專利名稱：編碼5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合酶(epsps)的表達盒和包含它的除草劑耐受植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的核酸序列的新表達盒以及它用于獲得抑制此酶的抗除草劑的植物，尤其是膦酸家族的除草劑，特別是N-膦酰甲基甘氨酸家族。
目前技術水平農業的主要問題之一是在農作物生長區域控制不需要的自身繁殖植物或野草發育。野草繁衍導致農作物削弱以及培育它們的產量減少。為抗擊這些不需要的植物，一般使用除草劑噴射到農作物上。
存在許多類型的除草劑，特別是選擇性除草劑，它們僅作用于一組特定植物而不影響農作物。選擇性除草劑的缺點是它們的活性譜通常受限制，需要使用具有不同活性譜的其它選擇性除草劑以有效控制野草。此缺點的解決方法是使用能作用于所有植物的總除草劑。總除草劑的靶通常是參與植物重要代謝途徑的酶，使它們具有對遠緣系統發育來源的植物有廣譜活性的優點。然而，這種除草劑也有主要缺點，當它們施用于農作物以去除野草時，它們也作用于農作物。克服此缺點可通過使用對所述除草劑耐受的農作物。這種植物一般通過遺傳工程獲得，通過將編碼抗所述除草劑的酶的基因引入其基因組，從而使它們在其組織中過度表達所述酶。
EPSPS是參與莽草酸生物合成途徑的質體酶，引起芳族氨基酸合成。已知EPSPS是膦酰甲基甘氨酸類型的膦酸家族除草劑的靶酶。抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的除草劑是作為很有效的葉除草劑而熟知的。此除草劑種類中最熟知的除草劑是草甘膦[N-(膦酰甲基)甘氨酸]。也已知磺酸鹽或fosametine。草甘膦的特征是缺乏對農作物種類的選擇性，因此一般在不需要選擇性的條件下使用，例如作為總除草劑。
為克服草甘膦選擇性的問題，已開發了對此除草劑耐受的植物，通過用編碼草甘膦-耐受EPSPS酶的基因轉化所述植物。編碼草甘膦-耐受EPSPS酶的基因特別描述于專利申請EP 0837944。尤其是，草甘膦-耐受的玉米和大豆分別以Roundup-Ready CornTM和Roundup-Ready SoybeanTM的商標出售。這樣，草甘膦能施用于農作物而不影響已對其耐受的農作物。
此策略的成功基本上是基于想要變成耐受的植物組織中酶表達的質量和數量。這些表達質量和數量的參數由引入表達盒的調節元件控制，表達盒有編碼所述EPSPS酶的核酸序列。對表達盒必需的調節元件是啟動子調節序列和終止子調節序列。表達盒也能包含信號肽或轉運肽以及轉錄激活元件或增強子。然而，對表達盒中核酸系列編碼蛋白表達的質量和數量貢獻最大的調節元件是啟動子。鑒定適用于表達特定蛋白的啟動子也主要取決于所述蛋白的性質，尤其是所述蛋白表達的所需數量和質量。與特定啟動子相關的是它控制的核酸序列所編碼產物表達的量以及此表達的質量，特別是時空的質量。此外，一些啟動子是組成型的且其它是誘導型的。
用于植物中想要表達EPSPS酶的表達盒中啟動子的一個重要特征是它應允許定量表達，足以賦予草甘膦耐受性給可能受此除草劑影響的植物的所有組織。
本發明的技術問題在于獲得表達盒，其中啟動子特別適用于在轉化植物中定量和定性表達EPSPS酶，所述表達盒然后賦予所述植物對抑制此酶的除草劑的有效耐受性，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
允許高水平表達的啟動子一般是高表達蛋白的啟動子。在滿足這些標準的最常用啟動子中，作為例子提到細菌啟動子如章魚氨酸合酶基因或胭脂氨酸合酶基因的啟動子，病毒啟動子如花椰菜花葉病毒35S或19S RNAs的轉錄控制基因的啟動子(Odell等.，1985，Nature，313，810-812)或者木薯葉脈花葉病毒的啟動子(如專利申請WO 97/48819所述)。在植物來源的啟動子中，提到核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亞基基因的啟動子、專利申請EP 0 507 698所述組蛋白基因的啟動子或水稻肌動蛋白基因的啟動子(US 5,641,876)。
其它啟動子特定在某些組織的細胞中表達。這種啟動子一般是調節蛋白表達的啟動子，蛋白參與特定組織或器官的功能。在植物中，已知根-特異性啟動子如專利申請WO 00/29594所述，花-特異性啟動子如專利申請WO 98/22593、WO 99/15679或WO 99/43818所述，果實-特異性啟動子，特別是種子-特異性啟動子如專利申請WO 91/13993、WO 92/17580、WO 98/45460、WO 98/45461或WO 99/16890所述。
描述本發明涉及新表達盒，表達盒包括以轉錄方向彼此功能性連接的在植物細胞或植物中有功能的啟動子調節序列、編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的核酸序列和在植物細胞或植物中有功能的終止序列，特征在于啟動子調節序列是選自CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)植物病毒啟動子調節序列的核酸序列。
表達語“彼此功能性連接”指所述嵌合基因元件以彼此相連的方式使它們的功能協同且能表達編碼序列。例如，當能確保所述編碼序列表達時，啟動子與編碼序列功能性連接。構建根據發明的嵌合基因和其不同元件的裝配可用本領域技術人員熟知的技術完成，特別是Sambrook等.(1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Nolan C.編輯.，New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press)所述技術。表達語“在植物細胞或植物中有功能”指能在植物細胞或植物中發揮功能。
CsVMV啟動子調節序列描述于專利申請WO 97/48819(其內容納入本文供參考)，特別是包括專利申請WO 97/48819的一種序列標識符SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16代表的核苷酸序列之一的啟動子調節序列，更特別是專利申請WO 97/48819的序列標識符SEQ ID 3代表的核苷酸序列。
根據發明的第一個較佳實施方案，表達盒的啟動子調節序列以轉錄方向包括核酸序列X、Y和Z，它們分別由本專利申請的SEQ ID NO 1、2和3定義。
根據本發明，優選的表達盒啟動子調節序列由本專利申請的SEQ ID NO 4表示。
根據發明的第二個較佳實施方案，表達盒的啟動子調節序列以轉錄方向包括上面定義的核酸序列X、Y、Y和Z。含重復核酸序列Y的啟動子調節序列稱為雙CsVMV。雙CsVMV的核酸序列優選由本專利申請的SEQ ID NO 5表示。
本發明也涉及能與上面核酸序列選擇性雜交的序列、與上面序列同源的序列和所述序列的功能片段。
根據本發明，術語“核酸序列”指核苷酸或多核苷酸序列，可以是DNA或RNA類型，優選DNA類型，特別是雙鏈的。
根據發明，表達語“能選擇性雜交的序列”指與上面序列雜交的序列，雜交水平顯著大于背景噪音。背景噪音可能與現有其它DNA序列雜交有關，特別是cDNA文庫中存在的其它cDNA。能選擇性雜交的序列與上面根據發明的SEQ ID所定義序列間的相互作用產生的信號水平一般比產生背景噪音的其它DNA序列相互作用的信號水平強10倍，優選100倍。相互作用水平可測量，例如用放射性元素如32P標記探針。選擇性雜交一般在很嚴格的介質條件下獲得(例如0.03M NaCl和0.03M檸檬酸鈉，約50℃-60℃)。雜交當然可以根據當前技術水平的常規方法完成(特別是Sambrook等.，1989，《分子克隆實驗室手冊》)。
根據發明，術語“同源”指相對編碼發明融合蛋白的核苷酸序列表現出一種或多種序列修飾的核酸片段。這些修飾可根據常規突變技術獲得，或另外選擇合成寡核苷酸，寡核苷酸用于通過雜交制備所述序列。關于可能引起相同氨基酸表達的多種核酸組合，根據發明的參考序列與相應同系物間有很大的差異。相對參考序列的同源程度有利地為至少70％，優選至少80％，更優選至少90％。這些修飾一般且優選為中性，即它們不影響融合蛋白的一級序列。
測量和鑒定核酸序列間同源性的方法是本領域技術人員熟知的。可使用例如PILEUP或BLAST程序(特別是Altschul等.，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等.，1990，J.Mol.Biol.215403-10)。
測量和鑒定多肽或蛋白間同源性的方法是本領域技術人員熟知的。可使用例如UWGCG包和BESTFITT程序來計算同源性(Deverexu等.，1984，Nucleic Acid Res.12，387-395)。
根據發明，術語“片段”指根據發明的DNA序列片段，即上面已缺失部分但保持所述序列功能的序列。
根據發明，術語“EPSPS”指任何天然或突變的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶，其酶活性在于從磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸合成5-0-(1-羧乙烯基)-3-磷酸莽草酸(E.C.2.5.1.19；Morell等.，1967，J.Biol.Chem.242，82-90)。特別所述EPSPS酶可源自于任何類型的生物體。根據發明的EPSPS酶也具有耐受膦酰甲基甘氨酸家族除草劑的性質，特別是對于草甘膦。
已知編碼EPSPS的序列自然耐受膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦，或如此使用這些序列。例如，提到細菌鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的AroA基因序列(Comai等.，1983，Science 221，370-371)、細菌農桿菌(Agrobacterium)屬的CP4基因序列(WO 92/04449)或者編碼矮牽牛EPSPS(Shah等.，1986，Science 233，478-481)、番茄EPSPS(Gasser等.，1988，J.Biol.Chem.263，4280-4289)或參屬(Eleusine)EPSPS(WO 01/66704)的基因序列。
也已知通過突變使編碼EPSPS的序列對草甘膦耐受。例如，提到編碼細菌來源(Stalker等.，1985，J.Biol.Chem.260(8)，4724-4728)或植物來源(EP0293358；Ruff等.，1991，Plant Physiol.96(S)，摘要592；WO 91/04323；WO 92/06201；EP 0837944)的突變EPSPS的基因序列。編碼根據發明優選的突變植物EPSPS的基因序列編碼專利申請EP 0837944所述的玉米EPSPS，包括用異亮氨酸在102位取代蘇氨酸的第1個突變和用絲氨酸在106位取代脯氨酸的第2個突變。由于EPSPS間強的序列同源性，更特別在植物EPSPS間，攜帶相同突變的水稻EPSPS也描述于專利申請WO 00/66746和WO 00/66747。一般，本發明可使用任何EPSPS和編碼它們的基因，基因攜帶上述蘇氨酸/異亮氨酸和脯氨酸/絲氨酸突變，無論這些氨基酸相對玉米EPSPS的102位和106位的相對位置如何。為了應用此原理，本領域技術人員通過使用序列排列的標準技術容易在任何EPSPS序列中找到待突變的2種氨基酸。
根據發明的較佳實施方案，編碼表達盒中所含EPSPS的核酸序列是編碼氨基酸突變的EPSPS的序列，氨基酸突變對應于102位的蘇氨酸和106位的脯氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
根據發明的另一個較佳實施方案，編碼表達盒中所含EPSPS的核酸序列是編碼突變的EPSPS的序列，包括102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
根據發明的又一個較佳實施方案，編碼表達盒中所含EPSPS的核酸序列是編碼玉米突變的EPSPS的序列，包括102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸。
在可用于根據本發明的表達盒的終止序列中，提到例如編碼根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶的基因的nos終止序列(Bevan等.，1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)或如專利申請EP 0 633 317所述組蛋白基因的終止序列。
根據發明的表達盒也可包括編碼信號肽或轉運肽的亞細胞定址序列(？addressing sequence)。這種序列位于編碼EPSPS的核酸序列上游或下游，能指導所述EPSPS特異地到宿主生物體的細胞區室中。例如，表達盒可包括編碼信號肽或轉運肽的序列用于指導EPSPS到特定的細胞質區室中，如線粒體、胞質內、內質網或液泡。
這種序列的作用特別描述于期刊Plant Molecular Biology(1998)38期，大部分是關于將蛋白轉運到植物細胞的不同區室中(在植物細胞中分選蛋白到液泡，127-144頁；核孔復合體，145-162頁；蛋白轉運到和穿過葉綠體包膜(envelopemembranes)，91-207頁；靶向葉綠體中類囊體蛋白的多種途徑，209-221頁；植物中的線粒體蛋白輸入，311-338頁)。
根據一個實施方案，轉運肽可以是葉綠體或線粒體定址信號，它然后在葉綠體或線粒體中被切割。
轉運肽可以是單或雙轉運肽。雙轉運肽任選通過中間序列分離，即它們以轉錄方向包括編碼植物基因轉運肽的序列，植物基因編碼位于質體的酶、植物基因成熟N-末端部分的一部分序列，植物基因編碼位于質體的酶、以及然后編碼植物基因第二種轉運肽的序列，植物基因編碼位于質體的酶。例如，這些雙轉運肽描述于專利申請EP 0 508 909。
根據發明，表達盒也可包括其它調節序列，調節序列位于啟動子和編碼序列間，如轉錄激活物(增強子)，例如專利申請WO 87/07644所述煙草花葉病毒(TMV)、Carrington和Freed所述煙草蝕紋病毒(TEV)或玄參花葉病毒(US 5 994 521)的轉錄激活物。根據發明的表達盒也可包含內含子，特別是促進單子葉植物中基因表達的內含子，如專利申請WO 99/34005所述水稻肌動蛋白基因的內含子1或玉米adh1內含子，或者是促進雙子葉植物基因表達的內含子，如擬南芥屬組蛋白內含子(EP 0850311)。
本發明也涉及克隆和/或表達載體，包括根據發明的表達盒。根據發明的載體用于轉化宿主生物體，特別是植物，并在其中表達EPSPS。此載體可以是質粒、粘粒、噬菌體或病毒。用于轉化根據發明的植物細胞或植物的載體優選是質粒。一般，此載體的主要性質應是在宿主生物體細胞中維持本身和自身復制的能力，特別是通過復制起點的存在，以及在其中表達EPSPS的能力。選擇這種載體以及將根據發明的表達盒插入其中的技術廣泛描述于Sambrook等。(1989，《分子克隆實驗室手冊》，Nolan C.編輯.，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)且是本領域技術人員的一般知識的一部分。除根據發明的表達盒之外，本發明所用載體也有利地包含另一個含選擇標記的表達盒。此選擇標記能選擇有效轉化的宿主生物體，即摻入載體的生物體。根據發明的一個特定實施方案，待轉化的宿主生物體是植物。在可使用的選擇標記中，提到的標記包含抗生素抗性基因，例如潮霉素磷酸轉移酶基因(Gritz等.，1983，Gene 25179-188)，也提到含除草劑耐受基因的標記，如用于耐受雙丙氨膦的bar基因(White等.，NAR 181062，1990)、用于耐受草甘膦的EPSPS基因(EP 0837944)或另外用于耐受異唑的HPPD基因(WO 96/38567)。同樣提到編碼易鑒定酶如GUS酶的基因和編碼色素或酶的基因，酶調節轉化細胞中的色素生成。這種選擇標記基因特別描述于專利申請WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567和WO 97/04103。
本發明也涉及用上述載體轉化的植物細胞。術語“轉化的植物細胞”指將根據發明的表達盒摻入其基因組的植物細胞，因而產生EPSPS。為獲得根據發明的轉化植物細胞，本領域技術人員可使用許多已知的轉化方法之一。這些方法之一是使待轉化的植物細胞接觸聚乙二醇(PEG)和發明的載體(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。電穿孔是另一種方法，使待轉化的植物細胞或組織和發明載體經受電場(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一種方法是通過微注射將載體直接注射到植物細胞或植物組織中(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)。可有利地使用“生物導彈”法。它是用粒子轟擊植物細胞或植物組織，發明的載體吸收于粒子上((Bruce等.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)，9692-9696；Klein等.，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美國專利號4,945,050)。轉化植物細胞優選用農桿菌屬細菌完成，優選通過用根癌農桿菌(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等.，1983，Gene23(3)315-330)或發根農桿菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物細胞或組織。用根癌農桿菌轉化植物細胞優選根據Ishida等所述方案(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)完成。本領域技術人員會根據待轉化植物細胞的性質選擇適當方法。
本發明的一個主題是產生對EPSPS-抑制除草劑耐受的植物的方法，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。此方法是從上述轉化植物細胞中再生轉化植物。通過此方法，根據發明的轉化植物的基因組中包含根據發明的表達盒且在其組織中表達EPSPS。
因此，本發明包括含根據發明的表達盒的轉化植物、這些植物的部分和這些植物的后代。表達語“這些植物的部分”指這些植物的任何器官，無論是地上或是地下。地上器官是莖、葉和花。地下器官主要是根，但它們也可以是塊莖。術語“后代”主要指種子，種子包含衍生自自這些植物彼此再生的胚。通過擴展，術語“后代”應用于在各新生代形成的所有種子，各代來源于植物與根據發明方法轉化的植物間的雜交。
因此，本發明的一個主題是轉化植物，有至少1個根據發明的表達盒以穩定方式整合到基因組中。
因而轉化的植物耐受EPSPS-抑制除草劑，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
根據發明的轉化植物也包括來源于生長和/或雜交上面植物的轉化植物，同樣包括這些植物的種子。
當然，除根據發明的表達盒之外，根據發明的轉化細胞和植物可包括至少1個其它表達盒，表達盒包含編碼感興趣蛋白的多核苷酸。在編碼感興趣蛋白的多核苷酸中，提到編碼另一種抗除草劑的酶的多核苷酸，例如用于編碼耐受雙丙氨膦的bar酶的多核苷酸(White等.，NAR 181062，1990)、或用于編碼耐受異唑的HPPD酶的多核苷酸(WO 96/38567；WO 99/24585；WO 99/24586)。也提到編碼殺蟲毒素的多核苷酸，例如編碼細菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒素的多核苷酸(例如參見國際專利申請WO 98/40490)。其它抗疾病的多核苷酸也能包含于這些植物，例如專利申請EP 0 531 498或美國專利5,866,778所述編碼草酸氧化酶的多核苷酸或編碼抗細菌和/或抗真菌肽的多核苷酸，如專利申請WO 97/30082、WO 99/24594、WO 99/02717、WO 99/53053和WO 99/91089所述。同樣提到編碼植物農藝學特征的多核苷酸，特別是美國專利5,552,306和US 5,614,313及專利申請WO 98/46763和WO 98/46764所述編碼δ-6去飽和酶的多核苷酸或編碼專利申請WO 00/01833和WO 00/36127所述編碼絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)的多核苷酸。
另外的表達盒也可通過根據發明的載體整合。在此情況中，載體包括根據發明的表達盒和至少1個編碼另一感興趣蛋白的表達盒。
它們也可通過至少1個其它載體整合，載體包括所述另外的表達盒，根據上面定義的常規技術。
根據發明的植物也能通過雜交親代獲得，1個親代攜帶根據發明的表達盒，另1個攜帶編碼至少1種其它感興趣蛋白的另一表達盒。
根據發明的轉化植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。這些植物優選是具有農藝學興趣的植物。單子葉植物有利地是小麥、玉米或水稻，雙子葉植物有利地是油菜、大豆、煙草或棉花。
本發明也涉及關于EPSPS-抑制除草劑保護農作物的方法，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦，特征在于所述植物用載體轉化，載體包括根據發明的表達盒。
本發明同樣涉及根據發明處理植物的方法，特征在于所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
本發明也涉及控制農作物中野草的方法，特征在于培育包含根據發明的表達盒的轉化植物，在于所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
本發明同樣涉及培育轉化植物的方法，包括根據發明的表達盒，特征是在適合生長所述植物的田間區域種植所述轉化植物的種子，將農用化學品組合物施用于所述田間區域，而基本上不影響所述轉化種子或所述轉化植物，然后當生長植物達到所需成熟度時收獲它們，且任選地從收獲植物中分離種子。
根據發明，術語“農用化學品組合物”指包括至少1種活性產物的任何農用化學品組合物，活性產物具有下列活性除草、殺真菌、殺細菌、殺病毒或殺蟲。
根據發明培育方法的一個較佳實施方案，農用化學品組合物包括有至少1種除草活性的至少1種活性產物，更優選EPSPS-抑制除草劑，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
從下面的實驗例子可更清楚地理解發明的不同方面。
下面這些例子描述的所有方法或操作通過例子給出且對應于選擇各種可用方法用于獲得相同結果。此選擇對結果的質量沒有影響，因此本領域技術人員可使用任何合適方法以獲得相同結果。尤其是，所用全部重組DNA技術根據標準方案完成，除非例子中另有說明，描述于Sambrook等.(1989，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Nolan C.編輯.，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)、Sambrook和Russel(2001，《分子克隆實驗室手冊》，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)、Ausubel等.(1994，《最新分子生物學實驗指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Current protocols，USA，第1和2卷)和Brown(1998，《分子生物學實驗室傳真》(Molecular Biology LabFax)，第2版，Academic Press，UK)。用于植物分子生物學的標準材料和方法描述于CroyR.D.D.(1993，《植物分子生物學實驗室傳真》(Plant Molecular Biology LabFax)，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK))。PCR(聚合酶鏈式反應)的標準材料和方法也描述于Dieffenbach和Dveksler(1995，《PCR引物實驗室手冊》(PCR PrimerA laboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)和McPherson等.(2000，《PCR-基礎從背景到實驗臺》(PCR-BasicsFrom background to bench)，第1版，Springer Verlag，Germany)。
實施例實施例1CsVMV啟動子序列克隆入多克隆載體pRD 254由Scripps研究所(La Jolla，CA，USA)提供的質粒pILTAB 357包含pBIN 19載體(Clontech)中的下列元件-CsVMV啟動字(序列由SEQ ID NO 4描述)-多克隆位點-NOS終止子在CsVMV啟動子序列中定義3個區域，稱為CsVMV X、CsVMV Y和CsVMV Z。
-CsVMV X從位置10到位置227(SEQ ID NO 1，長度218bp)-CsVMV Y從位置228到位置394(SEQ ID NO 2，長度167bp)-CsVMV Z從位置397到位置522(SEQ ID NO 3，長度126bp)在CsVMV啟動子的原始序列中，X和Y區毗鄰且Y和Z區由2bp序列AT分開。
克隆載體pRD 254相當于商業載體pBlueScript II SK(-)(Clontech)，它進行突變以便替代具有Pvu II位點的ApR基因中包含的獨特Sca I位點。
pILTAB 357的Hind III和Xba I位點間包含的532bp克隆入克隆載體pRD254，以便獲得質粒pRD 257。
實施例2CsVMV-EPSPS表達盒的產生開發了導入質粒的表達盒，稱為pSF29。
pSF29盒包括序列標識符SEQ ID NO 4所述CsVMV啟動子、編碼專利申請EP0508909所定義最佳化轉運肽(OTP)的序列、編碼玉米EPSPS的序列，包括專利申請0837944所述蘇氨酸102異亮氨酸和脯氨酸106絲氨酸突變，及Bevan等.(1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)所述nos終止子。
實施例3將表達盒整合到農桿菌T-DNA-載體中穿梭質粒用于在超雙元質粒pTVK 291中重組(Jun等.，1987)。2個質粒上存在的獨特COS位點間的重組產生對應于2個質粒的融合的單環分子。
通過DH5α[pSF29]、C2110[pTVK 291]和JC2073菌株(“輔助”菌株)的三親代雜交獲得pSF29與超雙元質粒pTVK 291間的重組。所得質粒稱為pSFK29。所得菌株C2110[pSFK29]在LB培養基上選擇，培養基含3種抗生素慶大霉素、卡那霉素和萘啶酸。萘啶酸可相對DH5α或JC2073選擇C2110；因為C2110含有對萘啶酸的染色體抗性，抗性在雜交中不能轉移到其它菌株。結合慶大霉素和卡那霉素能選擇含pSF29和pTVK 291的細菌。此外，pSF29不能在C2110中復制，除非它與pTVK 291重組，因為C2110含pTVK 291攜帶的RK2復制起點，但不含pSF29攜帶的pBR 322復制起點。
重組質粒然后通過第2次三親代雜交轉移到農桿菌菌株LBA 4404。所得菌株LBA 4404[pSFK29]在AB培養基上選擇(選擇農桿菌)，培養基含卡那霉素和慶大霉素。
實施例4用具CsVMV-EPSPS表達盒的根癌農桿菌轉化玉米通過農桿菌轉化玉米Zea mays是根據Ishida，Y.等.，(1996，NatureBiotechnology，14，745-750)所述方法完成。實施例3所述卸甲(di sarmed)根癌農桿菌菌株與未成熟玉米胚共培養。對胚選擇施用0.88mM草甘膦。獲得自抗性杯花萼(calices)的轉化產物然后回交，測試它們后代的草甘膦耐受性。
實施例5測試轉化產物的草甘膦耐受性每次作用獲得的20個種子在小盆豐富的混合肥料中溫室播種，3-到4-葉階段的萌后處理用對應于4kg/ha的草甘膦劑量進行(即4kg活性物質每5001)，使用校準處理塔。然后計算處理后存活的產物。結果顯示90％含CsVMV-EPSPS表達盒的轉化產物有能耐受對應于4kg/ha草甘膦劑量的植物。每次測試的耐受植物數量不一致是由于這些產物是性狀雜合子(CsVMV-EPSPS表達盒)且具有1個或多個整合座位，一些轉化產物通過盒插入位置提供更佳的EPSPS表達，因此對草甘膦耐受性更佳。
序列表<110>拜爾農科股份有限公司(Bayer CropScience S.A.)<120>編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的表達盒和包含它的除草劑耐受植物<130>BCS 02-4012<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>219<212>DNA<213>木薯葉脈花葉病毒<400>1agaaggtaat tatccaagat gtagcatcaa gaatccaatg tttacgggaa aaactatgga 60agtattatgt gagctcagca agaagcagat caatatgcgg cacatatgca acctatgttc 120aaaaatgaag aatgtacaga tacaagatcc tatactgcca gaatacgaag aagaatacgt 180agaaattgaa aaagaagaac caggcgaaga aaagaatct219<210>2<211>168<212>DNA<213>木薯葉脈花葉病毒<400>2tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa 60agagacatag aggacacatg taaggtggaa aatgtaaggg cggaaagtaa ccttatcaca 120aaggaatctt atcccccact acttatcctt ttatattttt ccgtgtca 168<210>3<211>127<212>DNA<213>木薯葉脈花葉病毒<400>3tttttgccct tgagttttcc tatataagga accaagttcg gcatttgtga aaacaagaaa60
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權利要求
1.一種表達盒，盒包括以轉錄方向彼此功能性連接、在植物細胞或植物中有功能的啟動子調節序列、編碼EPSPS的核酸序列和在植物細胞或植物中有功能的終止調節序列，其特征在于，啟動子調節序列選自CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)植物病毒啟動子調節序列的核酸序列。
2.如權利要求1所述的表達盒，其特征在于，啟動子調節序列以轉錄方向包含核酸序列X、Y和Z，它們分別由SEQ ID NO 1、2和3定義。
3.如權利要求1和2所述的表達盒，其特征在于，啟動子調節序列由SEQ IDNO 4表示。
4.如權利要求1所述的表達盒，其特征在于，啟動子調節序列由SEQ ID NO 5表示。
5.如權利要求1到4中任一項所述的表達盒，其特征在于，編碼EPSPS的核酸序列是編碼氫基酸突變的EPSPS的序列，氨基酸突變對應于102位的蘇氨酸和106位的脯氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
6.如權利要求5所述的表達盒，其特征在于，編碼EPSPS的核酸序列是編碼突變EPSPS的序列，包括在102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
7.如權利要求6所述的表達盒，其特征在于，編碼突變EPSPS的核酸序列是編碼玉米突變EPSPS的序列，包括在102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸。
8.如權利要求1到7中任一項所述的表達盒，其特征在于，所述表達盒也包含雙轉運肽，雙轉運肽以轉錄方向包含編碼植物基因轉運肽的序列，植物基因編碼位于質體的酶、植物基因成熟N-末端部分的一部分序列，植物基因編碼位于質體的酶、以及然后編碼植物基因第二種轉運肽的序列，植物基因編碼位于質體的酶。
9.轉化植物細胞或植物的克隆和/或表達載體，其特征在于，所述載體包含至少1個權利要求1到8中任一項所述的表達盒。
10.一種轉化的植物細胞，其特征在于，所述細胞包含權利要求1到8中任一項所述的表達盒。
11.一種轉化的植物，其特征在于，所述植物包含權利要求1到8中任一項所述的表達盒。
12.如權利要求11所述的轉化植物種子，其特征在于，所述種子包含權利要求8所述的表達盒。
13.如權利要求11所述的處理植物方法，其特征在于，所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述EPSPS-抑制除草劑是草甘膦。
15.一種控制農作物中野草的方法，其特征在于，培育權利要求11所述的轉化植物，所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述EPSPS-抑制除草劑是草甘膦。
17.一種培育權利要求11所述的轉化植物的方法，其特征在于，所述方法是在適合生長所述植物的田間區域種植所述轉化植物的種子，將農用化學品組合物施用于所述田間區域，而基本上不影響所述轉化種子或所述轉化植物，然后當生長植物達到所需成熟度時收獲它們，且任選地從收獲植物中分離種子。
全文摘要
本發明涉及包含編碼EPSPS的核酸序列的新表達盒。特別是本發明涉及新表達盒，表達盒包含以轉錄方向彼此功能性連接、在植物細胞或植物中有功能的啟動子調節序列、編碼EPSPS的核酸序列和在植物細胞或植物中有功能的終止序列，特征在于啟動子調節序列是選自CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)植物病毒啟動子調節序列的核酸序列。
文檔編號C12N15/83GK1720330SQ200380105147
公開日2006年1月11日 申請日期2003年12月10日 優先權日2002年12月12日
發明者F·施米特, J·-M·費呂略, A·薩利安德, E·佩吉特 申請人:拜爾農科股份有限公司