馬鈴薯抗低溫糖化分子標記組合及其在馬鈴薯抗低溫糖化育種中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學與遺傳育種領域，具體而言，設及馬鈴馨抗低溫糖化分子 標記組合及其在馬鈴馨抗低溫糖化育種中的應用。
【背景技術】
[0002] 馬鈴馨是（Solanum tuberrosum L.)世界第四大糧食作物，馬鈴馨加工在馬鈴馨 產業中占有重要地位，其中馨片馨條等馬鈴馨油炸加工產品因其食用方便和風味獨特備受 青睞，所占份額最大。但油炸加工對馬鈴馨塊莖品質的要求較高，除要求具有馨塊大、芽眼 淺、馨肉白色等外觀品質，更重要的是干物質含量需在20% W上，而且還原糖含量必須要低 于0.4% (鮮重）。如果塊莖中積累的還原糖含量過高，在加工時產生Millard反應，致使馨片 或馨條表面顏色變褐，有的甚至糊化，口感變苦，也會生成有潛在神經毒性和致癌性的丙締 酷胺，嚴重影響產品加工品質。
[0003] 而在馬鈴馨加工產業中，為延長加工時間，減少因膽藏期間塊莖失水皺縮、腐爛、 發芽等造成的原料損失，消除為抑制病蟲害施用化學藥劑而帶來的健康問題和環境危害， 通常采用低溫(<l〇°C)的條件來膽藏收獲后的馬鈴馨塊莖。但低溫膽藏會加速淀粉向還原 糖的轉化，造成還原糖含量的積累，但是運導致了馬鈴馨塊莖中還原糖的積累，即所謂的低 溫糖化，運正是絕大多是品種不適合加工的主要原因。
[0004] 低溫糖化是一個復雜的生理學和生物化學過程，既是植物低溫誘導的自然反應， 同時又存在廣泛的遺傳變異和復雜的基因調控。已有一些研究從控制低溫糖化代謝網絡相 關的遺傳基礎入手，力求掲示其遺傳機制。化en等(2001)利用一個馬鈴馨雙單倍體群體(2n = 24)，構建了第一個與馬鈴馨碳水化合物代謝相關的功能分子(moleculor-化nction)圖 譜，定位了設及69個相關基因的85個WL標記。隨后，Men自ndz等（2002)利用2個雙單倍體群 體，針對低溫糖化性狀篩選并定位了 26個WL標記。國內金黎平(2002)也利用二倍體群體， 通過AFLP和SSR標記進行了 WL定位，定位結果顯示，19個WL分別分布在3、6、8、12、13、14、 15和16號連鎖群上，解釋的表型變異幅度為5.50%-70%。在關聯分析方面，D'hoop(2002) 利用AFLP標記與馨片或馨條的色澤進行了相關分析，結果顯示，經過4°C膽藏后塊莖炸片色 澤相關標記位于馬鈴馨的1、6、7、8、9和12號染色體上，經過8°C膽藏后塊莖炸片色澤相關標 記位于馬鈴馨的1、2、4、5、6、9和10號染色體上，其中8°C和4°C膽藏后炸片色澤只有一個位 點相重疊。所有運些研究都顯示，馬鈴馨塊莖的低溫糖化是一個能穩定遺傳性狀，存在利用 分子標記輔助選擇的可能;但由于受多個遺傳位點控制，因此，通過類似與質量性狀的單個 分子標記很難達到理想的效果;再加上，馬鈴馨為同源四倍體作物，運將加大了常規選擇育 種的難度。因此，解析馬鈴馨低溫糖化的抗性遺傳機制，開發一組抗低溫糖化關聯的分子標 記組合，對多個控制低溫糖化的WL進行檢測，形成一個抗低溫糖化品系高效準確篩選方 法，將為馬鈴馨加工品種選育提供重要的技術支撐。
[0005] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一組馬鈴馨抗低溫糖化基因型篩選的分子標記組合，所述 的分子標記組合對馬鈴馨抗低溫糖化基因型的選育具有較高的準確性，為馬鈴馨抗低溫糖 化材料的鑒定提供了基礎，并建立用于抗低溫糖化育種分子標記輔助選擇體系。
[0007] 為了實現本發明的上述目的，特采用W下技術方案：
[000引馬鈴馨低溫糖化抗性的分子標記組合，所述分子標記為S3001-S3004核酸序列中 的任一種或多種；
[0009] S3001分子標記的上下游引物核酸序列如沈Q ID No.l和沈Q ID齡.2所示，53002 分子標記的上下游引物核酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，S3003分子標記的上 下游引物核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，S3004分子標記的上下游引物核酸 序列如沈Q ID No.7和沈Q ID No.8所示。
[0010] 其中，S3001和S3003分子標記位于馬鈴馨6號染色體，S3002分子標記位于馬鈴馨5 號染色體，S3004分子標記位于馬鈴馨7號染色體。
[0011] 本發明提供的馬鈴馨抗低溫糖化分子標記組合，運些分子標記通過對不同抗低溫 糖化能力的品種（系），進行相關分子標記多態性分析和低溫還原糖含量測定，并分析標記 和低溫糖化抗性之間的相關性，篩選得到用于建立抗低溫糖化育種分子標記輔助選擇體系 的分子標記組合，該分子標記組合對抗低溫糖化馬鈴馨基因型篩選具有較高的準確性，為 馬鈴馨低溫糖化抗性株系鑒定和抗低溫糖化育種提供了技術支持。
[0012] 本發明還提供了所述的馬鈴馨抗低溫糖化性分子標記獲得的方法，包括W下步 驟：
[0013] (a)、W母本邸25和父本CW2-1W及兩者雜交產生的后代作為材料；
[0014] (b)、提取材料的基因組DNA;
[0015] (C)、利用SSR分子標記、AFLP分子標記W及根據基因組序列設計的分子標記，得到 在親本之間具有多態性的引物，用于連鎖圖譜構建；
[0016] (d)、利用多態性引物對步驟(b)提取的兩者雜交產生后代的基因組DNA進行擴增， 結合低溫下塊莖還原糖含量測定測定結果，并進行互作分析，獲得馬鈴馨抗低溫糖化的 QTL，計算OTL間的加性與上位性效應，得到所述的馬鈴馨抗低溫糖化分子標記組合。
[0017] 本發明提供的馬鈴馨抗低溫糖化分子標記的篩選方法，W母本抓25和父本CW2-1 W及兩者雜交產生的后代作為材料，WSSR分子標記、AFLP分子標記W及根據基因組序列設 定的分子標記篩選馬鈴馨低溫糖化抗性的分子標記，進行候選基因多態性分析，同時對低 溫糖化抗性進行鑒定，進行候選基因標記和低溫糖化抗性之間的相關性分析，篩選得到用 于建立加工品質育種分子標記輔助選擇體系的分子標記組合，為馬鈴馨低溫糖化抗性育種 W及馬鈴馨的加工提供技術基礎。
[0018] 本發明還提供了一種馬鈴馨低溫糖化抗性的檢測方法，是W上述的引物對馬鈴馨 樣本的基因組提取物進行降落PCR擴增，分別對應得到S3001的PCR擴增產物、S3002的PCR擴 增產物、S3003的PCR擴增產物、S3004的PCR擴增產物；
[0019] S3001的PCR擴增產物和S3002的PCR擴增產物直接進行檢測，S3003的PCR擴增產物 先采用Alu I酶酶切，酶切產物再進行檢測，S3004的PCR擴增產物先采用Afa I酶酶切，酶切 產物然后進行檢測；
[0020] 各分子標記采用的降落PCR擴增程序依次為:95°C預變性3min;94°C變性30s，58°C 退火30s，72°C延伸Imin，循環11次，每次循環退火溫度降0.5°C;94°C變性30s，52°C退火 30s，72°C 延伸 60s，循環 33 次;72°C 延伸 5min;4-10°C 保存。
[0021] 本發明提供的一種檢測馬鈴馨低溫糖化抗性的方法，該方法選用上述分子標記對 待測樣品的基因組進行降落PCR擴增，經多次試驗驗證，采用上述降落PCR體系W及程序，擴 增特異性強，無明顯雜帶出現，得到的擴增片段易于檢測。由于分子標記為S3003和S3004 時，兩者PCR擴增得到的產物沒有多態性，因此，酶切后才能觀察到其多態性，W實現鑒定的 目的。最終通過觀察PCR擴增產物或PCR擴增產物酶切片段的多態性檢測來判斷馬鈴馨的低 溫糖化抗性，方便易行，為馬鈴馨低溫糖化分子標記輔助育種提供技術支持。
[0022] 為了得到的PCR擴增產物節約成本，易于觀察，且不產生其他干擾條帶，進一步地， 各分子標記的降落PCR體系均為15-2扣1;馬鈴馨樣本的基因組提取物在降落PCR體系中的 添加量為50ngW上；更優選的馬鈴馨樣本的基因組提取物在降落PCR體系中的添加量為 100-200ng。
[0023] 經試驗發現，由S3001分子標記、S3002分子標記、S3003分子標記和S3004分子標記 組成的標記組合具有更好的低溫糖化抗性，優選地，檢測馬鈴馨低溫糖化抗性采用的分子 標記組合為S3001分子標記、S3002分子標記、S3003分子標記和S3004分子標記。
[0024] 進一步地，檢測抗低溫糖化馬鈴馨基因型表現為S3001無目標帶，S3002分子標記、 S3003分子標記和S3004分子標記均有目標條帶。
[0025] 優選地，所述