSS分析的數據樣本名花型組黃牡丹10紫牡丹10矮牡丹10紫斑牡丹10狹葉牡丹10楊山牡丹10大花黃牡丹10皇嘉門20太陽30島錦30海黃30金閣40白王獅子30芳紀20金島40寒桜獅子30初烏10紅冠玉配20中川粉20花和尚20藕斷絲連40喜慶20大瓣粉20輕羅30鳳丹10墊單220墊重380彭州太平紅80胭脂圖20黑花魁20小葉紫30湖藍30青龍戲桃花50藍月30紅荷20水晶白70少女裙30黃麗20<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果表明，該位點的第7個等位基因(375bp條帶)與花型相關聯，單因素方差分析中P^0.027(顯著性水平小于0.05)。相關分析中的相關系數是0.296,P=0.027(顯著性水平小于0.05)。實施例2、參數的優化以'冠世墨玉，為供試材料，進行參數的優化。一、PCR條件的優化1、退火溫度的優化在植株生長旺盛期將幼嫩葉片采下，自來水沖洗干凈，拭干備用提取總DNA。按照Xia。yanHanetal.(Biochem.Genet.2008,46:162-179)中的方法提取牡丹嫩葉中的總DNA。以總DNA為模板，用引物對甲進行PCR。分別選擇4個退火溫度(52.rC、53.5。C、55.4°C、57.4°C)進行退火溫度的優化。PCR反應體系(20叱)3PLDNA模板(10-50ng)、1叱正向引物(IOuM)、1叱反向引物(IOuM)、IO叱2XEasyTaqPCRSuperMix(不含染料)(購自北京全式金生物技術有限公司)、5.0叱ddH20。PCR的反應程序94'C進行5min，94'C進行30s，在預定的退火溫度下進行30s，72。C進行lmin，共35個循環；72。C進行10min;12。C終止反應。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。上樣量是IOPL(含2^6XLoadingbuffer,購自北京全式金生物技術有限公司)。電壓120V，電泳時間是45min。電泳緩沖液為1XTAE(每升50XTAE中242gTris堿，57.1mL冰醋酸，100mL0.5MEDTA，pH值為8.0)。結果表明55.4"C是最佳退火溫度。二、膠濃度的篩選在植株生長旺盛期將幼嫩葉片采下，自來水沖洗干凈，拭干備用提取總DNA。按照XiaoyanHanetal.(Biochem.Genet.2008，46:162-179)中的方法提取牡丹嫩葉中的總DNA。以總DNA為模板，用引物對甲進行PCR。PCR反應體系:3叱DNA模板(10-50ng)、1叱正引物(IOuM)、1ML反引物(10uM)、10ML2XEasyTaqPCRS叩erMix(不含染料)(購自北京全式金生物技術有限公司)、5.0MLddH20。PCR的反應程序94t:進行5min，94。C進行30s，55.4'C進行30s，72。C進行lmin，共35個循環；72。C進行10min;12。C終止反應。PCR產物在94t變性5min，然后在4-6.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠(設置三種聚丙烯酰胺凝膠濃度4%、5.5%、6.5%)上電泳。上樣量5PL(含2.5叱2X變性凝膠加樣緩沖液，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。聚丙烯酰胺膠的大小35cmX45cm,厚度是0.4mm。電泳條件是75W恒功率下預電泳40min，1500V下電泳1h30min，電泳緩沖液是1XTBE(5XTBE:445慮Tris-CL，445函硼酸，12mMEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉，調pH值為8.0)。結果表明，4-6.5%變性聚丙烯酰胺凝膠均可得到分辨率較高的電泳結果。11序列表〈110〉中國科學院植物研究所<120〉獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法及其專用引物<130〉CGGNARY92064〈160〉4<210>1<211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉<400〉1caagaaggtcaacaataaac20<210〉2<211〉20〈212>DNA<213>人工序列<220><223〉<400>2caaggaggtcaacaataaac20〈210〉3〈211〉20<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉<400>3cacagaagcctccatatttt20<210〉4<211〉20<212>■<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉4cacagaagcctccatttttt201權利要求1、一種獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的專用引物，包括如下引物對甲序列表的序列1所示的DNA和序列表的序列3所示的DNA。2、如權利要求l所述的專用引物，其特征在于所述專用引物還包括如下引物對乙和/或引物對丙和/或引物對丁引物對乙序列表的序列2所示的DNA和序列表的序列3所示的DNA;引物對丙序列表的序列1所示的DNA和序列表的序列4所示的DNA。引物對丁序列表的序列2所示的DNA和序列表的序列4所示的DNA。3、一種獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法，包括如下步驟1)提取牡丹的基因組DNA;2)以基因組DNA為模板，利用權利要求1或2所述的專用引物進行PCR擴增；3)將PCR擴增產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據電泳帶型確定與待測牡丹花型性狀相關的分子標記。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟l)中，所述牡丹的基因組DNA來自牡丹的任何器官，優選來自葉片；步驟2)中，所述PCR擴增中，退火溫度為53.5-57.4°C，循環數個數為32-36;步驟3)中，電泳采用4-6.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠。5、應用權利要求3或4所述方法得到的分子標記也屬于本發明的保護范圍。6、一種獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的試劑盒，含有權利要求1或2所述的專用引物。7、如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括PCR反應的常規試劑、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的常規試劑和Bassam銀染的常規試劑；所述試劑盒優選包括聚丙烯酰胺、DNA聚合酶和Mg2+離子。8、權利要求1或2所述專用引物在獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記中的應用。全文摘要本發明公開了一種獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的方法及其專用引物。本發明提供的獲取與牡丹花型性狀相關的分子標記的專用引物，包括如下引物對甲序列表的序列1所示的DNA序列和序列表的序列2所示的DNA序列。本發明提供的方法是應用所述專用引物對待測牡丹基因組DNA進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據電泳帶型確定與待測牡丹花型性狀相關的分子標記。本發明提供的分子標記可以用于檢測牡丹的花型性狀，可以提高牡丹選擇育種的準確性和效率，縮短育種周期，為牡丹針對花型的育種提供了一種有效的方法。文檔編號C12Q1/68GK101492742SQ200910077930公開日2009年7月29日申請日期2009年2月4日優先權日2009年2月4日發明者張晶晶,王亮生,舒慶艷申請人:中國科學院植物研究所