專利名稱：：丙酮酸激酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種激酶，編碼該酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述激酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。更具體地，本發明涉及一種丙酮酸激酶，編碼該丙酮酸激酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述丙酮酸激酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。
背景技術：
：磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和二磷酸腺苷(ADP)在鉀離子依賴性丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)(EC2.7.1.40)作用下生成丙酮酸(Pyruvate)和三磷酸腺苷(ATP)，生成的丙酮酸和還原型輔酶I(NADH)在乳酸脫氫酶的作用下生成L-乳酸和氧化型輔酶I。具體反應如以下的式一和式二所示K+IP^l^^I^'I^^^^^^^JP^輕**，，，，《**響，輕，，鵬^^^^^^^^^'…"'l'…'j^^"J^]f^丙鋼酸激醇(PK)(式一)lt酸脫氮酶(LDH)丙簡酸鹽+NADH+H'———----------------—------乳酸+NAD+(式二)由以上反應式可知，NADH的下降速率與鉀離子濃度成正比，因此可以利用分光光度計，通過在340nm波長處監測NADH吸光度的變化，來計算出被測標本(例如，血清等體液)中的鉀離子的含量。現已經開發出符合以上原理的測定血清中鉀離子濃度的試劑盒，例如東洋紡(T0Y0B0)生產的血清鉀離子濃度檢測試劑盒。從上述式一可以看出，試劑盒中最重要的組份是丙酮酸激酶，它的活性直接決定了試劑盒能否正常使用以及由試劑盒所測得的測量結果是否準確。但是目前的試劑盒所用的丙酮酸激酶存在著耐熱性差(參見圖7和圖8)，使試劑盒的運輸、保存和使用過程對環境溫度要求較高，容易由于丙酮酸激酶的變性而影響到試劑盒測定的有效性和準確性。此外，目前的試劑盒所用的丙酮酸激酶只能在窄的PH值范圍內保持較高的穩定性和活性(參見圖5和圖6)，大大局限了試劑盒能夠測定的被測標本的范圍，對測定的pH條件要求較高，從而對使用試劑盒的人員的操作技術水平要求也很高。
發明內容本發明的一個目的是克服現有的丙酮酸激酶耐熱性差、僅能在窄的pH值范圍內保持較高的穩定性和活性的缺點，提供一種耐熱性好、能在寬的pH值范圍內保持較高的穩定性和活性的丙酮酸激酶。本發明的第二個目的是提供編碼所述丙酮酸激酶的核苷酸序列。本發明的第三個目的是提供包括所述核苷酸序列的重組載體。本發明的第四個目的是提供包括所述重組載體的重組宿主細胞。本發明的第五個目的是提供包括上述丙酮酸激酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。丙酮酸激酶作為酵解途徑中的重要調節酶，廣泛存在于多種生物體中，并且具有多種同功酶。但是不同生物體(比如哺乳動物、細菌等)來源的丙酮酸激酶的性質差別很大。本發明的發明人付出了大量地創造性勞動，利用對多種生物體設計引物釣取目的基因的方法，最終從干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiATCC334)中得到本發明具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的丙酮酸激酶。并且本發明的發明人意外地發現，所得丙酮酸激酶及其變異體耐熱性好、對于底物丙酮酸的Km值小，并且在寬的pH值范圍內穩定性和活性都很高。本發明提供了一種丙酮酸激酶，其中，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列為(l)SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，或者(2)對(1)所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不變的氨基酸序列。本發明還提供了編碼本發明所述丙酮酸激酶的核苷酸序列。本發明還提供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。本發明還提供了包括本發明所述的丙酮酸激酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發明提供的丙酮酸激酶具有如下優點第一，耐熱性好。參見圖3和圖4可知，本發明的丙酮酸激酶在6(TC加熱10分鐘條件下都具有50%以上的相對活性，明顯高于在相同條件下的對比例1(參見圖7和圖8)的丙酮酸激酶的相對活性。第二，在寬的pH值范圍內穩定性和活性都很高。參見圖l和圖2可知，本發明的丙酮酸激酶在pH4至ll條件下都具有50X以上的相對活性，明顯高于在相同條件下的對比例1(參見圖5和圖6)的丙酮酸激酶的相對活性。第三，對于底物丙酮酸的Km值小。本發明的丙酮酸激酶在37t:條件下對于底物丙酮酸的Km值僅為0.8X10—3，而在相同條件下對比例1的丙酮酸激酶對于底物丙酮酸的Km值達1.0X10—2。圖1制備實施例1的丙酮酸激酶pH穩定性曲線圖；圖2制備實施例1的丙酮酸激酶pH活性曲線圖3制備實施例1的丙酮酸激酶溫度穩定性曲線圖；圖4制備實施例1的丙酮酸激酶溫度活性曲線圖；圖5對比例1的丙酮酸激酶pH穩定性曲線圖；圖6對比例1的丙酮酸激酶pH活性曲線圖；圖7對比例1的丙酮酸激酶溫度穩定性曲線圖；圖8對比例1的丙酮酸激酶溫度活性曲線圖。具體實施例方式本發明提供了一種丙酮酸激酶，其中，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列為(l)SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，或者(2)對(1)所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不變的氨基酸序列。本領域人員公知，組成蛋白質的20種氨基酸殘基，按照側鏈極性可以分成四類1、非極性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(lie)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro);2、極性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gin)和酪氨酸(Tyr);3、帶正電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His);4、帶負電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見"生物化學"(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質中如果發生同屬一個類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質結構域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水囊袋結構的作用)沒有改變，因此對蛋白質的立體結構并不會產生影響，因此仍然可以實現蛋白的功能。例如，本領域技術人員公知，Ala禾口Ser、Val禾口Ile、Asp禾口Glu、Ser禾口Thr、Ala禾口Gly、Ala禾口Thr、Ser禾口Asn、Ala禾口Val、Ser禾口Gly、Tyr禾口Phe、Ala禾口Pro、Lys禾口Arg、Asp禾口Asn、Leu禾口Ile、Leu禾口Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會影響蛋白的立體結構和功能。例如本發明制備實施例3中記載的氨基酸序列在SEQIDNO:1的第327位上絲氨酸被丙氨酸取代，或者本發明制備實施例4中記載的氨基酸序列在SEQIDNO:1的第391位上異亮氨酸被纈氨酸取代，具有所得氨基酸序列的丙酮酸激酶在結構和功能上沒有差異。所述同屬一個類別的氨基酸殘基取代可以發生在丙酮酸激酶上的任意一個氨基酸殘基位置上。相反，不同類別的氨基酸殘基發生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列舉的取代規律，很可能會使蛋白的結構發生變化，功能出現差異。本發明提供的丙酮酸激酶還可以進行修飾或突變，得到衍生的蛋白質。本發明所述"衍生的蛋白質"指與具有上述氨基酸序列的丙酮酸激酶存在氨基酸序列上的差異，或者有不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導的遺傳變異體。所述誘導變異體可以通過各種技術得到，如輻射或誘變劑等產生的隨機突變，也可以通過如定點突變法或其他已知分子生物學的技術獲得。所述"衍生的蛋白質"還包括具有天然L型氨基酸的殘基的類似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e-氨基酸、Y-氨基酸等)的類似物。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的蛋白的化學衍生形式，如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白。這種修飾可以通過將蛋白暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的蛋白。優選情況下，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列為SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，或者為第327位絲氨酸被丙氨酸取代的SEQIDN0:l所示的氨基酸序列，或者為第391位異亮氨酸被纈氨酸取代的SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。本發明還提供了編碼本發明所述丙酮酸激酶的核苷酸序列。本領域公知，組成蛋白質的20種不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡并性，決定一個氨基酸的密碼子大多不止一個，三聯體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本領域人員根據公知的密碼子表，從本發明公開的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的丙酮酸激酶活性不變的氨基酸序列，完全可以推導出能夠編碼它們的基因的核苷酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核苷酸序列，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發明范圍內。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過修改本發明提供的核酸序列，得到與本發明所述丙酮酸酶活性一致的氨基酸序列。優選情況下，本發明所述核苷酸序列為(1)SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；或者(2)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或者(3)對SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的丙酮酸激酶功能不變。(3)所述的核苷酸序列指在高嚴謹條件下可以與SEQIDN0:2或者SEQIDNO:3所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，所述高嚴謹條件是指在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65t:下雜交并洗膜。所述核苷酸序列更優選為SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列最優選為SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。本發明的發明人通過大量的實驗最終確定的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，由于可能更符合例如大腸桿菌的基因工程菌的密碼子偏好性，因而更有利于基因工程菌表達蛋白產物。本發明提供的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領域技術人員根據本發明所提供的核苷酸序列和重組工程菌，可以很容易獲得模板和引物，利用PCR進行擴增獲得有關序列。序列較長時，可以進行兩次或多次PCR擴增，然后將所得片段按正確次序拼接。一旦獲得了有關核苷酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關氨基酸序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉入基因工程菌中，然后通過常規的方法從增殖后的宿主細胞分離得到有關核苷酸序列。此外，還可用公知的人工化學合成的方法來合成有關核苷酸序列。本發明還提供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。本領域公知，所述重組載體一般包括空載體和插入該空載體的目的基因，所述目的基因為本發明所述的丙酮酸激酶的核苷酸序列。在本發明中，所述"空載體"(或稱"載體")可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒、粘粒、噬菌體及反轉錄病毒等，本發明優選pET28b質粒或其他大腸桿菌表達載體如pKK223-3，pEXl/2/3、pUC18等。所述空載體可以包括多種常用的檢測標記(例如熒光標記、抗生素標記等報告基因)和酶切位點。重組載體構建可采用空載體本身多克隆位點的各種核酸內切酶(如對于pUC18，可用SalI、BamHI、EcoRI等，對于pET28a，可用Ndel、Nhel、EcoRI、BamH、Hindl工I等，對于pET28b可用EcoRI、Ndel、BamH、Hind111等)進行酶切獲得線性質粒，與采用相同核酸內切酶切割的基因片段連接，獲得重組質粒。優選所述重組載體為pET28b-PK或pKK223-3-PK，pEXl/2/3-PK等。本發明優選采用EcoRI和Ndel雙酶切pET28b及與其連接的PCR產物片段，經連接酶連接，構建本發明的重組載體pET28b-PK。本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。可以通過本領域常規的方法將所述重組載體轉化、轉導或者轉染到宿主細胞中，如氯化鈣法化學轉化、高壓電擊轉化，優選電擊轉化；所述宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞，優選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母(如畢赤酵母)或各種動植物細胞，更優選所述宿主細胞為本領域常用的基因工程菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。最優選所述宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。可以使用本領域常用的方法從重組宿主細胞中分離和純化丙酮酸激酶。例如，離心分離培養基和重組宿主細胞，高壓勻漿破碎細胞、離心過濾去除細胞碎片，親和層析純化丙酮酸激酶。對于分離純化所得的丙酮酸激酶的產物，可以使用本領域常用的方法進行純度鑒定。例如，考馬斯亮藍法、凱氏定氮法、雙縮脲法、1owry法、紫外吸收法、親和層析、酶活性、抗原抗體法、電泳分析(例如十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)、沉降分析、擴散分析、恒溶度法、蛋白質譜等。本發明還提供了包括本發明所述的丙酮酸激酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。優選情況下，本發明的試劑盒包括丙酮酸激酶，而不包括核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞。更優選本發明的試劑盒包括丙酮酸激酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞。可以用本領域常用的方法制備丙酮酸激酶的干粉，只要該方法能夠得到丙酮酸激酶的干粉，并且不破壞丙酮酸激酶的干粉的活性即可。例如使用真空減壓濃縮器得到濃縮的酶液，然后使用冷凍干燥機干燥濃縮的酶液；或者使用真空減壓干燥器等設備。由于本發明的丙酮酸激酶耐熱性好，還可以使用噴霧干燥的技術得到該酶的干粉。丙酮酸脫氫酶的干粉在使用時可以通過溶解于PH7.5-10的緩沖液體系(例如三乙醇胺緩沖液、磷酸鹽緩沖液，優選pH為7.6-8)中而轉化為液體形式。本發明的試劑盒還可以包括本領域常用于丙酮酸激酶試劑盒的成分。對應于本發明的試劑盒中的丙酮酸激酶可以是液體形式和/或固體干粉形式，本發明的試劑盒中的其他成分也可以是液體形式和/或固體干粉形式。例如，當本發明的試劑盒為液體形式時，一般可以含有試劑一(Rl)和試劑二(R2);其中，所述試劑一可以包括溶于pH7.5-10的三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的10-50U/mL的谷氨酸脫氫酶(GLDH)、1.0-20U/mL7的丙酮酸激酶、1.0-10mmol/L的a_酮戊二酸、3-15mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3.15-15.5mmol/L的ADP和0.3-1.5mmol/L的NADH;所述試劑二可以含有溶于pH9-12的三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的50-100U/mL的乳酸脫氫酶(LDH)、以及5-25mmol/L的a-硝基酚半乳糖苷。優選情況下，所述試劑一可以包括溶于pH8-9的三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的10-30U/mL的谷氨酸脫氫酶、1.0-10U/mL的丙酮酸激酶、1.0-5mmol/L的a-酮戊二酸、3-10咖01/1的磷酸烯醇式丙酮酸、3.15-10mmol/L的ADP和0.3-1.0mmo1/L的NADH;所述試劑二可以含有溶于pH9-11的三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的60-85U/mL的乳酸脫氫酶、以及5-15mmol/L的a-硝基酚半乳糖苷。更優選的情況下，所述試劑一可以包括溶于pH8.0-8.5的三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的10-15U/mL的谷氨酸脫氫酶、1.0-5U/mL的丙酮酸激酶、1.0-3mmol/L的a-酮戊二酸、3-6mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸、3.15-6.5mmol/L的ADP和0.3_0.8mmol/L的NADH;所述試劑二可以含有溶于pH9-10的三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的60-80U/mL的乳酸脫氫酶、以及5-10mmo1/L的a-硝基酚半乳糖苷。以上所述的試劑一和試劑二分別都可以通過冷凍干燥技術，結合減壓蒸餾技術、反滲透技術及超濾技術等，制備成試劑一干粉(其中包含本發明的丙酮酸激酶干粉)和試劑二干粉。所述干粉可以在檢測待測標本前用選自去離子水、蒸餾水和雙蒸水的溶劑復溶至所述試劑的原有體積。因此本發明的試劑盒可以包括液體形式的試劑一和試劑二，或者可以包括試劑一干粉和液體形式的試劑二，或者可以包括液體形式的試劑一和試劑二干粉，或者可以包括固體形式的試劑一干粉和試劑二干粉。在檢測待測標本中的鉀離子時，先將體積比為i:ioo至i:io的待測標本(或鉀離子校準液)與試劑一混合，在37t:下保溫300秒后，向混合物中加入試劑二。所述鉀離子校準液可以是含有鉀離子的水溶液，例如，已知濃度的KC1水溶液、1(20)3水溶液。將所得試劑一、試劑二和待測標本(或鉀離子校準液)的混合液在37t:下保溫60秒時，在340nm下通過分光光度計記錄吸光度數值A1，在測定A1后的第180秒記錄吸光度數值A2。按照以下式三計算鉀離子的濃度△A械本鐘離子濃度=-———---------x校準液的鉀離子濃度AAid(式二)其中，AA二A2-A1，即AA標本二A2標本-A1標本，AA校準二A2校準-A1校準。通常采用兩種校準液即鉀離子濃度為2.55mmol/L的低值校準液和鉀離子濃度為6.15mmol/L的高值校準液。所述校準液可以使其他具有4-5mmol/L差值的鉀離子溶液，但校準液的最低值不得低于0.5mmo1最高值不得高于lOmmol否則會超出分光光度計的量程。使用本發明的試劑盒時，一般可達到的準確的鉀離子濃度測量范圍為2.0-10.0mmol/L。本發明的試劑盒可以包括記載有上述各種組分使用方法和用量的說明書。因此，所述標準液也可以不配備在試劑盒中，由使用者在使用前按照試劑盒說明書的記載根據現有技術配制即可。適于使用本發明所述試劑盒的待測標本可以使動物體(包括人體)健康狀態下以及病理狀態下產生的各種體液，例如血液、淋巴液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液、乳汁、羊水、膽汁、肋膜積液(又稱胸水)、支氣管液、濾泡液、腹腔積液(又稱腹水)、心包膜積液、關節積液、各器官的囊腫積液等等。下面結合實施例進一步說明本發明，除非特別說明本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。制備實施例1(1)干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiATCC334)基因組DNA的提取將干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiATCC334)以1X103細胞/毫升的接種量，在37°C、200轉/分的轉速下100ml培養基中振蕩培養18小時后，該細菌的密度達到4X108細胞/毫升。所述培養干酪乳桿菌的培養基配方為牛肉膏3g/L;蔗糖2g/L;大豆蛋白胨10g/L;氯化鈉2g/L;培養基的溶劑為無菌蒸餾水，培養基的pH為7.5。其中g/L為固體物質與溶劑的重量體積比。在有蓋50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I在65。C水浴預熱備用，所述提取緩沖液I含有100,1/LTris鹽酸、pH8.0、20,1/LEDTA、500mmol/LNaCl和1.5%SDS。在10000rpm下離心10min收集干酪乳桿菌菌體。將離心得到的菌體與液氮以體積比l:l的比例在研缽中混合后充分研磨后，倒入所述65°C預熱的離心管中，混勻，65°C水浴溫育10分鐘。然后加入20ml符合25:24:1的比例的酚/氯仿/異戊醇混合物，顛倒混勻，4t:下12000rpm離心5分鐘。移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清得到提取的基因組DNA15微克。將提取的基因組DNA15微克，溶解在10mmol/L的Tris-Cl緩沖液中備用，該緩沖液的pH為8.0，并且同時含有lmmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)。[(Km](2)釣取目的基因(即丙酮酸激酶基因)本發明的發明人設計了正向引物ATCGCATATGAAAAAAACCAAGATCGTC(SEQIDNO:4)，其上附加有Ndel酶切位點；反向引物ATCGGAATTCTTAAAGGGCGTTGGTAGC(SEQIDNO:5)，其上附加有EcoRI酶切位點。以上述步驟(1)得到的干酪乳桿菌基因組DNA為模板，按照如下條件擴增丙酮酸激酶基因聚合酶鏈式反應的混合物包括正向引物3iU;反向引物3iU;dNTPs:3;10X緩沖液:10iU;高保真Taq酶(PyrobestTaq);基因組DNA:100ng;加雙蒸水至1001，退火溫度為52°C，延伸時間為2分鐘，30個循環得到基因擴增產物。將得到的擴增基因片段用瓊脂糖凝膠電泳回收純化出1.7-1.8kb單一條帶的DNA片段。將所得DNA片段用美國應用生物系統公司的310型全自動DNA測序儀測序，測序結果顯示所得DNA片段中含有長度為1764bp(起始于起始密碼子atg并終止于終止密碼子taa)的蛋白編碼基因，詳細序列如SEQIDNO:2所示。(3)構建重組載體用限制性內切酶NdeI和EcoRI酶切(2)得到的蛋白編碼基因，酶切所得大片段通過使用T4DNA連接酶，連接至同樣已經用限制性內切酶Ndel和EcoRI酶切過的空載體pET28b上。將包括重組載體的連接反應產物轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞中，然后所得轉化產物涂布在含有50g/mL的卡那霉素LB瓊脂平板上，在37。C培養過夜，隨機挑選10個克隆接種到含有50g/mL的卡那霉素的LB液體培養基中過夜培養后，提取質粒，用限制性內切酶Ndel和EcoRI進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。結果測到大小約為1.8Kb片段的酶切片段的相應重組質粒為陽性克隆，即證明獲得了重組表達載體pET28b-PK。培養所述陽性克隆，提取重組表達載體pET28b-PK。所述重組表達載體pET28b-PK在pH為7.5的50mmol/L的Tris-HCl緩沖液中保存。(4)重組載體對宿主細胞的轉化以及所得重組宿主細胞的培養挑取在LB固體培養基上37C培養16小時的大腸桿菌BL21(DE3)的單菌落，于液體LB培養基中在37°C、150rpm的搖床再培養16小時。取lml所得液體培養物轉接于100ml新鮮液體LB培養基中，在37t:搖床上以250-300rpm的轉速劇烈振蕩培養2.5小時。吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘后，在4°C、3000g下離心5分鐘。棄去上清，加入100ii1在冰上預冷的0.lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，在冰放置20分鐘。然后在4°C、3000g下離心5分鐘，棄去上清，加入100y1在冰上預冷的0.lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，得到感受態的宿主細胞。取200iU上述感受態的大腸桿菌BL21(DE3)置于1.5ml離心管中，加入體積為lOiil的pET28b-PK溶液(其中pET28b-PK含量為40ng)輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。然后在42t:水浴中熱擊90秒，接著迅速置于冰上冷卻5分鐘。向離心管中加入lmlLB液體培養基(不含卡那霉素)，混勻后37t:振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的卡那霉素抗生素抗性基因(Ampr)。將上述菌液搖勻后取100y1涂布于含Kan的LB篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37t:培養20小時。在篩選平板上出現了大腸桿菌的菌落，即pET28b-PK已經轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，得到了本實施例的重組宿主細胞——大腸桿菌BL21(DE3)-pET28bPK。配制3LLB培養基加入到5L發酵罐中，在12rC滅菌15分鐘，完全冷卻至室溫后加入卡那霉素，使其終濃度為50ug/mL。在所得培養基中加入60mL生長至對數生長期的上述大腸桿菌BL21(DE3)-pET28bPK(106細胞/毫升)。在37。C下培養至發酵液取樣中的細胞密度達到107細胞/毫升。然后加入lmmol/L的異丙基-!3-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，誘導8小時后發酵完畢。(5)蛋白產物的分離提純將(4)得到的發酵液在10000rpm下離心10min，收集重組宿主細胞沉淀。棄去上清，將所得重組宿主細胞重懸于等體積的pH為7.5的50mmol/L的Tris-HCl溶液中。用高壓勻漿機破碎重懸的細胞，在10000rpm下離心10min，收集上清粗酶液，棄取細胞碎片沉淀。將上述所得粗酶液用孔徑為0.22iim濾膜過濾后，所得濾液在美國通用電子公司(GE公司)的安克塔純化者(AKTAPurifier)鎳親和層析柱上進行親和層析。其中，上樣緩沖液為50mmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液。在流過兩個柱體積的上樣緩沖液后，使用洗脫緩沖液，其為含有0.5mol/L咪唑的50mmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液。當咪唑濃度達0.3mol/L時開始收集蛋白，收集實時監測到的蛋白單峰結束。向收集到的蛋白溶液中加入40%(W/V)硫酸銨沉淀，然后在10000rpm的轉速下離心10分鐘。收集蛋白沉淀，并用0.lmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液復溶。所得溶液用孔徑為0.22ym的濾膜過濾后，所得濾液再用葡聚糖凝膠G-25層析柱(S印hadexG-25)脫鹽。所述脫鹽緩沖液是O.lmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液。在用脫鹽緩沖液平衡好的層析柱上上樣，其中樣品溶液(即上述用0.lmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液復溶的蛋白溶液)的流速為5ml/min，然后用脫鹽緩沖液以15ml/min的流速洗脫2個柱體積。收集洗脫下的液體共500毫升。所收集的液體在普通冰箱中-l(TC下冷凍2小時，然后再_401:深冷冰箱預凍8小時，在德國科瑞斯特(CHRIST)的ALPHAl-4LSC型冷凍干燥機中，以真空度0.04mbar、安全壓力0.100mbar且冷阱溫度_60°C的條件凍干10小時。然后等物料溫度與凍干機隔板溫度差為零，并且觀察在15秒內壓力指示不變時，結束凍干。凍干所得蛋白質的量為10克。凍干蛋白在冷凍條件下密封保存。采用《蛋白質電泳試驗技術》(郭堯君，132-145頁，科學出版社，1999年)記載的SDS-PAGE電泳的方法測定出本實施例的蛋白質的分子量為64KD，并且根據《生物化學》(王鏡巖等，高等教育出版社，2002，見168頁)記載的蛋白質一級結構的測定方法(分肽段測定)，測得本實施例的蛋白質有588個氨基酸殘基(參見SEQIDNO:l所示的氨基酸序列)，與由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列編碼的蛋白質結果一致。按照文獻"丙酮酸激酶反應的靜態和動態研究(EquilibriumandKineticStudiesofthePyruvicKinaseReaction)，，，JohnT.McQuate禾口MertonF.Utter，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，第234巻，第2151-2157頁，1959年，所記載的方法，測到本實施例的蛋白不僅具有丙酮酸激酶的活性，并且具有的丙酮酸的Km值為0.8X10—^Ql/L，足以滿足臨床上測定待測標本中鉀離子濃度的試劑盒的對丙酮酸激酶的要求(37。C下的丙酮酸的Km值至多為0.8X10—2mol/L)。綜上，本發明的發明人得到了一種新的丙酮酸激酶，其來源于干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiATCC334)，分子量為64KD，具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列以及SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。其中，本領域技術人員通過閱讀本實施例，可以知曉本發明的核苷酸序列例如SEQIDN0:2，并可以通過化學合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有該核苷酸序列的核酸后，無需實施本實施例第(1)_(2)步，而是直接從本實施例第(3)步開始重復本實施例。制備實施例2按照SEQIDNO:3對SEQIDNO:2所示的核苷酸序列進行定點突變，得到SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的同義突變核苷酸序列。然后將得到的核苷酸序列按照制備實施例1的方法連接到pET28b空載體上，也轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養所得重組宿主細胞，結果本實施例的丙酮酸激酶產量比制備實施例1提高了10%。制備實施例3將SEQIDNO:2所示的核苷酸序列第979位的核苷酸定點突變，即由密碼子"T"突變為"G"。按照制備實施例1的方法連接到pET28b空載體上，也轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養所得重組宿主細胞，結果得到的丙酮酸激酶，其氨基酸序列為第327位絲氨酸被丙氨酸取代的SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，其Km值為0.8X10—^q1/L，其丙酮酸激酶的產量與制備實施例1持平。制備實施例4將SEQIDN0:3所示的核苷酸序列第1174位的核苷酸定點突變，即由密碼子"T"突變為"G"。按照制備實施例1的方法連接到pET28b空載體上，也轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養所得重組宿主細胞，結果得到的丙酮酸激酶，其氨基酸序列為第392位絲氨酸被丙氨酸取代的SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，其Km值為110.8X10—^Ql/L，其丙酮酸激酶的產量比制備實施例l持平。0095]對比例10096]本對比例為東洋紡公司(T0Y0B0)生產的兔肌來源的丙酮酸激酶，其分子量為237KD，對丙酮酸的Km為1.0X10—2mol/L，最適pH值7.0，最適溫度40°C。0097]測試實施例10098]按照如下方法測試制備實施例1-4和對比例1的丙酮酸激酶活性0099]1)測定試劑:0100]試劑l(Rl):0101]pH為7.6的三乙醇胺緩沖液122mmol/L0102]氯化鎂(MgCl2):3.6,1/L0103]磷酸烯醇丙酮酸鉀鹽0.7mmol/L0104]氯化鉀(KC1):13.5mmol/L0105]二磷酸腺苷(ADP):18.66mmol/L0106]乳酸脫氫酶(LDH):1.5U/mL0107]試劑2(R2):0108]pH為9.0的Tris-Cl緩沖液40mmol/L0109]NADH:1.2g/L0110]酶干粉用pH為7.6的三乙醇胺緩沖液稀釋至1000U/L。01"]2)操作過程:0112]取0.9mL試劑Rl加上0.3mL試劑R2混勻，37。C保溫3分鐘，然后加入0.04mL的酶液。在340nm下根據NADH的減少量來判斷丙酮酸激酶的酶活。線性范圍是0.2-lKU/L。在37t:條件下，1分鐘氧化1微摩爾NADH的酶量為1個酶活力單位。其中，1KU的酶活力是指，在37。C下1分鐘內NADH減少1000微摩爾。3)酶活計算公式活(U/ml)=A0DZmin(AODfe本AOD空白)xVtxdf=AQDzmfax9，xdf6,22x1,0xVs酶活(U/mg)=(U/mL)Xl/C其中，Vt:總體積(124mL)Vs:酶液樣品體積(0.04mL)6.22:在測定條件下NADH的摩爾吸光系數(cm2/ymoL)l.O:光徑長度(cm)df:稀釋倍數C:溶液中酶濃度4)測試結果見下表1表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由以上結果可知，實施例1-4的丙酮酸激酶其酶活力與對比例1相比在同一數量級上，完全能夠滿足臨床上測定待測標本中鉀離子濃度的試劑盒的對丙酮酸激酶的要求。測試實施例2按照如下方法測試制備實施例1-4和對比例1的丙酮酸激酶的pH穩定性將0.5KU的丙酮酸激酶在25。C下，分別溶于PH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的lOOmmol/L三乙醇胺緩沖液中，靜置20小時。除"酶干粉用pH為7.6的三乙醇胺緩沖液稀釋至1000U/L"的步驟不同外，按照測試實施例1的方法測定酶活。按所測酶活與最大所測酶活的比值百分數即相對活性為縱坐標，pH為橫坐標繪制曲線。制備實施例1的測試結果見圖l，對比例1的測試結果見圖5。制備實施例2與制備實施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制備實施例3和制備實施例4的蛋白與制備實施例1性質相同(未示出)。從圖中可以看出，制備實施例l-4的pH穩定性顯著好于對比例l，這樣一來包括本發明的丙酮酸激酶的試劑盒能夠測定的待測樣本的種類比現有技術更多，對試劑盒的運輸、保存的條件降低，對使用試劑盒的人員的操作精密精細要求降低，有利于帶有丙酮酸激酶的試劑盒的普及。測試實施例3按照如下方法測試制備實施例1-4和對比例1的丙酮酸激酶的最適pH:將0.5KU的丙酮酸激酶在37。C下，分別溶于pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的10Ommol/L三乙醇胺緩沖液中放置五分鐘。除"酶干粉用pH為7.6的三乙醇胺緩沖液稀釋至1000U/L"的步驟不同外，按照測試實施例1的方法測定酶活。按所測酶活與最大所測酶活的比值百分數即相對活性為縱坐標，PH為橫坐標繪制曲線。制備實施例1的測試結果見圖2，對比例1的測試結果見圖6。制備實施例2與制備實施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制備實施例3和制備實施例4的蛋白與制備實施例1性質相同(未示出)。從圖中可以看出，制備實施例1-4的最適pH大于對比例l，在多種常規偏堿性的待測標本(比如血清)中更穩定。并且結合表1的數據可知，即使制備實施例的酶活性在pH7.0時下降至最適pH值時的70X，其活力仍然高于對比例1。測試實施例4按照如下方法測試制備實施例1-4和對比例1的丙酮酸激酶的熱穩定性將O.5KU的丙酮酸激酶干粉溶于pH值為8.0的10Ommol/L三乙醇胺緩沖液中，分別在35、40、45、50、60、65。C下，靜置30分鐘。除"酶干粉用pH為7.6的三乙醇胺緩沖液稀釋至1000U/L"的步驟不同外，按照測試實施例1的方法測定酶活。按所測酶活與最大所測酶活的比值百分數即相對活性為縱坐標，溫度為橫坐標繪制曲線。制備實施例1的測試結果見圖3，對比例1的測試結果見圖7。制備實施例2與制備實施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制備實施例3和制備實施例4的蛋白與制備實施例1性質相同(未示出)。從圖中可以看出，制備實施例1-4的熱穩定性顯著大于對比例1。在6(TC加熱1013分鐘條件下都具有50%以上的相對活性，明顯高于在相同條件下的對比例1的丙酮酸激酶的相對活性。測試實施例5按照如下方法測試制備實施例1-4和對比例1的丙酮酸激酶的最適溫度將O.5KU的丙酮酸激酶干粉溶于ra值為8.0的100mmol/L三乙醇胺緩沖液中，分別在35、40、45、50、60、65。C下，放置5分鐘。除"酶干粉用pH為7.6的三乙醇胺緩沖液稀釋至1000U/L"的步驟不同外，按照測試實施例1的方法測定酶活。按所測酶活與最大所測酶活的比值百分數即相對活性為縱坐標，溫度為橫坐標繪制曲線。制備實施例1的測試結果見圖4，對比例1的測試結果見圖8。制備實施例2與制備實施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制備實施例3和制備實施例4的蛋白與制備實施例1性質相同(未示出)。從圖中可以看出，制備實施例1-4的最適溫度顯著大于對比例l，在多種高溫惡劣環境中可以保持穩定。并且結合表l的數據可知，即使制備實施例的酶活性在37t:時下降至最適溫度的約20%，其活力仍然高于同溫度下的對比例1。制備實施例5-8按照表2的配方配制試劑一和試劑二表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>制備實施例5和6的試劑一和試劑二分別配制成液體形式即可。制備實施例7和8的試劑一和試劑二分別在如下條件下冷凍干燥在普通冰箱中-l(TC下冷凍2小時，然后再-4(TC深冷冰箱預凍8小時，在德國科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA1_4LSC型冷凍干燥機中，以真空度O.04mbar、安全壓力0.lOOmbar且冷阱溫度_60°C的條件凍干10小時。然后等物料溫度與凍干機隔板溫度差為零，并且觀察在15秒內壓力指示不變時，結束凍干。凍干得到的試劑干粉可以在使用前用蒸餾水復溶成原液體形式的體積。凍干得到的試劑干粉，比液體形式的試劑保存的時間更長，包裝要求較低，并且體積更小，運輸更容易。制備實施例5-8具有鉀離子濃度為2.55mmol/L的低值校準液(KC1)和鉀離子濃度為6.15mmol/L的高值校準液(KC1)。對比例2按照與制備實施例5相同的配方配制成液體形式的試劑盒。測試實施例6本測試實施例測量了兩個待測標本一個是3.50mmol/L的KC1水溶液標準品；另一個為健康狀況良好的30歲女性的血清待測標本，抽取其10ml血液，靜置至血細胞沉淀分層，取上層血清5ml用于對制備實施例5-8和對比例2的試劑盒進行檢驗。分別將制備實施例5-8中的Rl取200ill，加上標本6iU，標本和Rl在37。C保溫300秒，加入R2。R1、R2和標本混合液在37。C條件下保溫60秒，340nm條件下記錄吸光度數值Al，180秒記錄吸光度數值A2，根據吸光度數值的變化，并按照式三計算鉀離子的濃度。測試結果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表3可以看出，制備實施例5-8的試劑盒測試結果比對比例2更接近真實值；并且制備實施例5-8的試劑盒測試結果標準偏差明顯小于對比例2，說明本發明的試劑盒性能更穩定，測量更準確。0156]序列表0157]〈110〉北京利德曼生化股份有限公司0158]〈120〉丙酮酸激酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒0159]〈130>0ICN0934290160]〈160>50161]〈170>PatentInversion3.40162]〈210>10163]〈211>5880164]〈212>PRT0165]〈213>Lactobacilluscasei0166]〈400>10167]MetLysLysThrLyslieValSerThrLeuGlyProAlaSerAsnThr0168]1510150169]ThrAsplielieValLysLeulieGluAlaGlyAlaAsnValPheArg0170]2025300171]PheAsnPheSerHisGlyAspHisGluGluHisLeuAlaArgMetAsn0172]3540450173]MetValHisGluAlaGluLyslieThrGlyLysThrValGlylieMet0174]5055600175]LeuAspThrLysGlyAlaGlulieArgThrThrLeuGluAspThrPro0176]657075800177]AsnGlyLyslieAspPheHisThrGlyAspLysValArglieSerMet0178]8590950179]AspAlaSerLeuLysGlyThrLysGluLysValAlaValThrTyrPro0180]1001051100181]GlyLeuTyrAspAspThrHisValGlyGlyHisValLeuPheAspAsp0182]1151201250183]GlyLeulieAspMetLyslieThrGluLysAspGluLysAsnArgGlu0184]1301351400185]LeuValThrValValGinAsnAspGlyValLeuGlyGlyLysLysGly0186]1451501551600187]ValAsnAlaProGlyValAlalieAsnLeuProGlylieThrGluLys0188]1651701750189]AspSerAspAsplieArgPheGlyLeuAspAsnGlylieAsnPhelie0190]1801851900191]AlaAlaSerPheValArgLysProGinAspValLeuAsplieArgGlu0192]1952002050193]LeuLeuGluGluLysAsnAlaLeuAsnValGinliePheProLyslie0194]2102152200195]GluSerGinGluGlylieAspAsnlieAspAsplieLeuLysValSer0196]2252302352400197]AspGlyLeuMetValAlaArgGlyAspMetGlyValGlulieProPhe0198]2452502550199]GluHisValProlieValGinLysArgLeulieLysLysCysAsnSer0200]2602652700201]LeuGlyLysProVallieThrAlaThrGinMetLeuAspSerMetGin0202]2752802850203]GluAsnProArgProThrArgAlaGluValAsnAspValAlaAsnAla0204]2902953000205]ValPheAspGlyThrAspAlaThrMetLeuSerGlyGluSerAlaAsn17305310315320GlyAspTyrProValGluSerValAlaAlaMetAlaArglieAspGlu325330335TyrThrGluAlaAlaMetMetAspGinAspAlaPheAlaLeuLysGlu340345350SerSerAsnLysAsnValThrGluAlaValGlyGinSerValAlaHis355360365ThrAlaArgAsnLeuGlyValLysThrlieValAlaAlaThrGluSer370375380GlyTyrThrAlaArgMetlieSerLysTyrArgProLysAlaAsplie385390395400LeuAlalieThrPheSerGluLysThrGinArgGlyLeuMetValAsn405410415TrpGlyValTyrProlielieAlaGluLysProAlaAsnThrAspAla420425430MetPheAspLeuAlaThrLysLysAlaGinAspLeuGlyPheAlaLys435440445GluGlyAspLeulieLeulieThrAlaGlyValProValGlyGluSer450455460GlyThrThrAsnValMetLysValGinLeulieGlySerLysLeuVal465470475■GinGlySerGlyValGlyAspGluSerThrlieGlyLysAlaVallie485490495AlaSerAsnAlaGinGluAlaAlaAlaLysMetGinLysGlyAsplie500505510LeuValValLysThrThrAspLysAspTyrLeuProAlalieGluLys515520525AlaAlaAlaLeuValValGluThrGlyGlyLeuThrSerHisAlaAla530535540ValValGlylieAlaMetGlylieProValValValGlyAlaGluAsn545550555560AlaThrSerVallieSerAspGlyGinlielieThrValAspSerArg565570575ArgGlylielieTyrLysGlyAlaThrAsnAlaLeu580585〈210>2〈211>1767〈212>DNA〈213>Lactobacilluscaseigtteagttgattgaagcgggtgccaacgttttccgtttcaatttctcacatggtgatcat120g^gagcatttggcacggatg皿catggttcacg皿gctg^^gatcacgggteagacc180gttggtetcatgctggatecgaagggtgccgaaattcggacaactcttgaagateccccg240aatggteagatcgattttcacaccggtgataaagttcgcatctccatggatgcaagtctg300aaaggcaccaaggaaaaagttgctgttecctetcctggcctttetgatgacactcacgtt360ggcggccatgttttgtttgatgatggcttgattgacatgaagatcaccgaaaaggacgaa420aagaaccgtgaactcgtteccgttgttcaaaacgacggtgtccttggtggteagaaaggt480gtcaacgctcctggtgttgccatcaacttgcctgggattecggaaaaagactccgatgac540attcgtttcggcttggacaacgggatcaacttcattgctgcttccttcgttcgteagcct600caagacgttttegacattcgtgaactccttgaagaaaagaacgcacttaatgttcagatc660ttccctaagatcgaatcacaagaaggcatcgacaacattgatgacatcttgaaggtttcc720gatggcttaatggttgctcgtggcgacatgggtgttgaaattccatttgaacatgttccg780atcgttcagaagcgcttgatcaagaagtgcaactctttgggtaagccggttatcacggct840acacaaatgttggattccatgcaagaaaacccacgtcctacccgtgccgaagtaaacgac900gttgccaatgccgtgtttgatggcaccgatgcaacgatgctttctggcgaatctgctaat960ggtgactatccgttgctgcaatggctcggattgacg皿teC3CCg皿gC31020gcgatgatggatcaggatgccttcgcattggteac皿g皿cgtcaccgaa1080gctgttggcc皿3gtgttgCacacacggctcgcaactteggggtte卿ccattgttgct1140gcgaccg皿tccggctacactgcccgcatgatttccaagtatcgtccgaaggctgacatt1200cttgccatteccttcagcgacgcggcctgatggtcaactggggcgtttec1260ccaatcattgCtg皿33gCCtgctaacaccgatgctetgttcgacttggc皿cc皿g^g1320gcccaagaccttggctttgcteagg皿ggcgatctgatcttgatcactgccggtgttcct1380gttggtg皿tctggcacaacc皿cgteatgtcattggctccaagctggtt1440c皿ggctcaggtgtcggcgacgaatccacgcagtcatcgc皿gc皿cgct1500c皿g皿gctgctgcteagatgc皿皿gggtgacattctggttgtteagac1560gattetttgcC3gC皿tCg3gccttggttgttga皿ccggtggcttgacc16203gtC3CgC3gctgttgttggtettgctetgggtetcccagttgttgttgg1680gcteccagcgtcatctccgatggccagatcattectgttgactcccgtcgtgggatcatc1740teca皿ggtgcteccaacgccctttea1767〈210>3〈211>1767〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3atgaaaaaaaccaaaattgtgagcaccctgggcccggcgagcaacaccaccgatattatt60gtgaaactgattgaagcgggcgcgaacgtgtttcgttttaactttegccatggcgatcat120g朋g朋catctggcgcgtetg朋catggtgcatg朋gcgg朋朋朋tteccggc朋朋cc180gtgggcattatgctggatacca^ggcgcgccaccctggaagateccccg240朋cggc朋朋ttgattttcateccggcgattgcgagcctg3003朋ggC3CC3朋g朋朋agtggcggtgacctatccgggcctacccatgtg360ggcggccatgtgctgtttgatgatggcctgattgatetgaa^tteccg34203朋33CCgtg朋ctggtgaccgtggtgcag咖gatggcgtgctgggcggc^皿^ggc■gtgaacgcgccgggcgtggcgattaacctgccgggcatta540attcgttttggcctggateacggcattaactttattgcggcgagctttgtgcgte^ccg600caggatgtgctggatattcgtgaactgctg3CgCgCtg33cgtgcagatt660tttccgaaaattg朋3gCC3atgatettctga^gtgagc720gatggcctgatggtggcgcgtggcgatetgggcgtgga^ttccgtttgaacatgtgccg7803ttgtgC3g3aacgtctgat^cagcctgggca^ccggtgatteccgcg840acccagatgctggategcatgcagg^^cccgcgtccgacccgtgcgga■gtggcgaacgcggtgtttgatggcaccgatgcgaccatgctgagcggcga^gcgcg^c960ggcgattatcCggtgg朋3gcgtggcggcgatggcgcgte1020gcgatgatggatcaggatgcgtttgcgctgCgtg3CCg331080gcggtgggcc卿gcgtggcgcateccgcgcgteacctgggcgtg皿皿ccattgtggcg1140gCg3CCg朋3gcggctataccgcgcgtetgatcgtccg皿agcggatett1200ctggcgattecctttegcgacgtggcctgatggtg咖tggggcgtgtet1260ccgattettgcgga朋朋ccggCg33C3CCg3tgCg3tgtttgatctggcgacc皿皿^1320gcgcaggatctgggctttgcga皿g皿ggcgatctgattctgattaccgcgggcgtgccg1380gtgggcg腿gcggcaccac3皿gtgC3gCtgattggragca皿ctggtg1440cagggcagcggcgtgggcg3tg皿3gC3CCcggtgattgcgagc皿cgcg1500C3gg朋gCggcggcg朋朋tgC3g3皿ggCgatettctggtggtg皿皿ccaccgate^1560gattetctgccggcgattga皿皿gcggcggcgctggtggtgg皿3CCggcggcctgacc1620agccatgcggcggtggtgggcattgcgatgggcattccggtggtggtgggCgCgg33皿C1680gcgaccagcgtgattegcgatggccagattatteccgtggategccgtcgtggcattett1740tete朋ggcgcgaccaacgcgctgtaa1767〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>正向引物〈400>4atcgcatetgagatcgtc28〈210>5〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>反向序列〈400>5atcggaattctteaagggcgttggtegc28權利要求一種丙酮酸激酶，其特征在于，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列為(1)SEQIDNO1所示的氨基酸序列，或者(2)對(1)所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不變的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的丙酮酸激酶，其中，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列為第327位絲氨酸被丙氨酸取代的SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。3.根據權利要求1所述的丙酮酸激酶，其中，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列為第391位異亮氨酸被纈氨酸取代的SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。4.一種編碼丙酮酸激酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為編碼權利要求1-3中任意一項所述的丙酮酸激酶的核苷酸序列。5.根據權利要求4所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為(1)SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；或者(2)SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或者(3)對SEQIDN0:2或者SEQIDNO:3所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的丙酮酸激酶功能不變。6.根據權利要求4所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為SEQIDN0:2或者SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。7.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體由空載體和插入該空載體的目的基因組成，所述目的基因為權利要求4-6中任意一項所述的丙酮酸激酶的核苷酸序列。8.—種重組宿主細胞，其特征在于，所述重組宿主細胞含有權利要求7所述的重組載體。9.根據權利要求8所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。10.—種檢測鉀離子的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下(a)-(d)中的至少一種(a)權利要求1-3中任意一項所述的丙酮酸激酶；(b)權利要求4-6中任意一項所述的丙酮酸激酶的核苷酸序列；(c)權利要求7所述的重組載體；(d)權利要求8或9所述的重組宿主細胞。全文摘要本發明公開了一種丙酮酸激酶，其氨基酸序列為(1)SEQIDNO1所示的氨基酸序列，或者(2)對(1)所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不變的氨基酸序列。本發明還公開了編碼所述丙酮酸激酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述丙酮酸激酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發明的丙酮酸激酶耐熱性好、對于底物丙酮酸的Km值小，并且在寬的pH值范圍內穩定性和活性(比活力)者很高。文檔編號C12R1/245GK101698837SQ20091009068公開日2010年4月28日申請日期2009年9月8日優先權日2009年9月8日發明者不公告發明人申請人:北京利德曼生化股份有限公司