專利名稱：一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌。本發明還涉及一種用上述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法。
背景技術：
脂肪醇是合成表面活性劑、洗滌劑、增塑劑及其他多種精細化學用品的基礎化工 原料，廣泛應用于紡織、日化、造紙、食品、醫藥、皮革等領域。其中，C12-C14鏈長的脂肪醇 稱作中碳脂肪醇，也稱作洗滌劑醇，是表面活性劑的主要原料，中碳醇的產量占總醇產量的 55%之多。其價格直接影響著脂肪醇的價格和利潤，因此，中碳醇的生產具有重要的應用和 市場前景。目前，工業上生產的脂肪醇主要來自兩個方面(1)合成脂肪醇以化石能源_烯烴為原料合成脂肪醇，主要是通過羰基合成法和 齊格勒合成法進行，前者的原料是α-烯烴或內烯烴，后者的原料為乙烯；(2)天然脂肪醇以天然油脂為原料生產天然脂肪醇，其主要工藝路線是在Cu-Cr 或Cd-Cu-Cr等催化劑作用下，將脂肪酸甲酯或游離脂肪酸進行催化加氫得到脂肪醇(趙國 志等，1994)。隨著石油資源的日益減少和價格的極不穩定，以烯烴為原料的合成脂肪醇產業正 面臨著很大的發展障礙。對于天然脂肪醇而言，國內天然脂肪醇的油脂原料主要從馬來西 亞、印度尼西亞和菲律賓等國家進口，其價格隨石油和豆油價格漲價而猛漲，造成天然脂肪 醇生產成本過高，這是引起國內天然脂肪醇價格居高不下的主要原因。因此，尋找合適、豐 富的脂肪醇制備原料將是今后脂肪醇工業發展的重點方向。而利用微生物法合成脂肪醇可 以很好的解決原料來源問題，并且和化學催化相比，微生物催化合成脂肪醇是一種更加綠 色環保的方法，因此是今后脂肪醇工業發展的一個新的方向。大腸桿菌具有遺傳背景清楚，生長速度快，可實現高密度培養的優點，因此可以很 好的用于代謝產物的生產。脂肪醇生產中很關鍵的一步是脂肪酸的生產，而乙酰_CoA(乙 酰輔酶A)到丙二酰-CoA的轉化，是脂肪酸生物合成中的限速酶。在大腸桿菌中過量表達 乙酰-CoA羧化酶可以加快其脂肪酸合成的速率，從而使其積累更多的脂肪酸。硫脂酶催化脂酰-ACP為游離脂肪酸，但是大腸桿菌自身的硫脂酶主要作用于 C16和C18的脂酰-ACP，因此它主要積累C16和C18的脂肪酸。而據報道，U. californica, C. calophylla, C. hookeriana以及C. palustvis等生長的種子中積累癸酸和月桂酸等 中短鏈脂肪酸(Voelker et al.，1992，Filichkin et al. ,2005, Dehesh et al.，1996， Katayoon et al.，1996)。因此，在大腸桿菌中過量表達U. californica的硫脂酶基因BTE， 或 C. calophylla 的 Cc FatB2,或 C. hookeriana 的 Ch FatB2,或 C. palustvis 的 Cp FatB1 ^ 便可以獲得中短鏈的脂肪酸。游離脂肪酸在大腸桿菌脂酰-C0A合成酶(fadD)的作用下活化為脂酰_CoA，它可 繼續在脂酰-CoA脫氫酶(fadE)的作用下轉化為烯酰-CoA，從而進入β-氧化途徑。脂酰-CoA是脂肪醇生物合成途徑的一個中間物，有必要阻止脂酰-CoA進入降解代謝途徑以 積累脂酰-CoA用于中碳脂肪醇的生物合成。大腸桿菌自身并不能完成脂酰-C0A到脂肪醇的轉化，但是來源于Arabidopsis thaliana和Simmondsia chinensis的脂酰-CoA還原酶具有將脂酰-CoA還原為脂肪醇 的活性。因此，在大腸桿菌內過量表達A. thaliana的脂酰-CoA還原酶編碼基因CER4或 S. chinensis的脂酰-CoA還原酶編碼基因FAR，就可以在大腸桿菌內實現脂酰-CoA到脂肪 醇的轉化。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌。本發明的又一目的是提供利用上述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法。為實現上述目的，本發明中提供的用于制備中碳脂肪醇的，是通過以下方法構建 而成通過PCR (聚合酶鏈式反應)擴增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因和脂酰-CoA 還原酶基因，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達載體 pET-30a(+)或pACYCDuet-1，載體片斷膠回收后，將載體基因片段按摩爾比為1_2 4-5 的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4-7°C連接15-30小時，連接產物于38_42°C熱擊轉化 E. coli DH5a感受態細胞，涂布平板培養15-30小時，PCR篩選陽性克隆。陽性克隆提取質 粒DNA，酶切和測序鑒定后，熱擊轉化E. coli BL21 (DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE 基因后即得目標工程大腸桿菌。本發明提供的利用上述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法，是將工程大腸桿 菌以1-2 100-130(體積)的比例接種內含卡那霉素和氯霉素的M9液體培養液中， 在35-37 V，225rpm條件下培養至OD6tltlnm為0. 6-0. 8時，加入誘導劑IPTG至終濃度為 0. 1-0. 2mmol化―1，誘導目的蛋白的過量表達，然后轉入28_30°C，225rpm繼續培養18-24小 時；培養后的菌液離心取上清液，用等體積的正己烷萃取，制得中碳脂肪醇，所得脂肪醇通 過GC-MS分析其組成及含量。正己烷減壓蒸餾后回收使用。本發明是在大腸桿菌中表達了調控脂肪酸生物合成以及控制脂肪酸鏈長以及還 原脂肪酸的一系列關鍵酶基因。所獲得的工程大腸桿菌可高密度培養，生長速度快，可很好 的用于脂肪醇的生物合成。
圖1是在實施例1中構建pA-accAB⑶表達載體過程的示意圖；圖2是在實施例1中構建pET-BTE/CER4表達載體過程的示意圖。
具體實施例方式本發明通過在大腸桿菌中過量表達乙酰-CoA羧化酶、硫脂酶、脂酰-CoA還原酶， 并失活大腸桿菌的脂酰-CoA脫氫酶，使大腸桿菌能夠高效地將糖類轉化為中碳脂肪醇。本發明通過PCR擴增乙酰-CoA羧化酶基因，硫脂酶基因，脂酰-CoA還原酶基因， 用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達載體pET-30a(+)或pACY⑶uet-Ι，載體片斷膠回收后，將載體基因片段按摩爾比為1 5的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4°C連接過夜，連接產物42°C熱擊轉化E. coli DH5 α感受態細胞，涂布平板培 養過夜，PCR篩選陽性克隆。陽性克隆提取質粒DNA，酶切和測序鑒定后，熱擊轉化Ε. coli BL21 (DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE基因后即得目標工程大腸桿菌。硫脂酶基因為來源于Umbellularia californica的BTE基因，或來源于Cuphea calophylla的Cc FatB2基因，或來源于Cuphea hookeriana的Ch FatB2基因，或來源于 Cuphea palustvis 的 Cp FatB1 基因，或同 BTE，Cc FatB2, Ch FatB2 和 Cp FatB1 同源性超過 70%的DNA序列。脂酰-CoA還原酶基因為來源于Arabidopsis thaliana的CER4基因，或來源于 Simmondsia chinensis的FAR基因，或同CER4和FAR基因同源性超過70%的DNA序列。乙酰-CoA 羧化酶基因為來源于 Acinetobacter calcoaceticus 的 accABCD 基因， ^jfeiJIT- E. coli 白勺 accABCD SS, ^^iHT Corynebacteriumglutamicum 白勺 dtsRl-accBC 基因，或同這些基因同源性超過70 %的DNA序列。脂酰-CoA脫氫酶基因為大腸桿菌的fadE基因。構建好的工程大腸桿菌以1 100的比例接種內含卡那霉素和氯霉素的M9液體 培養液中，在37°C，225rpm條件下培養至OD6tltlnm (需氧量)為0. 6-0. 8時，加入誘導劑IPTG至 終濃度為0. Immol · L—1，誘導目的蛋白的過量表達，然后轉入30°C，225rpm繼續培養18-24 小時。培養后的菌液12000g離心10分鐘，取上清液，用等體積的正己烷萃取2-3次，減壓 蒸發除去正己烷后，制得中碳脂肪醇，所得脂肪醇通過GC-MS分析其組成及含量。正己烷減 壓蒸餾后回收使用。以下舉實施例并結合附圖對本發明作詳細描述。實施例1通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，U. californica的BTE基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE 基因以用于生物合成中碳脂肪醇。1. 1)外源基因的克隆和表達載體的構建1. 1. 1)外源基因的克隆1. 1. 1. 1)A. calcoaceticus乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆提取A. calcoaceticus基因組DNA，根據GenBank序列設計引物，PCR擴增下列基 因accA :acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit) GeneID(NCBI) 2878570 ；accBC ( accB 禾口 accC ^？ 13 ) :accB :biotin carboxyl carrier protein ofacetyl-CoA, GeneID(NCBI) 2878571 ；accC :acetyl_CoA carboxylase, GeneID(NCBI) 2878572 ；accD :acetyl_CoA carboxylase, beta subunit, GeneID(NCBI) :2878573。再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。1. 1. 1. 2)硫脂酶基因的克隆提取U. californica的總mRNA，然后反轉錄為cDNA，根據GenBank序列設計引物，PCR擴增克隆其硫脂酶基因BTE，GI (NCBI) :170555。再利用膠回收試劑盒回收目的基因。1. 1. 1. 3)脂酰-CoA還原酶基因的克隆提取A. thaliana的總mRNA，然后反轉錄為cDNA，根據GenBank序列設計引物，PCR 擴增脂酰-CoA還原酶基因CER4，GI (NCBI) :240256152。再利用膠回收試劑盒回收目的基 因。1. 1. 2)表達載體的構建1. 1. 2. 1) pA-accABCD表達載體的構建(請參閱圖1)1. 1. 2. 1. 1) pA-accA 載體的構建將膠回收后的accA基因與pACYCDuet-Ι載體(Novagen)用BamH I和Sac I進行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pA-accA后，再通過限制性酶切和測序鑒定。1. 1. 2. 1. 2) pA-accABC 載體的構建將膠回收后的accBC基因與pA-accA載體用Nde I和Xho I進行雙酶切，載體與 外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5a，PCR篩選陽性 克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pA-accABC后，再通過限制性酶切和測序鑒定。1. 1. 2. 1. 3) pA-accD 載體的構建將膠回收后的accD基因與pACYCDuet-Ι載體(Novagen)用BamH I和Sac I進行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pA-accD后，再通過限制性酶切和測序鑒定。1. 1. 2. 1. 4) pA-accABCD 表達載體的構建以pA-accD重組質粒為模板，擴增含有T7啟動子的accD基因即T7_aCCD，用Sal I和Afl II分別雙酶切T7-aCCD和pA-accABC，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例， 4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5ci，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒 pA-accABCD后，再通過限制性酶切和測序鑒定pA-accABCD。1. 1. 2. 2) pET-BTE/CER4表達載體的構建(請參閱圖2)1. 1. 2. 2. 1) pET-BTE 表達載體的構建分別將膠回收后的BTE基因與pET_30a(+)載體用Nde I和Not I進行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒pET-BTE后，再通過限制性酶切和測序鑒定 pET-BTE。1. 1. 2. 2. 2) pET_CER4 表達載體的構建分別將膠回收后的CER4基因和pET_30a(+)載體用Bgl II和Xho I進行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒PET-CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定 PET-CER4。1. 1. 2. 2. 3) pET_BTE/CER4 表達載體的構建以pET-CER4為模板，PCR擴增含有T7啟動子的CER4基因T7-CER4。然后分別將T7-CER4和載體pET-BTE用Not I和Xho I進行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coliDH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組質粒PET-BTE/CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定pET_BTE/CER4。1. 2) pA-accADBC 和 pET_BTE/CER4 共同轉化大腸桿菌pET-BTE/CER4熱擊轉化E. coli BL21 (DE3)感受態細胞，通過PCR篩選獲得陽性克 隆，提取陽性克隆的質粒后再通過酶切和測序鑒定；然后將pA-accADBC重組質粒熱擊轉化 含有PET-BTE/CER4的大腸桿菌感受態細胞，通過PCR篩選獲得陽性克隆，提取陽性克隆的 質粒后再通過酶切和測序鑒定。由此獲得了含有pA-accADBC和pET_BTE/CER4兩個表達載 體的工程大腸桿菌。1. 3)大腸桿菌fadE基因的敲除采用TargeTron 基因敲除系統(Sigma-Aldrich)對大腸桿菌的fadE基因進行敲 除。1. 4) SDS-PAGE鑒定目標蛋白的表達將活化后的工程大腸桿菌按1 100的接種量接種到IOmL LB液體培養液中(內 含50 μ g · ml/1的卡那霉素和34 μ g · ml/1氯霉素)，37°C，225rpm振蕩培養2h，在菌液中加 入誘導劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉入30°C，225rpm繼續培養3_4h，誘導表達目的 蛋白。取出誘導后的培養物，12000g離心2min，收集菌體，菌體細胞用0. 05mol/L的磷酸緩 沖液(pH7. 8)洗滌一次，按1 10的比例再用此緩沖液重懸細胞，加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸lOmin，瞬時高速離心，10% SDS-PAGE電泳檢測，即可檢測到目標蛋白的 表達。1. 5)工程大腸桿菌的培養將活化后的工程大腸桿菌按1 100的比例接種到M9液體培養液中(內含 50 yg -mr1的卡那霉素和34 μ g -mr1氯霉素)，37°C，225rpm條件下振蕩培養，當OD6tltlnm為 0. 6-0. 8時，在菌液中加入誘導劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉入在30°C，225rpm條 件下，繼續培養18-24h。1.6)脂肪醇的提取誘導培養后的菌液在12000g條件下，離心lOmin，收集上清液，并用等體積的正己 烷萃取2-3次，旋轉蒸發除去正己烷后即得中碳脂肪醇。正己烷回收利用。1. 7)脂肪醇組成及含量的測定得到的脂肪醇通過GC-MS測定其組成及含量。實施例2通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD), C. calophylla的Cc FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例3通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. hookeriana的Ch FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例4
通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. palustvis的Cp FatB1基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例5通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， U. californica的BTE基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用 于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例6通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. calophylla的Cc FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例7通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. hookeriana的Ch FatB2基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例8通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. palustvis的Cp FatB1基因和A. thaliana的CER4基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以 用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例9通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，U. californica 的 BTE 基因和 A. thaliana 的 CER4 基因，并敲除大腸桿菌 的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。9. 1)外源基因的克隆和表達載體的構建9. 1. 1)外源基因的克隆9. 1. 1. 1)C. glutamicum乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆提取C. glutamicum基因組DNA，根據GenBank序列設計引物，PCR擴增下列基因dtsRl :acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit) ，GeneID(NCBI) 3345446 ；accBC :biotin carboxylase 禾口 biotin carboxyl carrier protein, GeneID(NCBI) 3343021 ；再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。9. 1. 1.2)硫脂酶基因的克隆提取U. californica的總mRNA，然后反轉錄為cDNA，根據GenBank序列設計引物， PCR擴增克隆其硫脂酶基因BTE，GI (NCBI) :170555。再利用膠回收試劑盒回收目的基因。9. 1. 1. 3)脂酰-CoA還原酶基因的克隆提取A. thaliana的總mRNA，然后反轉錄為cDNA，根據GenBank序列設計引物，PCR 擴增脂酰-CoA還原酶基因CER4，GI (NCBI) :240256152。再利用膠回收試劑盒回收目的基 因。
9. 1. 2)表達載體的構建9. 1. 2. 1) pA-dtsRl/accBC 表達載體的構建9. 1. 2. 1. l)pA-dtsRl 載體的構建將膠回收后的dtsRl基因用Pag I和BamH I進行雙酶切，載體 pACYCDuet-1 (Novagen)用Nco I和BamH I進行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組質粒pA-dtsRl后，再通過限制性酶切和測序鑒定。9. 1. 2. 1. 2) pA-dtsRl/accBC 載體的構建分別將膠回收后的accBC基因與pA-dtsRl載體用Mun I和Pac I進行雙酶切，載 體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5a，PCR篩 選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒PA-dtsRl/accBC后，再通過限制性酶切和測序鑒定。9. 1. 2. 2)pET-BTE/CER4 表達載體的構建(附圖 2)9. 1. 2. 2. DpET-BTE 表達載體的構建分別將膠回收后的BTE基因與pET_30a(+)載體用Nde I和Not I進行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒ρΕΤ-ΒΤΕ后，再通過限制性酶切和測序鑒定 ρΕΤ-ΒΤΕ。9. 1. 2. 2. 2)pET_CER4 表達載體的構建分別將膠回收后的CER4基因和pET_30a(+)載體用Bgl II和Xho I進行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5 α , PCR 篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質粒PET-CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定 PET-CER4。9. 1. 2. 2. 3) pET-BTE/CER4 表達載體的構建以pET-CER4為模板，PCR擴增含有Τ7啟動子的CER4基因T7-CER4。然后分別將 T7-CER4和載體ρΕΤ-ΒΤΕ用Not I和Xho I進行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過夜，連接產物轉化E. coliDH5a , PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組質粒PET-BTE/CER4后，再通過限制性酶切和測序鑒定pET_BTE/CER4。9. 2) pA-dtsRl/accBC 和 pET_BTE/CER4 共同轉化大腸桿菌pET-BTE/CER4熱擊轉化E. coli BL21 (DE3)感受態細胞，通過PCR篩選獲得陽性克 隆，提取陽性克隆的質粒后再通過酶切和測序鑒定；然后將pA-dtsRl/accBC重組質粒熱擊 轉化含有PET-BTE/CER4的大腸桿菌感受態細胞，通過PCR篩選獲得陽性克隆，提取陽性克 隆的質粒后再通過酶切和測序鑒定。由此獲得了含有pA-dtsRl/accBC和pET_BTE/CER4兩 個表達載體的工程大腸桿菌。9. 3)大腸桿菌fadE基因的敲除采用TargeTron 基因敲除系統(Sigma-Aldrich)對大腸桿菌的fadE基因進行敲 除。9. 4) SDS-PAGE鑒定目標蛋白的表達將活化后的工程大腸桿菌按1 100的接種量接種到IOmL LB液體培養液中(內含50 μ g · ml/1的卡那霉素和34 μ g · ml/1氯霉素)，37°C，225rpm振蕩培養2h，在菌液中加 入誘導劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉入30°C，225rpm繼續培養3_4h，誘導表達目的 蛋白。取出誘導后的培養物，12000g離心2min，收集菌體，菌體細胞用0. 05mol/L的磷酸緩 沖液(pH7. 8)洗滌一次，按1 10的比例再用此緩沖液重懸細胞，加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸lOmin，瞬時高速離心，10% SDS-PAGE電泳檢測，即可檢測到目標蛋白的 表達。9.5)工程大腸桿菌的培養將活化后的工程大腸桿菌按1 100的比例接種到M9液體培養液中(內含 50 yg -mr1的卡那霉素和34 μ g -mr1氯霉素)，37°C，225rpm條件下振蕩培養，當OD6tltlnm為 0. 6-0. 8時，在菌液中加入誘導劑IPTG至終濃度0. Immol化―1，然后轉入在30°C，225rpm條 件下，繼續培養18-24h。9.6)脂肪醇的提取誘導培養后的菌液在12000g條件下，離心lOmin，收集上清液，并用等體積的正己 烷萃取2-3次，旋轉蒸發除去正己烷后即得中碳脂肪醇。正己烷回收利用。9. 7)脂肪醇組成及含量的測定得到的脂肪醇通過GC-MS測定其組成及含量。實施例10通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC) ,C. calophylla 的 Cc FatB2 基因和 A. thaliana 的 CER4 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。實施例11通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因和 A. thaliana 的 CER4 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。實施例12通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. palustvis 的 Cp FatB1 基因和 A. thaliana 的 CERl 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。實施例13通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD),U. californica的BTE基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE 基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例14通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD), C. calophylla的Cc FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例15通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. hookeriana的Ch FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例16通過在大腸桿菌中共同過量表達A. calcoaceticus的乙酰_CoA羧化酶基因 (accABCD)，C. palustvis的Cp FatBi基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的 fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例17通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， U. californica的BTE基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用 于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例18通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. calophylla的Cc FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例19通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. hookeriana的Ch FatB2基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因 以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例20通過在大腸桿菌中共同過量表達E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. palustvis的Cp FatBi基因和S. chinensis的FAR基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以 用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例1。實施例21通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，U. californica 的 BTE 基因和 S. chinensis 的 FAR 基因，并敲除大腸桿菌 的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。實施例22通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. calophylla 的 Cc FatB2 基因和 S. chinensis 的 FAR基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。實施例23通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因和 S. chinensis 的 FAR 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。實施例24通過在大腸桿菌中共同過量表達C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. palustvis 的 Cp FatBi 基因和 S. chinensis 的 FAR 基因，并敲除大腸桿 菌的fadE基因以用于生物合成中碳脂肪醇。方法過程同實施例9。
權利要求
一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌，通過下述方法得到通過聚合酶鏈式反應擴增乙酰 CoA羧化酶基因、硫脂酶基因和脂酰 CoA還原酶基因，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達載體pET 30a(+)或pACYCDuet 1，載體片斷膠回收后，將載體∶基因片段按摩爾比為1 2∶4 5的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4 7℃連接15 30小時，連接產物于38 42℃熱擊轉化E.coli DH5α感受態細胞，涂布平板培養15 30小時，PCR篩選陽性克隆。陽性克隆提取質粒DNA，酶切和測序鑒定后，熱擊轉化E.coli BL21(DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE基因后即得目標工程大腸桿菌。
2.根據權利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經異丙基硫 代- β -D-半乳糖苷誘導后過量表達硫脂酶。
3.根據權利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經異丙基硫 代-β -D-半乳糖苷誘導后過量表達脂酰-CoA還原酶。
4.根據權利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經異丙基硫 代-β -D-半乳糖苷誘導后過量表達乙酰-CoA羧化酶。
5.根據權利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，工程大腸桿菌通過搖瓶或發酵罐進行 培養。
6.一種利用權利要求1所述工程大腸桿菌制備中碳脂肪醇的方法，將工程大腸桿菌以 1-2 100-130 (ν/ν)的比例接種內含卡那霉素和氯霉素的Μ9液體培養液中，在35-37°C， 225rpm條件下培養至OD6tltlnm為0. 6-0. 8時，加入誘導劑IPTG至終濃度為0. 1-0. 2mmol化一1， 誘導目的蛋白的過量表達，然后轉入28-30°C，225rpm繼續培養18-24小時；培養后的菌液 離心取上清液，用等體積的正己烷萃取，減壓蒸發除去正己烷后制得中碳脂肪醇。
7.根據權利要求6所述制備中碳脂肪醇的方法，其中，正己烷減壓蒸餾后回收使用。
8.根據權利要求6所述制備中碳脂肪醇的方法，其中，所得脂肪醇通過GC-MS分析其組 成及含量。
全文摘要
一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌和制備中碳脂肪醇的方法，該方法通過在大腸桿菌中過量表達硫脂酶基因，脂酰-CoA還原酶基因等，使大腸桿菌獲得生產中碳脂肪醇的能力，結合過量表達乙酰-CoA羧化酶基因并敲除大腸桿菌的脂酰-CoA脫氫酶基因，進一步提高工程大腸桿菌的脂肪醇生產能力。該方法可用于重要化工原料中碳脂肪醇的生物合成。
文檔編號C12P7/02GK101899411SQ200910090469
公開日2010年12月1日 申請日期2009年8月12日 優先權日2009年8月12日
發明者劉煒, 咸漠, 孟鑫, 徐鑫, 楊建明, 鄭艷寧 申請人:青島生物能源與過程研究所